Khảo sát một số đột biến gen Beta Globin hiếm gặp ở người Việt Nam bằng phương pháp NGS

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 400 KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐỘT BIẾN GEN BETA GLOBIN HIẾM GẶP Ở NGƯỜI VIỆT NAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP NGS Nguyễn Hồng Sơn*, Trần Tuấn Anh*, Nguyễn Lê Anh*, Nguyễn Thùy Trang*, Bạch Quốc Khánh*, Dương Quốc Chính* TÓM TẮT Mục tiêu: Từ kết quả nghiên cứu toàn quốc về đột biến gen globin, chúng tôi bước đầu nghiên cứu về đặc điểm một số đột biến gen beta globin hiếm gặp ở người Việt Nam. Đối tượng: Tổng số 58 mẫu máu ngoại vi của người nghi ngờ mang gen bệnh beta thalassemia với các tiêu chí sau: hồng cầu nhỏ (MCV 3,5%) và có kết quả PCR âm tính với 9 đột biến phổ biến trên gen beta globin. Phương pháp nghiên cứu: Mô tả cắt ngang. 12.555 mẫu máu ngoại vi chống đông bằng EDTA được tách chiết ADN và phân tích 9 đột biến gen beta globin bằng phương pháp PCR. 58 mẫu âm tính với PCR được tiếp tục chuẩn bị thư viện theo và giải trình tự gen trên hệ thống MiSeq (Illumina, Mỹ) để tìm các đột biến hiếm gặp. Kết quả: Kết quả phân tích đặc điểm đột biến của 58 mẫu nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự toàn bộ gen beta globin (HBB) bằng phương pháp NGS cho thấy tỷ lệ phát hiện ra đột biến là khá cao (chiếm 53%). Kiểu hình β0 / β chiếm tỷ lệ 71%, trong đó đột biến codon 26 (G>T) tạo bộ ba kết thúc chiếm tỷ lệ cao nhất (51,6%) trên tổng số gen đột biến phát hiện được. Đột biến codon 15 (G>A) cũng tạo thành bộ ba kết thúc với kiểu hình β0 tương tự như codon26 (G>T). Các đột biến hiếm -29 (A>G), -30 (T>C) xảy ra tại vùng promoter của gen beta globin, gây rối loạn quá trình phiên mã. Đột biến IVS-II-848 (C>G), sự thay thế C ở vị trí 848 trên intron 2 đã làm giảm hiệu quả của việc lắp ráp mARN. Bên cạnh đó chúng tôi cũng phát hiện biến thể huyết sắc tố (Hope) hiếm gặp do đột biến trên gen beta globin. Kết luận: Chúng tôi phát hiện những đột biến gen beta globin hiếm gặp, mở rộng dữ liệu đột biến gen beta globin gây bệnh beta thalassemia tại Việt Nam; phát hiện ra biến thể huyết sắc tố bất thường (Hope) - một biến thể rất hiếm gặp trên thế giới, ở Việt Nam cũng chưa có báo cáo về biến thể này. Đồng thời chúng tôi cũng thấy được vai trò, giá trị của việc ứng dụng phương pháp giải trình tự gen NGS trong việc phát hiện đột biến hiếm cũng như đột biến mới. Từ đó nhìn ra được những mặt thiếu hụt dẫn đến nhầm lẫn, sai sót của phương pháp điện di huyết sắc tố. Còn nhiều đột biến trên gen beta globin mà chúng tôi chưa tìm ra, chúng tôi tin rằng nghiên cứu này góp phần trong việc phát hiện ra đột biến gen mới, đột biến gen hiếm gặp. Từ khóa: beta thalassemia, alen đột biến, kiểu gen β-globin ABSTRACT CHARACTERISTICS OF RARE BETA GLOBIN GENE MUTATIONS IN VIETNAM BY NGS METHOD Nguyen Hong Son, Tran Tuan Anh, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Trang, Bach Quoc Khanh, Le Xuan Hai, Duong Quoc Chinh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 6 - 2019: 400 - 408 Objective: From the results of a national study on thalassemia gene mutations, we initially studied the characteristics of some rare beta globin mutations in Vietnam. **Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương. Tác giả liên lạc: TS. Dương Quốc Chính ĐT: 0962168505 Email: chinh.duong@nihbt.