Khóa luận Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

1 Chƣơng 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Trong những năm gần đây, cây điều (Anacardium occidental L.) đã và đang trở thành một cây công nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao của nước ta. Hằng năm, doanh thu từ cây điều đem về cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước xuất khẩu nhân điều đứng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil [4]. Bên cạnh đó, việc canh tác cây điều còn giúp nước ta giải quyết được những vấn đề xã hội khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải quyết việc làm, đem lại thu nhập ổn định cho người nông dân ở những vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm trong vùng có khí hậu thuận lợi và có diện tích lớn đất phù hợp cho sự phát triển của cây điều, vì vậy chúng ta có tiềm năng lớn để phát triển mạnh cây điều. Tuy nhiên tình hình canh tác cây điều của nước ta nói chung và của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu nói riêng không đạt tương xứng như tiềm năng, do đó năng suất bình quân còn thấp, không đồng đều và không ổn định cả về chất lượng và sản lượng, bắt nguồn từ việc phát triển cây điều một cách tự phát, không được đầu tư nghiên cứu nghiêm túc, đặc biệt là những nghiên cứu về các giống điều và kỹ thuật canh tác. Để có thể đề ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của quần thể cây điều hiện có. Xuất phát từ yêu cầu đó, được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, dưới sự hướng dẫn của thầy TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP”. 2 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu  Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.  Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều, làm cơ sở cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP vào những nghiên cứu sâu rộng hơn về tính đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều cũng như trên những đối tượng nghiên cứu khác sau này. 1.2.2. Yêu cầu  Thu thập được mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình dựa trên kiểu hình như: khả năng chịu hạn tốt hay không tốt, năng suất và chất lượng hạt cao hay thấp, có tính đề kháng với sâu bệnh cao hay thấp, ra hoa sớm hay muộn,…  Ly trích DNA có chất lượng tốt từ các mẫu lá thu được (được bảo quản lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD và AFLP.  Thực hiện thành công kỹ thuật RAPD từ đó đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận diện một số đoạn DNA có thể được sử dụng như những chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng đáng quan tâm.  Thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA có chất lượng tốt, từ đó lựa chọn ra một vài tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thích hợp cho việc áp dụng kỹ thuật AFLP trên cây điều. 1.3. Hạn chế của đề tài  Những nghiên cứu phân loại giống điều tại Việt Nam chưa được thiết lập, đồng thời khó có khả năng nhận diện giống trong thực tế tại vườn nông hộ nên chỉ thực hiện lấy mẫu những cây điều có đặc điểm nổi bật và điển hình, không dựa trên đặc điểm phân loại giống.  Không có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn. 3  Không có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR – RAPD với nhiều primer và tìm ra quy trình PCR – RAPD tối ưu.  Không có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP trên nhiều mẫu và với nhiều tổ hợp primer do chi phí thực hiện quá cao. 4 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về cây điều 2.1.1. Nguồn gốc cây điều Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale L. Cây điều có nguồn gốc ở Brazil. Người Bồ Đào Nha là những người đầu tiên mang cây điều từ Brazil sang trồng ở châu Á và châu Phi trong công cuộc mở rộng thuộc địa của họ. Điều kiện tự nhiên ở châu Á phù hợp cho sự phát triển của cây điều. Ngày nay cây điều trải rộng trong ranh giới vĩ tuyến 25o Bắc và 25o Nam. Trước kia, cây điều được trồng chủ yếu để che phủ đất, chống xói mòn,…Mãi đến tận đầu thế kỷ 20 nhân điều mới thực sự trở thành nông sản có giá trị trên toàn thế giới [2][3]. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây điều Cây điều là loài cây thân mộc vùng nhiệt đới, sống lâu năm (đến khoảng 30 – 40 năm hay cao hơn), chịu hạn tốt, có thể sinh trưởng và phát triển ở những vùng đất khô cằn, bạc màu mà những cây lương thực khác khó có thể sống nổi. 2.1.2.1. Thân và cành cây Thân thường cao khoảng 6 – 8 m, những nơi đất tốt có thể đến 10 – 12 m, đường kính vòng thân có thể đạt 40 – 50 cm. Chiều cao thân cây có liên hệ mật thiết với mật độ trồng. Nếu trồng với mật độ dày, thân cây tăng trưởng chiều cao mạnh nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt, không thể cho nhiều hoa và trái. Thông thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m. Tán cây điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có khi đạt 20 m [2]. 2.1.2.2. Hệ rễ Cây điều có rễ cọc và rễ ngang. Ở những vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp, rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, do đó cây điều có khả năng chịu hạn cao và vững 5 chắc. Rễ cọc cây điều trên 5 tuổi có thể sâu khoảng 5 m. Hệ thống rễ ngang mọc cách mặt đất khoảng 12 cm. 2.1.2.3. Lá Lá cây điều thuộc loại lá đơn, nguyên. Lá thường có dạng thuôn hay hình trứng, đuôi lá thường hơi tròn. Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, khi già có màu xanh thẫm. Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến lá trưởng thành khoảng 20 ngày [3]. 2.1.2.4. Hoa và quả điều Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời. Khi mới nở cánh hoa có màu trắng hay vàng có sọc đỏ, sau đó chuyển thành màu hồng sẫm. Hoa điều có hai loại: hoa đực và hoa lưỡng tính. Hoa đực gồm toàn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng 8 – 12 nhị đực và có một nhụy cái ở chính giữa. Nhụy cái gồm một bầu noãn nằm dưới một vòi dài (dài và mập hơn nhị đực). Theo Copeland (1961), trong bầu noãn chứa một noãn duy nhất, nếu được thụ tinh sẽ phát triển thành hạt điều [2]. Hoa điều mọc thành từng chùm có từ vài chục đến 1 – 2 trăm hoa, gồm cả hoa đực và hoa lưỡng tính, trong đó hoa đực chiếm tỉ lệ cao, còn hoa lưỡng tính dao động từ 0 – 30 % tổng số hoa trong chùm. Số hoa lưỡng tính đậu quả tới chín cho thu hoạch khoảng 10 %. Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao. Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào từng cây khác nhau trong vườn. Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng 12 – 15 % [3]. Mùa hoa điều nở là mùa khô. Hoa điều thường nở từ tháng 11 kéo dài đến tận tháng 3 năm sau, tuy nhiên hoa nở rộ ở tháng 1 – tháng 2. Sự nở hoa có liên hệ mật thiết với nhiệt độ môi trường. Có sự chênh lệch về thời điểm nở hoa, ngay cả với những hoa cùng chùm. Hoa điều nở từ sáng sớm tới trưa, sau đó bắt đầu héo. Sau khi thụ phấn xong, quá trình thụ tinh bắt đầu: hạt phấn nảy nầm trên đầu núm nhụy cái đưa các tinh tử xuyên qua vòi nhụy vào bầu noãn để thụ tinh cho tế bào trứng. Thụ tinh xong bắt đầu quá trình hình thành và phát triển của hạt điều. Quả điều thật là phần mà ta hay gọi là hạt, phần gọi là quả thực ra do phần cuống phình to ra, gọi là quả giả. Hạt điều bao giờ cũng phát triển trước và nhanh hơn quả giả ở gần cuống. Khi hạt điều 6 tăng trưởng đến kích thước tối đa, có sự hình thành đầy đủ các bộ phận, bước vào giai đoạn chín lúc bấy giờ quả giả mới tăng trưởng mạnh [2]. Hạt điều có hình dạng giống quả thận, khi non có màu xanh, khi chín khô chuyển qua màu nâu xám hoặc xám hồng. Hạt điều ở nước ta thường dài 2,6 – 3,1 cm, dày 1,2 – 1,7 cm, nặng khoảng 3 – 7 g. Cấu tạo hạt điều gồm 3 phần rõ rệt:  Phần vỏ cứng: chiếm khoảng 60 % – 70 % trọng lượng hạt điều, trong đó phần dầu vỏ hạt chiếm 20 % – 22 % trọng lượng hạt.  Phần giữa: là lớp vỏ lụa, lúc còn non đóng vai trò cung cấp chất dinh dưỡng nuôi hạt, khi chín teo lại, chiếm khoảng 5 % trọng lượng hạt.  Phần trong cùng: là nhân hạt điều, chính là phôi hạt có đầy đủ chồi mầm, thân mầm và rễ mầm. Bộ phận có kích thước lớn của phôi là hai lá mầm có chứa nhiều chất dinh dưỡng để nuôi cây mầm khi mới mọc [3].  Sau khi thụ tinh xong không phải bất cứ hoa điều lưỡng tính nào cũng đều phát triển thành quả giả và hạt cho đến khi chín. Có nhiều khi hạt và quả giả chưa kịp chín đã rụng, gọi là hiện tượng rụng trái non. Tỉ lệ rụng trái non phụ thuộc vào từng cây, từng vụ, do nhiều nguyên nhân khác nhau như: di truyền, thời tiết bất thường, sâu bệnh, đất quá khô hoặc úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng. Sau khi trồng khoảng 2 – 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái. Năng suất giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết. Năng suất hạt điều trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4]. 2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều 2.1.3.1. Khí hậu Các yếu tố thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây điều :  Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 – 2.000 mm/năm, có một mùa mưa tập trung, không đến sớm, sau đó là một mùa khô kéo dài 4 – 6 tháng [2]. 7  Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20oC – 37oC, cực thuận ở 27oC [9]. Một điều ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất hạt điều là do sương muối. Khi có nhiều sương muối trùng với thời kỳ kết hạt non của cây, nhiều hạt non sẽ bị thối đen, năng suất giảm. Cây điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều bởi sương muối.  Chế độ ánh sáng: Cây điều là cây ưa sáng hoàn toàn, thích hợp ở những vùng mà độ dài ngày và đêm bằng nhau và bầu trời quang đãng. Số giờ nắng khoảng 2000 h/năm [3].  Độ ẩm tương đối: Độ ẩm không khí thích hợp từ 65 % – 80 %. 2.1.3.2. Đất đai Cây điều có thể mọc trên nhiều loại đất khác nhau (đất đỏ, đất cát, đất xám phù sa cổ, đất sỏi đá,…), tuy nhiên muốn đạt năng suất cao đòi hỏi phải có tầng đất mặt sâu, thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, pH đất từ 4,5 – 6,5. Vườn trồng phải được nhổ cỏ thường xuyên để cây phát triển tốt. 2.1.3.3. Mật độ trồng Thông thường mật độ trồng thích hợp là 10 m x 10 m, ở mật độ này cây điều phát triển tốt chiều cao và tán [3]. 2.1.4. Giống điều và các phƣơng pháp nhân giống Giống như các loại cây trồng từ hạt khác, cây điều có khả năng xảy ra thụ phấn chéo cao và phát tán rộng, vì vậy quần thể cây điều có tính đa dạng di truyền cao. Trong thực tế, ở Việt Nam có những giống điều chủ yếu như: PN1, MH4/5, MH5/4, BO1 (là giống điều ghép cao sản). Bên cạnh đó còn những giống điều khác chưa phân loại được [3]. Theo như kinh nghiệm của các nông dân, có 2 giống điều chủ yếu là: điều Ấn Độ có tán rộng, đọt non màu đỏ và cho năng suất rất cao song hay bị sâu hại trong khi điều Việt Nam có tán hẹp và đọt non màu xanh, năng suất không cao bằng điều Ấn Độ song khả năng chống chịu sâu hại cao. 2.1.4.1 . Đặc điểm thực vật học của các giống điều  Về hình dạng cây: Có cây thân cao và cây thân lùn. Giữa 2 dạng chính này còn có nhiều dạng trung gian phong phú. 8  Về màu sắc lá: Có giống có lá non màu nõn chuối và lá già màu xanh nhạt, có giống có lá non từ màu hồng đến đỏ tía và lá già màu xanh đậm.  