Khảo sát quy trình chuỗi polymerase (PCR) phát hiện một số loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 429 KHẢO SÁT QUY TRÌNH CHUỖI POLYMERASE (PCR) PHÁT HIỆN MỘT SỐ LOÀI LACTOBACILLUS TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG Lê Thị Hiên*, Trần Nguyễn Minh Đoan* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Probiotic là những vi sinh vật có lợi, được bổ sung trong nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng – trong đó Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi khuẩn probiotic. Các nhà sản xuất thường công bố tên loài vi khuẩn Lactobacillus trên bao bì nhằm tăng giá trị của sản phẩm. Hiện nay, các phương pháp truyền thống để xác định loài Lactobacillus còn hạn chế và phương pháp dựa trên sinh học phân tử được xem là giải pháp tiềm năng. Để có được phương pháp hiệu quả nhằm thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực phẩm chức năng được Bộ Y tế giao phó, đồng thời đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng phương pháp định danh một số loài Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật PCR. Mục tiêu: Khảo sát và lựa chọn quy trình phát hiện 9 loài Lactobacillus trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp PCR có thể áp dụng tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm An toàn Thực phẩm Khu vực phía Nam, Viện Y tế công cộng TP. Hồ Chí Minh. Phương pháp nghiên cứu: Lựa chọn quy trình tách chiết DNA; khảo sát độ đặc hiệu của mồi; tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR; khảo sát mức phát hiện LOD50 của phương pháp; ứng dụng quy trình phân tích một số mẫu thực tế. Kết quả: Chúng tôi đã lựa chọn được 9 cặp mồi đặc hiệu cho 9 loài vi khuẩn Lactobacillus, bao gồm: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus, L. fermentum và L. sakei. Mức phát hiện LOD50 của các phương pháp này đều ở mức thấp (dưới 3 CFU/g): thấp nhất 0,7 CFU L. acidophilus /g và cao nhất 2,5 CFU L. sakei /g trong nền mẫu thực phẩm chức năng dạng lỏng; thấp nhất 0,8 CFU L. reuteri /g đến cao nhất 2,7 CFU L. sakei /g đối với mẫu thực phẩm chức năng dạng bột. Phương pháp có độ chọn lọc tốt, chỉ phát hiện đặc hiệu đúng chủng mục tiêu. Kết luận: Quy trình bước đầu có thể đưa vào áp dụng để phát hiện 9 loài vi khuẩn Lactobacillus trong thực phẩm chức năng. Từ khóa: phản ứng PCR, probiotic ABSTRACT SURVEYING POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) METHOD TO DETECT SOME LACTOBACILLUS SPECIES IN FUNCTIONAL FOOD Le Thi Hien, Tran Nguyen Minh Doan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 5 - 2019: 429 – 437 Background: Probiotics are live microorganisms that benefit the host's health. Most of the probiotics in many functional food products are lactobacilli. These bacteria are labeled to increase the value of the product. Currently, traditional methods to identify Lactobacillus species are limited and methods based on molecular biology are considered potential solutions. In order to have an effective method to perform the monitoring functional food products follow requirements of the Ministry of Health and at the same time to meet the testing needs of customers, we implemented this study to develop the rapid method for identification some common *Viện Y Tế Công Cộng TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Lê Thị Hiên ĐT: 0938640803 Email: lethihien@iph.org.