Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao chiết kim thất láng (gynura nitida dc., asteraceae)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 647 KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP ĐƯỜNG UỐNG VÀ TÁC ĐỘNG CHỐNG OXY HÓA, BẢO VỆ GAN CỦA CAO CHIẾT KIM THẤT LÁNG (GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE) Trần Thị Nguyệt Ánh*, Trần Thị Ngọc Tú*, Bùi Mỹ Linh**, Đỗ Thị Hồng Tươi* TÓM TẮT Mở đầu: Đề tài cung cấp cơ sở về tính an toàn và tác dụng dược lý của Kim thất láng qua khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của dược liệu này. Phương pháp nghiên cứu: Cây Kim thất láng được chiết với 4 dung môi khác nhau. Dựa trên kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng phương pháp DPPH, chọn cao chiết tiềm năng. Khảo sát độc tính cấp đường uống và xác định LD50 của cao chiết tiềm năng bằng phương pháp Behrens; tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng cách cho uống paracetamol liều 400 mg/kg. Kết quả: Cao tiềm năng là cao cồn 50% (hiệu suất chiết 26,2%) thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro với EC50 là 615,23 µg/ml. Khi cho uống, LD50 trên chuột nhắt của cao cồn 50% từ Kim thất láng là 25,64 ± 1,39 g cao/kg. Cho chuột uống paracetamol 400 mg/kg gây tổn thương gan, làm tăng đáng kể hoạt tính AST, ALT huyết. Cao Kim thất láng ở liều 130 và 260 mg/kg làm giảm hoạt tính AST, ALT huyết, hàm lượng MDA trong gan, phục hồi GSH so với lô chứng bệnh. Liều 260 mg/kg cho tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan tốt hơn liều 130 mg/kg và tương đương với thuốc đối chứng silymarin 100 mg/kg, đưa hàm lượng MDA và GSH của gan trở về như mức sinh lý bình thường. Phân tích đại thể và vi thể gan cho thấy việc uống cao Kim thất láng trong 7 ngày làm giảm tổn thương gan do paracetamol gây ra. Kết luận: Cao cồn 50% từ Kim thất láng thể hiện độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt với LD50 là 25,64 ± 1,39 g/kg và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan ở liều 130 mg/kg và 260 mg/kg; trong đó liều 260 mg/kg có tác động tương đương silymarin liều 100 mg/kg. Từ khóa: Kim thất láng, độc tính cấp, paracetamol, chống oxy hóa, bảo vệ gan. ABSTRACT STUDY ON ACUTE ORAL TOXICITY AND ANTIOXIDANT, HEPATOPROTECTIVE EFFECTS OF EXTRACTS FROM GYNURA NITIDA DC., ASTERACEAE Tran Thi Nguyet Anh, Tran Thi Ngoc Tu, Bui My Linh, Do Thi Hong Tuoi * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 647 – 654 Introduction: The aim of this study is to evaluate acute oral toxicity and antioxidant, hepatoprotective effects of Gynura nitida DC., Asteraceae in order to provide the evidences about the safety and pharmacological effect of this plant. Methods: Dry material was extracted with 4 different solvents (96%, 70%, 50% ethanol and water). Based on the in vitro antioxidant activity of the extracts by DPPH test, potential solvent was selected. The oral acute toxicity was evaluated in mice and LD50 estimated by Behrens method. The antioxidant and hepatoprotective effects of G. nitida extracts were examined in mice induced liver damage by oral administration of 400 mg/kg paracetamol. *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh **Khoa Dược, Trường Đại học