Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết thạch hộc nuôi cấy mô và thạch hộc tự nhiên (Dendrobium Nobile Lindl. Orchidaceae)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 70 KHẢO SÁT SƠ BỘ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CAO CHIẾT THẠCH HỘC NUÔI CẤY MÔ VÀ THẠCH HỘC TỰ NHIÊN (DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE) Lâm Cẩm Tiên * , Trần Công Luận** TÓM TẮT Tình hình chung và mục tiêu nghiên cứu: Hiện nay Thạch hộc là dượcliệu quý hiếm, được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn. Nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao. Bước đầu làm rõ tính an toàn vàthành phần hoạt chất có trong Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc trồng tự nhiên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu độc tính cấp và khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộctự nhiên (Kim thoa Thạch hộc) (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae). Phương pháp nghiên cứu: Thử nghiệm độc tính cấp đường uống để xác định LD50 theo phương pháp Karber-Behrens. Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu và cao chiết cồn 60% Thạch hộc bằng các phản ứng hóa học đặc trưng và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng. Tiêu chuẩn chất lượng của dược liệu được kiểm nghiệm theo DĐVN IV. Kết quả: Xác định được Dmax cao Thạch hộc nuôi cấy là 25 g cao/kg (tương đương 126,45 g dược liệu khô) và cao Thạch hộc tự nhiên là 28,6 g cao/kg (tương đương 348,78 g dược liệu khô). Sơ bộ thành phần hóa thực vật của 2 mẫu dược liệu đều có tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid và saponin. Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid là 3,22% và saponin 15,61%. Cao Thạch hộc tự nhiên có hàm lượng alkaloid là 2,6% và saponin 11,71%. Kết luận: Liều lượng Thạch hộc sử dụng mỗi ngày là khoảng 6 - 12g dược liệu khô, dùng Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên với liều gấp 10,5 lần và 29 lần liều thường sử dụng hàng ngày vẫn cho thấy khoảng cách an toàn rộng. Sơ bộ thành phần hóa học của dược liệu và cao chiết của Thạch hộc nuôi cấy mô và Thạch hộc tự nhiên giống nhau. Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 lần và hàm lượng saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên. Từ khóa: Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae, Thạch hộc tự nhiên, Thạch hộc nuôi cấy mô, sắc ký lớp mỏng, sơ bộ thành phần hóa học. ABSTRACT PRINCIPAL SURVEY CHEMICAL COMPONENTS OF EXTRACTIONS OF TISSUE CULTURE DENDROBIUM AND WILD DENDROBIUM (DENDROBIUM NOBILE LINDL. ORCHIDACEAE) Lam Cam Tien, Tran Cong Luan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 22 - No 5- 2018: 70 –77 Background and Objectives: Wild dendrobium (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) is a rare plant that has been proven to have potent antioxidant efficacy in the experiment and the current trend is to apply plant biotechnology to produce medicinal sources with a large and high quality. In order to clarify the safety and survey the active ingredients of tissue culture dendrobium andwild dendrobium, we conducted a study on acute toxicity and principal investigations of the chemical compositions of tissue culture dendrobium and wild dendrobium. Methods: In vivo acute toxicity test is conducted using Karber-Behrens method to determine Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y dược TP. HCM ** Đại học Công nghệ Miền Đông Tác giả liên lạc: ThS. BS. Lâm Cẩm Tiên ĐT: 01699940841 Email: lamcamtien2015@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 71 LD50.Preliminary analysis of