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 401 Methods: A total of 58 peripheral blood samples of people carrying beta thalassemia gene with the following criteria: Microcytosis (MCV 3,5 %), negative for 9 common mutations in the beta globin gene. Cross-sectional description. 12,555 peripheral blood samples were subjected to extract DNA and performed PCR analysis for 9 common mutations of beta globin gene. 58 samples with PCR negative result were further analized with next-generation sequencing, using Illumina MiSeq sequencer, for rare mutation of beta globin gene. Results: The mutant characteristics of 58 subjects analysed by NGS sequencing which showed that the rate of mutant detection is quite high (53%). The phenotype β0 / β accounts for 71%, in which mutation codon 26 (G>T) creates a stop codon with the highest percentage (51.6%) of the total number of mutated genes detected. The codon 15 mutation (G>A) also forms a stop codon with a phenotype β0 similar to codon26 (G>T). Rare mutations -29 (A>G), -30 (T>C) occur in the promoter region of the β – globin gene, disrupting the transcription process. Mutation IVS-II-848 (C>G), replacement of C at position 848 on intron 2 to decreases the efficiency of splicing mRNA. In addition, we also found a rare hemoglobin variant (Hope) due to mutations in beta globin gene. Conclusion: We found the rare beta globin gene mutations and extended the beta globin mutation data in Vietnam; discovered the variant of abnormal hemoglobin (Hope) - a very rare variant in the world, this variant has not been reported in Vietnam before. At the same time, we also found the role and value of the application of NGS sequencing method in diagnosing the rare and new mutations. Since then, we found several shortcomings that lead to confusion and errors of hemoglobin electrophoresis. There are many mutations of the beta globin gene that we have not found, we believe that this study will contributed importantly to establish new gene mutations and rare gene mutations data. Keywords: beta thalassemia, mutant alleles, β-globin genotype ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia là nhóm bệnh hemoglobin di truyền do thiếu hụt tổng hợp một hay nhiều mạch polypeptid trong globin của hemoglobin. Tùy theo nguyên nhân đột biến ở gen alpha (α) hay gen beta (β) mà người ta chia thành α hoặc β thalassemia(14,17). Khác với bệnh alpha Thalassemia chủ yếu do các đột biến mất đoạn, beta Thalassemia hình thành chủ yếu do các đôt biến điểm. Năm 2007, có khoảng hơn 200 đột biến được mô tả; thì đến nay, đã có hơn 900 đột biến β-globin đã được xác định trên toàn thế giới (cập nhập tại Sự đa dạng đột biến đã đặt ra những vấn đề rất lớn trong các chương trình dự phòng, chống sinh ra những đứa trẻ bị bệnh thalassemia. Ở trên thế giới đã có rất nhiều bài báo, nghiên cứu