Khảo sát tác động kháng staphylococcus aureus của phối hợp dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran và một số kháng sinh

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 83 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG KHÁNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS CỦA PHỐI HỢP DẪN CHẤT ACID CARBOXYLIC CỦA 2-SALICYLOYLBENZOFURAN VÀ MỘT SỐ KHÁNG SINH Vũ Thanh Thảo*, Trần Cát Đơng*, Phạm Ngọc Tuấn Anh* TĨM TẮT Mở đầu: Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân chính gây các bệnh nhiễm khuẩn với tỉ lệ mắc cũng như tử vong cao. Do đĩ, cần thiết phải cĩ sự hợp tác tồn cầu nhằm hướng tới giải quyết các thách thức của tình trạng đề kháng kháng sinh, trong đĩ cần phải thúc đẩy việc nghiên cứu, tìm kiếm thuốc kháng sinh mới. Trong nghiên cứu trước, dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran cho thấy cĩ tác động kháng khuẩn yếu trên chủng S. aureus. Trong nghiên cứu này, các dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran được khảo sát tác động kháng S. aureus khi phối hợp với một số thuốc kháng sinh. Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá tác động kháng S. aureus của phối hợp dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran và một số kháng sinh. Đối tượng - phương pháp nghiên cứu: Các phối hợp dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran với kháng sinh ampicillin, cefuroxim, ciprofloxacin, gentamicin và vancomycin. MIC của chất thử và kháng sinh được xác định bằng phương pháp pha lỗng trong thạch. Định tính tác động hiệp đồng kháng khuẩn trên phiến 96 giếng, trong đĩ mỗi giếng chứa ½MIC của kháng sinh và dẫn chât 2-salicyloylbenzofuran. Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn bằng phương pháp bàn cờ. Kết quả: Dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran 1a–f sở hữu hoạt tính kháng khuẩn yếu trên các chủng S. aureus với MIC = 32 – 1024 µg/mL. Kết quả đánh giá khả năng hiệp đồng kháng khuẩn đã phát hiện được 6 phối hợp cho kết quả (+) trong đĩ phối hợp 1e + gentamicin cho tác động hiệp đồng (FICI = 0.375) trên MRSA ATCC 33591, 1c + ciprofloxacin/gentamicin, 1f + ciprofloxacin cho tác động hiệp đồng một phần trên MRSA ATCC 33591 với FICI lần lượt là 0.75, 0.625, 0.625 và tác động cộng hợp (FICI = 1.0) trên chủng MRSA ATCC 43300 của phối hợp 1b + cefuroxim/gentamicin. Các phối hợp này đều làm tăng hoạt tính của các kháng sinh lên 2 - 4 lần. Kết luận: Các dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran sở hữu hoạt tính kháng khuẩn yếu nhưng khi phối hợp với các kháng sinh đã cho các tác động hiệp đồng với FICI = 0.375–1.0. Các phối hợp này làm tăng hoạt tính của các kháng sinh lên 2 – 4 lần, qua đĩ cho thấy tiềm năng của các dẫn chất này trong việc sử dụng phối hợp với kháng sinh để làm tăng hoạt lực kháng khuẩn trên các chủng đề kháng kháng sinh MRSA. Từ khĩa: 2-salicyloylbenzofuran, Staphylococcus aureus, kháng sinh, tác động hiệp đồng, chỉ số ức chế riêng phần, FICI. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Tuấn Anh ĐT: 0909704081 Email: pnta@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 84 ABSTRACT SYNERGISTIC ANTIBACTERIAL EFFECTS OF 2-SALICYLOYLBENZOFURAN BEARING CARBOXYLIC ACID DERIVATIVES AND ANTIBIOTICS ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS Vu Thanh Thao, Tran Cat Dong, Pham Ngoc Tuan Anh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 83 – 88 Background: Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a major cause of a variety of community- and healthcare-related infections that have been extremely difficult to treat with related morbidity and mortality being on the rise. The prevention and control of the antibiotic resistance threats have been identified as global