Buôn Ma Thuột Tác giả liên lạc: PGS. TS. Đỗ Thị Hồng Tươi ĐT: 0908683080 Email: hongtuoi@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 648 Results: The potential solvent is 50% ethanol (rendement of extraction de 26.2%). This extract expressed acute oral toxicity with value of EC50 of 615.23 g/ml. For oral acute toxicity of 50% ethanol extract in mice, LD50 was 25.64 ± 1.39 g/kg. Oral administration of 400 mg/kg paracetamol induced liver injury associated to significant increases in AST, ALT. The oral doses of 130 and 260 mg/kg of G. nitida extract decreased ALT, AST, MDA levels and increased GSH compared to pathological group. The antioxidant and hepatoprotective effects of dose of 260 mg/kg were better than those of 130 mg/kg; this effect was similar to that of 100 mg/kg silymarin with normal MDA and GSH levels as those of physiological group. Macro-and micro-analyse of liver showed that oral administration of G. nitida extract for 7 days decreased paracetamol-induced liver injury. Conclusion: The 50% ethanol extract of G. nitida had oral acute toxicity in mice with LD50 of 25.64 ± 1.39 g/kg as well as expressed antioxidant, hepatoprotective effects at the doses of 130 mg/kg and 260 mg/kg; effects at 260 mg/kg similar to those of 100 mg/kg silymarin. Key words: Gynura nitida DC., acute toxicity, paracetamol, antioxidant, hepatoprotective effect ĐẶT VẤN ĐỀ Gan dễ bị ảnh hưởng bởi chất độc nên bệnh gan đa dạng và phức tạp. Xu hướng điều trị bệnh gan hiện nay là sử dụng thuốc từ dược liệu nhờ ưu điểm có thể sử dụng lâu dài, an toàn. Gần đây, Kim thất láng (Gynura nitida DC., Asteraceae) thường gọi là Rau rừng, được người dân ưa thích và phân phối trong siêu thị ở nhiều tỉnh của Việt Nam(5,11). Một số báo cáo cho thấy các loài trong chi Gynura có tác dụng kháng viêm, chống oxy hóa. G. procumbens sử dụng trong dân gian ở Thái Lan trị viêm tại chỗ, thấp khớp, bệnh do virus(1,6). Dịch chiết ether của G. bicolor ngăn cản hoạt động của NF-κB, ức chế sản xuất NO, PGE2, giảm đáp ứng viêm ở tế bào RAW 267.7(16). Dịch chiết ethyl acetat của G. bicolor chứa hợp chất phenol có hoạt tính chống oxy hóa mạnh(16). G. procumbens thể hiện khả năng khử DPPH tương ứng với tổng lượng phenolic theo thứ tự dịch chiết methanol > ethanol > nước; khả năng ức chế CYP3A4, CYP1A2 tương ứng với lượng flavonoid: dịch chiết ethanol > methanol > nước(1). Theo Wan và cộng sự (2014), dịch chiết từ lá G. formosana có khả năng chống oxy hóa, khử gốc tự do phụ thuộc lượng hợp chất phenolic và flavonoid ở những nhiệt độ khác nhau(15). Tuy nhiên, các báo cáo về tính an toàn và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của cây Kim thất láng còn rất hạn chế. Từ những cơ sở trên, đề tài thực hiện “Khảo sát độc tính cấp đường uống và tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của Kim thất láng (Gynura nitida DC.)” ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu thử Phần trên mặt đất cây Kim thất láng thu hái tại Buôn Ma Thuột, Đắk Lắk vào tháng 10/2016, được định danh, cung cấp bởi PGS.TS. Bùi Mỹ Linh, Trường Đại học Buôn Ma Thuột. Hóa chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), acid ascorbic, MDA chuẩn, GSH chuẩn, acid thiobarbituric (Sigma-Aldrich, Mỹ); paracetamol (Sanofi-Aventis, Việt Nam); thuốc thử Folin- Ciocalteu, methanol, acid tricloroacetic (TCA), Tris-HCl (Merck, Đức), silymarin (viên Légalon®, số lô: B1600984, ngày sản xuất: 01/4/2016; hạn dùng: 31/3/2021, Madaus GmbH, Đức), formalin, NaCl, KCl (Guangdong Guanghua, Trung Quốc). Động vật nghiên cứu Chuột nhắt Swiss albino đực và cái, 5-6 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 22-25 g, do Viện Vaccin và sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp. Chuột khoẻ mạnh, nuôi ổn định 5 ngày trong lồng 25x35x15 cm (6 chuột/lồng), cung cấp thức ăn, nước uống đầy đủ. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 649 Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất dược liệu Cao được chiết nóng theo tỷ lệ 1 g bột dược liệu với 10 ml dung môi (nước, cồn 50%, 70%, 96% hoặc dung môi tiềm năng) ở 90 oC, chiết 3 lần, 30 phút/lần; dịch chiết được bốc hơi dung môi trên bếp cách thủy ở 50 oC và cô giảm áp thu hồi dung môi, thu cao toàn phần, hút ẩm đến khối lượng không đổi (trong bình hút ẩm). Khảo sát hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng phương pháp DPPH(14) Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu tỷ lệ thuận với sự giảm cường độ màu của DPPH và được xác định bằng cách đo OD ở 517 nm. Kết quả được tính theo công thức: HTCO (%) = [(ODchứng - ODthử)/ ODchứng] × 100. Mẫu chứng (có DPPH, không có mẫu thử) và acid ascorbic được tiến hành song song. Xác định EC50 (nồng độ có HTCO 50%) bằng phần mềm Excel 2010. Khảo sát chất lượng của cao toàn phần tiềm năng Dựa vào hoạt tính chống oxy hóa in vitro của 04 cao, xác định dung môi tiềm năng, chiết cao tiềm năng. Độ tinh khiết (độ ẩm, độ tro toàn phần, độ tro không tan trong acid) của cao tiềm năng được xác định theo các phụ lục tương ứng trong Dược điển Việt Nam V(2). Hợp chất polyphenol trong cao tiềm năng được định lượng bằng phương pháp Folin - Ciocalteu sử dụng chất chuẩn pyrogallol(2,12). Khảo sát độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt Thực hiện theo “Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu” của Bộ Y tế ban hành theo quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015(3). Chuột (50% đực, 50% cái) được nhịn đói ít nhất 12 giờ, cho uống cùng liều cao thử trong điều kiện ổn định, quan sát trong 72 giờ. Giai đoạn sơ bộ xác định liều lớn nhất không làm chết con nào (LD0) và liều tối thiểu gây chết 100% chuột (LD100). Sau đó, chia chuột làm 5 lô (10 con/lô), chia liều ở các lô theo cấp số cộng khoảng từ LD0 - LD100. Theo dõi chuột trong 72 giờ, ghi nhận biểu hiện độc (cử động tổng quát, hành vi, trạng thái lông, ăn uống, tiêu tiểu), số chuột chết/sống, lập bảng số liệu, tính LD50. Liều Số lượng thực tế Số lượng tích lũy Số chết Số sống Tổng số Số chết Số sống Tổng số % chết (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) LD50 được tính theo phương pháp Behrens: LD50 = D1 + [(50-a) x d]/(b-a) Trong đó: D1: liều có % chết sát dưới 50%; a: % chết sát dưới 50%; b: % chết sát trên 50%; d: khoảng cách giữa liều có % chết sát dưới 50% và sát trên 50%. Tính sai số chuẩn của LD50: Vẽ đồ thị biểu diễn % chết tích lũy theo liều, xác định LD16 và LD84. Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức: , với s = (LD84 - LD16)/2 là phân phối chuẩn; hằng số Behrens k = 0,66; d: bước nhảy liều giữa 2 liều gần LD50; n: số chuột trung bình của các nhóm. Nếu sau 72 giờ, chuột không có dấu hiệu bất thường hoặc chết, theo dõi tiếp trong 14 ngày. Chuột chết trong thời gian quan sát, mổ xác để xem nguyên nhân chết. Những chuột sống sau 14 ngày được mổ để xem các cơ quan bên trong có bất thường không. Khảo sát tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột nhắt(9,10) Chuột được chia ngẫu nhiên thành 5 lô (n = 6): lô 1 (sinh lý) và lô 2 (chứng bệnh): uống nước cất, lô 3 (đối chiếu): uống silymarin 100 mg/kg, lô 4, 5: uống cao thử lần lượt với liều 130 và 260 mg/kg; uống 1 lần/ngày vào buổi sáng, thể tích 10 ml/kg, liên tục trong 7 ngày. Ngày thứ 7, sau 1 giờ cho chuột uống nước cất, cao thử hoặc silymarin, gây độc gan cho chuột (trừ lô 1) bằng cách cho uống paracetamol liều duy nhất 400 mg/kg. Sau 6 giờ cho uống paracetamol, gây mê chuột bằng đá CO2, mổ lấy máu tim đo hoạt tính ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase) bằng phương pháp đo động học enzym; tách gan, quan sát đại thể, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 650 ghi trọng lượng. Một phần gan được ngâm trong formol 10% để nhuộm hematoxylin-eosin (HE), phân tích vi thể; phần còn lại để định lượng MDA, GSH. Định lượng malonyl dialdehyd (MDA), glutathion (GSH) trong gan: một phần gan được nghiền đồng thể trong KCl 1,15% (tỉ lệ 1g:10 ml) ở 0-4°C. Lấy 2 ml dịch đồng thể, thêm 1 ml Tris- HCl ủ 60 phút ở 37°C; thêm 1 ml TCA 10%, ly tâm 15 phút 10000 rpm ở 4°C; lấy 2 ml dịch trong phản ứng với 1 ml acid thiobarbituric 0,8% ở 100°C trong 15 phút, đo OD ở 532 nm để định lượng MDA. Lấy 1 ml dịch đồng thể, thêm 2 ml Tris-HCl ủ 60 phút ở 37°C; thêm 1 ml TCA 10%, ly tâm 15 phút, 10000 rpm ở 4oC; lấy 1 ml dịch trong phản ứng với 1,8 ml đệm phosphat-EDTA, 0,2 ml thuốc thử Ellman, ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút, đo OD ở 412 nm để định lượng GSH. Hàm lượng MDA và GSH (nmol/ml dịch đồng thể) được tính theo phương trình hồi quy của MDA/GSH chuẩn. Từ đó, xác định hàm lượng MDA hoặc GSH (nmol/g protein) theo công thức: C = Cnmol/ml × 1000/Cprotein; trong đó Cprotein xác định bằng phương pháp Bradford dựa vào đường cong chuẩn độ của albumin huyết thanh bò (BSA)(4). Phân tích kết quả và xử lý số liệu thống kê Kết quả xử lý bằng Excel, trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn của giá trị trung bình (Mean ± SEM), phân tích thống kê bằng test Kruskal-Wallis và Mann-Whitney (phần mềm SPSS 20.0). Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05. KẾT QUẢ Hiệu suất chiết và hoạt tính chống oxy hóa của các cao toàn phần Hiệu suất chiết cao với 04 dung môi cồn 96%, cồn 70%, cồn 50% và nước lần lượt là 8,13%, 18,67%, 25,93% và 22,93%. Hoạt tính chống oxy hóa in vitro của 4 cao ở nồng độ 1000 µg/ml lần lượt là 20,89%, 48,21%, 73,62% và 10,05%. Từ đó, khảo sát hoạt tính chống oxy ở các nồng độ khác của cao cồn 50% để xác định EC50 so với chất acid ascorbic. Dựa theo phương trình tuyến tính giữa nồng độ và hoạt tính chống oxy hóa của cao Kim thất láng (y = 0,0543x + 16,593, R² = 0,9934) và chất đối chứng acid ascorbic (y = 6,9411x - 0,4636, R² = 0,9936), xác định EC50 của cao cồn 50% và acid