Khảo sát tính an toàn của viên nang cứng ngưu tất - đan sâm - Tam thất trên thực nghiệm

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 250 KHẢO SÁT TÍNH AN TOÀN CỦA VIÊN NANG CỨNG NGƯU TẤT – ĐAN SÂM - TAM THẤT TRÊN THỰC NGHIỆM Nguyễn Thanh Tuấn*, Nguyễn Thị Sơn**, Trần Kim Trang*** TÓM TẮT Mục đích nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm được thực hiện để xác định tính an toàn của viên MIX, một chế phẩm kết hợp dược liệu (Ngưu tất, Đan sâm, Tam thất), nhằm bổ sung vào danh mục thuốc điều trị hạ lipid máu có nguồn gốc từ thảo dược. Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Viên MIX bào chế tại Công ty cổ phần Dược Lâm Đồng (LADOPHAR). Nghiên cứu thực nghiệm khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên MIX trên chuột nhắt trắng. Khảo sát độc tính cấp: Chuột chia thành nhiều lô, mỗi lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Đánh giá dựa vào phản ứng sống hay chết nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Theo dõi tiếp 14 ngày ghi nhận triệu chứng bất thường. Khảo sát độc tính bán trường diễn: Lô thử nghiệm cho chuột uống thuốc liều 4 viên/kg liên tục trong 2 tháng, thực hiện song song với lô chứng uống nước cất. Lấy máu xét nghiệm trước và sau thử nghiệm, xét nghiệm đại thể (gan, tim, thận) sau kết thúc thử nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá: Trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ quan, huyết học, chức năng gan, chức năng thận. Kết quả: Với liều 32 viên/kg thể trọng chuột là liều cao nhất có thể bơm qua kim mà không làm chết chuột. Theo dõi chuột thử nghiệm trong vòng 72 giờ và tiếp tục trong 14 ngày, các chuột đều sinh hoạt bình thường. Sau 2 tháng uống viên MIX liều 4 viên/kg thể trọng. Trọng lượng chuột của lô thử nghiệm tăng có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Các thông số huyết học, sinh hóa (GOT, GPT, urea, creatinin), trọng lượng và vi thể (gan, tim, thận) của lô thử nghiệm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cùng thời điểm khảo sát. Kết luận: Viên MIX không có độc tính cấp trên đường uống. Viên MIX liều 4 viên/kg không có biểu hiện bất thường qua các thông số khảo sát độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Từ khóa: ngưu tất, đan sâm, tam thất, chuột nhắt, độc tính ABSTRACT TOXICITY EFFECT OF MIX CAPSULE (ACHYRANTHES BIDENTATA- SALVIA MILTIORRHIZA- PANAXNOTOGINSENG) IN MICE Nguyen Thanh Tuan, Nguyen Thi Sơn, Tran Kim Trang * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 250 - 255 Objectives: Experimental study is conducted in the aim of evaluating the toxicity effect of MIX capsule, a pharmaceutical preparation of herbals (Achyranthes bidentata, Salvia miltiorrhiza, Panaxnotoginseng), in mice. Materials - Methods: MIX capsule was prepared at Lam Dong Pharmaceutical Company (LADOPHAR). Acute toxicity test: mice divided into several groups, each group was given the same dose of MIX. The result based on survival or death reaction in each mice group after 72 hours. Symptoms in mice were noted in 14 following days. Sub-chronic toxicity test: the test group with dose of 4 capsules/kg body weight for 2 months continuously. Blood in mice were checked before and after the test, organs (liver, heart, kidney) were checked at the end of the test. Evaluation criteria: Body weight, organ weight, hematology, liver function, kidney function. *Phòng khám Đa khoa Hoàn Hảo TP. Hồ Chí Minh **Khoa Y Học Cổ Truyền Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ***Khoa Y Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thanh Tuấn ĐT: 0913123348 Email: tuandhyd@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 251 Results: No acute toxicity found with the highest possible dose 32 capsules/kg body weight. Monitoring the mice for 72 hours and continuing for 14 days, the mice were survival. After 2 months of taking MIX dose of 4 capsules/kg body weight. The weight of mice in the test group was increased significantly compared with the control group. No statistical differences of SGOT, SGPT, urea, creatinine, organ weight and