public health priorities that require actions across all government sectors and society. To combat increasingly serious threat, one of the most important main actions is to accelerate the discovery and development of new classes of antibacterial agents. In the previous study, the carboxylic acid derivatives of 2-salicyloylbenzofuran were found to exhibit reasonable activity against S. aureus. In continuation of our work on search for novel anti-MRSA agents, the carboxylic acid derivatives of 2-salicyloylbenzofuran were determined their anti-S. aureus in combination with antibiotics. Objectives: This research aims to study on synergistic effects of combining 2-salicyloylbenzofuran bearing carboxylic acid derivatives with approved antibiotics against S. aureus strains. Materials and Methods: 2-Salicyloylbenzofuran bearing carboxylic acid derivatives and approved antibiotics including ampicillin, cefuroxime, ciprofloxacin, gentamicin and vancomycin were used in this research. MICs of compounds were deterimined by agar dilution method. The preliminarily screening of the synergistic effect was performed in 96-well microdilution plate containing ½ x MIC of antibiotic and ½ x MIC 2-salicyloylbenzofuran derivative. The combinations with positive interactions were determined the fractional inhibitory concentration index (FICI) by the agar dilution checkerboard procedure. Results: The 2-salicyloylbenzofuran bearing carboxylic acid derivatives 1a-f were found to possess weak activities against S. aureus strains (MICs = 32 – 1024 µg/mL). The preliminarily screening of the synergistic combinations exhibited six positive interactions. The combination of 1e with gentamicin displayed the most synergistic interaction against MRSA ATCC 33591 (FICI = 0.375). Meanwhile, combinations of 1c with ciprofloxacin or gentamicin, 1f with ciprofloxacin showed partial synergistic interactions against MRSA ATCC 33591 with FICI values 0.75, 0.625, 0.625, respectively. Besides, the synergistic test observed two additive interactions (FICI = 1.0) against MRSA ATCC 43300 strain when compound 1b was used in combination with cefuroxime or gentamicin. The rates in increasing susceptibility of MRSA with antibiotics were 2-4 fold in these cases. Conclusion: In this study, 2-salicyloylbenzofuran bearing carboxylic acid derivatives did not show much significant activities against MSSA and MRSA alone. However, these compounds when used in combination with approved antibiotics exhibited significant synergistic activities in some cases with the FICI values in the range of 0.375–1.0. The rates in increasing susceptibility of MRSA with antibiotics were 2-4 fold in these cases. These findings suggested that 2-salicyloylbenzofuran bearing carboxylic acid derivatives could potentially be used as antibiotic enhancers to the activity of existing antibiotics against MRSA. Key words: 2-salicyloylbenzofuran, Staphylococcus aureus, antibiotic, synergistic effect, the fractional inhibitory concentration index, FICI. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 85 MỞ ĐẦU Vấn đề đề kháng kháng sinh đã mang tính tồn cầu, đặc biệt ở các nước đang phát triển với gánh nặng của các bệnh nhiễm khuẩn. Các bệnh nhiễm khuẩn cĩ tỉ lệ mắc cũng như tử vong cao và việc kiểm sốt các loại bệnh này chịu tác động của tình trạng đề kháng kháng sinh(1,2,8). Trong các chủng đề kháng kháng sinh thì Staphylococcus aureus kháng methicillin (MRSA) là tác nhân chính gây các bệnh nhiễm khuẩn nguy hiểm trên da, mơ mềm, xương, đường hơ hấp và máu(3,4,8). Tại Mỹ, MRSA gây ra khoảng 90.000 ca bệnh và ước tính khoảng 19.000 trường hợp tử vong trong năm 2005(1,4). Tại Châu Âu, MRSA liên quan tới hơn 150.000 bệnh nhân nhiễm trùng và làm tăng