ascorbic lần lượt là 615,23 và 7,27 µg/ml. Từ đó, tiến hành chiết cao tiềm năng với cồn 50% có hiệu suất chiết 26,2%, thu cao đặc, màu xanh đen đậm, có mùi thơm đặc trưng của dược liệu. Chất lượng của cao cồn 50% Cao có độ ẩm trung bình 10,8%, độ tro toàn phần trung bình là 8,8%, độ tro không tan trong acid trung bình 0,6%. Cao chứa nhóm hợp chất polyphenol với hàm lượng polyphenol toàn phần theo phương pháp Folin-Ciocalteu là 85 mg pyrogallol/g cao. Độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt của cao cồn 50% từ cây Kim thất láng Cho chuột uống đồng lượng cao thử ở nồng độ tối đa phân tán trong nước cất qua kim là 1500 mg/ml, thể tích cho chuột uống 20 ml/kg (tương đương 30 g cao/kg). Quan sát thấy chuột giảm di chuyển, thở nhanh trong 2-3 phút. Sau 5 phút, chuột co thắt thành bụng kéo dài 30 phút. Khoảng từ 30 - 60 phút, 20% (2/10) chuột co giật và chết, số chuột còn lại di chuyển, ăn cám và uống nước bình thường. Sau 72 giờ, 60% (6/10) chuột chết. Tiến hành giảm liều cao thử, kết quả cho thấy liều cao nhất không gây chết chuột (LD0) là 14 g cao/kg. Tiến hành xác định LD50: Số lượng chuột chết và sống ở mỗi lô sau 72 giờ được trình bày ở Bảng 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 651 Bảng 1: Số lượng chuột chết/sống ở mỗi lô uống cao Kim thất láng Liều (g/kg) Số lượng chuột thực tế Số lượng chuột tích lũy Số chết Số sống Tổng số Số chết Số sống Tổng số % chết 14 0 10 10 0 34 34 0 18 2 8 10 2 24 26 7,69 22 3 7 10 5 16 21 23,81 26 5 5 10 10 9 19 52,63 30 6 4 10 16 4 20 80,00 Giá trị LD50 xác định theo phương pháp Behrens: LD50 = D1 + [(50-a) x d]/(b-a) = 22 + [(50 - 23,81) x 4]/(52,63 - 23,81) = 25,64 mg/kg Đồ thị biểu diễn tỷ lệ phần trăm chết tích lũy (%) theo liều dùng ở Hình 1. Hình 1: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ chết tích lũy (%) theo liều uống cao Kim thất láng Từ đồ thị, xác định LD16 = 16,07 g/kg và LD84 = 30,67 g/kg. Phân phối chuẩn s = (LD84 - LD16)/2 = (30,67 – 16,07)/2 = 7,3 Sai số chuẩn của LD50 tính theo công thức: 39,110/43,766,0.. xx n dsk Es Vậy LD50 của cao cồn 50% từ cây Kim thất láng là 25,64 ± 1,39 (g/kg). Chuột chết trong thử nghiệm và chuột sống sau 14 ngày được mổ, quan sát đại thể cho thấy không có sự thay đổi về đại thể ở tất cả chuột thử nghiệm. Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo của cao cồn 50% từ cây Kim thất láng Liều có thể dùng trong thử nghiệm sinh lý (Ds) ở chuột nhắt không vượt quá 1/10 LD50(5). Do đó, đề tài chọn liều cho uống của cao cồn 50% là 130 mg/kg và 260 mg cao/kg (tương ứng 1/200 và 1/100 LD50, tương đương 500 mg và 1000 mg bột dược liệu khô/kg) để khảo sát tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan trên chuột nhắt được gây tổn thương gan bằng paracetamol. Tác động lên hoạt tính enzym gan Tác động của cao Kim thất láng lên hoạt tính enzym AST, ALT được trình bày trong Bảng 2. Bảng 2: Hoạt tính AST, ALT ở các lô chuột thử nghiệm Lô (n = 6) AST (U/L) ALT (U/L) Sinh lý 123,78 ± 6,92 62,78 ± 4,61 Chứng bệnh 5975,22 ± 292,76 *** 9910,62 ± 446,31 *** Silymarin 100 mg/kg 2449,82 ± 635,53 ***## 4834,17 ± 1222,15 ***## Cao thử liều 130 mg/kg 4166,92 ± 144,96 ***## 7508,58 ± 548,42 ***## Cao thử liều 260 mg/kg 2448,63 ± 459,07 ***## 3965,93 ± 719,95 ***## ***p < 0,001 so với lô sinh lý, ##p < 0,01 so với lô chứng bệnh Hoạt tính AST, ALT của lô chứng bệnh cao hơn lô sinh lý (p < 0,001; AST tăng 48,3 lần, ALT tăng 157,9 lần). Khi dự phòng tổn thương gan bằng cách cho chuột uống silymarin 100 mg/kg hoặc cao thử liều 130 và 260 mg/kg, hoạt tính AST, ALT của chuột giảm có ý nghĩa so với lô chứng bệnh (p < 0,01). Cụ thể: lô silymarin, AST giảm 2,43 lần và ALT giảm 2,05 lần; lô cao thử liều 130 và 260 mg/kg: AST giảm lần lượt 1,43 và 2,44 lần; ALT giảm lần lượt 1,32 và 2,50 lần. Tác dụng của cao Kim thất láng liều 260 mg/kg khác biệt không có ý nghĩa so với silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). Giữa 2 liều cao thử, liều 260 mg/kg giảm hoạt tính ALT tốt hơn liều 130 mg/kg (p < 0,05; thấp hơn 1,9 lần); hoạt tính AST của chuột uống cao thử liều 130 mg/kg cao gấp 1,7 lần so với liều 260 mg/kg nhưng khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05); do số lượng chuột thử nghiệm ít, khoảng dao động giữa các chuột trong một lô rộng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 652 Tác động lên hàm lượng MDA, GSH của gan Từ phương trình tuyến tính của protein (y = 0,1704x + 0,2541, R2 = 0,9553), MDA chuẩn (y = 0,0356x + 0,0912, R² = 0,9936) và GSH chuẩn (y = 0,0007x + 0,1431, R² = 0,9951) suy ra hàm lượng MDA và GSH trong gan (Bảng 3). Bảng 3: Hàm lượng MDA, GSH trong gan của các lô chuột thử nghiệm Lô (n = 6) nmol MDA/g protein nmol GSH/g protein Sinh lý 2,96 ± 0,27 972,93 ± 39,28 Chứng bệnh 14,33 ± 2,09 ** 153,61 ± 15,09 ** Silymarin liều 100 mg/kg 2,63 ± 0,29 ## 685,81 ± 102,28 *## Cao thử liều 130 mg/kg 3,92 ± 0,34 ## 287,26 ± 26,94 **## Cao thử liều 260 mg/kg 2,39 ± 0,37 ## 916,20 ± 85,65 ## *p < 0,05 và **p < 0,01 so với lô sinh lý ##p < 0,01 so với lô chứng bệnh Hàm lượng MDA ở lô chứng bệnh tăng 4,84 lần so với lô sinh lý (p < 0,01). Lô silymarin 100 mg/kg và 2 lô thử đều có hàm lượng MDA gan thấp hơn lô chứng bệnh (p < 0,01), cụ thể MDA ở 3 lô này giảm lần lượt 5,45; 3,66 và 5,60 lần và không khác biệt có ý nghĩa so với sinh lý (p > 0,05). Ngoài ra, hàm lượng MDA ở lô cao liều 260 mg/kg thấp hơn có ý nghĩa so với liều 130 mg/kg (p < 0,05) và không khác biệt so với silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). Về hàm lượng GSH trong gan, lô chứng bệnh giảm 6,33 lần so với lô sinh lý (p < 0,01). Lượng GSH của lô silymarin 100 mg/kg, 2 lô cao Kim thất láng liều 130 và 260 mg/kg tăng lần lượt 4,46; 1,87 và 5,96 lần so với lô chứng bệnh (p < 0,01). Hàm lượng GSH ở lô silymarin và lô cao liều 130 mg/kg lần lượt bằng khoảng 70% và 30% lô sinh lý (p < 0,05). Ở lô cao thử liều 260 mg/kg, GSH gan phục hồi gần trở về mức sinh lý (khoảng 94%, p > 0,05), khác biệt không có ý nghĩa so với silymarin 100 mg/kg (p > 0,05). Giữa 2 liều của cao thử, lượng GSH ở lô uống liều 260 mg/kg cao hơn lô 130 mg/kg (p < 0,01). Tác động lên đại thể, vi thể gan Về đại thể, tất cả chuột sinh lý đều có gan màu đỏ, không phù mề, mặt nhẵn và mềm mại. Chuột chứng bệnh có gan bạc màu, bề mặt có chấm trắng và sung huyết. Đa số chuột ở 2 lô cao thử và lô silymarin có gan màu đỏ, bề mặt nhẵn, không nổi nốt trắng hoặc sung huyết. Kết quả phân tích vi phẫu gan chuột ở các lô được trình bày trong Bảng 4 và Hình 