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 430 Lactobacillus species used in functional foods by PCR technique. Objectives: Assess and select PCR method to detect 9 Lactobacillus species in functional foods that can be applied in microbiology laboratory of The Southern Regional Centre of Food Safety, Institute of Public Health, Ho Chi Minh City. Methods: Select the DNA extraction procedures; assess the primers’ specificity; optimize PCR conditions; survey the detection level 50 (LOD50) of the method; apply PCR method to analyse samples. Results: 9 specific primer pairs were selected for 9 Lactobacillus species, including: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus, L. fermentum and L. sakei. The detection level (LOD50) of these methods was low (below 3 CFU / g): range from 0.7 CFU L. acidophilus / g to 2.5 CFU L. sakei / g in the background of liquid functional food and from 0.8 CFU L. reuteri/g to 2.7 CFU L. sakei/g for powdered functional food. The PCR methods had good selectivity, and could be applied on actual samples. Conclusions: The methods can be applied to detect these Lactobacillus species in functional foods in our microbiological laboratory. Keywords: polymerase chain reaction, probiotics ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic là những vi sinh vật còn sống khi đưa vào cơ thể một lượng vừa đủ sẽ mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ(6). Vì những lợi ích mà probiotic mang lại cũng như sự tự do lựa chọn sử dụng của người tiêu dùng nên tình hình sản xuất và tiêu thụ các sản phẩm probiotic gia tăng không ngừng. Doanh số bán các sản phẩm probiotic có xu hướng gia tăng trên phạm vi toàn cầu với tỷ lệ 35%: từ 23,1 tỷ đô la Mỹ (năm 2010) lên 31,3 tỷ đô la Mỹ (năm 2014)(12). Lactobacillus là nhóm chủ yếu trong số các vi khuẩn probiotic, được bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm chức năng. Tuy nhiên, trước khi được cho phép bổ sung vào trong thực phẩm như một probiotic, các chủng vi khuẩn Lactobacillus cần phải được nghiên cứu và chứng minh khả năng mang lại lợi ích cho sức khỏe cũng như an toàn cho con người(7). Vì thế, chỉ có 1 số ít loài Lactobacillus được xem là vi khuẩn probiotic và được phép đưa vào sử dụng cho con người. Hiện nay, trên thị trường Việt Nam, có hơn 15 sản phẩm thực phẩm chức năng được dán nhãn bổ sung các loài Lactobacillus. Tuy nhiên, thông tin này cần được giám sát và kiểm tra bởi các cơ quan chức năng – trong đó, Viện Y tế công cộng Thành phố Hồ Chí Minh đóng vai trò không nhỏ. Hiện nay, có 3 nhóm kỹ thuật chính để xác định loài Lactobacillus. Các phương pháp vi sinh truyền thống dù được xem là tiêu chuẩn vàng, nhưng số lượng loài vi khuẩn Lactobacillus có thể xác định được còn hạn chế. Các phương pháp dựa trên proteomics lại phát triển trên các thiết bị, máy móc kỹ thuật cao và đắt tiền. Vì thế, các phương pháp định danh ở cấp độ loài dựa trên kiểu gen được khuyến cáo đưa vào ứng dụng nhiều hơn vì chúng cho kết quả nhanh và chính xác hơn - trong số đó, phương pháp PCR là phương pháp tương đối đơn giản và phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm vi sinh vật. Để có được phương pháp hữu hiệu nhằm thực hiện chức năng giám sát sản phẩm thực phẩm chức năng cũng như đáp ứng nhu cầu kiểm nghiệm của khách hàng, chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm xây dựng phương pháp định danh một số loài Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức năng bằng kỹ thuật PCR. Mục tiêu nghiên cứu Khảo sát quy trình xác định 9 loài vi khuẩn Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức năng: L. acidophilus, L. rhamnosus, L. casei, L. plantarum, L. bulgaricus, L. reuteri, L. pentosus, L. fermentum và L. sakei thông qua việc lựa chọn mồi đặc hiệu, quy trình tách chiết DNA và tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 431 Khảo sát mức phát hiện LOD50 và độ chọn lọc của quy trình. Ứng dụng quy trình để kiểm tra một số mẫu thực phẩm chức năng trên thị trường. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu này tiến hành trên các chủng vi khuẩn Lactobacillus mục tiêu và chủng không mục tiêu được liệt kê trong bảng 1. Chủng vi khuẩn L. reuteri và L. pentosus phân lập từ thực phẩm chức năng và đã được tiến hành định danh theo phương pháp PCR - giải trình tự. Bảng 1: Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu Chủng vi sinh vật mục tiêu Chủng vi sinh vật không mục tiêu Lactobacillus fermentum ATCC 9338 Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus casei ATCC 334 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei ATCC BAA-52 Lactobacillus plantarum ATCC 8014 Lactococcus lactis ATCC 19435 Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103 Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 Bifidobacterium animalis subsp. lactis ATCC 25527 Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus ATCC 11842 Bifidobacterium breve ATCC 15700 Lactobacillus sakei ssp. sakei ATCC 15521 Bacillus cereus ATCC 10876 Lactobacillus reuteri Bacillus subtilis ATCC 6633 Lactobacillus pentosus Escherichia coli ATCC 11775 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Listeria monocytogenes ATCC 19115 Salmonella Typhimurium ATCC 13311 Shigella sonnei ATCC 9290 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Vibrio parahaemolyticus ATCC 1780 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Cronobacter sakazakii BCRC 13988 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA vi khuẩn Thực hiện trên 3 quy trình: Phương pháp tách chiết bằng nhiệt Ly tâm 1ml dịch nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn ở 10.000g/ 5 phút/ 20- 250C. Sau khi ly tâm, đổ bỏ dịch nổi và rửa sinh khối trong 1mL NaCl 0,85%. Vortex hỗn dịch và ly tâm ở 10.000g/10 phút ở 20 – 250C. Loại bỏ dịch nổi và huyền phù sinh khối trong 0,5ml TE 1X. Đun sôi 95oC/15 phút, sau đó đặt ống trong đá 5 phút. Ly tâm 10.000g/5 phút/200C - 250C. Chuyển 400µl dịch nổi chứa DNA vi khuẩn sang tube 1,5 ml mới. DNA vi khuẩn được bảo quản ở -200C. Phương pháp tách chiết A Phương pháp này được điều chỉnh lại quy trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự(1). Trong đó, chúng tôi loại bỏ bước bổ sung RNase A để xây dựng quy trình tách chiết A cho phòng thí nghiệm. Phương pháp tách chiết bằng bộ kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, nước sản xuất) Huyền dịch sau tách chiết được đo độ hấp thụ ánh sáng với máy đo OD (Quawell Q5000, Mỹ) tại các bước sóng 230, 260, 280 nm, thu được các giá trị A230, A260, A280. DNA được đánh giá tinh sạch khi có tỷ số A260/A280 thuộc khoảng 1,8 – 2,0 và tỷ số A260/A230 tốt nhất nếu lớn hơn 1,5. Lựa chọn mồi Tham khảo một số nghiên cứu đã công bố trước đó về quy trình PCR phát hiện một số vi khuẩn Lactobacillus trong thực phẩm (liệt kê trong Bảng 2). Các trình tự mồi đã được kiểm tra mô hình bằng chương trình BLAST trên NCBI. Các mồi phù hợp được chọn và đưa vào trong nghiên cứu. Bảng 2: Trình tự mồi và kích thước sản phẩm PCR được sử dụng trong nghiên cứu Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham khảo Lactobacillus LacF AGCAGTAGGGAATCTTCCA 94°C/2p, 25 x (94°C/15s, 345 (8) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 432 Mục tiêu Mồi Trình tự mồi (5’ – 3’) Chu trình nhiệt Sản phẩm (bp) Tham khảo spp. LacR ATTTCACCGCTACACATG 51°C/15s, 72°C/30s), 72°C/5p L. casei casei-F TTATCATGTGGCCGAACAAA 98 o C/30s, 35x (98 o C/30s, 60 o C/30s, 72 o C/30s); 72 o C/5p 858 (5) casei-R GTTTGCGTCAAAGTCTGCAA L. pentosus pentF CAGTGGCGCGGTTGATATC 94 o C/1p, 30 x (94 o C/1p, 55 o C/30s, 72 o C/1p); 72 o C/5p 219 (14) pREV TCAGGGTTTCCAAACATCAC L. delbrueckii sp. bulgaricus 16SbulF AACATGAATCGCATGATTCAAGTTTG 95 o C/5p, 25 x (95 o C/20s, 62 o C/30s, 72 o C/1p); 72 o C/5p 675 (10) 16SbulR ACCGGAAAGTCCCCAACACCTA L. acidophilus Laci-F TGCAAAGTGGTAGCGTAAGC 95 o C/4p; 35 x (95 o C/20s; 62 o C/30s; 72 o C/30s); 72 o C/5p 207 (11) Laci-R CCTTTCCCTCACGGTACTG L. reuteri Lreu-F CAGACAATCTTTGATTGTTTAG 95 o C/4p; 