Kháo sát thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cao chiết hạt trâm mốc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 268 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO CHIẾT HẠT TRÂM MỐC (SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS) Lý Hải Triều*, Nguyễn Lê Tuyên*, Lâm Bích Thảo*, Nguyễn Hoàng Dũng**,Phùng Thị Thu Hường**, Nguyễn Thái Biềng***, Lê Văn Minh* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tình trạng kháng thuốc kháng sinh và sự gia tăng quá mức các gốc tự do trong cơ thể dẫn đến nhiều bệnh mãn tính và thoái hóa đang là vấn đề được quan tâm trong chăm sóc sức khoẻ cộng đồng. Việc cung cấp các chất chống oxy hóa tự nhiên và tìm ra các dược liệu mới có hoạt tính kháng sinh, kháng ung thư, an toàn, hiệu quả và giá cả phải chăng là cần thiết. Mục tiêu: Khảo sát thành phần hóa thực vật và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư của chiết xuất từ hạt Trâm mốc, đáp ứng nhu cầu tìm nguồn dược liệu mới. Phương pháp: Bột hạt Trâm mốc được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt và chiết lỏng-lỏng thu cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn. Hàm lượng flavonoid toàn phần được xác định bằng phương pháp UV-Vis theo chuẩn quercetin. Khả năng kháng khuẩn được xác định bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, hoạt tính kháng oxy hóa bằng thực nghiệm đánh bắt gốc tự do DPPH và kháng ung thư bằng thực nghiệm MTT. Kết quả: Hạt Trâm mốc có chứa các nhóm alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ và chất khử. Hàm lượng flavonoid đã trừ ẩm trong mẫu nguyên liệu đạt 0,084% và trong mẫu cao chiết đạt 0,201%. Cao chiết ethanol, cao ethyl acetat, cao n-butanol và cao nước có khả năng kháng đối với hai dòng vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus. Các cao chiết từ hạt trâm mốc đều thể hiện hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH, trong đó IC50 của cao diethyl ether (3,85 µg/ml) và cao ethyl acetat (3,77 µg/ml) thấp hơn chứng dương acid ascorbic (4,37 µg/ml). Ở nồng độ 100 µg/ml và 300 µg/ml, cao diethyl ether và cao ethyl acetat thể hiện hoạt tính ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư trên 50% đối với dòng tế bào MCF-7 và Hep-G2. Trong khi đó, chứng dương Camptothecin (0,01 µg/ml) ức chế 24,5±2,2% đối với MCF-7 và 27,7±2,2% đối với Hep-G2. Kết luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt Trâm mốc có thể là nguồn nguyên liệu tiềm năng để nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có tác dụng sinh học cao, góp phần phòng ngừa và hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn và các bệnh lý liên quan đến gốc tự do. Từ khóa: trâm mốc, flavonoid, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, kháng ung thư ABSTRACT PHYTOCHEMICAL COMPOSITION AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF SYZYGIUM CUMINI (L.) SKEELS SEED EXTRACTS Ly Hai Trieu, Nguyen Le Tuyen, Lam Bich Thao, Nguyen Hoang Dung, Phung Thi Thu Huong, Nguyen Thai Bieng, Le Van Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 4 - 2019: 268 – 276 Background: Antibiotic resistance and overgrowth of free radicals in the body causing chronic diseases and degenerative diseases are matters of concern in the public healthcare sector. Providing natural antioxidants and *Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. Hồ Chí Minh, Viện Dược liệu – Bộ Y Tế **Viện Kỹ thuật Công nghệ cao NTT, Đại học Nguyễn