microscopy (liver, heart, kidney) after 2 months of taking MIX dose of 4 capsules/kg. Conclusion: MIX capsule with dose of 32 capsules/kg body weight had shown no acute toxicity. MIX dose of 4 capsules /kg is safe for 2 months treatment on white mice. Key words: achyranthes bidentata, salvia miltiorrhiza, panaxnotoginseng, mice, toxicity ĐẶT VẤN ĐỀ Xu hướng điều trị rối loạn lipid máu hiện nay là hướng về thuốc có nguồn gốc tự nhiên vừa mang lại hiệu quả điều trị, vừa giảm được tác dụng phụ và chi phí điều trị. Nhằm góp phần hiện đại hóa thuốc Y học cổ truyền, sự tiện ích cho người sử dụng. Bài thuốc tân phương được phối ngũ dựa theo tác dụng dược lý Y học hiện đại và lý luận Y học cổ truyền có thành phần gồm 3 vị thuốc dễ tìm trong cộng đồng có tác dụng hạ lipid máu tốt (Ngưu tất, Đan sâm, Tam thất)(3), được bào chế dưới dạng viên nang. Với mong muốn tìm kiếm một chế phẩm có tác dụng điều trị hiệu quả và góp phần bổ sung vào danh mục thuốc điều trị hạ lipid máu có nguồn gốc từ thảo dược. Vì vậy, mục tiêu trong nghiên cứu này nhằm khảo sát tính an toàn của thuốc trên thực nghiệm, để có dữ liệu khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu Viên nang cứng Ngưu tất – Đan sâm – Tam thất (viên MIX) được bào chế tại Công ty cổ phần Dược Lâm Đồng (LADOPHAR). Hàm lượng 430 mg/viên, đạt tiêu chuẩn chất lượng để thử nghiệm. Viên được tháo bỏ vỏ nang, cân trọng lượng bột viên của 10 viên và lấy khối lượng trung bình 01 viên. Bột viên được hòa trong nước cất và cho chuột uống. Liều thử nghiệm được quy theo số lượng viên uống/kg thể trọng chuột. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng (chủng Swiss albino, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 20 ± 2 g) được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang. Chuột được nuôi bằng thực phẩm viên được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế Nha Trang, nước uống đầy đủ và được để ổn định 1 tuần trước thực nghiệm. Thể tích cho uống trong thử nghiệm không quá 0,5 ml/một chuột. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm khảo sát độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên MIX trên chuột nhắt trắng(1,3). Khảo sát độc tính cấp Chuột nhắt chia thành các lô tương tự, những chuột ở cùng một lô sẽ nhận cùng một liều chất khảo sát. Sự đánh giá dựa vào phản ứng toàn ứng hay bất ứng (sống hay chết) nhận thấy ở mỗi chuột trong nhóm sau 72 giờ. Chuột được tiếp tục theo dõi sau 14 ngày uống để ghi nhận những triệu chứng bất thường (nếu có). Xác định liều thấp nhất không làm chết chuột và liều làm chết 100% chuột. Từ đó, suy ra liều LD50 được tính theo công thức Behrens-Karber. Phương pháp khảo sát độc tính bán trường diễn Mẫu thử nghiệm được cho chuột uống thuốc liên tiếp trong 2 tháng với liều 4 viên/kg (tương đương với liều quy đổi trên người 50 kg là 17 viên/ngày, gấp khoảng 4 lần liều dự kiến sử dụng). Thực hiện song song với lô chứng (cho uống nước cất). Lấy 0,5 ml máu tĩnh mạch ở đuôi chuột xét Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 252 nghiệm (lấy máu vào buổi sáng trước khi cho chuột ăn). Mỗi mẫu máu chuột chỉ được sử dụng cho 2 xét nghiệm sinh hóa(6). Thời điểm xét nghiệm: Trước thử nghiệm, sau 1 tháng và sau 2 tháng thử nghiệm. Riêng các xét nghiệm đại thể lấy gan, tim, thận tiến hành sau kết thúc thử nghiệm. Các chỉ tiêu đánh giá: Trọng lượng cơ thể, trọng lượng cơ quan (gan, tim, thận), các thông số huyết học (hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, bạch cầu, tiểu cầu), các thông số sinh hóa chức năng gan (GOT, GPT), chức năng thận (creatinin, urea)(3,4,5). Các thông số theo dõi Theo dõi thể trọng chuột. Các thông số huyết học: được ghi nhận bằng máy phân tích huyết học tự động CELL - DYN 1700 (USA). Các thông số sinh hóa: chức năng gan (GOT, GPT), chức năng thận (urea, creatinin). Bộ kít định lượng sinh hóa được cung cấp bởi hãng Human Co., Germany. Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận. Giải phẫu vi thể: các khảo sát vi thể mô gan, tim, thận được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện Chợ Rẫy TP. Hồ Chí Minh. Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực nghiệm Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình M ± SEM (Standard Error of the Mean – sai số chuẩn của giá trị trung bình) và được xử lý thống kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và hậu kiểm bằng Student-Newman-Keuls test (phần mềm SigmaStat-3.5, USA). Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P <0,05. KẾT QUẢ Kết quả khảo sát độc tính cấp Bảng 1. Kết quả khảo sát độc tính cấp viên MIX Liều dùng (viên/kg) Số chuột thử (n) Số chuột chết (r) Tỷ lệ % chết 32 10 0 0,00 Kết quả ở Bảng 1 cho thấy với liều 32 viên/kg thể trọng chuột là liều cao nhất có thể bơm qua kim mà không làm chết chuột, còn gọi là Dmax. Theo dõi chuột thử nghiệm trong vòng 72 giờ sau khi cho uống, nhận thấy chuột không có biểu hiện hành vi bất thường, và sinh hoạt bình thường. Theo dõi tiếp tục trong 14 ngày, các chuột đều sinh hoạt bình thường. Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn Kết quả Bảng 2 cho thấy: Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit ở lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống viên MIX ở các thời điểm sau 1 tháng và 2 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Tuy nhiên không có sự khác biệt giữa lô chứng và lô thử ở cùng một thời điểm. Như vậy viên MIX liều 4 viên/kg sau 2 tháng cho uống không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit trong máu. Nồng độ GOT, GPT, hàm lượng urea, creatinin ở ở lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống viên MIX ở các thời điểm sau 1 tháng và 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê của nồng độ GOT, GPT, hàm lượng urea, creatinin giữa lô chứng và lô thử uống viên MIX liều 4 viên/kg ở cùng một thời điểm. Như vậy viên MIX liều 4 viên /kg sau 2 tháng cho uống không ảnh hưởng lên nồng độ GOT, GPT, hàm lượng urea, creatinin trong máu. Trọng lượng chuột của lô chứng cho uống nước cất và lô thử cho uống viên MIX ở thời điểm sau 1 tháng và 2 tháng đều có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Ở thời điểm sau 2 tháng, thể trọng chuột ở lô thử cho uống viên MIX có sự tăng khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý. Như vậy, cho uống viên MIX liều 4 viên/kg làm tăng trọng lượng chuột sau 2 tháng sử dụng. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 253 Bảng 2. Kết quả khảo sát độc tính bán trường diễn viên MIX Chỉ tiêu khảo sát Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Hồng cầu (10 6 /mm 3 ) Chứng 8,57 ± 0,29 10,72 ± 0,35* 9,97 ± 0,21* Viên MIX 8,84 ± 0,15 10,31 ± 0,18* 10,14 ± 0,16* Hemoglobin (g/dL) Chứng 14,06 ± 0,37 16,64 ± 0,35* 15,01 ± 0,96* Viên MIX 14,72 ± 0,25 16,12 ± 0,28* 15,89 ± 0,15* Hematocrit (%) Chứng 47,10 ± 1,21 56,85 ± 1,57* 51,60 ± 1,48* Viên MIX 50,34 ± 1,02 55,11 ± 0,88* 51,72 ± 0,95 Bạch cầu (10 3 /mm 3 ) Chứng 4,35 ± 0,25 6,37 ± 0,38* 7,87 ± 0,60* Viên MIX 3,95 ± 0,42 7,59 ± 0,71* 9,39 ± 0,97* Tiểu cầu (10 3 /mm 3 ) Chứng 808,10 ± 85,09 1013,20 ± 45,57* 1187,40 ± 105,62* Viên MIX 777,70 ± 83,62 1029,40 ± 103,77* 1268,50 ± 97,99* GOT (U/L) Chứng 44,00 ± 1,70 42,60 ± 0,83 41,80 ± 1,25 Viên MIX 44,47 ± 1,22 40,25 ± 1,75 40,73 ± 2,70 GPT (U/L) Chứng 44,80 ± 1,04 44,10 ± 2,22 44,20 ± 1,43 Viên MIX 45,47 ± 1,71 45,25 ± 1,58 43,73 ± 1,67 Urea (mg/dL) Chứng 47,24 ± 2,25 47,79 ± 2,23 48,33 ± 0,95 Viên MIX 47,71 ± 1,73 51,70 ± 1,70 50,04 ± 4,11 Creatinin (mg/dL) Chứng 0,63 ± 0,02 0,66 ± 0,03 0,62 ± 0,01 Viên MIX 0,62 ± 0,01 0,66 ± 0,01 0,62 ± 0,01 Trọng lượng chuột ( g) Chứng 23,10 ± 0,78 35,30 ± 1,34* 30,30 ± 1,29* Viên MIX 23,73 ± 0,56 37,73± 0,79* 41,63 ± 0,84* # #: P <0,05 so với lô chứng sinh lý cùng thời điểm, *: P <0,05 so với trước thử nghiệm Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận Bảng 3. Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận Trọng lượng tương đối của cơ quan (g%) Lô (N = 10) Chứng Viên MIX Gan 3,778 ± 0,111 3,483 ± 0,114 Tim 0,371 ± 0,019 0,351 ± 0,009 Thận 0,883 ± 0,063 0,837 ± 0,024 Kết quả Bảng 3 cho thấy trọng lượng tương đối của gan, tim, thận ở lô thử cho uống viên MIX ở các thời điểm sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy viên MIX liều 4 viên/kg sau 2 tháng cho uống không ảnh hưởng đến trọng lượng gan, tim, thận chuột. Giải phẫu vi thể Kết quả Bảng 4 & Hình 1, 2, 3 cho thấy giải phẫu vi thể gan, tim và thận không có sự khác biệt giữa lô uống viên MIX liều 4 viên/kg trong 2 tháng so với lô chứng sinh lý. Bảng 4. Kết quả giải phẫu vi thể gan, tim, thận STT LÔ CHỨNG VIÊN MIX 1 Viêm gan mạn tính mức độ nhẹ Viêm gan mạn tính hoạt động mức độ nhẹ 2 Mô tim trong giới hạn bình thường Mô tim trong giới hạn bình thường 3 Mô thận trong giới hạn bình thường Mô thận trong giới hạn bình thường Hình 1. Hình ảnh mô học giải phẫu vi thể trên gan; 1: lô chứng, 2: lô uống viên MIX Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 254 Hình 2. Hình ảnh mô học giải phẫu vi thể trên tim; 1: lô chứng, 2: lô uống viên MIX. Hình 3. Hình ảnh mô học giải phẫu vi thể trên thận; 1: lô chứng, 2: lô uống viên MIX BÀN LUẬN Về độc tính cấp Viên MIX chưa thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng. Với liều 32 viên/kg thể trọng chuột (tương đương liều 128 viên/người 50 kg) là liều cao nhất có thể bơm qua kim vào dạ dày chuột, không có chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi cho uống thuốc. Ngoài ra, cũng không khi nhận các triệu chứng bất thường trong 14 ngày tiếp theo. Nếu tính theo liều dự kiến sử dụng trên người (4 – 8 viên/ngày) thì liều này tương đương gấp 20 lần liều sử dụng trên người. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp cho thấy viên MIX tương đối an toàn. Về độc tính bán trường diễn Chuột được thử nghiệm từ 5-6 tuần tuổi, đang trong giai đoạn tăng trưởng và phát triển để chuyển sang giai đoạn trưởng thành nên trọng lượng chuột của lô chứng và lô uống viên MIX liều 4 viên/kg sau 2 tháng thử nghiệm đều tăng so với trước thử nghiệm; đồng thời, trọng lượng chuột của lô thử nghiệm sau 2 tháng tăng đạt sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng cho thấy viên MIX liều 4 viên/kg giúp tăng thể trọng chuột trong thời gian cho uống. Các thông số huyết học như: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit của chuột trong lô uống viên MIX liều 4 viên/kg đều trong giới hạn bình thường, không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý tại cùng một thời điểm. Kết quả khảo sát chứng tỏ tình trạng sức khỏe chuột bình thường (không bị suy tủy, không bị xuất huyết hay tổn thương ở các cơ quan). Nồng độ GOT, GPT khi uống viên MIX liều 4 viên/kg tương đương so với lô chứng, chứng tỏ gan không bị tổn thương. Hàm lượng urea và creatinin trong máu của các lô thử nghiệm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng ở cùng thời điểm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 255 khảo sát, chứng tỏ viên MIX liều 4 viên/kg không ảnh hưởng đến chức năng thận và quá trình chuyển hóa ở thận. Trọng lượng tương đối và kết quả giải phẫu vi thể tim, gan, thận không có sự khác biệt giữa lô uống viên MIX liều 4 viên/kg so với lô chứng sau 2 tháng. KẾT LUẬN Viên MIX không có độc tính cấp trên đường uống. Viên MIX liều 4 viên/kg không có biểu hiện bất thường qua các thông số khảo sát độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2015). Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. Quyết định số 141/QĐ – K2ĐT ngày 27/10/2015. 2. Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng (2000). Sinh lý học người và động vật. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, pp.7 – 91, 187 – 188, 235 – 237. 3. Đỗ Tất Lợi (2005). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản Y học, pp.48- 49, 289- 291, 818- 820. 4. Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998). Giáo trình sinh hóa hiện đại. Nhà xuất bản Giáo dục, pp.255 – 261. 5. Viện Dược Liệu (2006). Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, pp.311-320. 6. Vũ Đình Vinh (2001). Hướng dẫn sử dụng các xét nghiệm sinh hoá, Chương 11- Các xét nghiệm sinh hoá về gan. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp.562-594. Ngày nhận bài báo: 28/05/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019