về đột biến gen hiếm gặp và sự phát hiện của các đột biến mới(4,6,13,20). Tuy nhiên vẫn còn rất ít các nghiên cứu, các báo cáo về vấn đề này ở Việt Nam. Bên cạnh đó, cũng có nhiều biến thể huyết sắc tố do bất thường trên chuỗi beta globin đã được ghi nhận(24). Ngày nay, khi những tiến bộ trong việc phát hiện và xác định sự bất thường thông qua điện di huyết sắc tố và giải trình tự DNA, các biến thể hiếm, đột biến gen hiếm đã được xác định. Chính vì vậy, để góp phần cho công tác phòng bệnh chúng tôi thực hiện đề tài ‘‘Khảo sát một số đột biến gen beta globin hiếm gặp ở người Việt Nam bằng phương pháp NGS’’. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu được chọn lọc dựa trên một nghiên cứu cấp quốc gia về Thalassemia, thu thập từ hơn 23000 mẫu máu người dân đại diện cho 53 dận tộc của Việt Nam phân bố khắp các tỉnh thành cả nước. Các mẫu bệnh phẩm đã trải qua các vòng sàng lọc Thalassemia cộng đồng, đó là bộ 3 xét nghiệm cơ bản: tổng phân tích tế bào máu; định lượng sắt huyết thanh, Feritin và điện di huyết sắc tố; Các Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 402 mẫu có hồng cầu nhỏ (MCV<80 fL), nhược sắc (MCH<28 pg), tỷ lệ huyết sắc tố A2 tăng (HbA2>3,5%) là những đối tượng được nghi ngờ mang đột biến gen beta globin. Tổng cộng có 12.555 mẫu nghi ngờ mang đột biến gen globin đã được làm xét nghiệm vòng 2 bằng kỹ thuật MARMS-PCR, trong đó có 58 mẫu nghi ngờ mang đột biến gen beta thalassemia cho kết quả âm tính với các đột biến phổ biến của gen beta globin và được phân tích bằng kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ thứ 2 Next Generation Sequoncing (NGS). Phương pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang có phân tích. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 6 năm 2018. Kỹ thuật phân tích đột biến: giải trình tự thế hệ tiếp theo (Illumina - NGS) Từ 2 ml máu ngoại vi của đối tượng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành tách chiết ADN tổng số, sử dụng cột (Omega). Sau đó chúng tôi khuếch đại toàn bộ gen HBB (có kích thước khoảng 1.8Kb sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm PCR sau khi điện di kiểm tra kích thước sẽ được tinh sạch và đưa vào chuẩn bị thư viện sử dụng bộ kit Nextera XT và giải trình tự sử dụng máy giải trình tự thế hệ 2 (NGS) MiSeq (Illumina – Mỹ). Sau khi giải trình tự, chúng tôi phân tích kết quả sử dụng phần mềm MiSeq reporter, IGV, Hình 1. Sơ đồ nghiên cứu KẾT QUẢ Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu Nhận xét: Trong 58 mẫu nghiên cứu mang đột biến gen beta globin hiếm gặp, tỷ lệ gặp ở nữ là 68% và nhóm tuổi 10-19 tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất 79%. Sự phân bố của các đột biến gen hiếm gặp chủ yếu ở miền Trung với tỷ lệ 71%. Trong 58 mẫu nghiên cứu được giải trình tự gen này, chỉ có 31 trường hợp phát hiện được đột biến gen beta globin hiếm gặp (chiếm 53%). Đặc điểm đột biến gen của mẫu nghiên cứu Đặc điểm đột biến gen và liên quan Tỷ lệ mang ĐBG alpha globin của mẫu nghiên cứu là 36,2%. Trong đó, tỷ lệ mang ĐBG alpha globin ở nhóm cho kết quả dương tính với giải trình tự là 