Tất Thành ***Viện Đào tạo Dược, Học Viện Quân Y Tác giả liên lạc: TS. Lê Văn Minh ĐT: 0937326123 Email: lvminh05@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 269 finding new antibiotic and anticancer compounds which are safe, effective and affordable are essential. Objectives: To investigate phytochemical compositions and evaluate antimicrobial, antioxidant and anticancer activities of Syzygium cumini seed extracts in order to search for new medicinal materials. Method: Syzygium cumini seed powder was extracted through percolation and liquid-liquid extraction methods to obtain total extract and fractions. The content of total flavonoids was determined by UV-Vis spectrophotometric method based on quercetin standard. Antibacterial, antioxidant and anticancer activities were addressed by agar diffusion; DPPH radical capture methods; and MTT assay, respectively. Results: The main phytochemicals found in the seeds include alkaloids, flavonoids, tannins, triterpenoids, saponins, coumarins, anthraquinones, fats, essential oils, organic acids, and reducing agents. The contents of flavonoids dry weights were 0.084% and 0.201% in the raw material and in the crude extract, respectively. The ethanol extract and fractions of ethyl acetate, n-buthanol and water significantly revealed resistance to Escherichia coli and Staphylococcus aureus. All Syzygium cumini seed extracts presented DPPH free radical scavenging activity, therein, the IC50 values of diethyl ether (3.85 µg/mL) and ethyl acetate (3.77 µg/mL) fractions were lower than that of ascorbic acid (4.37 µg/mL). At 100 µg/ml and 300 µg/ml, diethyl ether and ethyl acetate fractions caused more than 50% growth inhibition of two cancer cell lines (MCF-7 and Hep-G2) in 2 days. While, Camptothecin as a positive control at 0.01 µg/mL expressed inhibitory activities of 24.5±2.2% for MCF-7 and 27.7±2.2% for Hep-G2. Conclusion: The results showed that the Syzygium cumini seeds are the promising medicinal material contributing to studies on antibiotics, natural antioxidant and anticancer compounds. That plays a pivotal role in the prevention and treatment of diseases associated with pathogen infections and free radicals. Keywords: syzygium cumini (L.) skeels, flavonoids, antibacterial, antioxidant, anticancer ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc kháng sinh là một trong những giải pháp quan trọng trong việc loại bỏ các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn. Tuy nhiên, tình trạng kháng kháng sinh ngày càng trầm trọng ở nhiều quốc gia do sử dụng kháng sinh không kiểm soát, sử dụng kháng sinh không phù hợp. Thách thức lớn trong chăm sóc sức khoẻ cộng đồng là nhu cầu về các loại thuốc mới, an toàn, hiệu quả để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt là ở các nước đang phát triển, nơi có tới một nửa số người tử vong do các bệnh truyền nhiễm(12). Song song đó, tình trạng quá tải các gốc tự do trong cơ thể sinh vật là nguyên nhân gây ra một số bệnh mãn tính và thoái hóa như ung thư, rối loạn miễn dịch, lão hóa, viêm khớp dạng thấp, đái tháo đường, bệnh tim mạch, suy giảm hệ thần kinh. Hiện nay, có nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp được sử dụng, tuy nhiên, chúng gây ra một số tác dụng phụ như ảnh hưởng đến chức năng gan, thận, chức năng tim mạch, hệ thần kinh và tạo ra chất gây ung thư(8). Ung thư thường được điều trị bằng liệu pháp miễn dịch, hóa trị, xạ trị, phẫu