35 x (95 o C/20s; 60 o C/30s; 72 o C/30s); 72 o C/5p 305 (11) Lreu-R GCTTGTTGGTTTGGGCTCTTC L. plantarum Lpla-F ATTCATAGTCTAGTTGGAGGT 95 o C/4p; 35 x (95 o C/20s; 60 o C/30s; 72 o C/30s); 72 o C/5p 248 (11) Lpla-R CCTGAACTGAGAGAATTTGA L. rhamnosus Lrha-F CTAGCGGGTGCGACTTTGTT 95 o C/4p; 35 x (95 o C/ 20s; 62 o C/30s; 72 o C/30s); 72 o C/5p 113 (11) Lrha-R GCGATGCGAATTTCTATTATT L. fermentum Lfer-F ACTAACTTGACTGATCTACGA 95 o C/4p; 35 x (95 o C/20s; 60 o C/30s; 72 o C/30s); 72 o C/5p 191 (11) Lfer-R TTCACTGCTCAAGTAATCATC L. sakei sakeiF GAGCTTGCTCCTCATTGATAA 94 o C/5p; 35 x (95 o C/ 20s; 58 o C/30s; 72 o C/ 30s); 72 o C/ 5p 433 (3) sakeiR TTGGATACCGTCACTACCTG Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi Nuôi cấy tăng sinh chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn Lactobacillus và Bifidobacterium sp. được nuôi trong môi trường canh thang De Man Rogosa Sharpe (MRS, Merck - Đức) ở 37oC trong 48 giờ ở điều kiện kỵ khí. Chủng vi khuẩn khác được nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng được nuôi cấy trên môi trường Tryptic Soy Broth (TSB, Merck - Đức) ở 37oC trong 24 giờ. Phản ứng PCR và diễn giải kết quả Mỗi chủng được tiến hành phân tích một lần theo quy trình nhiệt được trình bày trong bảng 2. Thành phần các phản ứng PCR bao gồm: 1X G2 Green GoTaq buffer, 0,5 µM mồi, 10 – 50ng DNA khuôn. PCR được tiến hành trên máy luân nhiệt Eppendorf Nexus. Sau đó, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, chạy ở điện thế 100V trong 35 phút; cuối cùng, gel được nhuộm với thuốc nhuộm Diamond Nucleic Acid Dye (Promega) và quan sát dưới đèn UV. Các phản ứng PCR cho kết quả vạch điện di không rõ ràng, có sản phẩm phụ hoặc không đặc hiệu sẽ được tiến hành tối ưu hóa bằng cách thay đổi 2 thông số sau với Hot-start Taq polymerase (Takara, Nhật) với thành phần bao gồm 1X Takara PCR buffer, 0,2 mM dNTP mỗi loại, 0,4U Hot Start Taq Polymerase, 0,5 µM mồi, 10 - 50ng DNA khuôn, nồng độ MgCl2 được thay đổi từ 1,5 - 5,5 mM; nhiệt độ bắt cặp thay đổi trong khoảng ± 5oC. Khảo sát một số thông số của quy trình Xác định mức phát hiện LOD50 Với nền mẫu này, chúng tôi lựa chọn 2 loại mẫu khác nhau: thực phẩm chức năng dạng bột và dạng lỏng. Các mẫu thực phẩm chức năng đã được kiểm tra trước cho thấy không có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus. Chuẩn bị 50 mẫu trắng. Mỗi mẫu được tiến hành cân 1g (hoặc 1mL) mẫu vào ống nghiệm chứa 9 mL dung dịch canh thang MRS. Chuẩn bị huyền dịch các chủng vi khuẩn ở 4 mức bậc 2: 20, 2-1, 2-2, 2-3. Tiến hành nhiễm 1 mL từ các ống chủng này vào huyền dịch mẫu (1g mẫu + 9ml canh thang MRS). Mức nhiễm 0 CFU và 101 CFU: mỗi mức được tiến hành trên 5 mẫu; 3 mức nhiễm còn lại: mỗi mức được tiến hành trên 10 mẫu. Lượng vi khuẩn bổ sung sẽ đồng thời được trải 1ml trên đĩa thạch MRS. Các mẫu được phân Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 433 tích theo quy trình. LOD50 được tính theo phương pháp Spearman-Karber(9). Xác định độ chọn lọc Độ chọn lọc của phương pháp thể hiện qua tính chọn lọc bao hàm và chọn lọc loại trừ. Các chủng vi khuẩn mục tiêu được chuẩn bị với lượng gấp 10 lần mức phát hiện trong 1 ml huyền dịch mẫu. Chọn các chủng vi khuẩn không mục tiêu thường được bổ sung trong thực phẩm chức năng có khả năng gây phản ứng chéo với chủng mục tiêu. Các chủng này được chuẩn bị với lượng gấp 100 lần mức phát hiện trong 1 ml huyền dịch. Bổ sung 1 ml huyền dịch vi khuẩn được cho vào 9 ml canh thang MRS, đồng thời được trải và kiểm tra trên đĩa thạch không chọn lọc thích hợp. Mẫu sẽ được tiến hành phân tích 1 lần theo quy trình nghiên cứu và ghi nhận kết quả. Áp dụng quy trình để phân tích trên một số mẫu thực phẩm chức năng thực tế Chúng tôi tiến hành thu thập 20 mẫu thực phẩm chức năng (2 mẫu ở dạng lỏng và 18 mẫu ở dạng