Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai (boehmeria nivea l.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 63 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE VÀ KHÁNG OXY HÓA TỪ CAO CHIẾT LÁ CÂY GAI (BOEHMERIA NIVEA L.) Phạm Ngọc Khôi*, Nguyễn Hoàng Thanh Trúc**, Đặng Đình Dần*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Cây gai (Boehmeria nivea L.) còn có tên gọi khác là tầm gai, gai bánh, thuộc họ Gai (Urticaceae), là loài bản địa ở Đông Á. Theo đông y, rễ cây gai có tính sát khuẩn, lợi tiểu, trị tiểu ra máu, an thai, trị phong thấp; lá cây gai tươi có tác dụng kháng sinh, tiêu viêm. Tuy nhiên, các hoạt tính sinh học đặc biệt như khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase trong phòng và điều trị bệnh gout hay khả năng kháng oxy hóa ở cây gai vẫn chưa được công bố đầy đủ. Nghiên cứu này nhằm khẳng định và đánh giá một số tác dụng sinh học của lá gai. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách chiết polyphenol bao gồm: loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi, thời gian chiết và nhiệt độ tách chiết để chọn ra điều kiện chiết tối ưu nhất nhằm đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai. Kết quả: Cao chiết từ lá cây gai có hàm lượng polyphenol cao nhất khi chiết trong dung môi là nước cất, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:30 (g/mL), thời gian tách chiết 30 phút và nhiệt độ tách chiết 60ºC. Cao chiết lá cây gai có khả năng ức chế enzyme xanthin oxidase cao (85,52%) ở nồng độ cao 0,5 mg/mL với giá trị IC50 cao chiết lá cây gai là 0,273 mg/mL. Cao chiết polyphenol từ lá cây gai còn thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa khá cao với giá trị IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 82,09 ppm. Kết luận: Nghiên cứu này đã khảo sát được điều kiện chiết tách polyphenol tốt nhất từ lá cây gai qua đó đánh giá được khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase trong phòng và điều trị bệnh gout và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai. Từ khóa: cây gai (Boehmeria nivea L.), polyphenol, xanthine oxidase, kháng oxy hóa ABSTRACT A STUDY ON INHIBITION XANTHINE OXIDASE ENZYME AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BOEHMERIA NIVEA L. Pham Ngoc Khoi, Nguyen Hoang Thanh Truc, Dang Dinh Dan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 3- 2019: 63-70 Background: Boehmeria nivea L. is a plant of the Urticaceae family, it occurs in East Asia. Traditional medicine studies have demonstrated the possibility of using the biological compounds derived from the roots are antiseptic, diuretic, blood in the urine, pregnancy, rheumatism; from fresh leaves have antibiotic, anti- inflammation effect. However, the inhibition xanthine oxidase enzyme for treatment gout disease or the antioxidant activities of Boehmeria nivea L. are not well studied. In this study, we confirm and evaluate some biological effects of Boehmeria nivea L. leaves. Material and method: The aim of this study is to study the best extraction process to obtain the highest *Bộ môn Mô Phôi - Di truyền, Khoa Y học cơ sở, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch, TP. Hồ Chí Minh **Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh ***Khoa Hóa sinh, Bệnh viện Thống Nhất TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Phạm Ngọc Khôi ĐT: 0909 097 802 Email: pnkhoi@pnt.