thuật và nhắm mục tiêu phân tử hoặc kết hợp những yếu tố này. Tuy nhiên, các thuốc hóa trị liệu gây ra nhiều tác dụng phụ như mệt mỏi, rụng tóc, suy giảm sức khỏe. Nắm bắt được các tình trạng trên, các nhà khoa học trên thế giới đang quay về tìm kiếm, sàng lọc các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học an toàn, hiệu quả và kinh tế. Cây Trâm mốc (Syzygium cumini L. skeels), là cây thường xanh nhiệt đới thuộc họ Đào Kim Nương (Myrtaceae), xuất hiện nhiều ở miền Nam, Việt Nam. Theo kinh nghiệm dân gian, trái Trâm mốc có vị chát, giàu anthocyanin, giàu vitamin A, C, giúp tiêu hóa tốt, hạ đường huyết, viêm dạ dày. Lá Trâm mốc chứa nhiều tannin dễ tiêu và được dùng nấu nước như trà, có lợi cho người bệnh tiểu đường. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy các bộ phận của cây Trâm mốc chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học, tiềm năng trong điều trị bệnh, trong đó hạt Trâm mốc có chứa alkaloid, glycosid, triterpenoid, steroid, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 270 saponin, flavonoid, tannin thể hiện nhiều hoạt tính sinh học như kháng ung thư, kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm, trị tiểu đường, bảo vệ gan(2,6). Nghiên cứu này tiến hành xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa và kháng ung thư từ hạt trâm mốc, cung cấp các dữ liệu khoa học cho định hướng nghiên cứu sau này. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thí nghiệm. Nguyên liệu thực vật Mẫu trái Trâm mốc (Syzygium cumini (L.) Skeels) chín được thu hái vào tháng 12 năm 2016 tại thành phố Hồ Chí Minh. Trái được loại bỏ phần thịt, hạt được làm sạch, phơi sấy khô và xay thành bột để nghiên cứu. Mẫu được giám định và lưu giữ tại Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh. Hoá chất, thuốc thử, thiết bị và dụng cụ Ethanol 96% (Công ty Cổ phần Dược phẩm OPC), diethyl ether, chloroform, ethyl acetat, n- butanol (Trung Quốc), methanol (Merck), quercetin (HPLC ≥ 95%); amoxicillin (Công ty Cổ phần Dược phẩm DOMESCO), môi trường Luria-Bertani (LB), các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococus aureus; DPPH (Sigma Co. Ldt, US), acid ascorbic (Sigma Co. Ldt, US), môi trường RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute- 1640), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide), trypsin, penicillin, huyết thanh bò FBS (fetal bovine serum). Bình chiết ngấm kiệt, bình lắng gạn, bản silica gel F254 tráng sẵn trên nền nhôm (Merck, Art. 1,05554), đĩa petri, bình Roux, đĩa nuôi cấy 96 giếng và các dụng cụ, hóa chất khác. Sơ bộ thành phần hóa thực vật Các dịch chiết từ bột hạt Trâm mốc được kiểm tra sự hiện diện của alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, anthocyanosid, proanthocyanidin, chất béo, tinh dầu, carotenoid, các acid hữu cơ, chất khử theo phương pháp của Cuilei (Trường Đại học Ruman) có sửa đổi phù hợp(13). Phương pháp chiết xuất cao chiết Bột nguyên liệu được chiết ngấm kiệt lần lượt với ethanol 96%, 70% và 45% ở nhiệt độ phòng ở nhiệt độ phòng. Cho bột nguyên liệu đã làm ẩm vào bình chiết ngấm kiệt, bổ sung ethanol 96% ngập bề mặt dược liệu từ 5-7 cm. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Tiến hành rút dịch chiết với tốc độ 2 ml/phút. Bã dược liệu tiếp tục chiết tương tự với dung môi ethanol 70% và 45%. Tập trung toàn bộ dịch chiết ở ba nồng độ trên, cô quay chân không dưới áp suất giảm thu được cao chiết toàn phần (Cao T)(13). Cao toàn phần được hòa tan trong nước cất và chiết lỏng-lỏng lần lượt với diethyl ether, chloroform, ethyl acetat và n-butanol thu phân đoạn cao chiết diethyl ether (Cao E), cao chloroform (Cao C), cao ethyl acetat (Cao A), cao n-butanol (Cao B) và cao nước (Cao N). Khảo sát độ tinh khiết Khảo sát độ tinh khiết của dược liệu và cao chiết dựa trên tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (DĐVN V) gồm các chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô (độ ẩm), độ tro toàn phần, độ tro không tan trong HCl. Thực hiện 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán(4). Phương pháp định tính nhóm hợp chất Định tính sự hiện diện của nhóm hợp chất flavonoid ở mẫu nguyên liệu và cao chiết toàn phần từ hạt trâm mốc bằng phản ứng hóa học với các thuốc thử đặc trưng (NaOH 10%, FeCl3 5%, Cyanidin, Pb(CH3COO)2 10%) và định tính quercetin bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Phương pháp định lượng flavonoid toàn phần Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần trong bột nguyên liệu và cao chiết toàn phần từ hạt trâm mốc bằng phương pháp UV-Vis theo chuẩn quercetin. Hỗn hợp phản ứng gồm 1 ml dịch chiết (từ phân đoạn ethyl acetat), 8 ml methanol và 1 ml AlCl3 2%, lắc đều. Sau 10 phút, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 271 tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 454 nm. Sử dụng methanol làm mẫu trắng. Thực hiện 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán(10). Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết Ba chủng vi khuẩn thử nghiệm (E. coli, P. aeruginosa, S. aureus) được cấy lên môi trường Mueller-Hinton. Trải vi khuẩn đã được hoạt hóa trên các bản thạch với mật độ khoảng 1×106 – 2×106 CFU/ml. Dùng dụng cụ đục lỗ thạch có đường kính 6 mm. Cho vào mỗi lỗ 0,1 ml dịch thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau. Ủ các đĩa thạch ở 37°C trong 24 giờ. Thực hiện lặp lại 3 lần trên mỗi nồng độ, đo đường kính vòng vô khuẩn (nếu có) ở mỗi nồng độ, lấy giá trị trung bình và tính toán. Chứng dương và chứng âm được sử dụng lần lượt là amoxicillin và nước cất vô trùng. Công thức tính đường kính vòng vô khuẩn (ĐKV): ĐKV = (ĐKVmẫu thử – ĐKVgiếng) – (ĐKVchứng âm – ĐKVgiếng) (mm)(7). Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Khả năng kháng oxy hóa của mẫu thử được thực hiện theo phương pháp DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) được mô tả bởi Alhakmani có sửa đổi như sau(1): Hỗn hợp phản ứng trong methanol bao gồm 0,5 ml mẫu thử ở các nồng độ khác nhau phản ứng với đồng lượng dung dịch DPPH 0,6 mM pha trong methanol. Thêm methanol vừa đủ 4 ml. Hỗn hợp phản ứng được ủ trong 30 phút ở nhiệt độ phòng trong tối. Tiến hành đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 515 nm. Sử dụng mẫu trắng là methanol. Acid ascorbic (vitamin C) được sử dụng làm mẫu đối chứng dương. Thực hiện 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán. Hoạt tính kháng oxy hóa (HTKO%) được tính theo công thức: Trong đó: ODc là độ hấp thụ của mẫu chứng âm (dung dịch DPPH 0,6 mM). ODt là độ hấp thụ của mẫu có chứa chất thử. Xác định giá trị IC50 để đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH của mẫu thử. Nuôi cấy tế bào Các dòng tế bào ung thư mua từ ATCC (Mỹ). Tế bào nuôi trong môi trường DMEM hoặc RPMI 1640 có bổ sung L-glutamin (200 mM), HEPES (1 M), 1% (v/v) penicillin– streptomycin, 10% (v/v) FBS và ủ ở 37oC, 5% CO2. Phương pháp MTT Tế bào