Về hoa: Có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh nhau 10 – 15 ngày, số lượng hoa trong mỗi chùm cũng khác nhau (có giống mỗi chùm chỉ có vài chục hoa, có giống lại có vài trăm hoa trên một chùm), tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình quân trong một chùm cũng thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp chỉ khoảng 5 % hay cũng có giống cao đến khoảng 30 %). Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau khi nở và đậu thành trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái, ít chỉ 1 – 3 trái.  Về quả giả: Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các giống. Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh. Có giống quả tròn, quả dài, quả to hay nhỏ. Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn khé cổ do có nhiều tananh trong nước quả.  Về hạt và năng suất hạt: Khác biệt về hạt ở các đặc điểm như hình dạng, kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân. Có giống hạt tròn mẩy, có giống hạt lép. Có giống hạt to và nặng, khi chín trọng lượng khô đạt đến 8 g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có giống hạt nhỏ, chỉ đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg). Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng lượng hạt, cũng có giống đạt 30 % trọng lượng hạt. 2.1.4.2. Phƣơng pháp nhân giống cây điều Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu là chiết, ghép, gieo hạt, tuy nhiên trong thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn cây điều mẹ tốt để lấy hạt làm giống. Ngoài ra, hiện nay nông dân thường mua cây giống cao sản từ những công ty giống. 2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới Từ một cây mọc hoang dại ở vùng Đông Bắc Brazil, ngày nay cây điều được trồng ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu ở những nước có nền nông nghiệp khá phát triển hay những nước đang phát triển. Hiện nay có khoảng 50 nước trồng điều trên toàn thế giới. Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Guinea- Bissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,… 9 Bảng2.1. Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001. ĐVT: tấn Nƣớc/khu vực 1997 2000 – 2001 Ấn Độ Brazil Việt Nam Tanzania Nigieria Mozambique Indonesia Guinea-Bissau Benin Các nuớc châu Phi nói tiếng Pháp Các nước khác 350.000 180.000 110.000 80.000 40.000 30.000 30.000 - - - 80.000 425.000 200.000 140.000 150.000 30.000 20.000 30.000 45.000 20.000 70.000 70.000 Cộng 900.000 1.200.000 Nguồn:[4]. Ngoài nhân điều là sản phẩm chính có giá trị kinh tế cao còn có dầu hạt điều (CNSL – Cashew nut shell liquid) – một sản phẩm tạo ra trong quá trình chế biến hạt điều lấy nhân xuất khẩu, chiếm khoảng 18 – 23 % trọng lượng hạt điều, có thành phần chính là acid anacardic và cardol. CNSL là một sản phẩm nguyên liệu đa năng, dùng cho công nghiệp hóa chất, chế tạo bố thắng, lớp phủ cho các bộ ly hợp, chế tạo các loại sơn,vecni, các loại nhựa,…Những nước sản xuất CNSL chủ yếu là Brazil, Ấn Độ, Mozambique, Tanzania,… Ngoài ra trái điều còn dùng làm nguyên liệu trong công nghiệp chế biến nước giải khát khá phát triển ở một số nước (Brazil, Ấn Độ,…). Gỗ điều dùng trong các ngành đồ gỗ mỹ nghệ và nội thất gia đình. Bên cạnh đó, cây điều còn có một số tác dụng chữa bệnh được một số nước sử dụng như: giảm đau, lợi tiểu, điều trị hen suyễn (Brazil), thuốc sát trùng (Peru),…[3]. 10 2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho cây điều phát triển. Cây điều có thể đã được đưa vào nước ta từ thế kỷ 18 hay sớm hơn (Johnson, 1973) [2], nhưng mãi đến đầu những năm 1975, cây điều mới được trồng phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc do bom đạn chiến tranh. Cho đến cuối thập kỷ 80 của thế kỷ 20 chúng ta mới bắt đầu xuất khẩu nhân điều [3]. Kể từ mốc thời gian đó đến nay, phát triển cây điều không phải lúc nào cũng thuận lợi, có những lúc người nông dân trồng điều đã phải chặt bỏ hết cả vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… do giá điều quá thấp và mất mùa liên tục. Tuy nhiên hiện nay ngành trồng điều đã và đang phát triển mạnh, đạt được những thành tựu đáng ghi nhận. Năm 2004, cả nước có hơn 400.000 ha diện tích trồng điều, là năm cho sản lượng cao nhất của ngành điều từ trước đến nay, đã xuất khẩu được 107.000 tấn nhân điều, tăng 25 % so với năm 2003, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 425 triệu USD, tăng 40 % so với năm 2003, trong đó thị trường Mỹ chiếm 41 %, Trung Quốc 20 %, Úc 10 %, còn lại là các thị trường khác. Năm 2004, Việt Nam chính thức trở thành nước xuất khẩu hạt điều đứng hàng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil. Năm 2005, chỉ tiêu của ngành điều là sản xuất chế biến khoảng 450.000 tấn điều thô, xuất khẩu 110.000 tấn nhân điều, giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt từ 430 – 450 triệu USD, phấn đấu hoàn thành kế hoạch trồng mới 50.000 ha điều cao sản và đến năm 2010, toàn bộ diện tích điều trên cả nước sẽ được thay bằng giống cao sản [4]. 11 Bảng2.2. Tình hình sản xuất, xuất nhập khẩu nhân điều của Việt Nam. Năm Hạt điều thô (tấn) Xuất khẩu (tấn) Giá trị kim ngạch (triệu USD) Sản xuất trong nước Nhập khẩu Hạt điều thô Nhân điều 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 1530 1449 468 12.000 28.000 31.000 47.000 60.000 90.000 100.000 110.000 140.000 100.000 70.000 135.000 140.000 - 10.000 20.000 25.000 40.000 - - - 300 11.000 27.000 30.000 40.000 30.000 50.000 - - 33,6 261 286 360 1.400 6.000 9.526 18.257 23.791 33.000 26.000 16.000 30.000 38.000 63.000 14 23 29 49 75 90 110 133 117 100 150 135 214 12 Bảng2.3. Thị phần xuất khẩu nhân điều của Việt Nam 3 năm 2000, 2001 và 2002. STT Quốc gia và khu vực 2000 (%) 2001 (%) 2002 (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hoa Kỳ Trung Quốc Úc Anh Hà Lan Nhật Canada Hồng Kông Đức New Zealand Đài Loan Các nước khác 18 32 17 8 8 3 3 3 2 1 1 1 24 28 18 7 10 2,5 .2,5 4 1 1 1 5 33,7 20,3 10,8 5,3 10,9 2,2 2,3 4,8 1 1 1,1 6,6 Nguồn: [4]. 13 Bảng2.4. Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010. ĐVT: ha 1997 2005 2010 Toàn quốc 250.000 340.000 500.000 Duyên hải Nam Trung Bộ Quảng Nam Quảng Ngãi Bình Định Phú Yên Khánh Hòa Ninh Thuận Bình Thuận 61.000 4.000 3.000 15.000 8.000 7.000 3.000 21.000 100.000 10.000 10.000 15.000 15.000 15.000 10.000 25.000 180.000 25.000 25.000 25.000 20.000 25.000 20.000 40.000 Tây Nguyên Kon tum Gia Lai Đắc Lắc Lâm Đồng 27.000 500 10.500 10.000 6.000 60.000 16.000 17.000 15.000 12.000 120.000 25.000 35.000 30.000 30.000 Đông Nam Bộ Đồng Nai Bà Rịa – Vũng Tàu Bình Dương Bình Phước Tây Ninh Tp. Hồ Chí Minh 149.000 35.000 20.000 32.000 50.000 10.000 2.000 170.000 40.000 25.000 28.000 65.000 10.000 2.000 190.000 40.000 30.000 28.000 65.000 25.000 2.000 Đồng bằng sông Cửu Long 13.000 10.000 10.000 Nguồn: [4]. Năm Vùng/Tỉnh 14 2.1.7. Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh mới thành lập năm 1991, thế mạnh là công nghiệp dầu khí và du lịch, ngoài ra còn phát triển mạnh cây công nghiệp như cao su, cà phê, tiêu, điều, đem lại nguồn thu nhập khá cao, chủ yếu là cho các huyện của tỉnh. Cũng như các địa phương khác, cây điều được trồng ở tỉnh chủ yếu là trồng từ hạt, có độ tuổi trung bình cao. Trong những năm gần đây đang phát triển mạnh cây điều cao sản cho năng suất cao và ổn định hơn so với các giống điều địa phương. Đất nông nghiệp của tỉnh khá màu mỡ, có diện tích đất đỏ bazan lớn, cùng với điều kiện khí hậu khá ổn định, nhiệt độ trung bình trong năm là 24oC – 28oC, có mùa khô và mùa mưa phân biệt, hệ thống thủy lợi phát triển và rộng khắp,…là những điều kiện thuận lợi cho phát triển cây điều. Bảng2.5. Sản lượng điều tại tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành chính. ĐVT: tấn 1996 2000 2001 2002 2003 Tổng số TP. Vũng Tàu TX. Bà Rịa H. Tân Thành H. Châu Đức H. Xuyên Mộc H. Long Đất H. Côn Đảo 6.257 153 109 1.630 1.387 2.589 384 6 5.102 48 73 413 742 3.575 250 1 6.010 48 71 812 1.272 3.575 231 1 7.316 24 72 1.462 1.447 4.009 301 1 10.417 28 143 1.462 2.206 6.138 440 1 (Nguồn: Sở Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu; Cục Thống kê tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.) Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào tổng thu nhập của toàn tỉnh không nhiều, song có một vai trò quan trọng trong sự phát triển chung của tỉnh, góp 15 phần đem lại thu nhập tương đối cho một bộ phận khá đông những người nông dân, giúp ngăn chặn tình trạng phân hóa giàu nghèo giữa thành thị và nông thôn. Với những vùng đất khô cằn, bạc màu thì cây điều là giải pháp thích hợp nhất để giúp bà con có được thu nhập cao. Tỉnh chủ trương đến năm 2010 thay thế dần các giống điều địa phương, trồng lâu năm, cho năng suất không cao, không ổn định bằng các giống điều cao sản cho năng suất cao, ổn định, kháng sâu bệnh và chất lượng đồng đều, phấn đấu đến năm 2010 đạt 16.000 tấn/năm (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR – VT). Chính vì vậy, việc đánh giá từng vùng quần thể và nhận diện các giống có giá trị cao là rất cần thiết. 2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử 2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử Tế bào là đơn vị của sự sống, được phân ra làm 2 loại: Tế bào tiền nhân (Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên được hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA (Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide được cấu tạo từ 3 thành phần: nhóm photphat, đường ribose và một trong 4 loại bazơ hữu cơ (adenine, cytoxine, thymine và guanine). Có 4 loại nucleotide khác nhau: A (nucleotide có chứa base adenine), T (nucleotide có chứa base thymine), C (nucleotide có chứa base cytoxine) và G (nucleotide có chứa base guanine). Các nucleotide trong cùng một mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết photphat và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với nhau theo nguyên tắc bổ sung A – T, G – C [1] [5] [8]. Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền [1]. 16 Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính trạng bên ngoài. Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị [1]. Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: - Chỉ thị hình thái. - Chỉ thị allozyme. - Chỉ thị phân tử. 2.2.1.1. Chỉ thị hình thái Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp. 2.2.1.2. Chỉ thị allozyme Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, allozyme có thể được phân tách bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị allozyme đem lại khả quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu rộng. 2.2.1.3. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân tử. Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho 17 công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:  Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…  Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP [1] [8]. 2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn (restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [1]. 