41,9%, còn ở nhóm âm tính là 29,6%. Có thể thấy tần xuất phối hợp giữa ĐBG alpha và ĐBG beta hiếm gặp là tương đối cao (Bảng 1). Bảng 1. Phối hợp đột biến gen (ĐBG) alpha và beta globin của đối tượng nghiên cứu Đột biến gen alpha Tổng Dương tính Âm tính Giải trình tự gen beta globin Âm tính n 8 19 27 % 29,6% 70,4% 100% Dương tính n 13 18 31 % 41,9% 58,1% 100% Tổng N 21 37 58 % 36,2% 63,8% 100% Tỷ lệ các alen đột biến được phát hiện Có 6 kiểu ĐBG hiếm gặp phát hiện được bằng phương pháp giải trình tự (chiếm 54,3%); Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 403 trong đó 2 đột biến gen codon 26 (G>T) [GAG>TAG] (27,1%) và codon 15 (G>A) [TGG >TAG] (10,2%) gây ra đột biến vô nghĩa chiếm tỷ lệ cao nhất. Bên cạnh đó, chúng tôi đã phát hiện được 3 đối tượng giải trình tự gen cho kết quả huyết sắc tố bất thường – Hb Hope [beta136 (H14) Gly → Asp (GGT>GAT)], đặc biệt có một mẫu nghiên cứu ở trạng thái đồng hợp tử βHope/βHope (Bảng 2). Bảng 2. Tỷ lệ của các loại alen đột biến trong nghiên cứu Stt Đột biến Tên đột biến Số allen đột biến Kiểu đột biến % 1 HBB:c.-79A>G -29 (A>G) 1 β+ 1,7 2 HBB:c.-80T>C -30 (T>C) 3 β 0 hoặc β+ (unclear) 5,1 3 HBB:c.47G>A cd 15 (G>A) 6 β 0 10,2 4 HBB:c.79G>T cd 26 (G>T) 16 β 0 27,1 5 HBB:c.410G>A Hb Hope 4 β Hope 6,8 6 HBB:c.316-3C>G IVS-II-848 (C>G) 2 β+ 3,4 7 Âm tính 27 45,7 Tổng 59 100 Bảng 3. Tỷ lệ kiểu hình của những ĐBG hiếm gặp dương tính với giải trình tự gen Kiểu hình N Tỷ lệ (%) Thành phần Hb (%) β 0 /β β cd15 /β, β cd26(G>T) /β 22 71 HbA1: 94,8±1,2% HbA2: 4,85±0,4% HbF: 3,4±1,13%(n=2) β + /β β -29 / β, β IVSII-848 / β 3 9.67 HbA1:94±2,2% HbA2: 4,8±0,3% HbF: 3,6% (n=1) β 0 or β + unclear/β β -30 / β 3 9.67 HbA1: 95,8±0,17% HbA2: 4,2±0,17% HST bất thường β Hope / β 2 6.45 HbA1: 59,4±4,38% HbA2: 2,7±0,1% HbF: 37,9±4,2% β Hope / β Hope 1 3.22 HbA1: 2,7% HbA2: 3,2% HbF: 94,1% Như vậy trong các ĐBG hiếm gặp phát hiện được, đột biến gây mất 1 chuỗi beta (β0) chiếm tỷ lệ rất cao 71%. Ở 3 đối tượng giải trình tự cho kết quả Hb Hope thì kết quả điện di HST chỉ cho 3 chỉ số là HbA1, HbA2, HbF (Bảng 3). Đặc điểm phân bố của các trường hợp β- thalassemia phối hợp với α-thalassemia Bảng 4. Kiểu gen phối hợp đột biến gen alpha và beta globin của đối tượng nghiên cứu ĐBG alpha globin ĐBG beta globin N % α 3,7 /αα cd26 (G>T) 2 15,4 α CS α/αα cd26 (G>T) 6 46,1 α 3,7 /αα -30 (T>C) 1 7,7 α CS α/αα cd15 (G>A) 1 7,7 -- SEA /αα Hb Hope 2 15,4 α 3,7 /αα IVS-II-848 (C>G) 1 7,7 Tổng 13 100 Trong các trường hợp giải trình tự gen dương tính có phối hợp với ĐBG alpha globin chiếm tỷ lệ khá cao 13/31 (41,9%), 11/13 (84,6%) trường hợp ĐBG beta globin phối hợp với tổn thương một gen α-globin; chỉ có 2/12 (15,4%) trường hợp phối hợp với tổn thương hai gen α-globin (--SEA/αα) (Bảng 4). Một số hình ảnh kết quả phân tích NGS phát hiện các đột biến hiếm (Hình 1, 2, 3, 4, 5, 6) BÀN LUẬN Nghiên cứu mô tả cắt ngang từ tháng 1 năm 2017 đến đến tháng 6 năm 2018, thu thập từ hơn 23.000 người dân đại diện cho 53 dân tộc của Việt Nam phân bố khắp các tỉnh thành cả nước. Các mẫu bệnh phẩm đã trải qua các vòng sàng lọc thalassemia cộng đồng, đó là bộ 3 xét nghiệm Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 404 cơ bản: tổng phân tích tế bào máu; định lượng sắt, Feritin và điện di huyết sắc tố. Sau đó những các mẫu nghi ngờ mang gen beta globin sẽ được xác định lại bằng các phương pháp MARMS– PCR với 9 đột biến phổ biến. Chúng tôi đã chọn lọc được 58 mẫu nghi ngờ mang gen β-globin mà phương pháp MARMS–PCR cho kết quả âm tính để phục vụ cho nghiên cứu này. Hình 1. Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm gây biến thể HST Hb Hope Mẫu 91087: Hb Hope [beta136 (H14) Gly → Asp (GGT>GAT)] Hình 2. Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm codon 26 (G>T) Mẫu 82169: Codon 26 (G>T); GAG(Glu)>TAG (stop codon) beta0 Hình 3. Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm codon 15 (G>A). Mẫu 89312: Codon 15 (G>A); TGG(Trp) > TAG (stop codon) beta0 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 405 Hình 4. Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm -30 (T>C) Mẫu 85361: -30 (T>C) beta (0 or + unclear) Hình 5. Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm IVS-II-848 (C>G) Mẫu 92332: IVS-II-848 (C>G); beta+ Hình 6: Phân tích trình tự DNA của đột biến hiếm -29 (A>G). Mẫu 82738: -29 (A>G) beta+ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 406 Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp giải trình tự gen thế hệ thứ 2 “next generation sequencing” (NGS) đây là một phương pháp hiện đại được ra đời từ năm 2005(15,2). Khác với những năm trước đây khi công nghệ NGS còn mới mẻ, những cải tiến của kỹ thuật NGS đã có độ chính xác rất cao và tỷ lệ âm tính giả và dương tính giả bị loại bỏ đi đáng kể(8). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được tính ưu việt của NGS về cả độ nhạy và độ đặc hiệu, đưa ra đánh giá toàn diện về các chiến lược sàng lọc bệnh thalassemia và chỉ ra rằng NGS là một phương pháp sàng lọc cạnh tranh, đặc biệt là trong các quần thể có tỷ lệ mắc bệnh cao(10,22,23).Kết quả phân tích đặc điểm đột biến của 58 mẫu nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự gen NGS cho thấy, tỷ lệ phát hiện ra đột biến là khá cao 31/58 (chiếm 53%). Theo kết quả Bảng 2, các đối tương nghiên cứu đều là người mang đột biến gen beta globin, hầu hết có kiểu hình dị hợp tử, chỉ có 1 cá thể có kiểu hình đồng hợp tử βHope / βHope. Trong đó đột biến gây mất 1 chuỗi beta (β0) chiếm tỷ lệ cao 71%. Đột biến gen Codon 26 (G>T) [GAG (Glu)>TAG (stop)] chiếm tỷ lệ cao nhất (16/31, chiếm 51,6%) và tất cả đối tượng có ĐBG này đều tập trung ở khu vực miền nam Việt Nam. Đột biến này xảy ra ở cùng vị trí với HbE (G>A), biến thể huyết sắc tố phổ biến nhất ở các nước Đông Nam Á. Tại đột biến này, có sự thay thế nucleotid G bằng T, sự thay thế này đã tạo thành mã bộ ba TAG - mã kết thúc tại codon 26 gây chấm dứt quá trình dịch mã và tạo đột biến vô nghĩa. Đột biến này cũng là một đột biến gen hiếm gặp trong công đồng người Thái Lan(7). Ở Việt Nam, đột biến này lần đầu tiên được báo cáo trong một nghiên cứu trên 44 bệnh nhân về đột biến gen beta globin của tác giả Maria G. Doro và cộng sự tại khu vực miền