Khảo sát đột biến CALR trên bệnh nhân xơ tủy nguyên phát bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 322 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN CALR TRÊN BỆNH NHÂN XƠ TỦY NGUYÊN PHÁT BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA Phan Thị Xinh*, Hoàng Anh Vũ** TÓM TẮT Mục tiêu: Xơ tủy nguyên phát là một dạng bệnh lý thuộc nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan lách tạo máu thay tủy. Các đột biến đặc trưng cho thể bệnh này bao gồm JAK2V617F (60%) và MPLW515L/K (5%). Gần đây, đột biến CALR được phát hiện trong khoảng 20 – 30% trường hợp xơ tủy nguyên phát với 2 loại đột biến phổ biến là mất 52 bp (loại 1), chèn 5 bp (loại 2) tại exon 9 gây lệch khung đọc và một số kiểu đột biến hiếm gặp khác. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA exon 9 của gen CALR để khảo sát đột biến, góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng. Đối tượng và phương pháp: Mẫu máu ngoại vi trong ống chống đông EDTA của bệnh nhân xơ tủy nguyên phát âm tính với đột biến JAK2V617F được tách chiết DNA. Các cặp mồi xuôi và mồi ngược được thiết kế để khuếch đại đặc hiệu exon 9 của gen CALR. Sản phẩm PCR được giải trình tự theo hai chiều xuôi và ngược trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer để khảo sát đột biến. Kết quả: Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR có nhiệt độ bắt cặp tối ưu là 550C. Phân tích kết quả giải trình tự chuỗi DNA ghi nhận 7/9 trường hợp có đột biến CALR chiếm 77,78%, trong đó phát hiện 2 kiểu đột biến bao gồm mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột biến chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các đột biến này đều ở dạng dị hợp tử. Kiểu mất đoạn 52 bp gặp ở 6 bệnh nhân, là kiểu đột biến thường gặp nhất trong nghiên cứu này. Kết luận: Chúng tôi đã thiết lập thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát hiện các đột biến CALR exon 9, giúp dễ dàng chẩn đoán các trường hợp xơ tủy nguyên phát không có đột biến JAK2V617F và MPLW515L/K trên lâm sàng. Từ khóa: Xơ tủy nguyên phát, gen CALR, đột biến gen, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT DETECTION OF CALR MUTATIONS IN PRIMARY MYELOFIBROSIS BY DNA SEQUENCING Phan Thi Xinh, Hoang Anh Vu * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 21 - No 2 - 2017: 322 - 326 Purpose: Primary myelofibrosis (PMF) is a type of myeloproliferative neoplasms (MPNs) characterized by fibrosis in bone marrow, increased proliferation of reticulin and replacing bone marrow by liver and spleen for hematopoiesis. The typical mutations in this disease consist of JAK2V617F (60%) and MPLW515L/K (5%). Recently, CALR mutations were detected in approximately 20 – 30% of PMF patients with 2 common types of mutations including 52 bp deletetion (type 1) and 5 bp insertion (type 2) in exon 9 leading to the frameshift and several other rare mutations. We aim to establish a procedure of DNA sequencing for CALR exon 9 and use for screening CALR mutations as an additional marker for diagnosis of PMF patients in clinical practice. * Bộ môn Huyết học - Đại học Y Dược TP.HCM; khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện Truyền máu Huyết học TP.HCM ** Bộ môn Mô phôi; Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM. Tác giả liên lạc: TS. Phan Thị Xinh ĐT: 0932 728 115 Email: phanthixinh@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 323 Methods: Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples of JAK2V617F- negative PMF patients. Forward and reverse primers were designed to amplify specifically CALR exon 9. PCR products were sequenced bidirectionally using Sanger’s technique on an ABI 3130 Genetic Analyzer system. Result: The primers CALR-g8F and CALR-g9R were used to amplify exon 9 of CALR with optimal annealing temperature