chemical compositions and 60% alcohol extraction of dendrobium by specific chemical reactions and thin layer chromatography. Quality standards of materials are tested according to Vietnamese Pharmacopoeia IV. Results: The Dmax of alcohol extraction of tissue culture dendrobium was determined to be 25 g/kg (equivalent to 126.45 g dried herb) and Dmax of extraction of wild dendrobium was 28.6 g/kg (equivalent to 348.78 g dried herb). The phytochemical compositions of two herbs are essential oils, triterpenoids, organic acids, polyuronids, alkaloids and saponins. Quantitative analysis of extraction of tissue culture dendrobium contains 3.22% alkaloid and 15.61% saponin; extraction of wild dendrobium contains 2.6% alkaloid and 11.71% saponin. Conclusions: The amount of dendrobium used per day is about 6 - 12 g driedherb, when the tissue culture dendrobium and wild dendrobium usedwith dosesat 10.5 times and 29 times higher than daily dose, it still showswide safe range. Preliminary chemical compositions of herbs and extracts of dendrobium are similar. Thealkaloid level and saponin level of extraction of tissue culture dendrobium is 1.2 times higher and 1.3 times higher than wild dendrobium. Keywords: Dendrobium nobile Lindl.Orchidaceae, wild dendrobium, tissue culture dendrobium, thin layer chromatography, chemical compositions. ĐẶT VẤN ĐỀ Đã từ rất lâu, Thạch hộc (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) là một trong những dược liệu quý, đã được Trung Quốc sử dụng như thuốc giảm đau, hạ sốt, kích thích dạ dày, để cải thiện cảm giác ngon miệng, kích thích tiết nước bọt, điều trị các bệnh khác nhau, như viêm dạ dày, đái tháo đường, lão hóa da, và bệnh tim mạch, mà phần lớn các bệnh này được cho là liên quan chặt chẽ với sự rối loạn trao đổi chất làm phóng thích ra các gốc tự, Thạch hộc có tác dụng chống lại sự rối loạn trong việc tạo ra gốc tự do(3). Một số nghiên cứu nước ngoài đã chứng minh Thạch hộc có tác dụng kháng viêm, chống tế bào ung thư, chống đột biến gen điều hòa miễn dịch,gần đây còn cho thấy tác dụng chống oxy hóa trên in vitro(5). Hiện nay Thạch hộc là thực vật quý hiếm, được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn, nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao(7). Để góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học và tính an toàn của Thạch hộc nuôi cấy mô. Chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu độc tính cấp và khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của cao chiết thạch hộc nuôi cấy mô và thạch hộc tự nhiên (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae)”. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU Đối tượng nghiên cứu Thạch hộc nuôi cấy môđược công ty cổ phần khoa học công nghệ Anh Đào, số 1031, Nguyễn Hữu Thọ, ấp 2, xã Long Thới, huyện Nhà bè, TP. HCM cung cấp. Mẫu được cấy từ thân Thạch hộc, nuôi trong ống nghiệm trong 5 tháng với môi trường sử dụng là MS (Mac Conkey - Sabouraud) bổ sung 30 g/l đường, 8 g/l agar, 50 g/l khoai tây, 200 ml/l nước dừa, 1 g/l than hoạt tính, mẫu được nuôi cấy trong điều kiện pH 5,7- 5,8, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ 2000 - 3000 lux, nhiệt độ 25 ± 2oC, và độ ẩm trung bình 50 - 60%. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50oC và được bảo quản trong hộp kín. Thạch hộc tự nhiên được vườn lan tại xã Qui Đức, huyện Bình Chánh, TP. HCM cung cấp. Mẫu được sấy khô ở nhiệt độ 45 - 50oC và được định danh tại Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP. HCM. Phương tiện Hóa chất: thuốc thử Bouchardat,Mayer, Dragendorff; hệ dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetate - acid formic (2:7:1), Chloroform - methanol (9:1), Chloroform - methanol - Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 72 ammoniac (40:5:1). Thiết bị: Tủ sấy Memmert (Germany), cân kĩ thuật Mettler Toledo AB204, máy cô giảm áp Buchi waterbath B-480, đèn soi UV Desaga. Động vật nghiên cứu Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, khỏe mạnh, đồng đều về giới, 6-8 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2g, cung cấp bởi Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Trong suốt quá trình thử nghiệm chuột được nuôi với thức ăn viên và điều kiện môi trường ổn định. Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thực nghiệm, đo lường độc lập. Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp(4) Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn: Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều 2 chuột) Khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù cho uống. Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%). Giai đoạn xác định (mỗi lô dò liều 6 chuột) Chuột được chia lô và cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0 và LD100 chia theo cấp số nhân. Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận động của chuột trong vòng 72 giờ sau khi dùng thuốc. Ghi nhận số chuột chết trong từng lô. Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Karber-Behrens. Phương pháp nghiên cứu hóa học Thử tinh khiết dược liệu theo DĐVN IV. Xác định độ ẩm, độ tro, định lượng các chất chiết trong dược liệu(2). Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học: Dựa vào giáo trình thực tập Dược liệu của bộ môn Dược liệu Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh(1). Chiết xuất cao, xác định độ ẩm, độ tro, định tính bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, định lượng bằng phương pháp cân 2 cao chiết: Chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol 60%: Dược liệu (Thạch hộc tự nhiên hoặc thạch hộc nuôi cấy) sau được làm ẩm với cồn 60% theo tỉ lệ (1:1), sau đó cho vào bình ngấm kiệt, cho cồn 60% cách mặt dược liệu 10 cm rồi đậy kín để yên trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, rút dịch chiết với tốc độ 2,3 ml/phút. Dịch chiết thu được cô quay chân không thu hồi dung môi thu được các cao. Định tính bằng phương pháp hóa học: hợp chất alkaloid với thuốc thử Bouchardat, Mayer, Dragendorff; hợp chất saponin với phản ứng tạo bọt và phản ứng Libermann Burchard. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetate - acid formic (2:7:1), Chloroform - methanol (9:1), Chloroform – methanol - ammoniac (40:5:1). Định lượng hợp chất alkaloid và saponin trong 2 mẫu cao bằng phương pháp cân. Hợp chất alkaloid Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu cho vào bình tam giác 250 ml, thêm 50 ml H2SO4 5%, siêu âm nóng 30 phút (50 ml x 8 lần), lọc. Dịch nước acid được kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH đậm đặc đến pH 9 - 10. Dịch nước kiềm hóa được lắc với chloroform (10 - 12 lần, mỗi lần 20 ml). Tập trung dịch chiết chloroform, rửa lại bằng nước cất (30 ml x 3 lần). Cô quay thu hồi dịch chloroform đến cắn. Cắn được sấy chân không, cân đến khối lượng không đổi, tính kết quả xác định hàm lượng alkaloid toàn phần. Kết quả định lượng lặp lại 3 lần lấy trung bình. Hợp chất saponin Cân chính xác khoảng 3 g dược liệu cho vào bình soxhlet, chiết với 20 x 10 ml MeOH cho đến kiệt saponin. Dịch MeOH được cô giảm áp cho đến cắn, hoà cắn với 50 ml nước cất. Dịch nước được lắc với ether (6 - 7 lần, mỗi lần 20 ml) cho đến khi lớp ether không màu hoặc màu rất nhạt. Gạn bỏ lớp