2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển trên gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng PCR, làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình thực hiện khó nhưng kết quả có độ tin cậy không cao [1]. 2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites) Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, dựa trên nguyên lý: Trình tự một đoạn DNA chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu lần và phát hiện qua điện di [6]. Kỹ thuật này có nhược điểm là phải biết trình tự gene của đối tượng nghiên cứu. 18 2.2.5. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides được lặp lại nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu được dùng để định danh những giống hay những loài rất gần nhau về mặt di truyền [6]. 2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [1] [6]. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD được minh họa trong hình 2.1. 19 Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD 2.2.6.1. Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD  Bước 1: Tách chiết DNA DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy nhiều). 5 ` 5 ` 5* 5* 3 ` 3 ` 3 ` 3 ` Primer ngẫu nhiên Thực hiện PCR với những primer ngẫu nhiên Sau phản ứng PCR, kết quả đem điện di phát hiện band. 20 Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13]. Phương pháp này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. Phức hợp này sau đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol, bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa DNA, pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ khác (polysaccharides, protein,…). Sau khi ly tâm, thu được DNA. Thông thường quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích. Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…). Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với muối. Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA: DNA bị phân hủy hoặc bị gãy. Có RNA trong mẫu DNA. Có polysaccharide trong mẫu DNA. Có polyphenol trong mẫu DNA. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA được trình bày trong bảng 2.6. 21 Bảng 2.6. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA. Thành phần Tên gọi Bản chất Tác dụng pH Ức chế hoạt động của những enzyme phân hủy (như enzyme DNase hoạt động ở pH=7). Tris-HCl Dung dịch đệm Duy trì pH phù hợp. EDTA ethylenediamine -tetraacetate Ức chế những enzyme phân hủy DNA. sodium acetat. Muối -Kết hợp với ethanol 100% kết tủa và rửa sạch DNA. -Bảo vệ DNA. CTAB hexadecyltrime- thylammonium- bromide. Chất tẩy cation. -Hòa tan màng tế bào. -Biến tính protein. -Thành lập phức hợp với những protein, polysaccha- ride. CIA chloroform- isoamylalcohol. Chiết xuất protein và những polycaccharide. isopropanol Kết tủa DNA. ß-mercaptoetha- nol Tác nhân phá hủy màng nhân và kháng lại sự oxi hóa. -Ức chế quá trình oxi hóa. -Phá vỡ màng nhân. -Bảo vệ DNA khỏi những quinone, disulfite, peroxi- dase, polyphenoloxydase. ethanol 100% -Kết tủa DNA. -Rửa sạch DNA. Có thể gây hại cho DNA do vậy phải kết hợp với muối. ethanol 70% Rửa sạch DNA. Không gây hại cho DNA do ở nồng độ thấp. 22  Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản phẩm không chính xác.  Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel agarose. 2.2.6.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD  Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng nhân bản cao.  Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6]. 2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD  Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp).  Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao [1] [6]. 2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời, mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:  Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…  Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6]. 23  Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995) [1] [6]. 2.2.7. Kỹ thuật AFLP 2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu. Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18]. Nguyên lý kỹ thuật AFLP được trình bày trong hình 2.2. Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP 24 2.2.7.2. Các bƣớc của kỹ thuật AFLP [17] Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:  Bước 1: Tách chiết DNA. Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất lượng DNA sử dụng cho kỹ thuật AFLP phải tốt hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.  Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter Bước này gồm có hai giai đoạn: Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn bằng 2 enzyme cắt. Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với những đoạn DNA vừa được cắt. Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2 đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn. Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau, giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước.  Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification) Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở đầu 3’. Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C). Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A). Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn lọc). Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter. 25 Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.  Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification) Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở đầu 3’. Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt giới hạn và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ xung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả. Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide. Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ xung với trình tự của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản phẩm khi điện di). Bảng 2.7. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc lớn. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc nhỏ. EcoRІ-ACT FAM EcoRІ -ACA FAM EcoRІ -AAC NED EcoRІ -ACC NED EcoRІ -AGC NED EcoRІ -AAG JOE EcoRІ -AGG JOE EcoRІ -ACG JOE EcoRІ-TG FAM EcoRІ-TC FAM EcoRІ-AC FAM EcoRІ-TT NED EcoRІ-AT NED EcoRІ-TA JOE EcoRІ-AG JOE EcoRІ-AA JOE 26 Bảng 2.8. Những primer MseI nhân bản chọn lọc. Những primer MseІ nhân bản chọn lọc MseІ-CAA MseІ-CAC MseІ-CAG MseІ-CAT MseІ-CTA MseІ-CTC MseІ-CTG MseІ-CTT  Bước 5: Điện di và phân tích kết quả Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di trên gel polyacrylamide. Nguyên lý hoạt động của máy giải trình tự: Khi sử dụng máy giải trình tự để điện di, các sản phẩm của phản ứng nhân bản chọn lọc sẽ được hút qua những ống mao quản có đường kính rất nhỏ, bên trong có polymer. Trong phản ứng nhân bản chọn lọc, các primer EcoRI có gắn chất phát huỳnh quang trước đó, vì vậy khi các sản phẩm nhân bản chọn lọc đi qua một camera laser, chúng sẽ phát màu, khi đó một đầu dò cực nhạy sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra này và truyền tín hiệu về máy tính sử lý. Độ dài của các đoạn được nhân bản chọn lọc sẽ được tính toán dựa vào vị trí tương đối của chúng với những band chuẩn có kích thước đã biết. Kết quả điện di trên máy giải trình tự cho độ chính xác rất cao, có thể phân biệt các band chỉ chênh lệch nhau đến vài nucleotide [17]. 27 2.2.7.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật AFLP  Kỹ thuật AFLP phù hợp cho tất cả các đối tượng nghiên cứu là thực vật, động vật và vi sinh vật mà không cần biết trước trình tự bộ gene.  Không giống như kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn và nhân bản một cách ngẫu nhiên, cho kết quả có độ tin cậy không cao, kỹ thuật AFLP sử dụng 2 primer dài, cho kết quả đáng tin cậy và ổn định (kết quả giống nhau khi được lập lại nhiều lần) do điều kiện thực hiện 2 phản ứng PCR nghiêm ngặt.  Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene có độ phân tách các band cao giúp phát hiện hầu hết những đoạn được nhân bản chọn lọc có độ dài gần bằng nhau mà khi điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide khó phát hiện được.  Khả năng xuất hiện đa hình lớn, nhận diện được chỉ thị trội với độ tin cậy cao. Đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao.  Sử dụng một lượng ít DNA so với RFLP [17]. 2.2.7.4. Những hạn chế của kỹ thuật AFLP  AFLP là kỹ thuật mới nên chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu. Chi phí tiến hành cao và thiết bị phức tạp nên chưa thể thay thế hoàn toàn các kỹ thuật khác, đặc biệt là với các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới.  Thao tác thực hiện khó, cần có đội ngũ chuyên viên được đào tạo lành nghề. 2.2.7.5. Ứng dụng của kỹ thuật AFLP Kỹ thuật AFLP được sử dụng cho những công việc:  Đánh giá đa dạng di truyền.  Nhận diện chỉ thị phân tử.  Xây dựng bản đồ gene. 28 2.2.8. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí như bảng 2.9. Bảng 2.9. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử. Các yếu tố chính AFLP RAPD SSR RFLP Allozyme Số lượng thông tin Khả năng đáng tin cậy Độ phân giải Cách tiến hành Thời gian tiến hành Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Cao Cao Cao Khó (*) Dài (*) Thấp Cao Cao Khó Dài Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn (*): Khi chưa phát hiện được trình tự primer. Nếu đã có trình tự primer thì thời gian tiến hành ngắn và cách thức tiến hành dễ (Theo Hillis và ctv, Karp và Edwards, 1998) [17] 2.2.9. Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng một chuỗi DNA khuôn thành hàng triệu bản giống hệt nhau và giống hệt chuỗi DNA khuôn qua vài chục chu kỳ nhiệt độ luân chuyển liên tục, sử dụng các primer bắt cặp bổ sung với chuỗi DNA khuôn, enzyme polymerase gắn các dNTPs vào với nhau theo một trình tự bổ xung với trình tự của chuỗi DNA khuôn, bắt đầu từ đầu 3’ của các primer [1] [5] [6] [8] [10] [11] [12] [14]. 2.2.9.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR Được miêu tả qua 3 giai đoạn: 29  Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao (khoảng 92oC – 96oC) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng DNA mạch đôi tạo ra nó.  Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thường được tiến hành ở nhiệt độ 50oC – 56 o C.  Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3’ do tác dụng của enzyme polymerase gắn các nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thường được tiến hành ở 70oC – 72 o C. Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA template), các dNTPs, enzyme polymerase, các primer, MgCl2, dung dịch đệm (buffer) và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ. Nguyên lý kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 2.3 và hình 2.4. 30 Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR 2.2.9.2. Quy trình chuẩn của phản ứng PCR Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất:  Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR: Nồng độ enzyme: thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung dịch phản ứng. Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme. Các dNTPs: Hàm lượng các dNTPs trong khoảng 20 – 200 μM cho kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTPs (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương đương nhau. Hàm lượng MgCl2: Nồng độ tối ưu của MgCl2 cho kết quả PCR tốt. Ion Mg + có thể ảnh hưởng đến: - Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn. Nguyên lý kỹ thuật PCR Từ 30 – 45 chu kỳ Bƣớc 1: Biến tính Bƣớc 2: Bắt cặp Bƣớc 3: Nối dài 31 - Quá trình bắt cặp của primer: MgCl2 làm tăng khả năng bắt cặp chính xác của primer với DNA template. - Sự đặc hiệu của sản phẩm PCR: bao gồm cả sự bắt cặp chính xác của primer với DNA khuôn và sự nối dài chính xác. - Hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Thông thường hàm lượng ion Mg+ cần thiết từ 0,5 – 2.5 mM.  Chu trình nhiệt: Ban đầu thiết lập một giai đoạn nhiệt độ khoảng 94oC trong 5 phút để hầu như tất cả các đoạn DNA khuôn mạch đôi bị biến tính tách ra thành 2 DNA khuôn mạch đơn phân biệt và không tự bắt cặp lại với nhau. Nhiệt độ biến tính: 94oC – 96oC trong 15 giây hay lâu hơn, các sản phẩm của chu kỳ PCR trước tiếp tục bị làm biến tính để thành DNA khuôn mạch đơn cho chu kỳ PCR tiếp theo. Nhiệt độ bắt cặp: 55oC (50oC – 56oC) trong 30 giây. Nhiệt độ bắt cặp là quan trọng nhất, bảo đảm rằng không quá thấp (do dẫn đến bắt cặp không đặc hiệu) và cũng không quá cao (dẫn đến khó bắt cặp hoàn toàn hay không bắt cặp). Nhiệt độ nối dài: 72oC trong 90 giây. Thời gian kéo dài phải đủ để có thể kéo dài hoàn toàn một trình tự và hầu hết các đoạn DNA khuôn mạch đơn, nếu không sẽ dẫn đến những kết quả sai lầm do không đủ thời gian để nối dài. Ba bước này lặp lại khoảng 30 – 45 chu kỳ. Chu kì cuối cùng kết thúc bằng một khoảng thời gian nối dài ở 72oC trong 5 phút. Sản phẩm PCR sau đó sẽ được bảo quản ở 4oC hay –20oC. 2.2.9.3. Tối ƣu hoá phản ứng PCR Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR trên DNA của nhiều loại sinh vật khác nhau các nhà khoa học cần phải tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR bởi mỗi loại sinh vật có một đặc trưng riêng. Các biện pháp tối ưu đó liên quan đến những vấn đề: 32  Trình tự của primer: Theo nguyên tắc, primer càng dài sự bắt cặp càng chuyên biệt và ngược lại. Mục đích của việc thiết kế primer là có được sự cân bằng giữa sự chuyên tính (bắt cặp hoàn toàn bổ xung giữa những nucleotide của primer với những nucleotide của DNA template) và hiệu quả của PCR (tạo ra càng nhiều sản phẩm gần với lý thuyết tính toán càng tốt). Trình tự của primer xác định kích thước, vị trí của sản phẩm PCR và nhiệt độ Tm, giúp ước lượng được nhiệt độ bắt cặp khoảng Tm – 2 (thường chỉ đúng với những primer có chiều dài nhỏ hơn 20 basepairs).  Nhiệt độ bắt cặp: Ta = Tm – 2oC, trong đó: Tm = 2 o C x (A+T) + 4 oC x (G+C) (Suggs và ctv, 1981) Với A, T, G, C là số lượng các nucleotide tương ứng có trong chuỗi primer, tuy nhiên công thức này chỉ để tham khảo hay ước lượng.  Nồng độ MgCl2: ảnh hưởng lớn đến kết quả phản ứng, người ta thường thay đổi nồng độ của MgCl2 trước tiên để phản ứng xảy ra dễ dàng hơn.  Nồng độ các dNTP: mỗi dNTP thường khoảng 200 μM.  Những enzyme DNA polymerase chịu nhiệt: Nên sử dụng ở nồng độ 0,5 U/25 μl đủ để kiểm soát sự đặc hiệu của phản ứng PCR. Không nên sử dụng enzyme ở nồng độ cao hơn 2,5 nM (1,25 U/25 μl).  Chất ổn định hoạt động enzyme (enzyme stabilizer): thường là gelatin ở nồng độ 0,01 % hay Triston X – 100 ở nồng độ 0,1 % trong dung dịch buffer để tồn trữ DNA.  Nồng độ các primer: pimer F (forward primer) và primer R (reverse primer) phải có nồng độ bằng nhau và không nên dư thừa.  Tỉ lệ primer/DNA template: Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng dimer – primer sẽ xuất hiện do lượng DNA template thấp và lượng primer quá cao. Ngược lại sản phẩm PCR không nhiều do không đủ primer cho nhân bản. 33 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu 3.1.1. Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1.1. Nguyên liệu Thực hiện các thí nghiệm trên 80 mẫu lá điều thu thập tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Cách thức chọn mẫu, lấy mẫu và bảo quản mẫu xem phần 3.2.1. 3.1.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn:  Giai đoạn 1: Thực hiện việc thu thập mẫu lá cây điều trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Giai đoạn thu thập mẫu được thực hiện từ 20/02/2005 – 11/03/2005.  Giai đoạn 2: Thực hiện tách chiết DNA, kỹ thuật RAPD và kỹ thuật AFLP tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật và Vi Sinh Vật, Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh, Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM. Giai đoạn thực hiện trong phòng thí nghiệm được thực hiện từ tháng 3/2005 đến tháng 8/2005. 3.1.2. Hóa chất cần thiết 3.1.2.1. Hóa chất dùng cho tách chiết và kiểm tra DNA lá điều  Dung dịch chloroform – isoamyl alcohol (CIA) có tỉ lệ chloroform : isoamyl alcohol = 24 : 1.  RNase (10 mg/ml) – enzyme phân huỷ RNA.  Dung dịch isopropanol lạnh.  Sodiumacetate 3 M.  Ethanol 96 % và ethanol 70 %.  Agarose. 34  TAE (Tris – Acetate – EDTA).  Dịch tách chiết EB (Extraction buffer), pha 100 ml (bảng 3.1). Bảng 3.1. Thành phần và cách pha EB. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 100 ml) CTAB (hexade- cyltrimethylammoniumbromide) EDTA 0,5 M Mercaptroethanol NaCl 5 M Tris – HCl 0,5 M Nước 2 g. 4 ml. 1 ml. 28 ml. 20 ml. Thêm cho đến 100 ml.  Dung dịch TE 1 X (Tris – HCl và ethylendiamine tetra acetate), cách pha (bảng 3.2). Bảng 3.2. Thành phần và cách pha TE 1 X. Thành phần Lƣợng dùng (pha trong 250 ml) Tris – HCl 1 M EDTA 0,5 M 1 ml. 0,2 ml  Loading dye.  Ethidiumbromide.  Nước cất siêu sạch khử ion. 35 3.1.2.2. Hóa chất dùng cho kỹ thuật PCR – RAPD  Bộ Taq polymerase (Biorad) và Taq polymerase (ABgene) gồm: Taq polymerase, MgCl2 và Taq buffer.  dNTPs.  Primer 1, primer 2, primer 9 và primer 11 (IDT, Mỹ).  Agarose (Pháp).  Loading dye 6 X  Ladder 100 basepairs (Invitrogene).  Ethidiumbromide.  Nước cất siêu sạch khử ion, chiếu tia UV. 3.1.2.3. Hóa chất dùng cho kỹ thuật AFLP (Applied Biosystem)  2 enzyme cắt: EcoRI và MseI.  Dung dịch đệm 5 X (50 mM Tris – HCl pH 7,0; 50 mM MgAc; 250 mM KAc).  2 adapter: EcoRI adapter và MseI adapter.  ATP 10 mM.  T4 DNA ligase.  Core mix Pre – selective amplification.  2 primer nhân bản tiền chọn lọc: EcoRI và MseI.  Core mix Selective amplification.  Primer EcoRI nhân bản chọn lọc.  Primer MseI nhân bản chọn lọc.  Nước cất siêu sạch, khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV.  Hidi.  Polyacrylamide. 36  Thang chuẩn Gene Scan. 3.1.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.1.3.1.Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho tách chiết và kiểm tra DNA  Chày cối nghiền mẫu (Đức).  Cân điện tử (Ohaus, Mỹ).  Ống eppendorf 1,5 ml (Pháp).  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Nichiryo, Nhật).  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl, 10 μl – 100 μl và 100 μl – 1000 μl (Đức).  Bao tay (Malaysia).  Máy vi ly tâm 14.000 vòng/phút (Hettich, Đức).  Tủ sấy (Anh).  Tủ ủ mẫu (Anh).  Tủ – 20oC (Sanyo, Nhật).  Nồi hấp autoclave (Nhật).  Máy điện di (Biorad, Thụy Điển và Cosmo Bio Co, Nhật).  Máy vortex (Đức).  Tủ hút, tủ cấy vô trùng (Việt Nam / Anh).  Máy chụp hình DNA Geldoc (Biorad, Thụy Điển).  Giếng đổ gel. 3.1.3.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật PCR – RAPD  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Bao tay.  Tủ hút (Việt Nam / Anh). 37  Tủ lạnh các loại (Nhật).  Ống eppendorf 200 μl.  Máy PCR PTC Thermocycle 100.  Giếng đổ gel.  Máy điện di (Biorad).  Máy chụp hình DNA Geldoc. 3.1.3.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm cần cho kỹ thuật AFLP  Các loại pipette 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Các loại đầu tipe 0,5 μl – 10 μl và 10 μl – 100 μl.  Đá gel, bao tay.  Tủ hút.  Tủ lạnh các loại.  Ống eppendorf 200 μl.  Giếng đổ gel.  Máy điện di.  Máy chụp hình DNA Geldoc.  Máy PCR Biorad (Biorad, Thụy Điển).  Bộ máy sequencing AB 3100 (Applied Biosystems, Mỹ). 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Phần thu thập mẫu Thực hiện thu thập mẫu lá điều của những cây điều đặc biệt và điển hình. 3.2.1.1. Phƣơng pháp chọn mẫu Tiến hành thu thập mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình trong vườn của những nông hộ được khảo sát theo mẫu in sẵn (xem phụ lục). 38 Lựa chọn nông hộ để khảo sát một cách ngẫu nhiên. Những đặc điểm nổi bật được chọn chủ yếu gồm:  Năng suất: cao hay thấp.  Ra hoa: nhiều hay ít, sớm hay muộn, một đợt hay nhiều đợt, nở đồng loạt hay phân tán.  Chùm: nhiều hay ít, một chùm có nhiều hay ít hạt.  Hạt: to hay nhỏ, màu sắc hạt.  Thân và cành cây: sum suê hay thưa thớt.  Hiện tượng rụng trái non: nhiều hay ít.  Quả: to hay nhỏ, màu sắc, ngon hay dở.  Khả năng chống chịu sâu hại: cao hay thấp.  Khả năng chống chịu bệnh: cao hay thấp. 3.2.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu Sau khi chọn được cây điều có những đặc điểm nổi bật đáng quan tâm, chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá. Lấy khoảng 4 – 5 lá còn non hay lá đã trưởng thành, không lấy lá đã già, chọn những lá tốt, không bị rách hay bị sâu hại, lau sạch rồi cho vào bọc nilon đã ghi đầy đủ thông tin về mẫu và được giữ mát trong thùng đá. Sau đó mẫu được giữ trong ngăn đá tủ lạnh và sau vài ngày chúng tôi đem mẫu giữ ở tủ –20oC tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh thuộc Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM. 3.2.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm Trong phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành những công việc:  Thực hiện tách chiết và kiểm tra DNA của các mẫu lá điều thu thập được.  Thực hiện kỹ thuật RAPD.  Thực hiện kỹ thuật AFLP. 39 3.2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết và kiểm tra DNA lá điều  Phương pháp tách chiết: Tách chiết DNA dựa trên phương pháp của Doyle và Doyle (1988). Phương pháp này dựa vào tính chất của CTAB như đã trình bày. Quy trình tách chiết gồm 12 bước: Bước 1: Cân 0,2.g lá đã rửa sạch cho vào cối nghiền mẫu, cho vào 1,2.ml dịch trích EB để nghiền lá với dung dịch này. Vortex kỹ. Ủ ở 65oC trong 45 phút. Bước 2: Thêm 500 μl chloroform:isoamylalcohol (24:1), vortex 10 phút, li tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Bước 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bước 2. Bước 4: Chuyển lấy dịch trong, thêm vào 2 μl RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ. Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –200C trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Bước 6: Ly tâm 5 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Đổ bỏ dịch trong. Bước 7: Cho vào 300 μl TE 1X, ủ 37oC trong 1 giờ. Bước 8: Thêm 20 μl muối sodium acetate 3 M và 640 μl ethanol 96 % (hay 100 %), trộn đều và để –20oC trong 30 phút. Bước 9: Ly tâm 10 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Bước 10: Rửa cặn với 400 μl ethanol 70 % bằng cách ly tâm 2 phút 14.000 vòng/phút ở 10oC. Đổ bỏ dịch trong. Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút. Bước 12: Bảo quản mẫu ở 4oC.  