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 64 polyphenol content Boehmeria nivea L. such as solvent, the ratio of material: solvent, time and temperature to use in inhibition of xanthine oxidase enzyme and antioxidant activities. Result: Distilled water, the ratio of material: solvent 1:30 (g/mL), 30 minutes, 60oC for polyphenol extraction efficiency is the highest Boehmeria nivea L. leaves. Extracts of Boehmeria nivea L. have a high inhibitory activity against xanthine oxidase (85.52%) at a high concentration of 0.5 mg/mL with the IC50 value of the leaf extracts was 0.273 mg/mL. This study also evaluated the ability to capture free radicals DPPH IC50 value of the ability to capture free radicals DPPH (82.09 ppm). Conclusion: In this study, for the first time, we were carried out to optimize extracting conditions of polyphenol from Boehmeria nivea L. leaves. Evaluated the ability in inhibition of xanthine oxidase enzyme to treat gout disease and antioxidants of polyphenol extracted though the ability to capture free radicals DPPH. Keyword: Boehmeria nivea L., polyphenol, xanthine oxidase, antioxidant ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh gout hay còn gọi là bệnh thống phong ngày càng phổ biến trong xã hội hiện đại, bệnh thường gắn liền với mức độ acid uric cao trong huyết thanh có thể gây sự lắng động chất này ở các khớp và mô mềm, lượng acid uric trong nước tiểu tăng quá mức có thể gây tủa và hình thành sỏi urat trong hệ tiết niệu. Nguyên nhân do trong khẩu phần ăn chứa lượng lớn acid nucleic như trứng, thịt, cá, hải sản. Xanthine dehydrogenase (XDH) hay xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metalloflavoprotein tạo các gốc tự do, trong giai đoạn cuối quá trình chuyển hóa các purine XO xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine vào tạo thành acid uric(9). Các thuốc điều trị tăng acid uric máu theo y học hiện đại đều có cơ chế tác dụng rõ ràng, tác dụng nhanh và hiệu quả điều trị tương đối tốt. Một trong đích tác dụng dược lý của thuốc hạ acid uric máu là xanthine oxidase, enzyme then chốt trong quá trình tổng hợp acid uric. Allopurinol là một trong những chất ức chế xanthine oxidase được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát và điều trị bệnh gout trong lâm sàng. Tuy nhiên, allopurinol lại có các tác dụng phụ không mong muốn như viêm gan, suy thận, dị ứng(3,10), nghiêm trọng hơn có thể gây hoại tử da và dẫn đến tử vong do hội chứng quá mẫn allopurinol(3,5). Vì vậy các hợp chất có hoạt tính sinh học nguồn gốc tự nhiên ngày càng được quan tâm nghiên cứu và thể hiện tính an toàn thay thế cho việc sử dụng allopurinol hiện nay đang được ưu tiên và hướng tới của nhiều nước trên thế giới. Một số cây được sử trong điều trị gout đã được nghiên cứu trước đây như sa kê, bồ công anh, lá đu đủ, trong đó có cây gai (Boehmeria nivea L.) (2). Hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về loài cây gai, các tác dụng dược lý cũng chưa có nhiều tài liệu nghiên cứu về loại cây này(2). Thêm vào đó vấn đề tìm ra các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật ngày càng được quan tâm nhiều hơn nhất là từ các hợp chất polyphenol. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình tách chiết lá cây gai bao gồm như loại dung môi, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi, thời gian và nhiệt độ tách chiết để chọn ra điều kiện chiết tối ưu có hàm lượng polyphenol cao nhất nhằm đánh giá khả năng ức chế hoạt động của enzyme xanthine oxidase và kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu Lá cây gai được thu hái ở tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam vào tháng 10 năm 2016. Địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Khoa học ứng dụng, Đại học Tôn Đức Thắng và Phòng Công nghệ các hợp chất thiên nhiên tại Viện Công nghệ Hóa học, Sở Khoa học và Công nghệ TP. Hồ Chí Minh. