Khả năng tồn tại và di cư của tế bào trong gel fibrin sau khi ghép trên mảnh ngà răng đã xử lý

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 1 KHẢ NĂNG TỒN TẠI VÀ DI CƯ CỦA TẾ BÀO TRONG GEL FIBRIN SAU KHI GHÉP TRÊN MẢNH NGÀ RĂNG ĐÃ XỬ LÝ Nguyễn Thị Ngọc Hạnh*, Đoàn Nguyên Vũ**, Trần Xuân Vĩnh***, Trần Lê Bảo Hà** TÓM TẮT Mở đầu: Gel fibrin là vật liệu khung nâng đỡ phù hợp cho sự tái tạo mô tủy. Tuy nhiên trong kĩ nghệ mô nha khoa hiện nay, ứng dụng của gel fibrin còn rất hạn chế. Mục tiêu: Mục tiêu của nghiên cứu này là tạo gel fibrin có tế bào và đánh giá sự tồn tại, di cư của tế bào trong cấu trúc này sau khi ghép trên mảnh ngà răng đã xử lý. Đối tượng và Phương pháp nghiên cứu: Các mảnh ngà răng người được tạo có kích thước khoảng 5 – 6 mm, đường kính rãnh là 1mm. Tế bào gốc tủy răng được đưa lên khung nâng đỡ gel fibrin. Gel fibrin có tế bào gốc tủy răng và mô tủy nguyên được cấy lên mảnh ngà răng đã xử lý. Cố định các thành phần trên mảnh ngà răng và nuôi cấy in vitro 2 tuần. Sự tồn tạo và di cư của tế bào trong gel fibrin được đánh giá bằng kỹ thuật mô học và phản ứng PCR Kết quả: Kết quả cho thấy có sự tồn tại của tế bào trong cấu trúc sau 2 tuần ghép trên mảnh ngà răng đã xử lý và có sự di cư của tế bào trong mô tủy nguyên sang gel fibrin. Từ khóa: Gel fibrin, bệnh lý tủy, tồn tại, di cư. ABSTRACT THE SURVIVAL AND MIGRATION OF CELLS IN THE GEL FIBRIN-FORMING CELLS AFTER SEEDED HUMAN TREATED DENTIN MATRIX Nguyen Thi Ngoc Hanh, Doan Nguyen Vu, Tran Xuan Vinh, Tran Le Bao Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 20 - No 2 - 2016: 1 - 6 Background: The fibrin gel has many useful characteristics for the pulp tissue regeneration but its application in dental engineering is still limited. Objective: The aims of this study are to conduct a cell containing fibrin gel and to evaluate the survival and migration of cells in this structure after seeded on human treated dentin matrix. Material and Methods: Firstly, the dentin slices from 5 – 6 mm in length and 1 mm diameter of drain were cut from human tooth. Dental pulp stem cells were seeded on fibrin gel. Secondly fibrin gel/cell structure and living pulp are seeded to the dentin slices. These slices then were fixed and cultured in vitro for 2 weeks. The survival and migration of cells in gel fibrin was evaluated by HE staining and PCR. Results: The results showed that the cells presented in fibrin gel/cell structure after two weeks. Some cells of living pulp tended to move into fibrin gel and proliferated together with dental pulp stem cells. Keywords: fibrin gel, survival, migration * Trường Cao đẳng Y tế Kiên Giang ** Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia-thành phố Hồ Chí Minh ***Bộ môn Nha khoa cơ sở, Khoa RHM, Đại học Y Dược, TpHCM Tác giả liên lạc: PGS.TS. Trần Lê Bảo Hà ĐT: 0988575507 Email: tlbha@hcmus.