được nuôi trong đĩa 96 giếng ở mật độ thích hợp. Sau khi ủ 24 giờ, tế bào được xử lý với thuốc ở hai nồng độ 300 µg/ml và 100 µg/ml trong 48 giờ. Trước khi kết thúc thử nghiệm 4 giờ, hút bỏ môi trường nuôi cũ rồi cho môi trường mới có chứa 10% MTT vào giếng. Tiếp tục ủ ở 37°C cho đến khi kết thúc. Tinh thể formazan tạo thành được hòa tan trong DMSO và sau đó đánh giá bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm và 630 nm, sẽ phản ánh số lượng tế bào sống trong dịch nuôi cấy. Thực hiện 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình từng mẫu và tính toán(3). Hoạt tính ức chế (I%) của mẫu thử được tính theo công thức: Trong đó: ODc là độ hấp thụ của mẫu không chứa chất thử; ODt là độ hấp thụ của mẫu có chứa chất thử. Phương pháp đánh giá kết quả Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: Mean ± SEM hoặc Mean ± SD và được xử lý bằng phần mềm MS Excel 2013, xử lý thống kê dựa vào phép kiểm t – test. KẾT QUẢ Sơ bộ thành phần hóa thực vật Kết quả phân tích thành phần hóa thực vật của hạt Trâm mốc được thể hiện ở Bảng 1. Trong Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 272 hạt Trâm mốc có sự hiện diện của alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ và chất khử. Bảng 1. Thành phần hóa thực vật hạt trâm mốc Nhóm hợp chất Hạt trâm mốc Nhóm hợp chất Hạt trâm mốc Alkaloid ++++ Proanthocyanidin - Flavonoid +++ Anthocyanosid - Tannin +++ Chất béo +++ Triterpenoid + Tinh dầu +++ Saponin + Carotenoids - Coumarin ++ Các acid hữu cơ ++ Anthraquinon + Chất khử ++ (-): không có, (±): nghi ngờ, (+): có ít, (++): có, (+++): có nhiều, (++++): có rất nhiều Kiểm nghiệm nguyên liệu và hiệu suất thu cao ethanol toàn phần Hiệu suất thu cao chiết toàn phần đã trừ độ ẩm đạt 28,62%. Trong đó, độ ẩm bột dược liệu (11,04±0,18%) và cao chiết (15,23±0,18%) đều đạt tiêu chuẩn DĐVN V (độ ẩm dược liệu <13%, độ ẩm cao đặc <20%). Tương tự, độ tro toàn phần của bột dược liệu (2,38±0,04%) và cao chiết (2,19±0,07%) có trị số nằm trong giới hạn cho phép (thường là 4-12% đối với nguyên liệu và ≤35% đối với cao chiết). Đối với độ tro không tan trong acid của dược liệu thì mức độ lẫn tạp chất của bột dược liệu (0,26±0,02%) đạt tiêu chuẩn DĐVN V (<2,4%). Định tính nhóm flavonoid bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng theo chuẩn quercetin Kết quả định tính flavonoid bằng phản ứng hóa học cho thấy cả bột dược liệu và cao chiết toàn phần hạt trâm mốc đều cho kết quả dương tính rõ rệt khi tác dụng với thuốc thử đặc trưng NaOH 10%, FeCl3 5%, cyanidin, Pb(CH3COO)2 10% (Bảng 2). Bảng 2. Mức độ phản ứng của flavonoid trong hạt trâm mốc với bốn loại thuốc thử Thuốc thử NaOH 10% FeCl3 5% Cyanidin Pb(CH3COO)210% Nguyên liệu +++ +++ ++ +++ Cao chiết +++ +++ ++ +++ (-): không có, (±): nghi ngờ, (+): có ít, (++): có, (+++): có nhiều, (++++): có rất nhiều Dịch chiết hạt trâm mốc được khảo sát với nhiều hệ dung môi khai triển với tỷ lệ khác nhau. Trong đó, 2 hệ thích hợp nhất cho việc phân tách flavonoid từ dịch chiết ethanol hạt trâm mốc là Toluen: Ethyl acetat: Acid formic (TAF, 4: 5: 0,2) và Butyl acetat: Acid formic: Nước (BFW, 15: 5: 5). Giá trị Rf của mẫu trùng với quercetin lần lượt là 0,57 (hệ TAF), 0,86 (hệ BFW). Hình 1 cho thấy màu sắc và giá trị Rf của các vết thu được trên sắc ký đồ của mẫu chiết từ cao, tương ứng với màu sắc và giá trị Rf mẫu nguyên liệu và trùng với vết của mẫu chuẩn quercetin. Điều này chứng tỏ có sự hiện diện của hoạt chất quercetin trong nguyên liệu và trong cao chiết toàn phần. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 273 Hình 1. Sắc ký đồ định tính flavonoid trong dịch chiết hạt trâm mốc. (1) Chuẩn quercetin, (2) Nguyên liệu, (3) Cao chiết. Quan sát dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm (trái), quan sát dưới ánh sáng thường (phải) có nhuộm thuốc thử FeCl3 5% trong ethanol Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis theo chuẩn quercetin Kết quả hàm lượng flavonoid toàn phần của nguyên liệu và cao chiết từ hạt trâm mốc được tính theo phương trình hồi quy chuẩn quercetin ở bước sóng 454 nm có dạng y=0,021x–0,055 với sai số giữa lý thuyết và thực nghiệm nhỏ (R2=0,998). Hàm lượng flavonoid toàn phần trung bình có trong 100 g bột nguyên liệu khô là 0,084±0,001% và trong 100 g cao chiết trừ ẩm là 0,201±0,002%. Nghiên cứu cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo chuẩn quercetin trong cao chiết cao hơn 2 lần so với nguyên liệu. Hoạt tính kháng khuẩn của các cao chiết Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethanol toàn phần và các cao phân đoạn từ hạt Trâm mốc được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn được trình bày ở Bảng 3. Ở nồng độ 10 và 20 mg/ml, cao chiết ethanol toàn phần, cao ethyl acetat, cao n-butanol và cao nước có hoạt tính ức chế với hai chủng vi khuẩn E. coli và S. aureus tạo vòng vô khuẩn rõ rệt, nhưng chưa thể hiện hoạt tính đối với chủng vi khuẩn P. aeruginosa. Cao diethyl ether, cao chloroform chưa thể hiện hoạt tính đối với cả ba chủng vi khuẩn ở hai nồng độ khảo sát. Bảng 3. Khả năng kháng khuẩn của các cao chiết từ hạt trâm mốc và amoxicillin Mẫu Nồng độ (mg/ml) Đường kính vòng vô khuẩn (mm) E. coli S.aureus P.aeruginosa Cao TP 10 10,33 ± 0,88 17,33 ± 0,67 - 20 15,67 ± 0,33 18,67 ± 2,40 - Cao E 10 20 - - - - - - Cao C 10 20 - - - - - - Cao A 10 19,67 ± 0,33 14,33 ± 1,86 - 20 25,33 ± 0,67 21,33 ± 0,67 - Cao B 10 13,33 ± 2,40 15,67 ± 1,20 - 20 17,67 ± 2,33 19,67 ± 1,20 - Cao N 10 5,67 ± 0,33 11,67 ± 1,45 - 20 11,67 ± 1,20 15,67 ± 1,45 - Amoxicillin 1 23,33 ± 0,67 24,67 ± 3,18 27,73 ± 0,15 Hoạt tính đánh bắt gốc tự do DPPH Bảng 4. Tác dụng đánh bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết từ hạt trâm mốc Mẫu thử IC50 (µg/ml) Cao T 9,28 Cao E 3,85 Cao C 35,54 Cao A 3,77 Cao B 5,93 Cao N 13,51 Acid ascorbic 4,37 Tác dụng đánh bắt gốc tự do DPPH của các cao chiết từ hạt trâm mốc được trình bày ở Bảng 4. Hoạt tính kháng oxy hoá theo thứ tự là Cao A > Cao E > Acid Ascorbic > Cao B > Cao T > Cao N > Cao C. Nhìn chung, các cao chiết từ hạt trâm mốc có giá trị IC50 thấp, thể hiện tác dụng kháng oxy hóa cao theo cơ chế dập tắt gốc tự do DPPH. Hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thư của các cao chiết Hoạt tính ức chế tăng trưởng dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 Kết quả thu nhận được sau 48 giờ xử lý tế bào ung thư Hep-G2 với các cao chiết từ hạt trâm mốc được thể hiện như Hình 2. Ở nồng độ 100 µg/ml (Hình 2A), cao E và cao Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 274 A thể hiện hiệu quả ức chế khoảng 65% và 50% sự tăng trưởng của tế bào Hep-G2 so với chứng dương camptothecin là 27,7±2,2%, trong khi các cao TP, cao C, cao B và cao N không thể hiện hoạt tính ức chế hoặc thể hiện sự ức chế không đáng kể. Ở nồng độ 300 µg/ml (Hình 2B), hầu hết các cao chiết từ hạt Trâm mốc đều thể hiện hiệu quả ức chế tăng trưởng cao hơn so với khi xử lý