Phương pháp kiểm tra DNA: Có 2 phương pháp kiểm tra DNA: Phương pháp đo mật độ quang phổ: Phương pháp này cho phép ước lượng tương đối chính xác lượng DNA cũng như chất lượng DNA có trong mẫu kết 40 quả thu được. Kết quả nếu giá trị tỉ số OD260 nm/OD280 nm trong khoảng 1,8 – 2,2 thì mẫu DNA tương đối sạch, có thể sử dụng được cho phản ứng PCR. Định lượng DNA theo công thức: Lượng DNA (ng/μl) = ( 62,9 x OD260 nm –36 x OD280 nm) x n với “n” là hệ số pha loãng. Phương pháp điện di: Phương pháp này cho phép ta đánh giá chất lượng DNA (có bị gãy nhiều hay không, có bẩn không,…) tuy nhiên không cho biết nồng độ của DNA thu được hay độ sạch của dung dịch DNA một cách chính xác. Điện di bằng gel agarose 1,0 %. Kết quả được đọc trên máy UV. 3.2.2.2. Kỹ thuật RAPD Tiến hành kỹ thuật PCR – RAPD với các primer (bảng 3.3). Bảng 3.3. Các primer sử dụng cho kỹ thuật PCR – RAPD. Các primer sử dụng Đặc điểm Primer 1 5 ’ TGCCGAGCTTG 3 ’ ; Tm = 40,7 o C; MW = 3.044. Primer 2 5 ’ AGTCAGCCAC 3 ’ ; Tm = 34,3 o C; MW = 2.997. Primer 9 5 ’ GGTACTCCCC 3 ’ ; Tm = 33,9 o C; MW = 2.964. Primer 11 5 ’ GAGACGCACA 3 ’ ; Tm = 35,3 o C; MW = 3.046. Trong quá trình thực hiện chúng tôi bố trí một số thí nghiệm nhằm tìm ra quy trình thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD phù hợp cho cây đìều:  Thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình do Samal và ctv (2003) đưa ra, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu trình nhiệt độ của thí nghiệm 1 được trình bày trong bảng 3.4. Thực hiện với 4 primer: 1; 2; 9 và 11. 41 Bảng 3.4. Thí nghiệm 1. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94oC – 4 phút. Lặp lại 45 chu kỳ: 94oC – 1 phút; 33oC – 1 phút(**); 72oC – 2 phút. 72oC – 10 phút. Giữ 4oC. (*): Dung dịch primer sử dụng có nồng độ 10 pmol/μl. (**): Nhiệt độ bắt cặp được ước lượng bằng công thức Ta = Tm – 2oC.  Thí nghiệm 2: Thực hiện giảm số chu kỳ nhiệt độ xuống còn 35 chu kỳ và giữ nguyên nồng độ các thành phần hoá chất như thí nghiệm 1 (bảng 3.5). Thực hiện với 4 primer: 1, 2, 9 và 11. Bảng 3.5. Thí nghiệm 2. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94oC – 4 phút. Lặp lại 35 chu kỳ: 94oC – 1 phút; 33oC – 1 phút(**); 72oC – 2 phút. 72oC – 10 phút. Giữ 4oC. 42  Thí nghiệm 3: Thực hiện tăng số chu kỳ nhiệt độ lên 37 chu kỳ, đồng thời giữ nguyên nồng độ các thành phần phản ứng như thí nghiệm 2 (bảng 3.6). Thực hiện với 4 primer: 1, 2, 9 và 11. Bảng 3.6. Thí nghiệm 3. Các mẫu thực hiện Thành phần (25 μl/ống) Chu trình nhiệt TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 Taq buffer 10 X 1,5 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 100 μM dNTPs 20 ng primer (0,65 μl) (*) 20 ng DNA khuôn Thêm nước đến 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút (**); 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. Giữ 4oC.  Thí nghiệm 4: Chúng tôi thực hiện 6 nghiệm thức thay đổi nồng độ các thành phần tham gia phản ứng (được trình bày trong bảng 3.7), đồng thời giữ nguyên chu trình phản ứng như thí nghiệm 3. Sử dụng primer 11, thực hiện với DNA của các mẫu TT1, TT4 và TT8. Chu trình phản ứng thí nghiệm 4: 94oC – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94oC – 1 phút; 33oC – 1 phút; 72oC – 2 phút. 72oC – 10 phút. 4oC – tùy ý. 43 Bảng 3.7. Thí nghiệm 4. TP MgCl2 25 mM Taq poly- merase 5 U dNTPs 10 mM Primer Nƣớc và DNA template Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (mM) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (U) Thể tích hút (μl) Nồng độ cuối (μM) Thể tích hút (μl) Lượng sử dụng (ng) NT1(ĐC) 1,5 1,5 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 2,5 μl Taq buffer 10x. Thêm nước sau cùng để đạt 25μl/ống. NT2 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,65 20 NT3 2 2 0,12 0,6 0,25 100 0,65 20 NT4 2 2 0,1 0,5 0,25 100 0,75 22 NT5 2 2 0,1 0,5 0,3 120 0,65 20 NT6 2 2 0,12 0,6 0,3 120 0,75 22 3.2.2.3. Kỹ thuật AFLP Thực hiện kỹ thuật AFLP với 8 mẫu DNA có chất lượng tốt (nồng độ DNA cao trên 100 ng/μl và tương đối sạch) là các mẫu: TT1, TT4, TT9, TT31, VT38, CĐ40, CĐ45, XM78.  Cắt giới hạn và gắn adapter: Kiểm tra phản ứng cắt DNA của enzyme: Sau khi có được DNA, bước đầu tiên là kiểm tra xem những enzyme cắt EcoRІ và MseІ có phù hợp với bộ gene đó hay không. Phản ứng cắt thử:  300 ng DNA bộ gene. NT 44  4 U enzyme EcoRI.  3 U enzyme MseI.  6 μl buffer 5 X. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở 37oC trong 2h, sau đó để 15 phút ở 70oC. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %. Thực hiện phản ứng cắt giới hạn và gắn adapter: - Thực hiện biến tính adapter để bảo đảm các adapter hoàn toàn tách ra khỏi nhau:  Ủ ống chứa adapter ở 95oC trong 5 phút.  Để nguội đến nhiệt độ phòng.  Ly tâm 1.400 vòng/phút. - Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 20 mẫu): Cho vào ống 200 μl:  2 μl buffer 5 X T4 DNA ligase có ATP.  2 μl 0,5 M NaCl.  1 μl BSA1mg/ml (làm loãng từ dung dịch gốc 10 mg/ml).  20 Unit MseI.  100 Unit EcoRI.  20 Weiss Unit T4 DNA ligase.  Cho thêm nước cất siêu sạch để được 40 μl. Trộn kỹ, ly tâm trong 10 giây. Luôn giữ trong đá. - Chuẩn bị phản ứng cắt và gắn: Cho vào ống 200 μl/phản ứng:  1 μl buffer T4 DNA ligase 10 X có ATP ( hay 2 μl đệm T4 DNA ligase 5 X có ATP).  1 μl NaCl 0,5 M.  0,5 μl BSA1mg/ml. 45  1 μl MseI adapter.  1 μl EcoRI adapter.  1 μl hỗn hợp enzyme đã chuẩn bị ở trên.  Cho thêm 0,5 μl mẫu (mẫu đối chứng cho 5,5 μl DNA từ KIT). Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay 37oC trong 2 giờ.  Nhân bản tiền chọn lọc: Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Pha loãng sản phẩm của phản ứng cắt và gắn adapter: Cho thêm 189 μl TE vào mỗi ống phản ứng cắt và gắn, bảo quản ở 4oC hay –20oC. - Trộn các thành phần sau trong ống 200 μl:  4 μl DNA đã cắt và pha loãng.  1 μl primer tiền nhân bản.  15 μl AFLP mix (P/N 402005). Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản tiền chọn lọc: bảng 3.8. Bảng 3.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Nhiệt độ và thời gian Chu trình Nhiệt độ và thời gian Nhiệt độ và thời gian Thực hiện 20 chu kỳ. 72 o C 2 phút. 94 o C 20 giây. 56 o C 30 giây. 72 o C 2 phút. 60 o C 30 giây. 4 o C giữ tùy ý. Kiểm tra sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc bằng gel agarose 1,5%. 46  Nhân bản chọn lọc: Để thực hiện bước này chúng tôi tiến hành chọn những tổ hợp primer EcoRI – MseI. Sau khi thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc xong, sản phẩm được điện di trên máy giải trình tự. Thành phần hỗn hợp phản ứng: - Chuẩn bị khuôn DNA:  10 μl sản phẩm tiền nhân bản.  190 μl đệm TE. Trộn kỹ, ly tâm 10 giây tốc độ thấp và giữ ở 4oC. - Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 12 tổ hợp primer nhân bản chọn lọc:  MseI + CAA – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAA – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAA – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAA – EcoRI + ACG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AAC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).  MseI + CAG – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).  MseI + CAG – EcoRI + AGC (phát màu vàng).  MseI + CAG – EcoRI + AAG (phát màu xanh lá cây). - Trộn hỗn hợp phản ứng:  3,0 μl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng.  1,0 μl primer MseI + Cxx (5 μM). 47  1,0 μl primer EcoRI + Axx đánh dấu huỳnh quang (1 μM).  15,0 μl hổn hợp AFLP (P/N 402005). (Luôn để hỗn hợp trong đá) Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản chọn lọc: bảng 3.9. Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc. Nhiệt độ, thời gian Chu trình Số chu kỳ 94 oC, 2 phút. 60 oC, 30 phút. 4 oC, giữ tùy ý. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 94 oC, 20 giây. 66 o C, 30 giây. 65 oC, 30 giây. 64 oC, 30 giây. 63 oC, 30 giây. 62 oC, 30 giây. 61 oC, 30 giây. 60 oC, 30 giây. 59 oC, 30 giây. 58 oC, 30 giây. 57 oC, 30 giây. 56 oC, 30 giây. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 72 oC, 2 phút. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 20 1 1  Điện di: Kết quả phản ứng nhân bản chọn lọc được điện di trên máy giải trình tự AB sequencer 3100. 48 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau thời gian thực hiện các thí nghiệm chúng tôi thu được một số kết quả: 4.1. Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Sau giai đoạn thu thập mẫu chúng tôi có được 80 mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và điển hình tại các địa phương thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu: Thành phố Vũng Tàu; Thị xã Bà Rịa; các huyện: Châu Đức, Long Điền, Long Đất, Tân Thành, Xuyên Mộc. Đặc điểm các mẫu được thống kê trong bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Đặc điểm cây chọn lấy mẫu Tỉ lệ % Năng suất Cao 79 % (63/80 mẫu) Thấp 21 % (17/80 mẫu) Hoa Ra nhiều hoa 90 % (72/80 mẫu) Ra ít hoa 10 % (8/80 mẫu) Ra hoa sớm 71 % (56/80 mẫu) Ra hoa muộn 29 % (24/80 mẫu) Ra hoa một đợt 55 % (44/80 mẫu) Ra hoa nhiều đợt 45 % (36/80mẫu) Hoa nở đồng loạt 59 % (47/80 mẫu) Hoa nở phân tán 41 % (33/80 mẫu) 49 Chùm Nhiều chùm 65 % (52/80 mẫu) Ít chùm 22 % (18/80 mẫu) Chùm có nhiều hạt 81 % (65/80 mẫu) Chùm có ít hạt 19 % (15/80 mẫu) Hạt To 73 % (58/80 mẫu) Nhỏ 27 % (22/80 mẫu) Thân và cành cây Sum suê 86 % (69/80 mẫu) Thưa thớt 14 % (11/80 mẫu) Hiện tƣợng rụng trái non Nhiều 22 % (18/80 mẫu) Ít 68 % (55/80 mẫu) Quả giả To 37 % (30/80 mẫu) Nhỏ 63 % (50/80 mẫu) Quả màu vàng 33 % (26/80 mẫu) Quả màu đỏ 67 % (54/80 mẫu) Quả ngon 23 % (18/80 mẫu) Quả dở 4 % (5/80 mẫu) Khả năng chống chịu sâu hại Cao 100 % (80/80 mẫu) Thấp 0 % (0/80 mẫu) Khả năng chống chịu bệnh Cao 76 % (62/80 mẫu) Thấp 24 % (18/80 mẫu) 50 Như vậy, thông qua điều tra và thu thập mẫu chúng tôi nhận thấy sự phân bố kiểu hình của cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu rất đa dạng. 4.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm 4.2.1. Kết quả tách chiết DNA 4.2.1.1. Kết quả chung Chúng tôi thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá điều thu thập được, kết quả có 55 mẫu đạt yêu cầu, đạt tỉ lệ khoảng 70 %. Chúng tôi chỉ sử dụng những mẫu DNA sau khi tách chiết điện di thấy có band và đo OD thấy giá trị OD từ 1,5 trở lên. Nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl. Chất lượng DNA được chia làm 2 nhóm:  Tỉ số OD từ 1,5 – 1,8: Có chất lượng trung bình, có 16/55 mẫu, chiếm 29 %.  Tỉ số OD từ 1,8 – 2,2: Có chất lượng tốt, có 39/55 mẫu, chiếm 71 %. Kết quả được minh họa trên hình 4.1. Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi trưởng thành. 4.2.1.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều  Đặc điểm: Sau khi tách chiết, DNA lá điều thường bị gãy nhiều (hình 4.1), có lẽ do tế bào lá điều có lớp thành tế bào dày và cứng, khó nghiền nên khi nghiền mạnh tay dễ làm gãy DNA. Lượng DNA thu được trong nghiên cứu này không cao, TT1 TT7 TT13 TT27TT33 CĐ45CĐ50 CĐ79 51 trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl, có thể do lá điều có nhiều chất thứ cấp khác như polyphenol, polypeptide,…gây khó khăn cho quá trình tách chiết. Một số mẫu có nồng độ DNA rất thấp (khoảng 30 ng/μl trở xuống) đều là của những mẫu lá non hay những lá đã trưởng thành nhưng còn mềm.  