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 2 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh lý tủy là một bệnh khá phổ biến trong lĩnh vực nha khoa, và nội nha là phương pháp điều trị được áp dụng nhiều nhất. Răng sau nội nha sẽ mất đi khả năng nhận cảm với sự thay đổi của môi trường và khả năng sửa chữa của răng với những tổn thương sau đó. Chính vì vậy, nhu cầu đòi hỏi một liệu pháp khác nhằm phục hồi tốt hơn cho răng là cần thiết. Trên thế giới, khi tế bào gốc tủy răng người được phân lập lần đầu tiên vào năm 2000, cùng với sự phát triển của kĩ nghệ mô thì các nhà nghiên cứu đã bắt đầu hi vọng có thể tái tạo lại được mô ngà tủy tự nhiên thay thế cho phương pháp điều trị nội nha hiện tại, mở ra cuộc cách mạng cho sự tái tạo ngà tủy, hay nói cách khác là chiếc răng có hy vọng được sống lại(3). Ngà răng người có các phân tử tín hiệu và rất nhiều protein đã được chứng minh là quan trọng trong sự phát triển, khoáng hóa và tái tạo ngà răng. Khi được phóng thích, những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong sự thành lập ngà sửa chữa, một đáp ứng của phức hợp ngà tủy. Những nghiên cứu trước đây đã chứng minh ngà răng người đã xử lý (hTDM) có tính tương hợp sinh học cũng như hoạt tính sinh học thích hợp để làm khung nâng đỡ lý tưởng trong tái tạo răng(5). Khung nâng đỡ fibrin được sử dụng trong các nghiên cứu tái tạo mô sụn, tim mạch và thần kinh. Các đặc tính sinh học của gel fibrin phù hợp làm khung nâng đỡ như: tương hợp sinh học, đáp ứng miễn dịch thấp, phân hủy sinh học, dễ dàng thu nhận và xử lý, có thể tạo ra được nhiều hình dạng với nhiều kích thước khác nhau... Gel fibrin thu nhận từ máu của bệnh nhân nên đó là khung nâng đỡ tự thân, sẽ không độc, không gây viêm. Gel fibrin mềm mại nên có thể đưa vào buồng tủy dễ dàng(2,4,9). Với những tính năng này, gel fibrin là vật liệu khung nâng đỡ phù hợp cho sự tái tạo mô tủy. Tuy nhiên trong kĩ nghệ mô nha khoa hiện nay, ứng dụng của gel fibrin còn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với mục tiêu là tạo được cấu trúc gel fibrin có tế bào và đánh giá sự tồn tại, di cư của tế bào trong cấu trúc này. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Gel fibrin từ huyết tương người; Tế bào gốc tủy răng người. Tạo mô hình nghiên cứu Xử lý răng và tạo mảnh ngà răng: Các mảnh ngà răng được tạo có chiều dài từ 5-6 mm, đường kính rãnh là 1mm và được lần lượt khuấy trong PBS (Phosphat Buffered Saline (Gibco)) 1X 10 phút, trong EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid - Sigma) 17% 10 phút, trong axit citric 19% 1 phút. Sau đó, các mảnh ngà răng này được lắc trong PBS 1X 5-7 ngày, tốc độ lắc là 120 vòng/phút. Cuối cùng, các mảnh ngà răng đã xử lý được thu nhận, làm khô, đóng gói và chiếu xạ ở Trung Tâm Nghiên Cứu và Triển Khai Công Nghệ Bức Xạ, Thành phố Hồ Chí Minh với liều chiếu xạ là 25 kGy(7, 8). Tạo cấu trúc gel fibrin/tế bào Gel fibrin có chứa tế bào bên trong được tạo bằng cách cho 250 µl huyết tương vào giếng, thêm 250 µl dung dịch CaCl2 40mM vào và thêm 104 tế bào gốc tuỷ răng, huyền phù để tế bào phân bố đều trong gel. Sau 24 giờ, thu nhận cấu trúc gel fibrin/tế bào và ghép lên mảnh ngà răng. Thu nhận mô tủy nguyên từ răng người nam Răng được tạo các rãnh dọc theo thân và chân với độ sâu vừa phải, không lộ tủy bằng máy cắt răng. Mô tủy nguyên được thu nhận trong tủ vô trùng theo các bước sau: khử trùng răng trong povidine trong 10 phút, rửa lại với PBS 1X (2 lần), đặt răng lên gạc vô trùng, dùng kéo cắt răng làm đôi theo các rãnh đã được tạo ra trước đó, thu nhận phần tủy buồng, cắt bỏ phần tủy chân gần chóp để tránh nguy cơ nhiễm khuẩn, cho vào 1 đĩa petri sạch có sẵn PBS 1X, dùng lưỡi dao phẫu thuật cắt mô tủy nguyên ra thành 2 phần. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 3 Ghép cấu trúc gel fibrin/tế bào lên mảnh ngà răng Chúng tôi thực hiện 3 nghiệm thức nghiên cứu, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần: Nghiệm thức 1 (NT 1): Mảnh ngà răng + gel fibrin/tế bào + mô tủy nguyên Nghiệm thức 2 (NT 2): Mảnh ngà răng + gel fibrin/tế bào Nghiệm thức 3 (NT 3): Mảnh ngà răng + gel fibrin Cố định gel fibrin và mô tủy nguyên lên mảnh ngà răng Tùy theo thành phần của từng nghiệm thức, tiến hành đặt gel fibrin, gel fibrin/ tế bào và mô tủy nguyên lên rãnh của mảnh ngà răng. Cố định các thành phần ghép bằng cách đặt lưới thép không gỉ kích thước 1x1cm, vào từng giếng của đĩa 4 giếng, lên trên mảnh ngà răng, sao cho vừa chặt tay. Đánh giá sự tồn tại của tế bào Mô hình sau khi lấy ra sẽ được cố định trong dung dịch formalin 10% đệm phosphate. Sau đó, mẫu được khử khoáng, cắt lát và nhuộm H&E. Đánh giá sự di cư của tế bào Phần gel fibrin sau khi tách ra từ 3 nghiệm thức sau 2 tuần nghiên cứu sẽ được bảo quản trong môi trường nuôi cấy. Sau đó, thực hiện phản ứng PCR xác định biểu hiện gen SRY. Tế bào gốc tủy răng người được thu nhận từ người nữ, mô tủy nguyên được thu nhận từ người nam. Gen SRY là gen đại diện cho giới tính nam. Phản ứng PCR nhằm xác định có hay không sự hiện diện của tế bào người nam ở vùng các tế bào nữ trong cấu trúc gel fibrin/tế bào, thông qua sự có mặt của gen SRY. KẾT QUẢ Tạo cấu trúc gel fibrin/tế bào Kính hiển vi soi ngược được sử dụng để quan sát tế bào trong gel. Hình 1. Tế bào trong gel (40X) A: Tế bào sau khi đưa lên gel fibrin, B: Tế bào sau 24 giờ đưa lên gel fibrin, C: Bề mặt đĩa sau khi lấy gel fibrin ra. A B C Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 4 Hình 2. Tế bào bên trong gel fibrin sau 1 tuần: (A) NT 1; (C) NT 2 và sau 2 tuần: (B) NT 1; (D) NT 2 2 1 F M L Hình 3. Kết quả PCR gen SRY mẫu gel sau 2 tuần, L: thang đánh giá; M: mô tủy nguyên người nam, F: mô tủy nguyên người nữ, 1: mẫu gel NT 1, 2: mẫu gel NT 2. Khi mới được cố định lên gel, tế bào có dạng tròn. Sau 24 giờ, tế bào có dạng trải dài. Sau khi lấy gel fibrin ra khỏi giếng, bề mặt giếng dưới kính hiển vi hầu như không thấy tế bào (Hình 1 A, B, C). A B C D Gel fibrin/ tế bào Gel fibrin/ tế bào Gel fibrin/ tế bào Ngà Ngà Gel fibrin/ tế bào Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 5 Kết quả nhuộm H&E Ở cả NT 1 và NT 2, mật độ tế bào bên trong gel ở 1 tuần và 2 tuần đều tương đương nhau, khó nhận ra sự thay đổi. (Hình 2 A, B, C, D). Kết quả PCR Kết quả PCR (Hình 3) cho thấy 4 mẫu đều biểu hiện gen chứng nội GAPDH (97bp). Mẫu gel của NT 1 biểu hiện gen SRY (224bp) giống với mẫu chứng là mô tủy nguyên của người nam, chứng tỏ đã có tế bào của phần mô tủy nguyên trong mô hình in vitro di chuyển sang phần gel fibrin. Mẫu gel của NT 2 biểu hiện âm tính giống với mẫu chứng là mô tủy nguyên của người nữ, phù hợp với thí nghiệm, do NT 2 không bổ sung mô tủy nguyên trong mô hình nghiên cứu. BÀN LUẬN Cấu trúc gel fibrin/tế bào Tế bào được đưa vào gel fibrin khi dung dịch fibrin còn tồn tại ở dạng lỏng (chưa hình thành gel). Khi đó, các tế bào huyền phù đều trong dung dịch fibrin. Khoảng 20 phút sau, dung dịch fibrin chuyển thành dạng gel, tế