2. Bảng 4: Kết quả phân tích vi phẫu gan chuột thử nghiệm Lô (n=6) Kết quả phân tích vi phẫu gan Sinh lý 6/6 mẫu gan bình thường, không viêm hay hoại tử. Chứng bệnh 4/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm 6/6 và trong tiểu thùy gan: 2/4); 2/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm 4/6 và trong tiểu thùy gan: 2/4) Silymarin 100 mg/kg 3/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18 3/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18 Cao Kim thất láng liều 130 mg/kg 1/6 mẫu gan viêm mức độ 8/18; 1/6 mẫu gan viêm mức độ 7/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm 5/6 và trong tiểu thùy gan: 2/4); 2/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18; 1/6 mẫu gan viêm mức độ 4/18 (hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm 3/6 và trong tiểu thùy gan: 1/4); 1/6 mẫu gan viêm mức độ 3/18 Cao Kim thất láng liều 260 mg/kg 3/6 mẫu gan viêm mức độ 7/18 3/6 mẫu gan viêm mức độ 6/18 Kết quả cho thấy lô sinh lý không chuột nào xuất hiện tình trạng viêm gan. Với lô chứng bệnh, xuất hiện tình trạng viêm gan cấp thể hiện qua những bất thường trên đại thể và vi thể gan (hoại tử nặng tế bào gan). Khi cho chuột uống cao cồn 50% từ Kim thất láng liều 130 và 260 mg/kg hoặc mẫu đối chứng silymarin 100 mg/kg, kết quả cho thấy có sự giảm tổn thương gan do paracetamol gây ra rõ rệt. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược 653 Hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm Hoại tử tiểu thùy gan Hình 2: Vi thể cấu trúc tế bào gan BÀN LUẬN Từ hiệu suất chiết và hoạt tính chống oxy hóa in vitro khảo sát bằng phương pháp DPPH, cồn 50% được chọn là dung môi tiềm năng để chiết khối lượng lớn cao Kim thất láng. Cao cồn 50% thể hiện hoạt tính chống oxy hóa in vitro với EC50 615,23 mg/ml, hàm lượng polyphenol toàn phần tương ứng 85 mg pyrogallol/g cao, phù hợp với một số báo cáo về hàm lượng polyphenol của G. procumbens khoảng 70,7 mg GAE/g cao và một số loài chi Gynura có hoạt tính chống oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do(1). Đề tài khảo sát khả năng chống oxy hóa, bảo vệ gan in vivo của cao cồn 50% từ cây Kim thất láng trên chuột nhắt gây tổn thương gan bằng paracetamol đã được báo cáo với liều 200 - 400 mg/kg có thể gây độc gan trong vòng 6-24 giờ(10). Kết quả cho thấy paracetamol làm tăng AST, ALT, MDA và giảm GSH tương tự báo cáo của Madkour và cộng sự (2013)(9). Cao chiết Kim thất láng cho uống liều 130 và 260 mg/kg thể hiện tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan; giúp giảm hoạt tính AST, ALT, hàm lượng MDA và tăng GSH, đặc biệt với liều 260 mg/kg thể hiện tác dụng tương tự silymarin 100 mg/kg, giúp giá trị MDA và GSH trở về gần với mức sinh lý. Tác dụng bảo vệ gan của cao Kim thất láng còn được khẳng định bởi sự giảm tổn thương gan ở các lô điều trị so với lô chứng bệnh khi phân tích vi thể cấu trúc gan. Tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan của Kim thất láng phù hợp với báo cáo về tác dụng dược lý của các loài thuộc chi Gynura như khả năng chống oxy hóa, cải thiện sự tăng hoạt tính AST, ALT của dịch chiết G. formosana trên chuột cống bị viêm gan nhiễm mỡ không do rượu và cao chiết G. procumbens trên thỏ bị tổn thương gan do chế độ ăn giàu