Khó khăn: Khó tách DNA từ lá điều còn non. Trong 80 mẫu thực hiện có 25 mẫu lá non cho kết quả tách chiết DNA không tốt (giá trị OD cao hơn 1,8 nhưng nồng độ DNA rất thấp, khi điện di không thấy kết quả). Lặp lại việc tách 25 mẫu lá non trên khoảng 2 – 3 lần nhưng vẫn không cho kết quả. Điều này có thể do lá non đang trong thời kỳ sinh trưởng mạnh nên nồng độ các hợp chất thứ cấp nhiều, ảnh hưởng không tốt đến việc tách chiết DNA, ngoài ra trong lá non hàm lượng nước cao làm cho số lượng DNA trong lá non ít hơn lá trưởng thành (hình 4.2). Hình 4.2 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi còn non  Biện pháp khắc phục: Đối với lá điều trưởng thành: Chúng tôi cũng đưa ra một số lưu ý khi thực hiện quá trình tách chiết: - Bước 1: Bước này cần phải giữ cho lá không bị khô trước khi nghiền, công đoạn nghiền phải đều tay, không nghiền mạnh. Sử dụng máy vortex khuấy trộn kỹ ở tốc độ thấp, khoảng 600 – 1.000 vòng/phút. TT16 TT20TT23 TT26TT28 TT30 52 - Bước 2: Thêm 500 μl chloroform : isoamylalcohol (24:1), sau đó có thể dùng máy vortex khuấy trộn ở tốc độ thấp như bước 1 hay chỉ cần đảo nhẹ trong khoảng 10 phút để hạn chế gãy DNA. - Bước 3: Chỉ nên hút khoảng 500 μl dịch ở bên trên, tránh chạm đầu tip vào phần ngăn cách giữa 2 pha vì đây là phần chứa nhiều protein bị loại bỏ. - Bước 4: Chỉ nên hút khoảng 250 – 300 μl dịch trích. - Bước 5: Thêm vào 250 μl dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở –20oC trong khoảng 1 giờ (nên để qua đêm). Nên lấy tỉ lệ DNA : dung dịch isopropanol lạnh = 1 : 1. - Bước7: Cho vào 300 μl TE 1 X, ủ 37oC trong 1 giờ. Có thể chỉ để khoảng 30 phút vì mục đích của bước này chỉ để cho DNA tan ra. - Bước 11: Lặp lại bước 10, để khô cặn, hòa tan cặn trong 100 μl TE 1 X, ủ ở 37oC trong 30 phút, phải để thật khô, không còn ethanol trong kết tủa DNA do ethanol ảnh hưởng xấu tới DNA và phản ứng PCR. Đối với lá điều non: Có thể tăng nồng độ các hóa chất có tác dụng làm kết tủa protein, peptide, polyphenol,…như CTAB, mercaptroethanol, chloroform,… và tăng lượng mẫu lá. 4.2.2. Kết quả thực hiện kỹ thuật RAPD, bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền và nhận diện một số band có thể là chỉ thị phân tử 4.2.2.1. Kết quả thí nghiệm 1: Thực hiện theo quy trình của các tác giả nƣớc ngoài Bước đầu chúng tôi đã thực hiện theo quy trình của Samal và ctv (2002) đưa ra nhưng không thấy kết quả với cả 4 primer đã dùng. Kết quả PCR – RAPD với primer 11 được trình bày trên hình 4.3. 53 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD primer 11 của thí nghiệm 1. Chúng tôi nhận định có thể do việc sử dụng hóa chất khác nguồn gốc nên việc áp dụng theo quy trình của các tác giả trên là không phù hợp. Mặt khác chúng tôi nhận thấy việc thực hiện tới 45 chu kỳ là quá nhiều, vì vậy chúng tôi đưa ra thí nghiệm 2 có 35 chu kỳ phản ứng và nồng độ các thành phần của phản ứng được giữ nguyên. 4.2.2.2 . Kết quả thí nghiệm 2: Giảm số chu kỳ xuống còn 35 chu kỳ và giử nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Sau khi thực hiện PCR – RAPD thu được kết quả với primer 1 và primer 11, trong khi primer 2 và 9 không có kết quả (hình 4.4). (A) (B) Hình 4.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 2 với primer 11 (A) và primer 2 (B). Chúng tôi nhận thấy phản ứng PCR với primer 1 và primer 11đã có sản phẩm nhưng mờ, không thể hiện được bản chất của kỹ thuật RAPD là cho nhiều band với TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 54 khả năng nhân bản lớn do sử dụng primer ngẫu nhiên, vì vậy chúng tôi thực hiện thí nghiệm 3: tăng số chu kỳ phản ứng lên 36 và 37 chu kỳ và giữ nguyên nồng độ các hoá chất. Đối với primer 2 và 9 không thấy kết quả, chúng tôi tiếp tục thực hiện với thí nghiệm 3. 4.2.2.3. Kết quả thí nghiệm 3: Tăng số chu kỳ lên 37 chu kỳ và giữ nguyên thành phần hoá chất nhƣ thí nghiệm 1 Thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ, với primer 1 và 11, số band xuất hiện nhiều hơn song còn mờ trong khi với primer 2 và 9 vẫn không có kết quả (hình 4.5). (C) (D) Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 3 với primer 11 (C) và primer 2 (D) Với primer 2 và 9 chúng tôi nhận thấy không có khả năng nhân bản DNA lá điều đã thu thập được, vì vậy chúng tôi không sử dụng 2 primer này ở các bước nghiên cứu tiếp theo. Với primer 1 và 11 chúng tôi nhận thấy primer 11 cho số band nhiều hơn và các band sáng hơn, do đó chúng tôi chọn primer 11 để tiến hành tiếp. Chúng tôi đã thử số chu kỳ nhiều hơn với primer 11song kết quả cũng không tốt hơn. Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm 4 bằng cách thay đổi nồng độ các hóa chất phản ứng và giữ nguyên 37chu kỳ. Chúng tôi nhận định vấn đề chủ yếu nằm ở việc tối ưu hóa nồng độ của MgCl2, nồng độ của Taq polymerase, dNTPs, primer, vì vậy chúng tôi đưa ra 5 nghiệm thức (NT) thay đổi nồng độ của MgCl2 kết hợp với việc thay đổi nồng độ của TT1TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 TT1 TT4 TT5 TT6 TT7 TT8 55 Taq polymerase, dNTPs, primer và 1 nghiệm thức giữ nguyên nồng độ các chất như ở thí nghiệm 3 để làm đối chứng (ĐC). 4.2.2.4 . Kết quả thí nghiệm 4: Thay đổi thành phần hóa chất, thực hiện phản ứng PCR qua 37 chu kỳ Tiến hành trên 3 mẫu TT1, TT4 và TT8, chúng tôi thu được kết quả, được trình bày trong hình 4.6. (E) (F) Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm PCR – RAPD của thí nghiệm 4 với primer 11 (E) và (F). Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 Nghiệm thức 4 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 TT1 TT4 TT8 56 Chúng tôi nhận thấy sau khi tăng nồng độ của MgCl2, phản ứng PCR có hiệu quả hơn nhiều, các nghiệm thức NT2, NT3, NT4, NT5, NT6 xuất hiện nhiều band hơn hẳn so NT1 và độ sáng của các band cũng tăng lên rõ rệt. Chúng tôi thấy NT5 và NT6 cho kết quả tốt hơn cả, trong khi NT6 tăng cả MgCl2, Taq polymerase, dNTPs và primer thì NT5 chỉ tăng MgCl2 và dNTPs, đồng thời sau một vài lần thực hiện lặp lại NT5 chúng tôi thấy NT5 cho kết quả khá ổn định, do đó chúng tôi thống nhất chọn NT5 để thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho tất cả các mẫu ly trích được DNA. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD được trình bày trong bảng 4.2. Bảng 4.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD. Thành phần hóa chất (25 μl/ống) Chu trình nhiệt Taq buffer 10 X 2 mM MgCl2 0,5 U Taq polymerase 120 μM dNTPs 20 ng primer11 20 ng DNA khuôn. Thêm nước để đạt 25 μl. 94 o C – 4 phút. Lặp lại 37 chu kỳ: 94 o C – 1 phút; 33 o C – 1 phút; 72 o C – 2 phút. 72 o C – 10 phút. 4 o C – giữ. 4.2.2.5. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR – RAPD trên các mẫu DNA thu đƣợc Khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD với 50 mẫu DNA, kết quả có 41/50 mẫu có kết quả, đạt tỉ lệ 82 %. Những mẫu không có kết quả, khi so sánh với kết quả tách chiết DNA chúng tôi nhận thấy những mẫu này có nồng độ DNA rất thấp (dưới 30 ng/μl), vì vậy chúng tôi nghi ngờ rằng trong khi hút DNA để thực hiện PCR – RAPD, do nồng độ quá thấp nên đã không hút đủ lượng DNA cần thiết. Các kết quả điện di được trình bày trong hình 4.7, 4.8 và 4.9. 57 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT1 – TT13. Hình 4.7 là kết quả điện di các mẫu từ TT1 – TT13 cho thấy có 3 band đồng hình và 6 band đa hình. Band đồng hình là những band có ở tất cả các mẫu, band đa hình là những band có ở mẫu này mà không có ở mẫu kia. Trên hình 4.7 ta thấy mẫu TT1 không có band 750 base pairs, 2300 base pairs, TT5 không có band 1600 base pairs, TT6 không có band 1600 base pairs. Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT14 – TT25 Từ hình 4.8 chúng tôi nhận thấy có mẫu TT24 và TT25 cho kết quả không tốt, vì vậy chúng tôi không sử dụng làm kết quả đánh giá đa dạng di truyền. TT14 TT15 TT17TT19 TT21 TT22 TT24 TT25 La Kết quả PCR – RAPD không tốt TT01 TT04 TT05 TT06 TT07 La TT08 TT09 TT10 TT11 TT12 TT13 Band khó xác định Band đa hình Band đồng hình 58 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27 – XM79. Chúng tôi chia hình 4.9 ra thành 2 hình cho dễ phân tích: hình 4.9A và 4.9B. Hình 4.9A Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR – RAPD các mẫu từ TT27–CD53. Khi sử dụng kỹ thuật RAPD với 11 primer để đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống điều (Samal và ctv, 2002) thì với primer 11 đã thu được 11 band trong đó có 9 band đa hình và 2 band đồng hình, điều này chứng tỏ primer 11 cho kết quả có tính đa hình cao và khá ổn định [7] [15]. TT TT TT TT TT VT CD CD La CD CD CD CD BR BR BR CD 27 29 31 33 36 38 39 40 41 43 44 45 46 49 50 53 Band đa hình 59 Hình 4.9B Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR– RAPD các mẫu từ XM61– M79. Vì một số band khó nhận biết bằng mắt thường nên chúng tôi sử dụng công cụ Detectband của phần mềm Quantity One 4.2.1 trong máy Geldoc để phát hiện band. Hình 4.10 Màn hình phát hiện band các kết quả PCR – RAPD. Chúng tôi đã phát hiện được 3/11 band đồng hình, chiếm tỉ lệ khoảng 27,3 % tổng số các band được phát hiện, có độ dài khoảng 550 base pairs, 900 base pairs và 1050 base pairs. La CĐ CĐ CĐ CĐ BR BR BR TT La XM XM XM XM XMXMXMXM a 41 43 44 45 46 49 50 53 61 64 70 72 76 77 78 79 60 Đối với tất cả các mẫu đã thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 8/11 band đa hình được phát hiện, chiếm tỉ lệ 72,7 % tổng số các band được phát hiện. Đặc điểm của các band đa hình được trình bày trong bảng 4.3. Bảng 4.3. Các band đa hình và mối liên quan với các đặc điểm của cây lấy mẫu. Các band Số lƣợng mẫu có Những đặc điểm chung của những cây có tạo band đa hình 600 base pairs 17/41 mẫu, tỉ lệ 41 %. Có đến 16/17 mẫu là của những cây cho rất nhiều hoa, ra hoa sớm và năng suất rất cao, vì vậy chúng tôi giả thuyết có thể band 600base pairs là chỉ thị phân tử của những tính trạng ra hoa sớm, rất nhiều hoa và năng suất rất cao. 700 base pairs 2/41 mẫu, tỉ lệ 5 %. Mẫu CĐ39 và CĐ41 giống nhau và khá đặc biệt so với những mẫu khác, trong đó có tính trạng trái đỏ, rất ngon nhưng ít hạt. Chúng tôi giả định có thể band 700base pairs này là chỉ thị của tính trạng trái đỏ và rất ngon. 750 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 1200 base pairs 25/41 mẫu, tỉ lệ 61 %. Chưa xác định. 1400 base pairs 27/41 mẫu, tỉ lệ 66 %. Chưa xác định. 1600 base pairs 26/41 mẫu, tỉ lệ 63 %. Chưa xác định. 1900 base pairs 35/41 mẫu, tỉ lệ 85 %. Chưa xác định. 2300 base pairs 30/41 mẫu, tỉ lệ 73 %. Chưa xác định. Khi điện di bằng gel agarose, độ dài của các band sẽ không thật sự chính xác do những hạn chế của gel agarose. Những band trên bản điện di có thể không hoàn toàn bằng nhau nhưng không thể phát hiện bằng mắt thường. Có thể giải trình tự của 61 những band đa hình này để biết chính xác độ dài và trình tự của chúng có thật sự bằng nhau hay không. Trong 8 band đa hình mà chúng tôi phát hiện được, các band 600 base pairs, 700 base pairs là 2 band rất đáng quan tâm, có thể giải trình tự và sử dụng như những chỉ thị phân tử để phân biệt những cây có những tính trạng đáng quan tâm (thống kê ở bảng 4.3). 