chi phí điều trị lên tới 380 triệu euro mỗi năm(4). Do đĩ, việc nhiễm vi khuẩn này hiện là vấn đề nghiêm trọng trên lâm sàng nên việc kiểm sốt và điều trị chủng MRSA được xác định là một trong những nhiệm vụ cấp bách của hệ thống y tế trên tồn thế giới(1-4,7,8). Khung cấu trúc 2-aroylbenzofuran đã được tổng hợp và sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram (+) và Gram (–) trong các nghiên cứu trước đây. Kết quả cho thấy một số dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran 1a–f (Hình 1) cho tác động kháng khuẩn tiềm năng trên chủng vi khuẩn S. aureus bao gồm cả chủng đề kháng kháng sinh MRSA(6). Trong nghiên cứu này, các dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran được khảo sát tác động kháng S. aureus khi phối hợp với một số thuốc kháng sinh. Hình 1: Cấu trúc dẫn chất acid carboxylic của 5,7- dibromo-2-salicyloylbenzofuran 1a–f ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng thử nghiệm Dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloyl benzofuran 1a–f Kháng sinh Ampicillin, cefuroxim, ciprofloxacin, gentamicin và vancomycin Vi khuẩn thử nghiệm Staphylococcus aureus ATCC 29213 (MSSA), Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA) và Staphylococcus aureus ATCC 33591 (MRSA). Phương pháp nghiên cứu Xác định MIC của chất thử và kháng sinh(6) MIC của chất thử 1a-f và kháng sinh được xác định bằng phương pháp pha lỗng trong thạch. Chất thử nghiệm được cân chính xác và pha thành dung dịch mẹ trong DMSO. Khi sử dụng pha lỗng bằng mơi trường thử nghiệm hoặc pha trực tiếp với mơi trường thử nghiệm sao cho tạo thành dãy nồng độ trong mơi trường thử nghiệm (cĩ nồng độ sau bằng ½ nồng độ trước) Vi khuẩn khảo sát được pha với nồng độ 107 CFU/ml và cho 1 – 2 μl huyền phù dịch vi khuẩn lên mặt thạch để đạt được mật độ vi khuẩn trên thạch là 104 CFU/ml, ủ ở 37 oC/18-24h. Khi pha chất thử vào mơi trường phải đảm bảo nồng độ DMSO nằm trong khoảng từ 2 – 5 % nhằm tránh việc nồng độ DMSO cao sẽ ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm. Xác định đĩa cĩ nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hồn tồn sự tạo khĩm, nồng độ tại đĩa thạch này là MIC của chất thử đối với vi khuẩn thử nghiệm. Định tính tác dụng hiệp đồng của các chất thử với kháng sinh(5) Pha nồng độ các chất thử 1a-f phối hợp với kháng sinh theo tỉ lệ ½ MIC của mỗi chất trong mỗi giếng của phiến 96 giếng. Vi khuẩn thử nghiệm được pha với nồng độ 107 CFU/ml Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 86 và chấm khoảng 1-2 µL lên bề mặt tất cả các giếng, ủ ở 37oC/18-24 h. Các phối hợp khơng cĩ vi khuẩn mọc được xác định là cĩ tác dụng hiệp đồng và sẽ được thực hiện định lượng khả năng hiệp đồng bằng thử nghiệm bàn cờ. Định lượng khả năng hiệp đồng của các chất thử với kháng sinh(5) Sử dụng phương pháp bàn cờ trên phiến 96 giếng, chất thử 1a-f và kháng sinh được khảo sát ở nồng độ từ 1/32 đến 2 lần MIC của mỗi chất. Bắt đầu từ giếng chứa chất thử và kháng sinh cĩ nồng độ gấp 2 lần MIC, kháng sinh cĩ nồng độ giảm dần ½ theo chiều ngang, chất thử cĩ nồng độ giảm dần ½ theo chiều dọc. Vi khuẩn khảo sát được pha với nồng độ 107 CFU/ml được chấm khoảng 1-2 µL lên bề mặt tất cả các giếng, ủ ở 37 oC/16-18 h. Xác định giếng cĩ nồng độ chất thử và kháng sinh thấp nhất ức chế hồn tồn sự tạo khĩm. Đánh giá kết quả(5) Các phối hợp cĩ tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn thử nghiệm sẽ được chọn để tính chỉ số ức chế riêng phần FICI (the fractional inhibitory concentration index) theo cơng thức sau: FICI = FICchất thử 1a-f + FICkháng sinh Trong đĩ: FIC = MICtrong phối hợp/ MICkhơng phối hợp FICI 0,5: hiệp đồng; 0,5 < FICI < 1: hiệp đồng một phần; FICI = 1: cộng hợp; 1 < FICI < 4: khơng tương tác; FICI ≥ 4: đối kháng. KẾT QUẢ MIC của chất thử và kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo-2- salicyloylbenzofuran 1a-f trên các chủng vi khuẩn MSSA ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 và MRSA ATCC 33591 được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn chất 1a-f Hợp chất CTCT MIC [µg/mL (mM)] X Z MSSA ATCC 29213 MRSA ATCC 43300 MRSA ATCC 33591 1a H 64 (0.14)a 64 (0.14)a 256 (0.56) 1b H 128 (0.27)a 128 (0.27)a 256 (0.55) 1c H 32 (0.06)a 64 (0.12)a 128 (0.25) 1d Br 128 (0.24) 256 (0.48) 1024 (1.92) 1e Br 32 (0.06) 32 (0.06) 128 (0.23) 1f Br 128 (0.21) 128 (0.21) 1024 (1.71) Ampicillin Cefuroxim Ciprofloxacin Gentamicin Vancomycin 0.25 (0.0007) 8 (0.02) 0.5 (0.0016) 2 (0.004) 0.0625 (0.00004) 16 (0.05) 16 (0.04) 0.125 (0.0004) 4 (0.008) 0.0625 (0.00004) 16 (0.05) 8 (0.02) 0.5 (0.0016) 8 (0.017) 1 (0.0007) a MIC được xác định từ nghiên cứu trước(6). MSSA: methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. MRSA: methicillin- resistant Staphylococcus aureus Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 87 Định tính khả năng hiệp đồng kháng khuẩn Kết quả định tính khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của các dẫn chất acid carboxylic của 2-salicyloylbenzofuran 1a-f với kháng sinh trên các chủng vi khuẩn MSSA ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 và MRSA ATCC 33591 đã tìm được 6 kết hợp cho hiệp đồng kháng khuẩn (Bảng 2). Bảng 2: Kết quả định tính khả năng hiệp đồng kháng khuẩn Kháng sinh Hợp chất 1b 1c 1e 1f MRSA ATCC 43300 MRSA ATCC 33591 MRSA ATCC 43300 MRSA ATCC 33591 MRSA ATCC 43300 MRSA ATCC 33591 MRSA ATCC 43300 MRSA ATCC 33591 Ampicillin – – – – – – – – Cefuroxim + – – – – – – – Ciprofloxacin – – + – – – + – Gentamicin + – + – + – – – Vancomycin – – – – – – – – MSSA: methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus Định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn Kết quả định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của 6 phối hợp gồm 1b + cefuroxime/gentamicin trên MRSA ATCC 43300 và 1c + ciprofloxacin/gentamicin, 1e + gentamicin, 1f + ciprofloxacin trên MRSA ATCC 33591 được trình bày trong Bảng 3. Bảng 3: Kết quả định lượng khả năng hiệp đồng kháng khuẩn Chủng vi khuẩna Hợp chất MIC [µg/mL (mM)] FICIb Kiểu tác động Riêng rẽ Phối hợp MRSA ATCC 43300 1b 128 (0.27) 64 (0.13) 1 Cộng hợp Cefuroxim 16 (0.04) 8 (0.02) 1b 128 (0.27) 64 (0.13) 1 Cộng hợp Gentamicin 4 (0.008) 2 (0.004) MRSA ATCC 33591 1c 128 (0.25) 32 (0.06) 0.75 Hiệp đồng một phần Ciprofloxacin 0.5 (0.0016) 0.25 (0.0008) 1c 128 (0.25) 16 (0.03) 0.625 Hiệp đồng một phần Gentamicin 8 (0.008) 4 (0.004) 1e 128 (0.23) 16 (0.03) 0.375 Hiệp đồng Gentamicin 8 (0.008) 2 (0.002) 1f 1024 (1.71) 128 (0.23) 0.625 Hiệp đồng một phần Ciprofloxacin 0.5 (0.0016) 0.25 (0.0008) a MRSA: methicillin-resistant Staphylococcus aureus, b FICI 0,5 : hiệp đồng; 0,5 < FICI < 1: hiệp đồng một phần; FICI = 1: cộng hợp BÀN LUẬN Các dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran cĩ hoạt tính kháng khuẩn yếu trên các chủng vi khuẩn MSSA ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 và MRSA ATCC 33591 với MIC = 32 – 1024 µg/mL. Trong đĩ, dẫn chất 1c và 1e cho hoạt tính mạnh nhất trên chủng MSSA ATCC 29213 (MIC = 32 µg/mL), dẫn chất 1e cho tác động mạnh nhất trên chủng MRSA ATCC 43300 (MIC = 32 µg/mL). Kết quả định tính khả năng hiệp đồng kháng khuẩn của các phối hợp giữa các dẫn chất acid carboxylic của 5,7-dibromo- 2-salicyloylbenzofuran 1a-f với các kháng sinh gồm ampicillin, cefuroxim, ciprofloxacin, gentamicin, vancomycin đã phát hiện được 6 phối hợp cho kết quả (+) gồm 1b + cefuroxim/gentamicin trên MRSA ATCC 43300, và 1c + ciprofloxacin/gentamicin, 1e + Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 88 