bào được bắt giữ bên trong gel. Dưới kính hiển vi soi ngược, có thể thấy tế bào phân bố đều trong gel fibrin. Khi mới được cố định lên gel, tế bào có dạng tròn do tế bào chưa bám dính và đang ở trạng thái co lại bởi ảnh hưởng của trypsin. Sau khi cố định tế bào lên gel fibrin, cần giữ gel trong tủ nuôi cấy ít nhất 24 giờ trước khi thu nhận. Đó là thời gian để tế bào thích nghi với môi trường mới và bám trải trên đó. Quan sát sau 24 giờ, tế bào bắt đầu có dạng bám trải trên khung nâng đỡ gel fibrin. Sau khi lấy gel fibrin ra khỏi giếng, quan sát bề mặt giếng dưới kính hiển vi, hầu như không thấy sự xuất hiện của tế bào. Điều này cho thấy, hiệu suất cố định tế bào lên gel fibrin cao. Sự tồn tại của tế bào Sau 2 tuần trong điều kiện nuôi cấy in vitro có thể quan sát thấy nhiều tế bào vẫn hiện diện bên trong gel. Ở cả NT 1 và NT 2, mật độ tế bào bên trong gel ở 1 tuần và 2 tuần đều tương đương nhau, khó nhận ra sự thay đổi. Điều này cho thấy các tế bào vẫn tồn tại bên trong gel. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các kết luận trên thế giới vì gel fibrin đã được chứng minh là có khả năng hỗ trợ sự bám, tăng sinh và biệt hóa của tế bào. Christman (2004) và Zha (2008) đã chứng minh trên gel fibrin tế bào có thể tồn tại và phát triển được. Gel fibrin có cấu trúc không gian 3 chiều, các lỗ thông với nhau. Gel fibrin đóng vai trò như chất nền ngoại bào tạm thời, cung cấp môi trường cho tế bào phát triển. Ngoài ra, gel fibrin có vùng RGD (Arginine-glycine- asparagine) là vùng cho phép các thụ thể của tế bào bám vào. Khi được đưa lên gel fibrin, tế bào được giữ lại trong chất nền ngoại bào này(1, 6) Theo Sharma (2014) và Jamey (2009), sự mềm mại và tương hợp sinh học tốt của gel fibrin là rất hiệu quả để tạo khung nâng đỡ cho tế bào. Hơn nữa, khung nâng đỡ fibrin còn có nhiều đặc tính như phân hủy sinh học, dễ dàng thu nhận và xử lý, có thể tạo ra được nhiều hình dạng với nhiều kích thước khác nhau. Gel fibrin thu nhận từ máu của bệnh nhân nên đó là khung nâng đỡ tự thân, sẽ không độc, không gây viêm. Không giống với hydrogel tổng hợp, fibrin không chỉ là khung nâng đỡ giúp phân phối tế bào một cách thụ động, mà nó còn chứa các nhân tố tăng trưởng đặc biệt như các thành phần đông máu, gồm fibronectin, axit hyaluronic và nhân tố von Willebrand(2, 4). Sự di cư của tế bào Kết quả PCR để đánh giá sự di cư của tế bào từ mô tủy nguyên người nam sang gel fibrin. Đồng thời với việc khuếch đại gen SRY (224 bp) chúng tôi khuếch đại gen GAPDH (97 bp). Đây là gen được thể hiện trên mọi tế bào, không phụ thuộc vào thể loại, trạng thái hoạt động hay nguồn gốc nên được dùng như một gen nội chuẩn để đánh giá chất lượng của sản phẩm DNA tách chiết. Kết quả cho thấy sự biểu hiện của GAPDH ở tất cả các mẫu đều rất rõ ràng. Điều này chứng tỏ khâu tách chiết và khuyếch Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số 2 * 2016 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 6 đại đạt độ nhạy. Cả 4 mẫu đều có chất lượng DNA được thu nhận tốt, đảm bảo tiêu chuẩn cho phản ứng, phản ứng PCR với chu trình thiết lập diễn ra bình thường, đồng thời không có sự khác biệt về lượng mẫu đã sử dụng trong mỗi phản ứng PCR. Hai mẫu đối chứng có kết quả hợp lý, mẫu mô tủy nguyên giới tính nam biểu hiện dương tính