bột) được bán tại các nhà thuốc tại TP. Hồ Chí Minh, ghi nhận thông tin bao bì và tiến hành phân tích theo quy trình đang khảo sát. KẾT QUẢ Lựa chọn quy trình tách chiết DNA Bước đầu tiên trong nghiên cứu và phân tích về mặt di truyền từ bất kỳ sinh vật nào là quá trình tách chiết và tinh sạch DNA chất lượng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn lựa chọn một phương pháp tách chiết phù hợp cho phân tích PCR từ vi khuẩn Lactobacillus. Từ cùng 1 dịch nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus sau 48 giờ, chúng tôi tiến hành tách chiết theo 3 phương pháp: nhiệt, quy trình A và bộ kit Promega. Để đánh giá hiệu quả của các phương pháp tách chiết, các tỷ số độ hấp thụ A260/A280, A260/A230 và nồng độ DNA của dịch sau tách chiết được so sánh với nhau, kết quả được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3: So sánh kết quả tách chiết DNA từ 3 phương pháp khác nhau STT Chủng vi khuẩn A260/A280 A260/A230 [DNA] (ng/µl) Nhiệt A Kit Nhiệt A Kit Nhiệt A Kit 1 L. acidophilus 1,58 2,18 1,86 0,95 1,83 1,84 143,6 459,5 323,0 2 L. rhamnosus 1,56 2,25 2,00 1,15 2,14 2,30 279,8 599,7 369,1 3 L. bulgaricus 1,45 2,11 2,34 0,88 1,88 1,79 122,6 547,4 368,0 4 L. casei 1,60 2,12 1,98 1,04 1,94 2,19 199,9 227,2 348,8 5 L. fermentum 1,57 2,22 1,83 0,90 1,99 1,87 190,4 503,2 236,0 6 L. plantarum 1,58 2,23 2,02 1,13 2,07 2,26 263,8 429,5 349,7 7 L. pentosus 1,39 2,20 2,14 0,93 2,03 2,23 105,2 601,2 353,7 8 L. reuteri 1,46 2,23 2,05 0,80 2,30 2,15 177,4 516,3 402,0 9 L. brevis 1,69 1,79 2,48 0,80 1,76 1,89 91,8 138,4 156,5 10 L. sakei 1,46 2,30 1,76 0,94 1,83 1,69 87,1 190,8 156,0 Trung bình 1,53 2,16 2,05 0,95 1,98 2,02 166,16 421,32 306,28 Phương pháp tách chiết bằng nhiệt cho sản phẩm sau tách chiết có tỷ lệ A260/A280, A260/A230 và hàm lượng DNA thấp nhất; trong khi 2 phương pháp tách chiết theo quy trình A (thay đổi từ quy trình của tác giả Alimolaei M và cộng sự (1)) và tách chiết bằng bộ kit Wizard® Genomic DNA Purification (Promega, Mỹ) cho các tỷ lệ xấp xủ bằng nhau. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi Để phát hiện các loài Lactobacillus khác nhau, một số tác giả đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các loài vi khuẩn này(2,4). Tham khảo nhiều công bố trước, dựa trên kết quả kiểm tra bằng chương trình BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), chúng tôi lựa chọn 9 cặp mồi cho 9 loài vi khuẩn Lactobacillus, với trình tự được liệt kê trong Bảng 2. Cặp mồi này giúp khuếch đại gen mục tiêu khác nhau, bao gồm vùng trình tự giữa gen mã hóa cho 16S RNA và 23S RNA (gọi là 16S-23S ISR), hoặc các gen giữ nhà (“house-keeping gene”) như recA, polA. Khi tiến hành phản ứng PCR trên 25 chủng vi khuẩn không mục tiêu, kết Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 434 quả cho thấy các cặp mồi này chỉ cho kết quả đặc hiệu cho vi khuẩn mục tiêu, đồng thời không cho sản phẩm trên chủng không mục tiêu. Hình 1 là kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ đặc hiệu mồi phát hiện L. fermentum (Hình 1). Hình 1: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu cặp mồi Lfer-F và Lfer-F phát hiện L. fermentum Giếng 1: L. acidophilus; 2: L. bulgaricus; 3: L. casei; 4: L. fermentum; 5: L. brevis; 6: L. pentosus; 7: L. plantarum; 8: L. reuteri; 9: L. rhamnosus; 10: L. sakei; 11: L. paracasei; 12: Lc. lactis; 13: E. coli; 14: S. aureus; 15: B. cereus; 16: B. subtilis; 17: S. Typhimurium; 18: Shi. sonnei; 19: P. aeruginosa; 20: En. faecalis; 21: S. thermophilus; 22: B. animalis; 23: B. lactis; 24: B. breve; 25: B. bifidum; 26: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp. Tối ưu hóa quy trình phát hiện L. reuteri Khi áp dụng quy trình phát hiện vi khuẩn L .reuteri, chúng tôi nhận thấy xuất hiện vạch sản phẩm phụ trên gel