ether, lớp nước được lắc với n-BuOH bão hoà nước cho đến kiệt saponin (khoảng 12 lần, mỗi lần 20 ml). Tập trung dịch chiết n- BuOH, rửa với nước cất (30 ml x 3 lần), cô giảm áp thu hồi n-BuOH cho đến cắn, làm khô trong Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 73 tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi thu được saponin toàn phần. Cân và tính hàm lượng saponin toàn phần trong dược liệu. Tiến hành định lượng 3 lần, lấy giá trị trung bình. KẾT QUẢ Thử nghiệm độc tính cấp của cao Thạch hộc nuôi cấy (cao 1) và cao Thạch hộc tự nhiên (cao 2) Bảng 1. Kết quả thử nghiệm độc tính cấp của cao 1 và cao 2 Lô thử Số chuột đực (con) Số chuột cái (con) Số chuột chết trong lô (con) Phân suất tử vong (%) Sơ khởi 2 2 0 0 Xác định 6 6 0 0 Cao 1: liều tối đa bơm qua kim theo đường uống là 25 g cao/kg chuột với thể tích 20 ml/kg thể trọng chuột. Cao 2: liều tối đa bơm qua kim theo đường uống là 28,6 g cao/kg chuột với thể tích 20 ml/kg thể trọng chuột. Trong thời gian 72 giờ và 2 tuần quan sát, không ghi nhận bất kỳ dấu hiệu bất thường nào xảy ra trên chuột thử nghiệm. Tất cả các chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường, không có chuột chết. Sau 2 tuần theo dõi, mổ chuột ở tất cả các lô không thấy bất kỳ thay đổi bệnh lý nào về hình thái đại thể của các cơ quan tim, gan, thận, bàng quang và hệ thống tiêu hóa. Do đó, không tìm được LD50 và xác định được Dmax là 25 g cao/kg chuột đối với cao 1 (tương đương 126,45 g dược liệu khô) và 28,6g cao/kg chuột đối với cao 2 (tương đương 348,78g dược liệu khô). Như vậy, cao Thạch hộc nuôi cấy và cao Thạch hộc tự nhiên không thể hiện độc tính cấp đường uống với liều tối đa có thể cho chuột uống. Điều này cho phép chúng ta nhận định rằng cao Thạch hộc nuôi cấy và cao Thạch hộc tự nhiên sử dụng trong thử nghiệm có độ an toàn khá cao trên động vật thử nghiệm. Khảo sát hóa học Phân tích sơ bộ Kết quả phân tích sơ bộ cho thấy thành phần hóa học của (Dendrobium nobile Lindl. Orchidaceae) cả mẫu nuôi cấy và tự nhiên đều có các nhóm hoạt chất: tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid và saponin. Bảng 2. Kết quả phân tích thành phần hóa thực vật Nhóm hợp chất Kết quả định tính chung Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên Tinh dầu + + Chất béo - - Carotenoid - - Triterpenoid + + Alkaloid + + Cournarin - - Anthraquinon - - Flavonoid - - Glycosid tim - - Tannin - - Các chất khử - - Acid hữu cơ + + Saponin + + Polyuronid + + Steroid - - Thử tinh khiết Độ ẩm trung bình của dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô là 9,47% ± 0,09; Thạch hộc tự nhiên là 10,70% ± 0,11. Độ tro toàn phần trung bình của dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô là 4,52% ± 0,03; Thạch hộc tự nhiên là 5,79% ± 0,05. Độ tro không tan trong acid hydrochloric trung bình của dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô là 0,6% ± 0,01; Thạch hộc tự nhiên là 0,8% ± 0,05. Định tính bằng phương pháp hóa học Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên và Thạch hộc nuôi cấy môt đều cho phản ứng dương tính với các thuốc thử của hợp chất alkaloid. Bảng 3. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Ống 1: dịch acid (đối chứng) Vàng trong Vàng trong Ống 2: dịch acid + TT Mayer Tủa vàng nhạt Tủa vàng nhạt Ống 3: dịch acid + TT Dragendroff Tủa đỏ cam Tủa đỏ cam Ống 4: dịch acid + TT Bouchardat Tủa đỏ nâu Tủa đỏ nâu Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 74 Dịch chiết từ Thạch hộc tự nhiên và Thạch hộc nuôi cấy mô đều cho phản ứng dương tính với phản ứng tạo bọt (lớp bọt bền hơn 30 phút). Bảng 4. Phản ứng hóa học định tính saponin trong nguyên liệu Phản ứng Thạch hộc nuôi cấy mô Thạch hộc tự nhiên Ống chứng Ống mẫu thử Ống chứng Ống mẫu thử Phản ứng tạo bọt Không tạo bọt Bọt bền trong 30 phút Không tạo bọt Bọt bền trong 30 phút Phản ứng Libermann Burchard Trắng trong Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Trắng trong Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Bảng 5. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất saponin trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Toluen - ethyl acetate - acid formic (2:7:1) Rf = 0,63 Rf = 0,81 Rf = 0,63 Rf = 0,81 Chloroform - methanol (9:1) Rf = 0,46 Rf = 0,81 Rf = 0,46 Rf = 0,81 Nhận xét: trên sắc kí đồ, Thạch hộc nuôi cấy và tự nhiên có các vết có Rf và màu sắc tương đồng. Xác định sự hiện diện của hợp chất alkaloid Bảng 6. Sắc ký lớp mỏng định tính hợp chất alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Chloroform: methanol: ammoniac (40:5:1) Rf = 0,71 Rf = 0,71 Nhận xét: trên sắc kí đồ, Thạch hộc nuôi cấy mô có các vết có Rf và màu sắc tương đồng với các vết của Thạch hộc tự nhiên. Định lượng Bảng 7. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Khối lượng mẫu thử (g) 3,0026 3,0012 3,0026 3,0046 3,0018 3,0022 Cắn alkaloid (g) 0,0277 0,0251 0,0262 0,0160 0,0146 0,0169 Hàm lượng alkaloid (%) 1,02 0,92 0,96 0,60 0,54 0,63 Trung bình (%) 0,97 % ± 0,03 0,59 % ± 0,03 Bảng 8. Định lượng saponin trong nguyên liệu Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên Thạch hộc nuôi cấy Thạch hộc tự nhiên Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Khối lượng mẫu thử (g) 3,0021 3,0018 3,0042 3,0030 3,0012 3,0001 Cắn saponin (g) 0,0986 0,1014 0,1025 0,0603 0,0605 0,0578 Hàm lượng saponin (%) 3,63 3,73 3,77 2,25 2,26 2,16 Trung bình (%) 3,71 % ± 0,04 2,22 % ± 0,03 Chiết xuất cao Thạch hộc nuôi cấy mô với khối lượng dược liệu là 850g thu được 180g cao, hiệu suất đạt được là 19,77%. Thạch hộc tự nhiên với khối lượng dược liệu là 700g thu được 72g cao, hiệu suất đạt được là 8,2%. Tiêu chuẩn hóa cao chiết Hình thức cảm quan Hai cao đều có thể chất quánh, màu đen, mùi thơm nhẹ, vị ngọt. Thử tinh khiết Độ tan: cả 2 mẫu cao thạch hộc nuối cấy mô và Thạch hộc tự nhiên đều tan trong 20ml nước. Độ ẩm trung bình của cao Thạch hộc nuôi cấy mô là 13,83% ± 0,15, Thạch hộc tự nhiên là 15,51% ± 0,03. Độ tro toàn phần trung bình của cao Thạch hộc nuôi cấy mô là 4,22% ± 0,02, Thạch hộc tự nhiên là 3,91% ± 0,02. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 75 Định tính bằng phương pháp hóa học Bảng 9. Phản ứng hóa học định tính alkaloid trong cao Cao Thạch hộc nuôi cấy Cao Thạch hộc tự nhiên Ống 1: dịch chiết cao (đối chứng) Vàng trong Vàng trong Ống 2: dịch chiết cao + TT Dragendroff Tủa đỏ cam Tủa đỏ cam Ống 3: dịch acid + TT Tủa đỏ nâu Tủa đỏ nâu Cao Thạch hộc nuôi cấy Cao Thạch hộc tự nhiên Bouchardat Ống 4: dịch acid + TT Mayer Tủa vàng nhạt Tủa vàng nhạt Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên và cao Thạch hộc nuôi cấy mô đều cho phản ứng dương tính với các thuốc thử của hợp chất alkaloid. Bảng 10. Phản ứng hóa học định tính saponin trong cao Phản ứng Cao Thạch hộc nuôi cấy mô Cao Thạch hộc tự nhiên Ống chứng Ống mẫu thử Ống chứng Ống mẫu thử Phản ứng tạo bọt Không tạo bọt Bọt bền trong 30 phút Không tạo bọt Bọt bền trong 30 phút Phản ứng Libermann Burchard Trắng trong Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Trắng trong Vòng ngăn cách màu nâu đỏ Nhận xét: dịch chiết cao Thạch hộc tự nhiên và cao Thạch hộc nuôi cấy đều cho phản ứng dương tính với phản ứng tạo bọt và phản ứng Libermann Buchard. Đ ị nh tính bằ ng phư ơ ng pháp sắ c