với gen SRY, mẫu mô tủy nguyên giới tính nữ không biểu hiện gen SRY. Về kết quả khuếch đại gen SRY, mẫu biểu hiện dương tính chỉ có nghiệm thức 1. Trong mô hình thí nghiệm, nghiệm thức 1 được bổ sung mô tủy nguyên người nam và gel fibrin có tế bào nữ. Kết quả cho thấy phần gel fibrin ở nghiệm thức 1 đã xuất hiện tế bào mang giới tính nam, từ đó kết luận rằng tế bào từ mô tủy nguyên của người nam đã di cư sang phần gel fibrin trong mô hình thí nghiệm. Nghiệm thức 2 âm tính với gen SRY, phù hợp với mô hình thí nghiệm, do nghiệm thức 2 không được bổ sung mô tủy nguyên của người nam, chỉ có gel fibrin có tế bào nữ. Kết quả PCR có thể đưa ra kết luận rằng tế bào từ mô tủy nguyên đã di cư sang cấu trúc gel fibrin/tế bào. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu đã tạo được cấu trúc gel fibrin/tế bào từ huyết tương và dung dịch CaCl2 với nồng độ cuối của CaCl2 là 20mM, và mật độ 104 tế bào trên 500 µl gel. Có sự tồn tại của tế bào bên trong cấu trúc gel fibrin sau 2 tuần ghép trên mảnh ngà răng đã xử lý và sự di cư của tế bào trong mô tủy nguyên sang gel fibrin. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được tài trợ bởi Bộ Khoa học và Công nghệ trong khuôn khổ đề tài mã số ĐTĐL.2012-G34. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Christman KL, Vardanian AJ, Fang Q., Sievers R. E., Fok H. H., et al. (2004), "Injectable fibrin scaffold improves cell transplant survival, reduces infarct expansion, and induces neovasculature formation in ischemic myocardium", J Am Coll Cardiol, 44 (3), pp.654-660. 2. Cornelissen C. G., Dietrich M., Kruger S., Spillner J., Schmitz- Rode T., et al. (2012), "Fibrin gel as alternative scaffold for respiratory tissue engineering", Ann Biomed Eng, 40 (3), pp.679-687 3. Gronthos S., Mankani M., Brahim J., Robey P. G., Shi S. (2000), "Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo", Proc Natl Acad Sci USA, 97 (25), pp.13625-13630. 4. Janmey P. A., Winer J. P., Weisel J. W. (2009), "Fibrin gels and their clinical and bioengineering applications", Journal of The Royal Society Interface, 6 (30), pp.1-10. 5. Li R., Guo W., Yang B., Guo L., Sheng L., et al. (2011), "Human treated dentin matrix as a natural scaffold for complete human dentin tissue regeneration", Biomaterials, 32 (20), pp.4525-4538. 6. Shaikh F. M., Callanan A., Kavanagh E. G., Burke P. E., Grace P. A., et al. (2008), "Fibrin: a natural biodegradable scaffold in vascular tissue engineering", Cells Tissues Organs, 188 (4), pp.333-346. 7. Tran Le Bao Ha, Nguyen Thi Ngoc My, Doan Nguyen Vu (2015), "Fabrication and evaluation of human dentin as scafford for dental pulp stem cells", Tissue engineering and Regenerative medicine. 8. Tran Le Bao Ha, Đoan Nguyen Vu, To Minh Quan, Phan Kim Ngoc, Nguyen Thi Thu, et al. (2011), "Study on Culture of Human Dental Pulp Stem Cells to apply in Tissue Engineering", Journal of Biomimetics, Biomaterials & Tissue Engineering, 11, pp.13-20. 9. Zhao H., Ma L., Zhou J., Mao Z., Gao C., et al. (2008), "Fabrication and physical and biological properties of fibrin gel derived from human plasma", Biomed Mater, 3 (1), pp.15001-15010 Ngày nhận bài báo: 27/01/2016 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/02/2016 Ngày bài báo được đăng: 25/03/2016