4.2.2.6. Đánh giá quy trình phản ứng PCR – RAPD Quy trình thực hiện phản ứng PCR – RAPD khá ổn định, cho nhiều band, có độ phân giải và độ sáng khá tốt, song còn một số vấn đề:  Khả năng nhân bản qua phản ứng PCR cao, tuy nhiên khả năng làm phát sinh chỉ thị phân tử lại thấp, thể hiện ở mức độ giống nhau về số lượng và độ dài các band trong tổng số các mẫu thực hiện PCR – RAPD thành công. Như vậy, hiệu quả phát hiện chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD có hạn chế.  Một số mẫu không ra kết quả tốt: Chúng tôi nhận thấy một điều là những mẫu ra kết quả không tốt là những mẫu lá trưởng thành nhưng còn mềm, có nồng độ DNA ly trích được rất thấp (chỉ khoảng 20 – 30 ng/μl). Với những mẫu này có thể thực hiện lại và có thể cho nhiều hơn 1 μl DNA khuôn vào hỗn hợp phản ứng.  Một số band tách không rõ: Có thể trong quá trình điện di, các band có độ dài gần bằng nhau nên khó tách ra rõ ràng. Chúng tôi sử dụng nồng độ 2 % agarose và điện di ở 50 V trong 1 h cho độ phân tách cao hơn, đồng thời điện di trong bồn lớn hơn xong vẫn gặp một số khó khăn, điển hình là các band di chuyển không đều, có thể do điện cực bị cong hay do hiệu ứng thành máy điện di ảnh hưởng đến sự di chuyển của các DNA. Những mẫu này nên thực hiện lại phản ứng PCR hay chạy điện di lại, cho lượng mẫu nhiều hơn và chỉnh sửa máy điện di có thể cho kết quả tốt hơn. 4.2.2.7. Phân tích kết quả phản ứng PCR – RAPD bằng phần mềm NTSYS Kết quả phát hiện band được đem sử lý bằng phần mềm NTSYSpc2.1. Các band được mã hoá dạng nhị phân, theo nguyên tắc có band thì ghi 1 và không có band thì ghi 0 (phụ lục 5). Kết quả được hiển thị theo dạng số liệu và dạng cây di truyền. 62 4.2.2.8. Đánh giá đa dạng di truyền Đánh giá đa dạng di truyền thông qua cây di truyền dựa trên các yếu tố:  Hệ số tương đồng di truyền.  Mức độ phân nhánh của cây di truyền. Trên địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, các huyện Tân Thành, Xuyên Mộc và Châu Đức có diện tích trồng điều nhiều nhất, vì vậy chúng tôi chủ yếu thu thập mẫu ở những huyện này. Khi đánh giá đa dạng di truyền của cây điều của từng huyện chúng tôi có các kết quả sau: Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Châu Đức: Có 7 mẫu có kết quả PCR – RAPD, kết quả đánh giá đa dạng di truyền được hiển thị theo dạng bảng và dạng cây di truyền (hình 4.11 và 4.12). Hình 4.11. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền dạng số liệu NTSYS đối với các mẫu thu được tại huyện Châu Đức. Bảng số liệu hiển thị mức độ tương quan di truyền giữa các mẫu một cách chính xác và cụ thể, song không tiện để đánh giá tổng thể nhiều mẫu nên thường sử dụng dạng cây di truyền để phân tích. 63 Hình 4.12. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Châu Đức. Các mẫu cây điều thu được ở huyện Châu Đức chia làm 2 nhánh riêng biệt, có mức độ tương đồng về di truyền khoảng 52 %. Nổi bật là CD39 và CD44 giống nhau đến khoảng 91 %, trong khi CD39 cho năng suất không cao nhưng CD44 lại cho năng suất rất cao. Các mẫu có mức độ giống nhau từ 73 % - 91 %, chia ra làm 5 nhánh nhỏ (trung bình 1,4 mẫu/nhánh). Nhận xét chung là tính đa dạng di truyền ở mức trung bình khá. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Xuyên Mộc (hình 4.13): Các mẫu cây điều thu được ở huyện Xuyên Mộc chia làm 2 nhánh khác biệt, có mức độ tương đồng di truyền khoảng 61 %. Điểm đặc biệt là các cây thu thập được mẫu của huyện Xuyên Mộc đều có tính chất chung là năng suất rất cao nhưng lại thuộc những nhánh khác biệt nhau, dù mức độ khác biệt không cao (từ 80 % – 90 %). Cây di truyền chia ra làm 6 nhánh, trung bình 1,3 mẫu/nhánh). Các cây điều ở huyện Xuyên Mộc có thể có mức độ đa dạng cao hơn huyện Châu Đức. 0,52 0,62 0,71 0,81 0,91 Coefficient CD39 CD44 CD40 CD43 CD45 CD41 CD53 64 Hình 4.13. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Xuyên Mộc. Đa dạng di truyền của cây điều ở huyện Tân Thành (hình 4.14). Hình 4.14. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở huyện Tân Thành. 0,68 0,76 0,84 0,92 1,0 Coefficient TT1 TT29 TT31 TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 TT21 TT6 TT8 TT33 TT9 TT14 TT5 TT13 TT15 TT19 TT17 TT27 TT36 0,61 0,71 0,81 0,90 1,0 Coefficient XM61 XM64 XM70 XM72 XM78 XM76 XM77 XM79 65 Các mẫu cây điều thu được ở huyện Tân Thành chia ra làm 2 nhánh tương đồng di truyền khoảng 68 %, tuy chia ra nhiều nhánh nhỏ (12 nhánh, trung bình 1,8 mẫu/nhánh) nhưng lại có mức độ tương đồng di truyền khá cao, do có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau về di truyền và một số mẫu có mức độ tương đồng di truyền khá cao (80 % - 90 %), vì vậy mức độ đa dạng di truyền chỉ ở mức trung bình. Đặc biệt có TT12 có tính trạng ra hoa nhiều nhưng trễ, rụng trái non nhiều lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT10, TT22 ra hoa sớm và ít rụng trái non. Tương tự, TT13 cũng mang những tính trạng hoàn toàn khác biệt so với TT15 và TT19 nhưng 3 mẫu này lại hoàn toàn tương đồng nhau về di truyền. Các cây điều thu được ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu: Đây là 2 nơi chúng tôi thu thập được ít mẫu nhất do diện tích canh tác rất ít và phân tán, do vậy không phát hiện được những cá thể nổi trội (hình 4.15). Hình 4.15. Cây di truyền các cây điều đã lấy mẫu ở Thị xã Bà Rịa và Thành phố Vũng Tàu. Tóm lại, bước đầu chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại các địa phương trong tỉnh chỉ ở mức trung bình. Để giải thích điều này có nhiều lý do, song chúng tôi nhận định một lý do chủ yếu là: Địa bàn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có điều kiện tự nhiên (đất đai và khí hậu) phù hợp cho việc canh tác cây điều với mục đích kinh tế là chính, vì vậy nông dân thường chọn mua cây giống có chất lượng tốt từ các công ty giống hay chọn những cây mẹ có chất lượng tốt nhất lấy hạt làm giống, vì vậy làm cho quần thể điều của tỉnh có mức độ tương đồng di truyền cao. 0,60 0,63 0,65 0,67 0,70 Coefficient VT38 BR46 BR49 BR50 66 Qua phỏng vấn nông hộ chúng tôi nhận thấy người nông dân thích chọn những cây điều có những đặc điểm: năng suất cao, ra hoa nhiều (tốt nhất là ra hoa nhiều và sớm để tránh bị ảnh hưởng của sương muối và thời tiết quá khô hạn) và hạt to. Chúng tôi thực hiện đánh giá mức độ đa dạng di truyền của những đặc điểm này và thu được kết quả: Với đặc điểm cho năng suất cao: Trong 41 mẫu thực hiện thành công phản ứng PCR – RAPD có 31 mẫu cho năng suất rất cao. Mức độ đa dạng di truyền được đánh giá thông qua cây di truyền (hình 4.16). Hình 4.16. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho năng suất cao. 0,57 0,68 0,79 0,89 1,00 Coefficient TT1 TT29 CD44 BR49 TT4 TT6 TT8 TT10 TT11 TT22 XM72 XM78 TT33 BR50 CD53 XM76 TT15 TT17 TT27 XM64 XM70 TT5 TT19 TT36 XM77 BR46 TT31 CD45 CD43 CD40 XM79 67 Với đặc điểm cho năng suất cao, các cây điều của tỉnh chia ra làm 2 nhánh lớn có mức độ tương đồng khoảng 57 %, trong đó các nhánh lại phân thành nhiều nhóm nhỏ khác. Mặc dù được phân thành nhiều nhóm nhỏ (21 nhóm, trung bình 1,5 mẫu/nhóm) nhưng các cá thể cùng nhóm lại có mức độ tương đồng khá cao (như CD40 và XM79 có mức độ tương đồng khoảng 90 %). Những cá thể điều cho năng suất cao ở huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao, có thể đến 100 % (theo hướng mũi tên trên hình 4.16). Vì vậy, nhận xét chung của chúng tôi là tính đa dạng của các cây điều cho năng suất cao tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu ở mức trung bình, có nghĩa là các cây điều cho năng suất cao ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có mức độ tương đồng về bản chất di truyền cao, điều này có thể giải thích dựa vào cách nông dân nhân giống điều và sử dụng cây giống của các công ty giống cây trồng. Điều này chứng tỏ nông dân trong tỉnh đã có ý thức khá tốt về việc canh tác cây điều, rất thuận lợi cho chiến lược phát triển cây điều cao sản của tỉnh. Với đặc điểm cho hạt to: Cây di truyền biểu hiện 15 mẫu của những cây cho hạt rất to (hình 4.17). Hình 4.17. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm cho hạt to. 0,59 0,69 0,80 0,90 1,0 Coefficient TT1 TT33 BR49 CD39 TT5 TT13 TT7 TT14 CD45 CD53 XM64 XM70 XM72 XM76 CD41 68 Đặc điểm cho hạt rất to chia ra làm 2 nhánh có mức tương đồng di truyền khoảng 59 %, trong đó các cá thể trong từng nhánh nhỏ có mức tương đồng khá cao (từ 65 % - 100%). Cây di truyền chia ra làm 14 nhánh, trung bình 1,1 mẫu/nhánh. Điều này nói lên tính đa dạng di truyền cao của các cá thể mang đặc điểm cho hạt to. Đặc điểm hạt to được người nông dân rất ưa chuộng, do bán được giá cao hơn so với hạt nhỏ, còn có thể cho năng suất cao hơn nếu như cây cho nhiều hoa và đậu nhiều quả. Đặc điểm ra hoa nhiều: Cây di truyền thể hiện 22 mẫu các cây ra hoa nhiều (hình 4.18). Hình 4.18. Cây di truyền của các cây điều đã lấy mẫu có đặc điểm ra hoa nhiều. Cây di truyền phân thành 2 nhánh có mức độ tương đồng di truyền khoảng 66 %. Chúng tôi vẫn thấy các cây điều tại huyện Tân Thành có mức độ tương đồng rất cao (hướng mũi tên), TT12 cho hoa nhiều nhưng rất trễ nhưng lại hoàn toàn giống với TT4, TT7, TT22 cho hoa rất sớm. Cây di truyền chia ra làm 13 nhánh, trung bình 1,7 0,66 0,75 0,83 0,92 1,0 Coefficient TT4 TT7 TT10 TT11 TT12 TT22 XM72 XM78 BR50 XM76 TT27 XM64 XM70 XM79 TT13 TT15 TT17 BR46 XM77 TT29 TT31 CD41 69 mẫu/nhánh, các mẫu tương đồng nhau từ 73 % - 100 %. Đánh giá chung tính đa dạng di truyền của đặc điểm ra hoa nhiều chỉ ở mức trung bình. Như vậy, khi đánh giá tính đa dạng di truyền của các cây điều dựa trên những đặc điểm nổi bật chúng tôi thấy mức độ tương đồng về di truyền của các cá thể đối với từng đặc điểm nổi bật vẫn rất cao, đồng thời nhận thấy các cây điều của huyện Tân Thành có đặc điểm cho năng suất cao liên quan chặt chẽ với đặc điểm ra hoa nhiều. Cây điều của huyện Tân Thành có mức độ tương đồng di truyền rất cao, ở cả 3 đặc điểm: cho năng suất cao, hạt to và ra nhiều hoa. 4.2.2.9. Đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chúng tôi đã tiến hành đánh giá đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu trên cơ sở các mẫu đã thu thập (hình 4.19). Quần thể điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu về di truyền được chia ra làm 2 nhánh I và II có mức độ tương đồng di truyền khoảng 59 %. Trong đó:  Nhánh I chia ra làm 2 nhánh nhỏ hơn: IB chỉ có BR49 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 75 % với IA gồm 4 mẫu. Tại nhánh IA có CD39 có những đặc điểm khác biệt hoàn toàn so với CD44 nhưng 2 mẫu này lại giống nhau đến khoảng 92 %.  Tại nhánh II, chia ra làm 2 nhánh IIA và IIB. Nhánh IIB chỉ có CD41 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 62 % với nhánh IIA – nhánh có nhiều mẫu nhất. Nhánh IIA chia thành 2 nhánh nhỏ hơn IIA1 và IIA2 có mức độ tương đồng di truyền khoảng 72 %. Các mẫu có thể có những đặc điểm giống nhau (năng suất cao, hạt to, chống chịu sâu bệnh tốt,…) nhưng lại có bản chất di truyền giống nhau khoảng 75 % đến 100 % (TT5, TT17, TT36, XM77,…). Ngược lại, có những mẫu có một số tính trạng hoàn toàn trái ngược nhau nhưng lại hoàn toàn giống nhau về di truyền (TT12 ra hoa nhiều nhưng nở trễ, rụng nhiều trái non lại được xếp chung với TT10, TT11, TT22,…không mang đặc điểm giống TT12). 