điện di bên cạnh sản phẩm chính (305 bp). Vì vậy, để phương pháp đạt được hiệu quả tốt, chúng tôi tiến hành tối ưu hóa phản ứng PCR này. Phương pháp Hot-start PCR có thể ngăn chặn sự kéo dài của DNA polymerase ở nhiệt độ thấp hơn, giảm các sản phẩm phụ không mong muốn. Thay đổi nồng độ magie cũng là một trong những cách thức đơn giản nhất để tối ưu hóa điều kiện phản ứng do tác động dễ thấy nhất lên tính nghiêm ngặt của phản ứng PCR. Hình 2: Kết quả thay đổi nồng độ MgCl2 để tối ưu hóa điều kiện phản ứng phát hiện L. reuteri. NC: chứng âm, số ghi trên mỗi giếng là nồng độ MgCl2 (tăng dần từ 1,5 - 5,5 mM). Lad: thang DNA 100bp Kết quả khảo sát cho thấy khi sử dụng phương pháp Hot start PCR với nồng độ magie thay đổi từ 1,5 mM đến 5,5 mM để phát hiện L. reuteri với sản phẩm có kích thước 305bp thì lượng sản phẩm phụ giảm dần (Hình 2). Phản ứng đạt điều kiện tối ưu ở 4,5mM Mg2+ với bộ kit Hot start PCR (Takara). Kết quả PCR khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp của phản ứng này không cho thấy có sự khác biệt. Khảo sát một số thông số của quy trình Mức phát hiện Bảng 4: Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của phương pháp trên nền mẫu thực phẩm chức năng (Đơn vị: CFU/ g hoặc mL) STT Vi khuẩn Thực phẩm chức năng dạng lỏng Thực phẩm chức năng dạng bột 1 L. acidophilus 0,7 1,3 2 L. bulgaricus 1,3 1,5 3 L. casei 1,0 1,2 4 L. fermentum 1,1 1,1 5 L. plantarum 1,8 1,4 6 L. pentosus 1,5 1,1 7 L. reuteri 1,0 0,8 8 L. rhamnosus 1,9 1,0 9 L. sakei 2,5 2,7 Kết quả xác định mức phát hiện LOD50 của phương pháp chúng tôi nghiên cứu trên 9 loài vi khuẩn Lactobacillus khác nhau được thể hiện 500 bp 500 bp 191 bp b) 500bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 435 trong Bảng 4. Xác định độ chọn lọc Hình 3. Kết quả kiểm tra độ chọn lọc của quy trình phát hiện L. plantarum Giếng 1: L. acidophilus; 2: L. bulgaricus; 3: L. casei; 4: L. fermentum; 5: L. brevis; 6: L. pentosus; 7: L. plantarum; 8: L. reuteri; 9: L. rhamnosus; 10: L. sakei; 11: L. paracasei; 12: Lc. lactis; 13: Chứng âm; Lad: Thang DNA 100bp Phương pháp được kiểm tra khả năng phát hiện chọn lọc các chủng vi khuẩn mục tiêu và không phát hiện đối với các chủng vi khuẩn không mục tiêu. Theo đó, các quy trình đều cho thấy có độ chọn lọc tốt: chỉ cho kết quả dương tính trên chủng vi khuẩn mục tiêu và âm tính trên chủng vi khuẩn không mục tiêu (Hình 3). Ứng dụng quy trình trên mẫu thực tế Chúng tôi thu thập ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức năng có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus để phân tích bằng quy trình xây dựng. Kết quả cho thấy trong tổng số 20 mẫu phân tích, có 5 sản phẩm không bổ sung loài vi khuẩn đúng như thông tin ghi trên bao bì (Bảng 5). Phần lớn các sản phẩm đều ghi nhãn có bổ sung vi khuẩn L. acidophilus (17/20 mẫu); tuy nhiên, theo kết quả phân tích, chỉ có 15/17 mẫu có phát hiện L. acidophilus và 2/17 mẫu không phát hiện vi khuẩn này (M6, M17). Bên cạnh đó, 2 mẫu (M2, M11) được nhà sản xuất công bố có chứa 3 loài vi khuẩn Lactobacillus khác nhau, tuy nhiên kết quả chỉ phát hiện 1 loài duy nhất. Bảng 5: Kết quả phân tích mẫu thực phẩm chức năng trên thực tế STT Mã số mẫu Thông tin ghi trên bao bì Kết quả phân tích L. acidophilus L. plantarum L. rhamnosus L. casei L. reuteri 1 M1 L. acidophilus + 2 M2 L. rhamnosus, L. plantarum, L. acidophilus + - - 3 M3 L. acidophilus + 4 M4 L. acidophilus + 5 M5 L. acidophilus + 6 M6 L. acidophilus + 7 M7 L. acidophilus + 8 M8 L. acidophilus + 9 M9 L. acidophilus + 10 M10 L. acidophilus + 11 M11 L. plantarum, L. casei, L. acidophilus + - - 12 M12 L. acidophilus + 13 M13 Lactobacillus - - + - - 14 M14 L. acidophilus - 15 M15 L. acidophilus + 16 M16 L. acidophilus + 17 M17 L. acidophilus - 18 M18 L. acidophilus + 19 M19 