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 65 Bố trí thí nghiệm Xử lý mẫu lá cây gai → Kiểm nghiệm vật liệu (dựa theo Dược điển Việt Nam V): xác định độ ẩm, định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây gai bằng phương pháp hóa học → Tách chiết vật liệu bằng phương pháp ngấm kiệt → Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết cao polyphenol → Thu được cao chiết từ lá cây gai → Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO từ cao chiết lá cây gai → Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH. Xử lý mẫu lá cây gai Mẫu lá cây gai sau khi thu được định danh bằng cách dựa vào đặc điểm hình thái thực vật như thân, lá, rễ, Mẫu lá cây gai sau khi được định danh, rửa sạch bằng nước (loại bỏ tạp chất, phần lá hư, rách, bị sâu mọt), lau khô bề mặt lá, sấy ở nhiệt độ 50 - 55ºC cho đến khối lượng chênh lệch không đáng kể. Nguyên liệu sau khi sấy xong cắt và nghiền nhỏ (mẫu không nên quá to sẽ gây khó chiết, không nên quá mịn vì sẽ cản trở dòng chảy khi lọc) và để thực hiện theo phương pháp ngấm kiệt. Xác định độ ẩm lá cây gai Dùng nhiệt độ cao để loại bỏ nước ra khỏi mẫu thử, hiệu số khối lượng của mẫu thử trước và sau khi sấy khô là lượng nước có trong mẫu thử theo quy định của Dược điển Việt Nam 5. Cho lượng mẫu 2 g vào máy xác định độ ẩm tự động ở nhiệt 105°C, đặt chế độ thời gian tự động cho đến khi máy báo hiệu ẩm đã tách hết, rồi đo kết quả độ ẩm mẫu(7). Định tính sơ bộ thành phần hóa học của lá cây gai Nguyên tắc là nhằm chiết tách hỗn hợp các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn theo độ phân cực tăng dần: kém phân cực, phân cực trung bình và phân cực mạnh rồi xác định các nhóm hợp chất trong dung dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng. Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi là diethyl ether, ethanol và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo phương pháp của Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh(7). Phương pháp tách chiết Cân chính xác 10 g mẫu (đã được sấy khô và nghiền nhỏ) cho vào chai thủy tinh 100 mL, rồi tiến hành khảo sát một điều kiện tách chiết trong khi các thông số khác được giữ cố định bằng phương pháp ngấm kiệt. Sau khi chuẩn bị lá cây gai, ngâm lá cây gai vào dung môi trong bình ngấm kiệt. Sau một khoảng thời gian xác định, rút nhỏ giọt dịch chiết ở phía dưới, đồng thời bổ sung thêm dung môi ở phía trên bằng cách cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp lá cây gai nằm yên. Lớp dung môi trong bình chiết thường được để ngập bề mặt dược liệu khoảng 3 - 4 cm. Sau đó tính hiệu quả quá trình trích ly polyphenol thể hiện qua hàm lượng polyphenol tổng số (TPC, total polyphenol concentration) được tính bằng phương pháp Foline – Ciocalteu(6,7,8). Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singleton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ, cụ thể như dịch chiết được hòa loãng ở nồng độ thích hợp, sau đó 0,1 mL dịch chiết đã pha loãng trộn với 0,9 mL nước cất trước khi thêm 1 mL thuốc thử Foline - Ciocalteu. Hỗn hợp được trộn đều trước khi thêm 2,5 mL Na2CO3 7,5%. Sau đó, hỗn hợp phản ứng được giữ ở 30 oC trong 30 phút trước khi đi đo ở bước sóng 760 nm sử dụng máy quang phổ kế (Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi miligam acid gallic tương đương (mg GAE)/g chất khô (db, dry basis). Công thức tính: PP = X * V * k / v * m * (1 – w), trong đó PP là hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g db), X là nồng độ acid gallic xác định theo đường chuẩn (mg/mL), V là thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu lá cây gai (mL), k là hệ số pha loãng, v là thể tích dịch dược liệu sử dụng (mL), m là khối lượng dược liệu thí nghiệm (g), w là độ ẩm của dược liệu (%)(7,8). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 66 Khảo sát điều kiện tách chiết Ảnh hưởng của dung môi chiết, sử dụng ba loại dung môi có độ phân cực khác nhau, bao gồm: ethanol 95%; ethanol 95%: nước cất (1:1); nước cất. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mức 1:25; 1:30; 1:40; 1:50 (g/mL). Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mốc thời gian 15; 30; 45; 60 phút. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol được thực hiện ở các mốc nhiệt độ 30; 45; 60; 75oC. Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO từ cao chiết lá cây gai Khảo sát khả năng ức chế của cao chiết lá cây gai đến hoạt động của enzyme XO in vitro, dựa vào thử nghiệm xanthine oxidase. Kết quả khảo sát được đánh giá dựa vào phần trăm enzyme XO bị ức chế. Cao chiết lá cây gai 10 mg được pha trong 10 mL DMSO (dimethyl sulfoxide) 0,1 M. Sau đó, cao chiết 1 mg/mL được pha loãng thành các nồng độ khác nhau (0 - 0,5 mg/mL), rồi được ủ ở nhiệt độ phòng (25°C) trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng ban đầu 100 µL XO 0,0125 U phản ứng được bổ sung 100 µL xanthin 0,5 mM và được tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Hỗn hợp phản ứng sau cùng được đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng 295 nm. Tỷ lệ ức chế được tính theo công thức: (Độ hấp thu đối chứng – Độ hấp thu thực nghiệm): Độ hấp thu đối chứng. Nghiên cứu này sử dụng allopurinol làm chất chuẩn để so sánh với mẫu đối chiếu là cao chiết lá cây gai(10). Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH (1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl) Xác định khả năng kháng oxy hóa của cao chiết lá cây gai và so sánh với hoạt tính của vitamin C bằng phương pháp DPPH. Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự di bền trong dung dịch ethanol bão hòa. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hòa hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt tính kháng oxy hóa được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của mẫu thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy ở bước sóng 517nm(7,6). Khả năng ức chế gốc tự do DPPH được xác định thông qua phần trăm ức chế I (%) được tính theo công thức sau: I (%) = (Ac – As): Ac x 100, trong đó: I (%) là phần trăm ức chế gốc tự do DPPH, Ac: giá trị mật độ quang của mẫu chứng, As: giá trị mật độ quang của mẫu thử nghiệm. Để có cơ sở đánh giá khả năng khử gốc tự do DPPH người ta thường sử dụng giá trị IC50 để so sánh mức độ khử gốc tự do giữa các mẫu chất. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu khảo sát mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp. Phương pháp xử lý số liệu Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần và sử dụng phầm mềm thống kê SAS 8.1 và Excel 2007 để tính giá trị trung bình, độ lệch chuẩn của và sự sai khác có ý nghĩa của ba lần lặp lại. Từ đó, biết được các kết quả thí nghiệm có ý nghĩa không và các yếu tố có ảnh hưởng lên kết quả thí nghiệm không. Kiểm định Tukey được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý nghĩa P < 0,05. KẾT QUẢ Kết quả kiểm tra độ ẩm nguyên liệu và hiệu suất thu hồi cao chiết lá gai Độ ẩm lá cây gai khô qua các lần lặp lại là 11,1 ± 0,26%. Khối lượng mẫu đem chiết là 100 g, trọng lượng cao thu được sau khi đem cô quay là 9 g, cho thấy hiệu suất thu hồi cao chiết là 9%. Cao chiết lá cây gai thu được sau khi cô quay ở dạng sệt và dự trữ ở 4 °C để sử dụng cho các thí nghiệm sau. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 67 Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên Khảo sát định tính sơ bộ các hợp chất có trong lá cây gai nhằm chọn được hợp chất thích hợp cho các thí nghiệm cần nghiên cứu. Dịch chiết được chiết với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi là 1:20 (g/mL), chiết trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng. Kết quả khảo sát định tính được trình bày ở Bảng 1. Từ kết quả định tính trong Bảng 1, ta thấy trong lá cây gai có các hợp chất tự nhiên như chất béo, carotenoid, polyphenol, tannin, flavonoid, anthraquinon. Bảng 1. Kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên có trong lá cây gai Hợp chất tự nhiên Thuốc thử Kết quả Loại dung dịch chiết Diethyl ether Ethanol Nước Chất béo Lớp giấy mỏng