trung, chiếm tỷ lệ 6,3%. Tuy nhiên ở khu vực miền bắc cũng như miền nam chưa có báo cáo nào về sự xuất hiện của đột biến này(5,25,26). Có thể thấy đây là một đột biến hiếm gặp trên cả nước và khu vực miền trung là nơi phân bố của đột biến này. Ở Codon 15 (G>A) cũng hình thành đột biến tương tự tạo bộ 3 kết thúc, với kiểu hình β°. Đột biến -29 (A>G) và -30 (T>C) là 2 đột biến được hình thành bằng cách thay thế 1 nucleotid xảy ra trong hộp TATA của gen beta globin, không thuộc vùng phiên mã mà thuộc vùng promoter(3,11,24). Ở đột biến -29 (A>G), gen đột biến này điều khiển mARN beta-globin hoạt động ở mức 25% so bình thường do giảm liên kết các yếu tố phiên mã(1), vì vậy chỉ gây giảm tổng hợp chuỗi beta globin. Đột biến này phổ biến nhất ở người Mỹ gốc phi và Trung Quốc xong tỷ lệ phân bố cũng không cao(1,11). Đột biến gen -30 (T>C) beta (0 or + unclear) là một đột biến điểm hiếm gặp không chỉ ở Việt Nam mà cả trên thế giới, sự tổn thương của gen do đột biến này không rõ ràng có thể gây mất tổng hợp chuỗi beta globin (β0), nhưng cũng có tường hợp chỉ làm giảm tổng hợp (β+)(3). Đột biến gen IVS- II-848 (C>G) là một đột biến thay thế C ở vị trí 848 cạnh vị trí nối AG trên intron 2 đã làm giảm hiệu quả của việc lắp ráp mARN, do vậy gây giảm tổng hợp chuỗi beta globin (β+). Đột biến này phân bố chủ yếu ở Nhật Bản với tần số thấp(9). Trong nghiên cứu, bên cạnh những ĐBG beta globin hiếm, chúng tôi cũng tìm được biến thể HST hiếm gặp của chuỗi beta – Hb Hope ở 3 cá thể, đây không phải là biến thể HST phổ biến trong cộng đồng người Việt Nam; vì vậy, chúng cần được giải thích một cách thận trọng. Hb Hope [β136 (H14) Gly → Asp (GGT>GAT)], đây là một biến thể của chuỗi beta globin, được mô tả lần đầu tiên trong một gia đình người Mỹ gốc Phi vào năm 1965(12), chúng cũng được tìm thấy trong một số gia đình ở Nhật Bản, Thái Lan, Lào và Cuba; thể dị hợp tử thường kết hợp với đột biến Hb S, Hb E và với beta thalassemia. HST bất thường này ở trạng thái dị hợp tử không gây ra bất kỳ dấu hiệu lâm sàng cũng như những bất thường trên hồng cầu(16), HST này không ổn định và làm giảm ái lực với oxy, nhưng nói chung là vô hại trên lâm sàng. Tuy vậy, trong nghiên cứu này, khi so sánh với kết quả điện di HST của Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 407 những cá thể mang Hb Hope, chúng tôi thấy một kết quả hết sức lạ, các kết quả chỉ cho ra 3 loại HST là HbA1, HbA2 và HbF. Liệu có sai sót gì trong các kỹ thuật giải trình tự gen hay phân tích HST. Tìm hiểu thêm về Hb Hope cũng như kiểm tra lại các kỹ thuật, chúng tôi đã tìm ra được một vài giả thiết có thể góp phần gây ra sự nhầm lẫn, sai sót này. Thứ nhất là khi điện di HST, vùng của Hb Hope khá nhất quán với vùng của Hb F, ngoài ra còn có một số biến thể HST khác cũng tương tự như Hb Pyrgos, Hb New York, Hb Kodaira và Hb Phimai(18). Thứ hai là Hb Hope là một biến thể rất hiếm gặp trong khi Hb F thì lại gặp tỷ lệ cao trong cộng đồng. Thứ ba là việc phân biệt Hb Hope trên điện di HST là rất khó khăn, Hb Hope này có thể là một yếu tố gây nhiễu trong việc đưa ra chẩn đoán chính xác bằng phương