70 Hình 4.19. Cây di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Theo như cây di truyền, quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu được chia thành 26 nhánh, trung bình mỗi nhánh có 1,6 mẫu, có mức độ tương đồng di truyền từ 59 % đến 100 %. Theo đánh giá của chúng tôi thông qua kỹ thuật RAPD, quần thể 0,59 0,69 0,79 0,90 1,0 Coefficient I II IIA IIB IIA2 IIA1 IIA1.1 IIA1.2 IA IB 71 điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tính đa dạng di truyền ở mức từ trung bình đến trung bình khá. Chúng tôi nhận thấy quần thể điều tại huyện Tân Thành có mức độ phân bố rộng nhất, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao nhất, thể hiện ở điều có nhiều mẫu hoàn toàn giống nhau (hướng mũi tên). Quần thể cây điều tại huyện Xuyên Mộc cũng có mức độ đa dạng di truyền khá cao, đồng thời có bản chất di truyền giống với quần thể điều của huyện Tân Thành. Quần thể điều ở huyện Châu Đức có mức độ đa dạng khá cao, biểu hiện ở mức độ phân bố phân tán rộng trên cây di truyền, đồng thời bản chất di truyền cũng khá gần với quần thể điều ở huyện Tân Thành. Như vậy, với mức độ đa dạng di truyền cao cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc khá đa dạng, đồng thời có mức độ tương đồng di truyền cao với các quần thể điều của các huyện khác cho thấy quần thể điều của các huyện Châu Đức, Tân Thành, Xuyên Mộc có thể có khả năng thích nghi cao với những điều kiện canh tác của các huyện khác nói riêng và của toàn tỉnh nói chung. Công tác chọn giống nên tập trung tại 3 huyện này, nếu có khả năng chọn được giống điều tốt nhất tại 3 huyện này thì khả năng phổ biến giống tốt nhất này trên địa bàn toàn tỉnh có thể rất lớn. Tính đa dạng di truyền của các đặc điểm nổi bật có liên quan đến hiệu quả kinh tế cũng được đánh giá là trung bình, vì vậy có thể nói, tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu có tiềm năng lớn để phát triển cây điều có chất lượng cao và đồng đều trên địa bàn toàn tỉnh, rất thuận lợi cho các công việc phổ biến kỹ thuật canh tác. Công việc sau thu hoạch cũng thuận lợi hơn do sử dụng công nghệ đồng bộ để chế biến hạt điều, sủ dụng một loại tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng nhân điều thành phẩm, góp phần làm tăng và ổn định giá trị nhân điều thành phẩm. 4.2.2.10. Hạn chế của kết quả đánh giá đa dạng di truyền bằng kỹ thuật PCR – RAPD Kết quả đánh giá đa dạng di truyền chưa thực sự chính xác và đầy đủ, bắt nguồn từ những nguyên nhân sau:  Số lượng mẫu thu thập được chưa đủ để thể hiện thực tế, chưa mang tính đại diện cao. 72  Kết quả ly trích DNA không tốt, chỉ thực hiện phản ứng PCR – RAPD cho 50 mẫu, thu được kết quả của 41 mẫu. Các mẫu không tách chiết được DNA chủ yếu thuộc huyện Châu Đức và Xuyên Mộc, làm ảnh hưởng đến kết quả chung do đây là 2 huyện có diện tích trồng điều nhiều nhất tỉnh.  Phản ứng PCR – RAPD chưa hoàn thiện.  Do những hạn chế của kỹ thuật điện di bằng agarose không cho độ phân tách cao, độ dài của các band có thể không bằng nhau nhưng không thể phân biệt được bằng mắt thường nên có thể nhận định sai độ dài của band. 4.2.3. Kết quả thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA lá điều 4.2.3.1. Kết quả cắt giới hạn và gắn adapter (hình 4.20) Hình 4.20. Kết quả phản ứng cắt và gắn adapter. Chúng tôi thấy có dấu hiệu sự cắt và gắn adapter một số đoạn có kích thước khác nhau trải dài trên bản điện di. Số lượng các đoạn tạo ra có thể là rất lớn. 4.2.3.2. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc (hình 4.21) TT1 TT31 CD40 TT78 TT4 TT9 VT38 CD45 ĐC 73 Hình 4.21. Kết quả phản ứng nhân bản tiền chọn lọc. Trên bản điện di có dấu hiệu sự nhân bản tiền chọn lọc một số phân đoạn. 4.2.3.3. Kết quả thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc Sử dụng máy giải trình tự gene AB Applied Biosystem 3100 điện di sản phẩm phản ứng nhân bản chọn lọc. Các đoạn DNA được nhân bản được hiển thị dạng peak đồng thời cho ta biết độ dài của đoạn. Kết quả được minh họa trên hình 4.23. Hình 4.22. Kết quả AFLP điện di trên máy AB sequencer 3100. Kết quả điện di AFLP cho thấy có sự khác biệt rõ ràng giữa các mẫu, các đoạn nhân bản chọn lọc được tạo ra có thể phân biệt với nhau đến từng nucleotide, giúp phát TT1 TT31 CD40 XM78 TT4 TT9 VT38 CD45 74 hiện sự khác biệt rất rõ ràng mà phương pháp điện di truyền thống không thể có được. Chiều dài các đoạn tạo ra có độ tin cậy lớn do mức độ lặp lại hoàn toàn giống nhau giữa các mẫu cao, được ước lượng bằng cách so sánh vị trí tương đối của các đoạn nhân bản chọn lọc với thang chuẩn. Tuy nhiên vẫn còn nhiều những đoạn ngắn khoảng dưới 100 basepairs (không được lấy làm kết quả do không có độ tin cậy cao), cho thấy kỹ thuật AFLP trên DNA cây điều vẫn còn phải được tiến hành hoàn thiện hơn nữa. 4.2.3.4. Phân tích kết quả AFLP trên một số mẫu DNA lá điều Kết quả cho thấy có 4 tổ hợp primer cho số band nhiều nhất, được trình bày trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả thực hiện AFLP trên một số mẫu DNA lá điều. Tổ hợp primer nhân bản chọn lọc Tổng số band tạo ra Band đồng hình Band đa hình MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green) 36 1 (2,8 %) 35 (97,2 %) MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green) 14 1 (7,3 %) 13 (92,7 %) Từ kết quả AFLP chúng tôi nhận thấy một số điều sau:  Tổng số band tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD, do đó làm tăng khả  Các đoạn tạo ra có chiều dài ngắn, dưới 500 basepairs.  Có thể phân biệt được những đoạn chỉ hơn kém nhau đến 1 nucleotide, điều này làm tăng độ tin cậy năng chính xác khi phân tích kết quả để đánh giá đa dạng di truyền.của kết quả. 75  Mức độ phát hiện các band đa hình cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD. Theo kết quả điện di giải trình tự (danh sách các band của các tổ hợp primer nhân bản chọn lọc được trình bày trong phụ luc), chúng tôi nhận thấy một số band đặc biệt:  Với 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green), kết quả thu được 36 band, trong đó chúng tôi nhận thấy các band 127 base pairs, 224 base pairs, 255 base pairs, 307 base pairs và 309 base pairs chỉ có ở mẫu CD45, có thể là chỉ thị phân tử cho tính trạng quả nhỏ ở mẫu CD45. Band 223 base pairs chỉ có ở mẫu VT8, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng ít hạt chỉ có ở mẫu VT8. Band 456 base pairs chỉ có ở mẫu TT4, có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả rất nhỏ, còn xanh mà đã già chỉ có ở mẫu TT4.  Với 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green), kết quả thu được 14 band, trong đó chúng tôi nhận thấy band 181 base pairs và band 254 base pairs chỉ có ở mẫu TT31 có thể là chỉ thị phân tử của tính trạng quả vàng của mẫu TT31. Các band này nếu được tiếp tục nghiên cứu (giải trình tự,…) có thể cho một số thông tin quan trọng liên quan đến tính trạng hạt to và một số tính trạng khác. Chúng tôi đã tiến hành phân tích đa dạng di truyền của từng tổ hợp primer khác nhau. Sử dụng phần mềm NTSYS chúng tôi xây dựng được 2 cây di truyền như hình 4.23 và 4.25:  Hình 4.23 là cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACT (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + AGG (Green). 76 Hình 4.23. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất. Qua hình 4.23 chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của các mẫu đã hạ thấp xuống chỉ còn từ 37 % – 61 %, đồng thời các mẫu đều thuộc các nhánh riêng biệt, điều này cho ta thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38 và CD45 là khá cao. Chúng tôi tiến hành so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.24). Hình 4.24. Cây di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD. Chúng tôi nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện RAPD khá cao, từ 70 % – 90 %, cao hơn hẳn so với khi sử dụng kỹ thuật AFLP. Như TT9 và VT38 giống nhau tới 90 % theo RAPD, nhưng chỉ 61 % theo AFLP. Như vậy, mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT4, TT9, VT38, CD45 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với kỹ thuật RAPD. 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 0,37 0,43 0,49 0,55 0,61 Coefficient TT4 CD45 TT9 VT38 77  Hình 4.25 là cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 thực hiện với tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ hai gồm 2 tổ hợp: MseI + CAA – EcoRI + ACA (Blue) và MseI + CAA – EcoRI + ACG (Green). Hình 4. 25. Cây di truyền kết quả AFLP tổ hợp thứ hai. Tương tự như tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thứ nhất, mức độ tương đồng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40 và XM78 từ 45 % - 65 %, đồng thời thuộc 4 nhánh khác nhau, cho thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khá cao. Chúng tôi cũng thực hiện so sánh với mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu này khi thực hiện bằng kỹ thuật RAPD (hình 4.26). Hình 4.26. Cây di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện RAPD. Chúng tôi cũng nhận thấy mức độ đa dạng di truyền của 4 mẫu TT1, TT31, CD40, XM78 thực hiện theo kỹ thuật AFLP cao hơn so với thực hiện theo kỹ thuật RAPD do nhận thấy mức độ tương đồng di truyền của RAPD cao hơn so với AFLP. 0,45 0,50 0,55 0,60 0,65 Coefficient TT1 CD40 XM78 TT31 0,60 0,65 0,70 0,75 0,80 Coefficient TT1 XM78 TT31 CD40 78 4.2.3.5. Đánh giá hiệu quả của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD Sau khi so sánh kết quả của kỹ thuật AFLP với kết quả cảu kỹ thuật RAPD, bước đầu chúng tôi nhận định những đặc điểm nổi bật của kỹ thuật AFLP so với kỹ thuật RAPD là:  Tổng số sản phẩm khuếch đại tạo ra của kỹ thuật AFLP nhiều hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD.  Mức độ phát hiện đa hình của kỹ thuật AFLP cao hơn hẳn so với kỹ thuật RAPD do có khả năng phân biệt độ dài các đoạn rất cao.  Kỹ thuật AFLP có khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền với độ tin cậy cao hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.  Kỹ thuật AFLP có khả năng tốt hơn trong việc phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao hơn so với kỹ thuật RAPD. Tuy nhiên khi tiến hành kỹ thuật AFLP có một số khó khăn hơn so với kỹ thuật RAPD, đó là quy trình tiến hành mất nhiều thời gian, chi phí cao và máy móc thiết bị phức tạp khó thao tác. 79 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Qua quá trình thực hiện các thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 5.1.1. Phần thu thập mẫu Thu thập được mẫu lá từ 80 cá thể nổi trội và đã thu thập các dữ liệu có liên quan của tất cả các cá thể này. 5.1.2. Phần tách chiết DNA Chúng tôi đã tiến hành tách chiết 80 mẫu lá thu thập được, kết quả thu được 55 mẫu cho nồng độ DNA trung bình khoảng 70 – 80.ng/μl. Chúng tôi nhận thấy DNA lá điều sau khi tách chiết thường bị gãy nhiều, nồng độ DNA thấp và rất khó tách được DNA của lá điều non. 5.1.3. Phần kỹ thuật RAPD, đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử Nói chung, phản ứng PCR – RAPD sử dụng primer 11 mà chúng tôi thực hiện là khá ổn định, khả năng nhân bản cao. Đã nhận biết được những band có độ dài khoảng