at 550C. The analysis of DNA sequencing results showed that 7 out of 9 patients (77.78%) carried CALR mutations, with 2 types of mutations including 52-bp deletion (c.1099_1150del) and 5-bp insertion (c.1154_1155insTTGTC), both were in heterozygous status. The 52-bp deletion type was the most common mutation, detected in 6 patients. Conclusion: We have successfully established the DNA sequencing procedure for detection of CALR exon 9 mutations, facilitating diagnosis of PMF in patients without JAK2V617F and MPLW515L/K mutations. Key words: Primary myelofibrosis, CALR gene, gene mutation, DNA sequencing. ĐẶT VẤN ĐỀ Nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy bao gồm bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy nguyên phát. Bệnh đặc trưng bởi tình trạng tăng sinh quá mức các tế bào máu và các giai đoạn biệt hóa của tế bào trong tủy xương và máu ngoại biên(2). Xơ tủy nguyên phát có tủy xương bị xơ hóa, tăng sinh reticulin và gan lách tạo máu thay tủy, đặc biệt là lách. Hầu hết các trường hợp xơ tủy nguyên phát đều có lách to lúc chẩn đoán và khoảng 50% trường hợp có gan to. Trong nhóm bệnh tân sản tăng sinh tủy có các đột biến gen giúp chẩn đoán bệnh như nhiễm sắc thể Philadelphia gặp trong bạch cầu mạn dòng tủy và đột biến gen JAK2V617F gặp trong đa hồng cầu nguyên phát, tăng tiểu cầu nguyên phát và xơ tủy nguyên phát với tỷ lệ tương ứng là 99%, 60%, 60%(1). Ngoài ra, các đột biến tăng chức năng liên quan gen MPL (MPLW515L/K) gặp trong 5% trường hợp xơ tủy nguyên phát, còn lại khoảng 40% trường hợp xơ tủy nguyên phát chưa phát hiện đột biến gen. Đến cuối năm 2013, hai nghiên cứu của Klampfl (5), Nangalia (Error! Reference source not found.) và cộng sự đã xác định đột biến gen CALR mã hóa Calreticulin trên 20 – 30% bệnh nhân (BN) xơ tủy nguyên phát không có đột biến gen JAK2 và MPL. Gen CALR nằm trên NST 19p13.2 gồm 9 exon, tổng hợp Calreticulin protein với trọng lượng 46-kDa có 3 vùng cấu trúc và chức năng bao gồm một vùng đầu tận N gắn lectin, một vùng giàu proline chứa vị trí tương tác Ca2+ có ái lực cao, và vùng đầu tận C có tính acid. Calreticulin còn có vùng KDEL tại vị trí đầu tận C với nhiều vị trí gắn Ca2+ và mang nhiều vị trí gắn với bề mặt tế bào và với các yếu tố đông máu(3,4,6). Về mặt chẩn đoán, sinh thiết tủy và nhuộm reticulin sẽ giúp chẩn đoán tình trạng xơ tủy và mức độ xơ tủy, tuy nhiên cần tìm nguyên nhân là xơ tủy nguyên phát hay thứ phát. Các dấu ấn sinh học phân tử giúp các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán được thể nguyên phát và có hướng điều trị phù hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện khảo sát đột biến CALR bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA, góp thêm 1 dấu ấn cho chẩn đoán xơ tủy nguyên phát trên lâm sàng. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Nghiên cứu được thực hiện trên 10 bệnh nhân chẩn đoán xơ tủy nguyên phát theo tiêu chuẩn của tổ chức y tế năm 2008 và không phát hiện đột biến JAK2 V617F. Phương pháp: Tách chiết genomic DNA 2 ml máu ngoại vi trong ống chống đông có EDTA được lắc đều và tách chiết DNA Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 324 bằng QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Thiết kế mồi Các đoạn mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen CALR mang mã số NM_004343 trong GenBank (bảng 1). Thực hiện PCR Mỗi tube PCR có thể tích 15 l chứa các thành phần gồm 1,5 µL 10X PCR buffer; 1,5 µL dNTP 2,5 mM; 0,75 µL mồi xuôi và 0,75 µL mồi ngược (10 M cho mỗi loại); 0,12 µL TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 2 µL genomic DNA (50 - 100 ng). Chu trình luân nhiệt được thực hiện trên máy ABI 2700 (Apllied Biosystems, Mỹ). Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,5% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới hệ thống chụp ảnh điện di ChemiDoc (Biorad, Mỹ). Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng illustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả giải trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench, so sánh với trình tự chuẩn của gen CALR mang mã số NM_004343 trong GenBank để xác định đột biến gen. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng quy trình giải trình tự DNA của gen CALR Đột biến gen CALR gặp trong khoảng 25% trường hợp xơ tủy nguyên phát và là đột biến thường gặp sau JAK2V617F (5,7,8). Các đột biến CALR gây ra các biến đổi liên quan trực tiếp đến con đường truyền tín hiệu JAK-STAT và là nhân tố tiên lượng độc lập về mức độ nguy cơ(2,5,8). Khi xảy ra đột biến CALR, protein calreticulin bị thay đổi ở vùng C-terminus và làm mất vùng KDEL, dẫn tới sự tăng sinh bất thường các dòng tế bào máu và sinh bệnh(7). Khi phân tích về thời gian sống toàn bộ của các trường hợp xơ tủy nguyên phát, nhiều nghiên cứu đã cho thấy các BN mang đột biến CALR có nguy cơ tử vong thấp hơn so với các BN mang đột biến JAK2V617F hoặc MPL (3,8,9). Gen CALR có nhiều kiểu đột biến khác nhau, trong đó 2 kiểu đột biến thường gặp là mất đoạn 52-bp và chèn 5-bp TTGTC nên sử dụng kỹ thuật giải trình chuỗi DNA để phát hiện các đột biến là cần thiết(8). Trong nghiên cứu, chúng tôi thiết kế mồi để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR (bảng 1) là vị trí thường xảy ra các đột biến làm thay đổi cấu trúc và chức năng của protein calreticulin. Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong nghiên cứu Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen được khuếch đại Dùng cho PCR CALR-g8F GAAACCCTGTCCAAAGCAAG Exon 8 – 9 (476 bp) CALR-g9R CAGGGCTGGACTGAGGCCTG Dùng cho sequencing CALR-g9F ACAACTTCCTCATCACCAACG Cặp mồi CALR-g8F và CALR-g9R được dùng để khuếch đại vùng exon 9 của gen CALR với kích thước là 476 bp (hình 1). Sau khi thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi trong khoảng 550C – 600C, chúng tôi chọn được nhiệt độ thích hợp cho phản ứng khuếch đại là 550C. Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 325 Hình 1: Khuếch đại exon 8 – 9 gen CALR. Giếng 1: Mẫu BN; giếng 2: chứng dương (476 bp); giếng 3: nước; giếng 4: 1kb DNA Ladder. Sản phẩm khuếch đại được thực hiện giải trình tự chuỗi DNA theo phương pháp Sanger trên hệ thống ABI 3130 Genetic Analyzer. Kết quả khuếch đại gen CALR của các mẫu phù hợp với trình tự gen CALR từ dữ liệu genome. Điều này cho thấy cặp mồi do chúng tôi thiết kế đã khuếch đại đặc hiệu trình tự gen CALR để phát hiện đột biến. Kết quả giải trình tự DNA của gen CALR trên mẫu BN xơ tủy nguyên phát Ứng dụng quy trình kỹ thuật đã được thiết lập ở trên để khảo sát đột biến gen CALR cho 9 BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát không mang đột biến gen JAK2V617F, chúng tôi phát hiện 7 BN có đột biến và hầu hết là đột biến mất đoạn (Bảng 2). Bảng 2: Đặc điểm bệnh nhân trong nghiên cứu Mã nghiên cứu Tuổi Giới Tình trạng đột biến PMF-01 30 Nữ c.1154_1155insTTGTC PMF-02 60 Nữ Không PMF-03 50 Nữ c.1099_1150del PMF-04 32 Nữ Không PMF-05 77 Nữ c.1099_1150del PMF-06 38 Nữ c.1099_1150del PMF-07 61 Nam c.1099_1150del PMF-08 83 Nữ c.1099_1150del PMF-09 42 Nam c.1099_1150del Kết quả nghiên cứu ở bảng 2 cho thấy các BN được chẩn đoán xơ tủy nguyên phát có tuổi trung bình là 53 tuổi, thấp nhất là 30 tuổi và cao nhất là 83 tuổi, và hầu hết là BN nữ (7/9 trường hợp). Trong 9 BN trên đã xác định âm tính JAK2V617F thì có 7/9 trường hợp phát hiện đột biến CALR, chiếm 77,78% với 2 kiểu đột biến là mất đoạn 52 bp (c.1099_1150del) và đột biến chèn thêm 5 bp (c.1154_1155insTTGTC), và các đột biến đều ở dạng dị hợp tử (hình 2). Mất đoạn 52 bp gặp trong 6 BN và là kiểu đột biến thường gặp nhất. Kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy rằng các trường hợp có mang đột biến CALR chiếm tỷ lệ cao ở BN xơ tủy nguyên phát âm tính JAK2V617F, trong đó đột biến mất đoạn 52 bp là kiểu đột biến thường gặp nhất, tương đồng với các nghiên cứu khác trên thế giới(7,8,10). Nghiên cứu của Nangalia J và cộng sự (2013) đã phát hiện đột biến CALR xuất hiện ở 18/32 trường hợp xơ tủy nguyên phát âm tính đột biến JAK2V617F, chiếm tỷ lệ là 56,25%(7). Năm 2014, Rumi E và cộng sự khảo sát trên 218 trường hợp xơ tủy nguyên phát âm tính với JAK2V617F cho kết quả là 64,22% trường hợp mang đột biến CALR, trong đó đột biến mất đoạn 52 bp chiếm 72%, đột biến chèn đoạn 5 bp chiếm 16% và các đột biến khác chiếm tỷ lệ thấp(8). Đồng thời Tefferi A và cộng sự cũng đã công bố tỷ lệ các kiểu đột biến CALR xuất hiện ở 113 BN xơ tủy nguyên phát với 98 trường hợp (74,8%) là đột biến mất đoạn 52 bp, 15 trường hợp (11,5%) là kiểu đột biến chèn đoạn 5 bp, và 18 trường hợp còn lại (13,7%) là các kiểu đột biến khác(10). Việc phát hiện các kiểu đột biến khác nhau và tỷ lệ đột biến tương đồng với các nghiên cứu khác cho thấy kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA trong nghiên cứu này phù hợp với việc khảo sát đột biến CALR trên BN xơ tủy nguyên phát. Kết quả trên cho thấy chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình giải trình tự chuỗi DNA cho phân tích đột biến gen CALR, giúp chẩn đoán chính xác xơ tủy nguyên phát để điều trị phù hợp. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * PB Tập 21 * Số 2 * 2017 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy năm 2017 326 Hình 2: Đột biến CALR trên exon 9. Dạng đột biến mất đoạn thường gặp c.1099_1151del52 (A) và đột biến chèn đoạn c.1154_1155insTTGTC (B). KẾT LUẬN Kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA phát hiện các đột biến CALR đã được thiết lập trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, giúp chẩn đoán và tiên lượng bệnh cho các BN xơ tủy nguyên phát. Hơn nữa, nghiên cứu này cũng cung cấp nền tảng để xây dựng cơ sở dữ liệu riêng cho BN tại Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, et al (2005), Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders, Lancet, 365(9464):1054-61. 2. Campbell PJ, Green AR (2006), The myeloproliferative disorders, N Engl J Med, 7;355(23):2452-66. 3. Chi J, Nicolaou KA, Nicolaidou V, et al (2014), Calreticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis. Leukemia, 28(5):1152-4. 4. Gold LI, Eggleton P, Sweetwyne MT, et al (2010), Calreticulin: non-endoplasmic reticulum functions in physiology and disease, FASEB J, 24:665–83. 5. Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al (2013). Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med, 369:2379–90. 6. Kuwabara K1, Pinsky DJ, Schmidt AM, et al (1995), Calreticulin, an antithrombotic agent which binds to vitamin K-dependent coagulation factors, stimulates endothelial nitric oxide production, and limits thrombosis in canine coronary arteries, J Biol Chem. Apr 7;270(14):8179-87. 7. Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al (2013), Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2, N Engl J Med;369: 2391–405. 8. Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al (2014), Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary myelofibrosis, Blood, 124(7):1062-9. 9. Mario Cazzola, Robert Kralovics (2014), From Janus kinase 2 to calreticulin: the clinically relevant genomic landscape of myeloproliferative neoplasms, Blood, 123:3714-3719. 10. Tefferi A, Lasho TL, Tischer A, et al (2014), The prognostic advantage of calreticulin mutations in myelofibrosis might be confined to type 1 or type 1-like CALR variants, Blood, 2014, 124:2465-2466. Ngày nhận bài báo: 06/03/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/03/2016 Ngày bài báo được đăng: 05/04/2017