ký lớ p mỏ ng Trên sắc kí đồ, nguyên liệu nuôi cấy có 2 vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có 2 vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao tự nhiên, cao tự nhiên có 6 vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao nuôi cấy mô (Bảng 11). Trên sắc kí đồ, nguyên liệu nuôi cấy mô có vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao nuôi cấy mô, nguyên liệu tự nhiên có vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao tự nhiên, cao tự nhiên có vết có Rf và màu sắc tương đồng với vết của cao nuôi cấy mô (Bảng 12). Bảng 11. Sắc ký lớp mỏng định tính alkaloid trong cao Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Cao Thạch hộc nuôi cấy mô Dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô Cao Thạch hộc tự nhiên Dược liệu Thạch học tự nhiên Cao Thạch hộc nuôi cấy mô Cao Thạch hộc tự nhiên Chloroform: methanol: ammoniac (40:5:1) Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Rf = 0,65 Rf = 0,71 Bảng 12. Sắc ký lớp mỏng định tính saponin trong cao Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Cao Thạch hộc nuôi cấy mô Dược liệu Thạch hộc nuôi cấy mô Cao Thạch hộc tự nhiên Dược liệu Thạch học tự nhiên Cao Thạch hộc nuôi cấy mô Cao Thạch hộc tự nhiên Chloroform: methanol (9:1) Rf = 0,44 Rf = 0,52 Rf = 0,82 Rf = 0,44 Rf = 0,52 Rf = 0,82 Rf = 0,44 Rf = 0,52 Rf = 0,82 Rf = 0,44 Rf = 0,52 Rf = 0,82 Rf = 0,46 Rf = 0,68 Rf = 0,94 Rf = 0,46 Rf = 0,68 Rf = 0,94 Định lượng Bảng 13. Định lượng alkaloid trong nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên Cao Thạch hộc nuôi cấy Cao Thạch hộc tự nhiên Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Khối lượng mẫu thử (g) 1,0031 1,0028 1,0011 1,0032 1,0038 1,0011 Cắn alkaloid (g) 0,0277 0,0280 0,0261 0,0227 0,0237 0,0211 Hàm lượng alkaloid (%) 3,27 3,30 3,09 2,63 2,74 2,45 Trung bình (%) 3,22 % ± 0,07 2,60 % ± 0,08 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 76 Bảng 14. Định lượng saponin trong nguyên liệu cao Thạch hộc nuôi cấy mô và tự nhiên Cao Thạch hộc nuôi cấy Cao Thạch hộc tự nhiên Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Khối lượng mẫu thử (g) 0,502 0,5005 0,5012 0,5018 0,5006 0,5022 Cắn saponin (g) 0,0651 0,0670 0,0662 0,0508 0,0494 0,0516 Hàm lượng saponin (%) 15,35 15,84 15,63 11,75 11,45 11,92 Trung bình (%) 15,61% ± 0,14 11,71% ± 0,14 BÀN LUẬN Trong thử nghiệm độc tính cấp, liều cao nhất có thể bơm được qua kim đầu tù cho chuột uống là 25 g cao/kg chuột (tương đương 116,87 g cao/kg người, khoảng 126,45 g dược liệu khô) đối với cao Thạch hộc nuôi cấy mô và 28,6 g cao/kg chuột (tương đương 133,7 g cao/kg người, khoảng 348,78 g dược liệu khô) đối với cao Thạch hộc tự nhiên. Ở liều này, thuốc ở dạng hỗn dịch rất đậm đặc vừa đủ qua đầu kim để có thể bơm thuốc vào dạ dày chuột. Sau khi uống thuốc, chuột vẫn ăn uống, hoạt động và bài tiết bình thường, không thấy có biểu hiện ngộ độc ở chuột và không có chuột nào chết trong vòng 72 giờ và suốt 2 tuần tiếp theo sau khi uống thuốc. Do đó chưa xác định được độc tính cấp và chưa tính được LD50 của cao trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Theo liều lượng sử dụng trong DĐVN IV, cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam (Viện dược liệu), các đơn thuốc kinh nghiệm, khối lượng dược liệu Thạch hộc sử dụng mỗi ngày khoảng 6 - 12 g dược liệu khô. Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên dùng liều duy nhất với lượng gấp 10,5 lần và 29 lần lượng thường sử dụng, cho thấy khoảng cách an toàn rộng. Hiện nay Thạch hộc là dược liệu quý hiếm, được đưa vào sách đỏ, cần được bảo tồn(7). Nên xu hướng mới là áp dụng công nghệ sinh học thực vật để tạo nguồn dược liệu với lượng lớn và chất lượng cao(6). Tuy nhiên chưa có nghiên cứu so sánh hoạt chất hóa học trong Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên. Do đó cần làm rõ các hoạt chất có trong các sản phẩm Thạch hộc nuôi cấy mô từ việc áp dụng công nghệ sinh vật thực vật so với Thạch hộc trồng tự nhiên để chủ động tạo được nguồn dược liệu quý hiếm và đạt chất lượng cao. Qua Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của 2 mẫu dược liệu đều có tinh dầu, triterpenoid, acid hữu cơ, polyuronid, alkaloid và saponin, ta thấy có sự tương đồng về các thành phần hóa học của 2 mẫu Thạch hộc nuôi cấy và Thạch hộc tự nhiên.Khảo sát một số tiêu chuẩn của cao chiết cồn mẫu Thạch hộc nuôi cấy mô và mẫu tự nhiên về hình thức cảm quan, độ tan trong nước, độ ẩm, độ tro toàn phần đạt theo tiêu chuẩn cơ sở. Định tính bằng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng đã chứng minh được trong cả 2 mẫu cao đều có hợp chất alkaloid và hợp chất saponin. Kết quả này cũng phù hợp với báo cáo của Wang X. K.và cộng sự trong Thạch hộc tự nhiên có hợp chất Alkaloid (Dendrobin)(8). Định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có 3,22% alkaloid và 15,61% saponin. Cao Thạch hộc tự nhiên có 2,6% alkaloid và 11,71% saponin. Điều này cho thấy cao Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid cao gấp 1,2 và hàm lượng saponin cao gấp1,3 lần cao Thạch hộc tự nhiên. Việc phân tích sơ bộ thành phần hợp chất trong nguyên liệu Thạch hộc cũng như cao Thạch hộc góp phần tạo cơ sở cho việc phân tích xác định cấu trúc các hợp chất chính alkaloid và saponin trong Thạch hộc. Và việc định lượng 2 hợp chất alkaloid và saponin bằng phương pháp cân tạo tiền đề cho việc xây dựng qui trình định lượng sắc ký cao hơn. Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về tính an toàn và tác dụng dược lý của Thạch hộc nuôi cấy mô. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 5 * 2018 Nghiên cứu Y học 77 KẾT LUẬN Độc tính cấp 2 cao: Cả 2 mẫu cao không gây biểu hiện độc tính cấp ở liều tối đa có thể cho uống. Cao Thạch hộc nuôi cấy mô có Dmax là 25 g cao/kg chuột, cao Thạch hộc tự nhiên có Dmax là 28,6 g cao/kg chuột. So sánh thành phần hóa học của cao Thạch hộc nuôi cấy mô và cao Thạch hộc tự nhiên:định tính cả 2 cao đều có hàm lượng alkaloid và saponin, định lượng cao Thạch hộc nuôi cấy mô có hàm lượng alkaloid và saponin cao hơn so với cao Thạch hộc tự nhiên. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ môn Dược liệu (2011). Phương pháp nghiên cứu dược liệu (tài liệu lưu hành nội bộ). Đại học Y Dược TP. HCM, tr. 1 – 16. 2. Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học, tr. 894-895. 3. China’s Pharmarcopoiea, Part One (1977). The People’s Health Sciences Publication C. Beijing (Peking), China, pp. 145. 4. Đỗ Trung Đàm (1996). Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 6-24, 50-57. 5. Lee YH, Jong DP, Nam IB, Shin IK, Byung ZA (1995). "In Vitro and In Vivo Antitumoral Phenanthrenes from the Aerial Parts of Dendrobium nobile". Planta Medica; 61(2): 178-180. 6. Viện Dược Liệu (2011). Công Trình Nghiên Cứu Khoa Học Viện Dược Liệu 2006-2011. NXB Khoa Học và Kỹ Thuật, tr.164-169. 7. Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (2007). Sách Đỏ Việt Nam. NXB Khoa học tự nhiên và công nghệ, tr. 57-60. 8. Wang XK, Zhao T, Che CH (1985). “Dendrobine and 3- Hydroxy-2-Oxodendrobine from Dendrobium nobile”. Journal of Natural Produm; 48(5): 796-801. Ngày nhận bài báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/06/2018 Ngày bài báo được đăng: 20/09/2018