L. casei + 20 M20 L. reuteri + BÀN LUẬN Tách chiết DNA là một bước quan trọng trong một quy trình PCR, ảnh hưởng trực tiếp đến thành công của một phản ứng PCR. Kết quả so sánh các thông số của sản phẩm sau tách chiết bằng 3 phương pháp khác nhau thể hiện ở bảng 500 bp 248 bp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 436 3 cho thấy phương pháp tách bằng nhiệt cho thấy hiệu quả thấp nhất. Bên cạnh đó, quy trình A cho kết quả tương đương với phương pháp tách bằng bộ kit thương mại về 2 chỉ số: tỷ lệ A260/A280, A260/A230 nhưng có khả năng thu được DNA với hàm lượng cao nhất. Tỷ lệ hấp thụ ở 260 nm và 280 nm được sử dụng để đánh giá độ tinh khiết của DNA và RNA. Nucleic acid có độ hấp thụ cực đại ở 260 nm. Một tỷ lệ A260/A280 xấp xỉ 1,8 thường được chấp nhận cho DNA tinh sạch. Khi tỷ lệ này thấp hơn đáng kể có nghĩa là trong dịch sau tách chiết có thể có sự hiện diện của protein, phenol hoặc các chất tạp nhiễm khác có độ hấp thụ mạnh ở hoặc gần bước sóng 280 nm. Trong khi đó, tỷ lệ A260/A230 cũng được sử dụng như một thước đo thứ cấp về độ tinh sạch của acid nucleic. Giá trị A260/A230 mong muốn thường nằm trong khoảng 1,8 - 2,2(13). Dịch DNA sau tách chiết bằng quy trình A và kit có độ tinh sạch tốt hơn so với phương pháp tách chiết bằng nhiệt vì có tỷ lệ A260/A280 và tỷ lệ A260/A230 đều lớn hơn 1,9 – điều này có thể do 2 phương pháp này có trải qua các bước phân hủy và loại bỏ protein. Hàm lượng DNA thu được từ 3 phương pháp tách chiết mặc dù đều đạt mức để sử dụng cho phản ứng PCR nhưng trong 3 phương pháp nghiên cứu thì quy trình A cho thấy khả năng thu được DNA với hàm lượng cao nhất. Trong quy trình A, chính việc sử dụng lysozyme đồng thời với EDTA và Triton X-100 giúp tăng hiệu quả trong việc phá vỡ các tế bào vi khuẩn (1). Việc loại bỏ bước sử dụng RNase A trong quá trình tách chiết không làm thay đổi hiệu quả của quá trình tách DNA. So sánh về mặt kinh tế, quy trình A là phương pháp thích hợp có thể đưa vào ứng dụng tại phòng thí nghiệm. PCR là phương pháp được sử dụng rất phổ biến để phát hiện nhiều đối tượng, do tính đặc hiệu và đơn giản của chúng. Để bắt đầu phản ứng kéo dài khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu của enzyme Taq polymerase, PCR cần phải có các cặp mồi đặc hiệu. Thành công của phản ứng PCR phụ thuộc rất lớn vào cặp mồi này. Có 9 cặp mồi lựa chọn đưa vào trong nghiên cứu này đã được kiểm tra đạt độ đặc hiệu với chủng vi sinh vật mục tiêu. Các thông số của quy trình PCR được khảo sát có khả năng cho phản ứng PCR tốt. Tuy nhiên, trước khi đưa vào áp dụng phương pháp để xác định 9 loài vi khuẩn Lactobacillus trong thực phẩm chức năng tại phòng thí nghiệm, cần thiết phải đánh giá khả năng áp dụng phương pháp trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm với 2 thông số: mức phát hiện và độ chọn lọc. Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp có khả năng phát hiện các vi khuẩn Lactobacillus trong nền mẫu thực phẩm chức năng dạng lỏng với mật độ khá thấp: LOD50 đều dưới 5 CFU/g, trong đó thấp nhất là Lb. acidophilus (0,7 CFU/g) và cao nhất là Lb. sakei (2,5 CFU/g). LOD50 của phương pháp phát hiện 9 loài vi khuẩn Lactobacillus trên mẫu thực phẩm chức năng dạng bột dao động từ 0,8 CFU/ g (L. reuteri) - 2,7 CFU/ g (L. sakei). Thông qua bước tăng sinh trong canh thang MRS sau 48 giờ ở điều kiện kỵ khí, vi khuẩn có thể được phát hiện bằng phương pháp PCR chỉ với một số lượng thấp của vi khuẩn ban đầu trong mẫu. Phương pháp cũng thể hiện độ chọn lọc tốt khi chỉ phát hiện vi sinh vật mục tiêu và không cho phản ứng dương tính giả trên các chủng vi sinh vật không mục tiêu. Khi áp dụng phương pháp để phân tích ngẫu nhiên 20 mẫu thực phẩm chức năng có bổ sung vi khuẩn Lactobacillus, kết quả cho thấy có một số mẫu được ghi thông tin trên