cholesterol(7,8,14,15). KẾT LUẬN Cao cồn 50% từ cây Kim thất láng thể hiện độc tính cấp đường uống với LD50 là 25,64 ± 1,39 g/kg. Cho chuột nhắt uống cao liều 130 và 260 mg/kg trong 7 ngày liên tiếp thể hiện tác động chống oxy hóa, bảo vệ gan, giảm tổn thương gan do paracetamol gây ra; trong đó liều 260 mg/kg tác động tốt hơn liều 130 mg/kg và tương tự tác động của silymarin 100 mg/kg. Đề tài mở ra triển vọng nghiên cứu và phát triển sản phẩm từ Kim thất láng ứng dụng trong phòng và/hoặc điều trị các bệnh về gan. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Afandi A, et al. (2014), “Antioxidant properties of Gynura procumbens extracts and their inhibitory effects on two major human recombinant cytochrome P450s using a high throughput luminescence assay”, Asian journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 7(5), pp. 36-41. 2. Bộ Y tế (2010), Dược điển Việt Nam 5, NXB Y học, PL 203, 204, 205. 3. Bộ Y tế (2015), Quyết định số 141/QĐ-K2ĐT ngày 27/10/2015, Hướng dẫn thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng thuốc đông y, thuốc từ dược liệu. 4. Bradford MM (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”, Analytical Biochemistry, 72, pp. 248 - 254. 5. Đỗ Trung Đàm (2014), Phương pháp xác định độc tính của thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr.15-157, 199-215. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Chuyên Đề Dược 654 6. Iskander M, et al. (2002), “Antiinflammatory screening of the medical plant Gynura procumbens”, Plant Foods for Human Nutrition, 57(3-4), pp. 233-244. 7. Ismail MAH, et al. (2016), “Effects of Gynura procumbens extract on liver function test of hypercholesterolemia induced rabbits”, 78(6-7), pp. 49-54 8. Ma J (2017), “Antioxidant and anti-inflammatory activities of ethyl acetate extract of Gynura formosana leaves”, Experimental and therapeutic medicine, 14, pp. 2303-2309. 9. Madkour FF, Abdel-Daim MM (2013), “Hepatoprotective and antioxidant activity of Dunaliella salina in paracetamol-induced acute toxicity in rats”, Indian journal of Pharmaceutical Sciences, 75(6), pp. 642-648. 10. Maes M, et al. (2016), “Experimental models of hepatotoxicity related to acute liver failure”, Toxicology and Applied Pharmacology, 290, pp. 86-97. 11. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, quyển III, Nhà xuất bản trẻ, tr. 230-233. 12. Singleton VL, et al. (1999), “Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin- Ciocalteu reagent”, Methods Enzymol, 299, pp. 152-178. 13. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. 14. Wan C, et al. (2011), “Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of Gynura divaricate leaf extracts at different temperatures”, Pharmacognosy Magazine, 7(25), pp. 40-45. 15. Wan Y, et al. (2014), “Therapeutical effect of Gynura formosana alcohol extract on non-alcoholic fatty liver disease in rats”, Global journal of Intergrated Chinese Medicine and Western Medicine, 2(2). 16. Wu C, et al. (2013), “Antiinflammatory activity of Gynura bicolor ether extract through inhibits nuclear factor kappa B activation”, Journal of Traditional and Complementary Medicine, 3(1), pp. 48-52. Ngày nhận bài báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019