Vết mờ ++ Carotenoid H2SO4 đậm đặc Xanh đậm + Alkaloid Dragendroff Tủa cam - Polyphenol FeCl3 5% Xanh đen ++ Flavonoid Mg kim loại, HCl đậm đặc Hồng tới đỏ + Anthocyanosid HCl 10% Xanh - Tannin Gelatin - muối Kết tủa đen + Coumarin NaOH 10%, HCl đậm đặc Ống có kiềm đục, acid hóa thì trong - Saponin Có bọt - Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt khí - - Polyuronid Cồn 95% Tủa bông - Anthraquinon NaOH 10% Lớp kiềm màu hồng tới đỏ + + dương tính, ++ dương tính rõ, - âm tính Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây gai Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây gai Khảo sát quá trình chiết lá cây gai bằng ba loại dung môi khác nhau như ethanol 95%, ethanol 95% + nước cất (1:1), nước cất. Với khối lượng mẫu 2 g và chiết theo tỷ lệ 1:25 ở 45°C trong 30 phút. Kết quả thu được thể hiện thông qua Biểu đồ 1. Kết quả cho thấy dung môi chiết là nước cất cho hàm lượng polyphenol cao hơn so với dung môi chiết ethanol 47,5% và ethanol 95%. Trong các dung môi khảo sát, nước cất cho hiệu quả trích ly polyphenol hiệu quả nhất cho TPC đạt 48,15 ± 0,21% mg GAE/g db, ethanol 95% cho hiệu quả chiết thấp nhất với TPC là 26,47 ± 0,31% mg GAE/g db. Hiệu suất chiết polyphenol bằng dung môi được sắp xếp theo thứ tự giảm dần: nước cất > ethanol 47,5% > ethanol 95%. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây gai Sau khi xác định loại dung môi thích hợp nhất là nước cất, quá trình chiết lá cây gai được tiếp tục khảo sát với 4 tỷ lệ nguyên liệu:dung môi khác nhau như 1:25, 1:30, 1:40, 1:50. Với cùng khối lượng nguyên liệu ban đầu là 2 g lá cây gai và chiết ở 45°C trong 30 phút, toàn bộ dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức theo các tỷ lệ khác nhau có thể tích khác nhau. Kết quả thu được thể hiện thông qua Biểu Đồ 2. Có thể thấy rằng tỷ lệ nguyên liệu trong dung môi nước ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol. Khi tăng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi từ 1:25 lên 1:30 thì TPC tăng từ 50,32 ± 0,31% mg GAE/g db lên 78,65 ± 1,11% mg GAE/g db (tăng 1,5 lần). Tỷ lệ nguyên liệu trong dung môi là 1:30 (g/mL) cho hàm lượng polyphenol là cao nhất. Gia tăng hơn nữa tỷ lệ nguyên liệu trong dung môi (tức từ 1:40 đến 1:50) hàm lượng TPC giảm không đáng kể. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 68 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây gai Sau khi xác định loại dung môi và tỷ lệ nguyên liệu dung môi thích hợp, quá trình chiết lá cây gai được tiếp tục khảo sát với 4 thời gian khác nhau như 15, 30, 45, 60 phút. Với cùng khối lượng nguyên liệu ban đầu là 2 g lá cây gai và chiết ở 45ºC, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 1:30, toàn bộ dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức theo các thời gian khác nhau. Kết quả thu được thể hiện thông qua Biểu đồ 3. Khi tăng thời gian từ 15 lên 30, 45 rồi 60 phút thì hàm lượng polyphenol tổng số cũng tăng dần lên. Ở thời gian chiết là 15 phút hàm lượng polyphenol thu được là 59,93 ± 0,55% mg GAE/g db, tiếp tục tăng thời gian lên 60 phút thì hàm lượng polyphenol thu được là cao nhất đạt được 85,97 ± 0,31% mgGAE/g db (tăng gấp 1,43 lần) so với ở 15 phút. Kết quả còn thể hiện hiệu suất trích ly tăng từ 30 đến 60 phút hàm lượng TPC tăng không đáng kể do đó chọn thời gian là 30 phút là tốt nhất để tiết kiệm thời gian. Biểu đồ 1. Ảnh hưởng của loại dung môi đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây gai Biểu đồ 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây gai Biểu đồ 3. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây gai Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 69 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol trích ly từ lá cây gai Sau khi xác định loại dung môi và tỷ lệ nguyên liệu dung môi thích hợp, thời gian chiết. Với cùng khối lượng nguyên liệu ban đầu là 2 g lá gai, với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:30, thời gian chiết 30 phút, toàn bộ dịch chiết thu được ở mỗi nghiệm thức theo các nhiệt độ khác nhau. Kết quả thu được thể hiện thông qua Biểu đồ 4. Kết quả thực nghiệm ở Biểu đồ 4 cho thấy ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng TPC trong dịch trích ly tăng lên từ 30oC là 61,06 ± 0,47% mg GAE/g db lên 92,17 ± 0,13% mg GAE/g db ở nhiệt độ 60oC, nhưng ở 75oC hàm lượng TPC giảm xuống còn 82,92 ± 0,09% mg GAE/g db. Như vậy, sau khi khảo sát các ảnh hưởng của các điều kiện tách chiết đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây gai, chúng tôi xác định được các thông số tách chiết tốt nhất sau: dung môi chiết là nước cất, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi là 1:30, thời gian chiết là 30 phút, nhiệt độ tách chiết là 60oC. Biểu đồ 4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol trích từ lá cây gai Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết lá gai Kết quả thí nghiệm cho thấy, ở nồng độ cao chiết 0,1 mg/mL thì hiệu suất ức chế đạt đến 27,02 ± 0,25%. Khi tăng nồng độ cao chiết từ 0,2; 0,3; 0,4 lên 0,5 mg/mL thì hiệu quả ức chế enzyme XO tăng lần lượt là 37,12 ± 0,31%, 53,1 ± 1,09%, 67,42 ± 0,85%, 85,52 ± 0,54%. Hàm lượng chất ức chế enzyme XO có trong cao chiết lá cây gai tính tương đương mM allopurinol tương ứng với nồng độ cao ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 mg/mL là 0,303; 0,536; 0,612; 0,827 mM. Ta thấy khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết lá cây gai tỷ lệ thuận với nồng độ cao chiết. Nồng độ cao chiết càng cao thì khả năng ức chế enzyme XO càng mạnh và ngược lại, khả năng ức chế enzyme XO giữa các nồng độ cao chiết khác biệt có ý nghĩa thống kê. Khả năng ức chế enzyme XO của cao lá cây gai được xác định dựa vào giá trị IC50. Giá trị IC50 được tính dựa vào đồ thị và phương trình của cao chiết lá cây gai y = 147,3x + 9,845. Giá trị IC50 của cao chiết lá cây gai là 0,273 mg/mL. Khảo sát khả năng kháng oxy hóa của dịch chiết từ lá cây gai Từ kết quả khảo sát khả năng khử gốc tự do của vitamin C bằng phương pháp DPPH, vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc phần trăm khử gốc tự do vào nồng độ vitamin C bằng phần mềm Excel 2007. Các nồng độ vitamin C và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường thẳng với phương trình y = 0,7634x + 13,22, với hệ số tương quan R = 0,992. Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của vitamin C là 48,17 (ppm). Vitamin C được dùng làm chất chuẩn để so sánh với mẫu đối chiếu là dịch chiết lá cây gai. Các nồng độ cao chiết lá cây gai và phần trăm ức chế được biểu thị dưới dạng đường thẳng với phương trình y = 0,6383x - 2,3997, với hệ số tương quan R = 0,9903. Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của cao chiết là 82,09 (ppm). Từ 2 kết quả trên thực nghiệm trên cho thấy IC50 của vitamin C 48,17 ppm thấp hơn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 3 * 2019 Hội Nghị Khoa Học Công Nghệ Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch 70 IC50 cao chiết 82,09 ppm tức khả năng khử gốc tự do cao hơn so với mẫu cao chiết. Kết quả trên cũng cho thấy mẫu cao chiết lá cây gai có khả năng kháng oxy hóa nhưng thấp hơn vitamin C khoảng 2 lần. BÀN LUẬN Trong cao chiết lá cây gai tìm thấy được một số hợp chất như polyphenol, tannin, flavonoid, anthraquinon, carotenoid, chất béo. Trong nghiên cứu này đã khảo sát điều kiện chiết tách polyphenol từ lá cây gai cho hiệu suất cao nhất với dung môi là nước cất, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi 1:30, thời gian 30 phút, nhiệt độ 60ºC với kết hợp chiết siêu âm nhằm đánh giá cao chiết lá cây gai có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase cao (85,521%) ở nồng độ cao 0,5 mg/mL, giá trị IC50 cao chiết lá cây gai là 0,273 mg/mL. Theo nghiên cứu của tác giả Đái Thị Xuân Trang (2014)(1) về cao chiết lá sake (Artocarpus altilis (Park)) có IC50 = 0,198 mg/mL, chặc chìu (Tetracera scandens) có hoạt tính ức chế 50% enzyme XO dưới 0,02 mg/mL, chiết xuất từ methanol của lá cây ngũ trảo (Vitex negundo L.) và lá cây cà độc dược (Datura metel L.) có hoạt tính ức chế 50% enzyme lần lượt là IC50 = 0,0785 mg/mL và IC50 = 0,0768 mg/mL. Từ các nghiên cứu trên, khi so sánh hoạt tính ức chế 50% enzyme XO của cao chiết lá cây gai với cao chiết từ các thực vật trên thì hoạt tính ức chế 50% enzyme XO của cao chiết lá cây gai là yếu hơn (0,273 mg/mL). Tuy nhiên, các hợp chất sinh học trong cao chiết lá cây gai có khả năng ức chế enzyme XO và có tiềm năng sử dụng cao chiết lá cây gai như thực phẩm bổ sung trong điều trị bệnh gout. Ngoài ra nghiên cứu này còn đánh giá được khả năng kháng oxy hóa của cao chiết polyphenol từ lá cây gai thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH. Cao chiết polyphenol từ lá cây gai thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa khá cao với giá trị IC50 của khả năng bắt gốc tự do DPPH là 82,09 ppm. KẾT LUẬN Nghiên cứu này nhằm khẳng định và đánh giá một số tác dụng sinh học của lá cây gai: định tính các nhóm hợp chất tự nhiên trong lá cây gai bằng phương pháp hóa học, khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thu cao chiết lá cây gai, khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao chiết lá cây gai ứng dụng trong phòng chống bệnh gout và khảo sát khả năng kháng oxy hóa từ cao chiết lá cây gai khá cao. Rõ ràng đây là một dược liệu có nhiều tác dụng sinh học quý mà lại dễ xây dựng nguồn nguyên liệu nên tiềm năng ứng dụng sản xuất là rất lớn, do đó cần nghiên cứu đưa ra quy trình sản xuất ra chế phẩm đóng vai trò quan trọng nhằm phục vụ công tác điều trị các căn bệnh thời đại. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đái Thị Xuân Trang (2014).“Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase từ lá sake Artocarpus altilis (park)“. Khoa học Đại học Cần Thơ, 32: 94 - 101. 2. Đỗ Tất Lợi (2011). “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”. Nhà xuất bản Thời Đại, Hà Nội. 3. Kong LD, Abliz Z, Zhou CX et al (2011). “Glycosides and xanthine oxidase inhibitors from”. Conyza bonariensis. Phytochemistry, 58(4):645-51. 4. Lioté F (2003). “Hyperuricemia and gout”. Curr Rheumatol Re, 5(3):227-34. 5. Nycyk JA, Drury JA, Cooke RW (1998). “Breath pentane as a marker for lipid peroxydation and adverse outcome in preterm infants”. Child Fetal Neonatal Ed, 79:67-69. 6. Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Khấu Phương Nhung (2017). “Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng tới việc thu nhận chế phẩm có hoạt tính polyphenol có trong rau càng cua (Peperomia pellucida L.) và xác định tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của chế phẩm thu được”. Khoa học Đại học Sài Gòn, 29(54):34-42. 7. Phạm Ngọc Khôi, Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2017). “Khảo sát điều kiện tách chiết và hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn của hợp chất polyphenol từ vỏ thân cây quao nước (Dolichandrone spathacsea)”. Khoa học Đại học Sư Phạm, 14(12):181-193. 8. Phạm Ngọc Khôi, Phùng Thanh Sơn (2017). “Tối ưu hóa quy trình chiết xuất và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa của cây diếp cá (Houttuynia cordata)”. Khoa học Đại học Đồng Tháp, 27:83-88. 9. Rasaratnam I, Christophides N (1995). “Gout: “a disease of plenty””. Aust Fam Physician, 24(5):849-51, 855-6, 859-60. 10. Wallach SL (1998). “The side effects of allopurinol”. Hosp Pract, 33(9):22. Ngày nhận bài báo: 29/11/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24/01/2019 Ngày bài báo được đăng: 20/04/2019