ở nồng độ 100 µg/ml (trừ các cao B và cao N), với phần trăm ức chế của cao E đạt 85,2 ± 1,1% và cao A đạt 69,1 ± 0,8%. Hình 2. Phần trăm ức chế sự tăng trưởng tế bào ung thư Hep-G2 sau 48 giờ xử lý với các cao chiết từ hạt trâm mốc ở nồng độ (A) 100 µg/ml và (B) 300 µg/ml Hoạt tính ức chế tăng trưởng dòng tế bào ung thư vú người MCF-7 Kết quả thu nhận được sau 48 giờ xử lý tế bào ung thư MCF-7 với các cao chiết từ hạt Trâm mốc được thể hiện như Hình 3. Tương tự như ở dòng tế bào Hep-G2, ở nồng độ 100 µg/ml (Hình 3A), cao E và cao A thể hiện hiệu quả ức chế cao, với phần trăm ức chế lần lượt là 78,7 ± 2,2% và 75,8 ± 3,5%, trong khi đó tỷ lệ ức chế của chứng dương camptothecin là 24,5 ± 2,2%, cao TP không thể hiện sự ức chế và cao C, cao B và cao N thể hiện sự ức chế không đáng kể (lần lượt là 26,5%, 12,6% và 4,7%). Khi tế bào MCF-7 được xử lý bằng các cao chiết từ hạt Trâm mốc ở nồng độ 300 µg/ml (Hình 3B), ngoại trừ cao E có tỷ lệ ức chế sự tăng trưởng giảm từ 78,7% xuống 63,3% và cao B giảm từ 12,6% xuống 7,8%, các cao chiết còn lại đều thể hiện hoạt tính ức chế tăng mạnh, cụ thể phần trăm ức chế của cao TP tăng đến 46,9%; của cao C tăng từ 26,5% tới 62,9%; của cao A từ 75,8% tới 81,7% và của cao N tăng từ 4,7% đến 50,1%. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 275 Hình 3. Phần trăm ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư MCF-7 sau 48 giờ xử lý với các cao chiết từ hạt trâm mốc ở nồng độ (A) 100 µg/ml và (B) 300 µg/ml BÀN LUẬN Nghiên cứu cho thấy hạt Trâm mốc có chứa các nhóm hợp chất như alkaloid, flavonoid, tannin, triterpenoid, saponin, coumarin, anthraquinon, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ và chất khử. Các bằng chứng thực nghiệm cho thấy flavonoid (bioflavonoid) thuộc nhóm polyphenol có các tác động sinh học đa hướng như kháng khuẩn, kháng viêm, kháng dị ứng, kháng ung thư, kháng oxy hóa và chống đái tháo đường(9). Các tác động này nhìn chung liên quan đến hoạt động thu hẹp gốc tự do của flavonoid. Bên cạnh đó, cấu trúc catechol và sự có mặt của các nhóm chức năng không bão hòa trong vòng cũng góp phần vào hoạt động của chúng. Flavonoid có thể có khả năng liên kết với các ion kim loại chuyển tiếp, ngăn ngừa sự hình thành của các gốc hydroxyl hoặc các gốc tự do liên quan đến kim loại được xúc tác từ H2O2(9,11). Quercetin là một flavonol, là một trong những flavonoid phổ biến, làm khung sườn cho nhiều loại flavonoid khác như rutin, quercitrin, troxerutin, isoquercitrin và một số flavonoid khác, được sử dụng như là một chất chuẩn dùng để định tính, định lượng flavonoid toàn phần trong nhiều nghiên cứu(5). Kết quả nghiên cứu cho thấy cao ethanol toàn phần, cao ethyl acetat, cao n-butanol và cao nước có hoạt tính kháng chủng E. coli và S. aureus tạo vòng vô khuẩn rõ trong đó cao ethyl acetat tạo vòng kháng khuẩn lớn hơn các cao chiết khác, ở nồng độ 20 mg/ml là 25,33 mm đối với E. coli và 21,33 mm đối với S. aureus, trong khi đó kháng sinh amoxicillin tạo vòng kháng khuẩn rõ rệt đối với ba chủng khảo sát ở nồng độ 1 mg/ml. Trong thực nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do DPPH, giá trị IC50 của cao toàn phần, cao diethyl ether, cao chloroform, cao ethyl acetat, cao n- butanol và cao nước từ hạt Trâm mốc lần lượt là 9,28 µg/ml, 3,85 µg/ml, 35,54 µg/ml, 3,77 µg/ml, 5,93 µg/ml và 13,51 µg/ml. Trong khi đó, IC50 của acid ascorbic là 4,37 µg/ml. Cao ethyl acetat và cao diethyl ether có hoạt tính kháng oxy hóa cao hơn so với acid ascorbic, một sản phẩm thương mại đã được chứng minh có hoạt tính kháng oxy hóa. Bên cạnh đó, kết quả ở thực nghiệm ức chế tăng trưởng tế bào ung thư cũng cho thấy cao ethyl acetat và cao diethyl ether thể hiện tỷ lệ ức chế trên 50% ở cả hai nồng độ khảo sát. Cao toàn phần, cao chloroform, cao n-butanol và cao nước cũng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa, ức chế tế bào ung thư. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu cho thấy các cao chiết từ hạt Trâm mốc có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Các cao chiết đều thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa theo Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 4 * 2019 Chuyên Đề Y Học Cổ Truyền 276 cơ chế đánh bắt gốc tự do DPPH, ức chế tăng sinh tế bào ung thư Hep-G2 và MCF-7. Trong đó, cao phân đoạn diethyl ether và ethyl acetat thể hiện hoạt tính tốt nhất. Vì vậy, cần có thêm những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hạt Trâm mốc để cung cấp cơ sở khoa học nhằm khai thác và ứng dụng dược liệu này trong công tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alhakmani F, Kumar S & Khan SA (2013). “Estimation of total phenolic content, in-vitro antioxidant and anti-inflammatory activity of flowers of Moringa oleifera. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 3(8):623-627. 2. Ayyanar M & Subash-Babu P (2012). “Syzygium cumini (L.) Skeels: A review of its phytochemical constituents and traditional uses”. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(3):240-246. 3. Barh D & Viswanathan G (2008). “Syzygium cumini inhibits growth and induces apoptosis in cervical cancer cell lines: a primary study”. Ecancermedicalscience, 2:83. 4. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, lần xuất bản thứ tư. 5. Da Silva LAL, Pezzini BR & Soares L (2015). “Spectrophotometric determination of the total flavonoid content in Ocimum basilicum L. (Lamiaceae) leaves”. Pharmacognosy Magazine, 11(41):96-101. 6. Kamal A (2014). “Phytochemical screening of Syzygium cumini seeds”. Indian Journal of Plant Sciences, 3(4):1-4. 7. Nguyễn Hoàng Minh, Nguyễn Thị Thu Hương, Dương Thị Mộng Ngọc, Trần Công Luận, La Văn Kính (2013). “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng viêm cấp của công thức phối hợp dược liệu xạ can, bọ mắm và dâu tằm”. Y Học TP. Hồ Chí Minh, 17:150-155. 8. Pham-Huy LA, He H & Pham-Huy C (2008). “Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health”. International Journal of Biomedical Science, 4(2):89-96. 9. Oguntibeju O (2014). “Antioxidant-Antidiabetic Agents and Human Health”. InTech, pp.423-430. 10. Shanmugapriya S, Muthusamy P, et al (2017). “Determination of total flavonoid content in ethanolic leaf extract of Moringa Oleifera”. World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 6(5):849-852. 11. Shiksharthi AR, Mittal S (2014). “Ficus racemosa: Phytochemistry, traditional uses, and pharmacological properties: A review”. International Journal of Recent Advances in Pharmaceutical Research, 4:6-15. 12. Srivastava J, Chandra H, Nautiyal AR, Kalra SJS (2013). “Antimicrobial resistance (AMR) and plant-derived antimicrobials (PDAms) as an alternative drug line to control infections”. Biotech, 4:451-460. 13. Trần Hùng và cộng sự(2014). “Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Bộ môn Dược liệu”. Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019