bao gì không đúng với thực tế (xem bảng 5). Như vậy cho thấy, trên thị trường thực phẩm chức năng, có một tỷ lệ không nhỏ các sản phẩm được ghi nhãn sai thực tế - thể hiện nhu cầu cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh được gian lận thương mại. KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, chúng tôi đã xây dựng phương pháp phát hiện 9 loài vi khuẩn Lactobacillus thường gặp trong thực phẩm chức năng với mức phát hiện: LOD50 đều dưới 3 CFU/g đối với cả 2 dạng thực phẩm chức năng khác nhau. Phương pháp cũng đồng thời có độ chọn lọc tốt, không cho kết quả dương tính giả Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 5 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 437 trên các chủng vi khuẩn không mục tiêu. Như vậy, quy trình có thể đưa vào ứng dụng tại phòng thí nghiệm vi sinh vật – Trung tâm Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm khu vực phía Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alimolaei M, Golchin M (2016). An Efficient DNA Extraction Method for Lactobacillus casei, a Difficult-to-Lyse Bacterium. Int J Enteric Pathog, doi:10.17795/ijep32472. 2. Amin M, Jorfi M, Khosravi AD, Samarbafzadeh AR, Sheikh AF (2009). Isolation and Identification of Lactobacillus casei and Lactobacillus plantarum from Plants by PCR and Detection of their Antibacterial Activity. J Biol Sci, 9(8):810–814. 3. Belfiore C, Raya RR, Vignolo GM (2013). Identification, technological and safety characterization of Lactobacillus sakei and Lactobacillus curvatus isolated from Argentinean anchovies (Engraulis anchoita). Springerplus, 2(1):1–8. 4. Bottari B, et al (2017). Effective identification of Lactobacillus casei group species: genome-based selection of the gene mutL as the target of a novel multiplex PCR assay. Microbiology, 163:950–960. 5. Cai H, Rodríguez BT, Zhang W, Broadbent JR, Steele JL (2007). Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus casei strains isolated from different ecological niches suggests frequent recombination and niche specificity. Microbiology, 153(8):2655–2665. 6. FAO (2001). Probiotics in food - Health and nutritional properties and guidelines for evaluation. Jt FAO/WHO Expert Consult Eval Heal Nutr Prop Probiotics Food Incl Powder Milk with Live Lact Acid Bact, 1-4:2. 7. FAO, WHO (2002). Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. URL: https://www.who.int/foodsafety/fs_management/en. 8. Karapetsas A, Vavoulidis E, Galanis A, Sandaltzopoulos R, Kourkoutas Y (2010). Rapid Detection and Identification only by Probiotic Lactobacillus casei ATCC 393 by Multiplex PCR. J Mol Microbiol Biotechnol, 18:156–161. 9. NMKL (2009). Protocol for the validation of alternative microbiological methods. NMKL, pp.5-12. 10. Prosekov A, Babich O, Bespomestnih K (2013). Identification of Industrially Important Lactic Acid Bacteria in Foodstuffs. Foods Raw Mater, 1(2):42–45. 11. Song Y, et al (2000). Rapid identication of 11 human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays using group- and species-specific primers derived from the 16S - 23S rRNA intergenic spacer region and its flanking 23S rRNA. FEMS Microbiol Lett, 187:167–173. 12. Statista (2014). Probiotic functional foods: global retail sales value by region 2012 - 2014. URL: www.statista.com/statistics/252941/probiotic-products-sales- worldwide-by-region/. 13. Thermo-Fisher-Scientific. T042-TECHNICAL Bull NanoDrop Spectrophotometers - Thermo Fish Sci. URL: doi:10.1002/jobm.19770170116. 14. Torriani S, Felis GE, Dellaglio F (2001). Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers. Appl Environ Microbiol, 67(8):3450–3454. Ngày nhận bài báo: 15/08/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 31/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019