pháp điện di hoặc sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)(19,21). Chẩn đoán Hb Hope dựa trên giải trình tự gen có thể giải quyết được vấn đề này, điện di HST chỉ có giá trị tham khảo và định hướng có bất thường về huyết sắc tố trong những trường hợp này. Chúng tôi cần làm thêm nhiều nghiên cứu để có thể tìm ra mối tương quan giữa 2 HST này, cũng như mở rộng ra các HST khác. Mặc dù biến thể này có thể không gây hậu quả lâm sàng, nhưng điều quan trọng là phải phân biệt chúng với các biến thể có ý nghĩa lâm sàng khác. Tất cả những mô tả này đặt ra câu hỏi về nguồn gốc Hb Hope trong cộng đồng Việt Nam. Để có thể đi sâu hơn, nghiên cứu tận gốc rễ, chúng tôi cần phải làm thêm nhiều khảo sát hơn nữa, xây dựng các phả hệ nếu có thể. KẾT LUẬN Nghiên cứu của chúng tôi đã góp phần vào việc tìm và phát hiện ra những đột biến gen beta globin hiếm gặp, mở rộng dữ liệu ĐBG beta globin bệnh tại Việt Nam; phát hiện ra biến thể HST bất thường Hb Hope-một biến thể rất hiếm gặp trên Thế giới, ở Việt Nam cũng chưa có báo cáo về biến thể này. Đồng thời chúng tôi cũng thấy được vai trò, giá trị của việc ứng dụng phương pháp giải trình tự gen NGS trong việc chẩn đoán người mang ĐBG beta globin hiếm cũng như ĐBG mới. Từ đó nhìn ra được những mặt thiếu hụt dẫn đến nhầm lẫn, sai sót của phương pháp điện di HST (HPLC). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Antonarakis SE, Irkin SH, Cheng TC, et al (1984). Beta- Thalassemia in American Blacks: novel mutations in the “TATA” box and an acceptor splice site. Proc Natl Acad Sci USA, 81(4): 1154–1158. 2. Besser J, Carleton HA, Gerner-Smidt P, et al (2018). Next- Generation Sequencing Technologies and their Application to the Study and Control of Bacterial Infections. Clin Microbiol Infect, 24(4):335–341. 3. Cai SP, Zhang JZ, Doherty M, et al (1989). A new TATA box mutation detected at prenatal diagnosis for beta-thalassemia. Am J Hum Genet, 45(1):112–114. 4. Chaudhary S, Dhawan D, Bagali PG, et al (2016). Compound heterozygous β+ β0 mutation of HBB gene leading to β- thalassemia major in a Gujarati family — A case study. Mol Genet Metab Rep, 7:51–53. 5. Doro MG, Casu G, Frogheri L, et al (2017). Molecular Characterization of β-Thalassemia Mutations in Central Vietnam. Hemoglobin, 41(2):96–99. 6. Efremov GD (2007). Dominantly Inherited β-Thalassemia. Hemoglobin, 31(2):193–207. 7. Fucharoen G, Fucharoen S, Jetsrisuparb A, et al (1990). Molecular basis of HbE-beta-thalassemia and the origin of HbE in northeast Thailand: identification of one novel mutation using amplified DNA from buffy coat specimens. Biochem Biophys Res Commun, 170(2):698–704. 8. Haque IS, Lazarin GA, Kang HP, et al (2016). Modeled Fetal Risk of Genetic Diseases Identified by Expanded Carrier Screening. JAMA, 316(7):734–742. 9. Hattori Y, Yamamoto K, Yamashiro Y, et al (1992). Three beta- thalassemia mutations in the Japanese: IVS-II-1 (G----A), IVS-II- 848 (C----G), and codon 90 (GAG----TAG). Hemoglobin, 16(1– 2):93–97. 