gentamicin, 1f + ciprofloxacin trên MRSA ATCC 33591. Trên chủng MSSA ATCC 29213, khơng cĩ phối hợp nào cho tác động hiệp đồng. Cũng như tất cả các phối hợp giữa dẫn chất acid acetic của 2-salicyloylbenzofuran 1a, 1d với các kháng sinh đều cho kết quả (–). Kết quả định lượng khả năng hiệp đồng của 6 phối hợp (+) cho thấy phối hợp 1e + gentamicin trên MRSA ATCC 33591 cho tác động hiệp đồng (FICI = 0.375). Đặc biệt, nồng độ MIC của gentamicin đã giảm 4 lần trong phối hợp này. Trong khi đĩ, 1c + ciprofloxacin/gentamicin, 1f + ciprofloxacin cho kết quả hiệp đồng một phần trên chủng MRSA ATCC 33591 với FICI lần lượt là 0.75, 0.625, 0.625. Ngồi ra, kết quả cũng ghi nhận tác động cộng hợp (FICI = 1.0) trên chủng MRSA ATCC 43300 của phối hợp 1b + cefuroxim/gentamicin. Tất cả các phối hợp này đều làm tăng hoạt tính của các kháng sinh lên 2 lần. Kết quả bước đầu cho thấy tiềm năng của các dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran trong việc làm tăng hoạt tính kháng MRSA của các kháng sinh đặc biệt là gentamicin khi sử dụng phối hợp. KẾT LUẬN Các dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran cĩ hoạt tính kháng khuẩn yếu trên các chủng vi khuẩn MSSA ATCC 29213, MRSA ATCC 43300 và MRSA ATCC 33591 với MIC = 32 – 1024 µg/mL. Kết quả hoạt tính kháng khuẩn khơng cho thấy nhiều tiềm năng kháng khuẩn riêng rẽ nhưng khi phối hợp với các kháng sinh đã cho thấy được các tương tác hiệp đồng giữa 1b + cefuroxim/gentamicin trên MRSA ATCC 43300, và 1c + ciprofloxacin/gentamicin, 1e + gentamicin, 1f + ciprofloxacin trên MRSA ATCC 33591 với FICI = 0.375–1.0. Các phối hợp này làm tăng hoạt tính của các kháng sinh lên 2 – 4 lần, qua đĩ cho thấy tiềm năng của các dẫn chất acid carboxylic của 2- salicyloylbenzofuran trong việc sử dụng phối hợp với kháng sinh để làm tăng hoạt lực kháng khuẩn trên các chủng đề kháng kháng sinh MRSA. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Carlet J, Jarlier V, Harbarth S, Voss A, Goossens H, Pittet D (2012). Ready for a world without antibiotics? The Pensières Antibiotic Resistance Call to Action. Antimicrobial Resistance & Infection Control, vol. 1, Article no. 11, pp.13. 2. Gilbert ND, Guidos JR, Boucher WH, Talbot HG, Spellberg B, Edwards Jr EJ, Michael Scheld W, Bradley SJ, Bartlett GJ (2010). The 10 x ‘20 Initiative: Pursuing a Global Commitment to Develop 10 New Antibacterial Drugs by 2020. Clinical Infectious Diseases, 50: pp.1081–1083. 3. Kưck R, Becker K, Cookson B, van Gemert-Pijnen JE, Harbarth S, et al. (2010). Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): burden of disease and control challenges in Europe. Euro surveillance, vol. 15, no. 41, Article ID 19688, pp.9. 4. Monina Klevens R, Morrison MA, Nadle J, et al. (2007). Invasive Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections in the United States. JAMA, 298: pp.1763–1771. 5. Mun SH, Kang OH, Joung DK, Kim SB, Choi, JG.; Shin DW, Kwon DY (2014). In vitro anti-MRSA activity of carvone with gentamicin. Experimental and Therapeutic Medicine, 7: pp.891–896. 6. Phan P-TT, Nguyen T-TT, Nguyen H-NT, Le B-K N, Vu TT, Tran DC, Pham T-AN (2017). Synthesis and Bioactivity Evaluation of Novel 2- Salicyloylbenzofurans as Antibacterial Agents. Molecules, 22 (5): 687, pp.13. 7. Tacconelli E, De Angelis G, de Waure C, Cataldo MA, La Torre G, Cauda R (2009). Rapid screening tests for methicillin-resistant Staphylococcus aureus at hospital admission: systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases, 9: pp.546–554. 8. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance. World Health Organization, Geneva, Switzerland, 2014. Available online: ereport/en/ (accessed on 10 January 2017). Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019