10. He J, Song W, Yang J, et al (2017). Next-generation sequencing improves thalassemia carrier screening among premarital adults in a high prevalence population: the Dai nationality, China. Genet Med, 19(9):1022–1031. 11. Huang S, Wong C, Antonarakis SE, et al (1986). The same “TATA” box beta-thalassemia mutation in Chinese and US blacks: another example of independent origins of mutation. Hum Genet, 74(2):162–164. 12. Ingle J, Adewoye A, Dewan R, et al (2004). Hb Hope [β136(H14)Gly→Asp (GGT→GAT)]: Interactions with Hb S [β6(A3)Glu→Val (GAG→GTG)], Other Variant Hemoglobins and Thalassemia. Hemoglobin, 28(4):277–285. 13. Jia S, Lao X, Li W, et al (2003). A rare beta-thalassaemia mutation (C-T) at position -90 of the beta-globin gene discovered in a Chinese family. Haematologica, 88(10):1191–1193. 14. Liên Đoàn Thalassemia Quốc Tế (2008). Cơ sở di truyền và sinh lý bệnh, Hướng dẫn xử trí lâm sàng bệnh thalassemia. Nhà xuất bản Y học, pp.14-19. 15. Margulies M, Egholm M, Altman WE, et al (2005). Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature, 437(7057):376–380. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 408 16. Minnich V, Hill RJ, Khuri PD, et al (1965). Hemoglobin Hope: A Beta Chain Variant. Blood, 25(5):830–838. 17. Nguyễn Công Khanh (2008). Thalassemia, Huyết học lâm sàng Nhi khoa. Nhà xuất bản Y học Hà Nội, pp.132-146. 18. Panyasai S and Pornprasert S (2016). Detection of Co-inheritance of Hb Hope and Hb Constant Spring in Three Thai Samples by Capillary Electrophoresis. Indian J Hematol Blood Transfus, 32(Suppl 1):267–271. 19. Panyasai S, Sukunthamala K, Jaiping K, et al (2011). Interference of hemoglobin Hope on beta-thalassemia diagnosis by the capillary electrophoresis Method. Am J Clin Pathol, 136(1):14–18. 20. Phylipsen M, Amato A, Cappabianca MP, et al (2009). Two new β-thalassemia deletions compromising prenatal diagnosis in an Italian and a Turkish couple seeking prevention. Haematologica, 94(9):1289–1292. 21. Pornprasert S, Panyasai S and Kongthai K (2012). Comparison of capillary electrophoregram among heterozygous Hb Hope, Hb Hope/α-thalassemia-1 SEA type deletion and Hb Hope/β(0)- thalassemia. Clin Chem Lab Med, 50(9):1625–1629. 22. Shang X, Peng Z, Ye Y, et al (2017). Rapid Targeted Next- Generation Sequencing Platform for Molecular Screening and Clinical Genotyping in Subjects with Hemoglobinopathies. EBioMedicine, 23:150–159. 23. Tan M, Lu S, Wu LS, et al (2015). Application of Next Generation Sequencing to Screen the Neonatal Thalassemia Genes, Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi, 23(5):1404–1409. 24. Thein SL (2013). The Molecular Basis of β-Thalassemia. Cold Spring Harb Perspect Med, 3(5). 25. Vo LTT, Nguyen TT, Le HX, et al (2018). Analysis of Common β-Thalassemia Mutations in North Vietnam. Hemoglobin, 42(1):16–22. 26. Vũ Hải Toàn và cs (2018). Bước đầu phân tích một số chỉ số trong sàng lọc Thalassemia cộng đồng. Y học Việt Nam, 467:435– 443. 27. Yang Z, Zhou W, Cui Q, et al (2019). Gene spectrum analysis of thalassemia for people residing in northern China. BMC Med Genet, 20(1):86. Ngày nhận bài báo: 15/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019