Khả năng kháng khuẩn vibrio parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu (combretum quadrangulare) trong điều kiện in vitro

An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 1 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN Vibrio parahaemolyticus CỦA DỊCH TRÍCH CÂY TRÂM BẦU (Combretum quadrangulare) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Nguyễn Công Tráng1, Ngô Thị Kim Cúc1, Phan Ngọc Thịnh1 1Trường Đại học Tiền Giang Thông tin chung: Ngày nhận bài: 05/08/2017 Ngày nhận kết quả bình duyệt: 08/10/2017 Ngày chấp nhận đăng: 04/2018 Title: A study on the anti-bacterial activity of extracts from sakae naa tree (Combretum quadrangulare) in Vitro Keywords: Sakae naa tree, hepatopancreas, EMS, herbal medicine, Vibrio parahaemolyticus Từ khóa: Cây trâm bầu, EMS, thảo mộc, Vibrio parahaemolyticus ABSTRACT Vibrio parahaemolyticus is a dangerous bacteria that caused a lot of diseases in a aquaculture, particularly EMS symtomp on the shrimp. Over the years, Sakae naa tree (Combretum quadrangulare) has been considered a precious herb because of its benefits to cure health humans and aquatic animals. This study was conducted to explore anti-bacterial activities of extracts from the sakae naa tree on Vibrio parahaemolyticus, together with seeds, leaves and the skin of the tree in vitro condition. The finding showed that extracts from Combretum quadrangulare were resistant significantly on Vibrio parahaemolyticus with 13.19 mm of average diameter, in which the resistance from seed extracts was stronger than those leaves and bark of the tree with 16.29 mm, 11.84 mm, and 11.44 mm of diameter, respectively. Anti-bacterial activities of extracts from sakae naa tree were in different ratios due to the mixed level of purified water. The experiment 1, 2, 3 and 4 was at 14.15 mm, 13,25 mm, 14.09 mm, and 12.28 mm diameter accordingly. MIC of seed extracts from sakae naa tree (one per five mixed with purified water) on Vibrio parahaemolyticus was 7.5 µL/mL. TÓM TẮT Vibrio parahaemolyticus gây nhiều bệnh nguy hiểm cho động vật thủy sản, đặc biệt hiện nay là hội chứng EMS trên tôm. Cây trâm bầu (Combretum quadrangulare) từ lâu được xem là loại thảo dược quý chữa nhiều bệnh trên người và động vật thủy sản. Nghiên cứu này để xác định khả năng kháng V. parahaemolyticus của dịch trích lá, vỏ và hạt cây trâm bầu trong điều kiện in vitro. Nghiên cứu cho thấy, dịch trích cây trâm bầu kháng V. parahaemolyticus mạnh với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình 13,19 mm. Trong đó, dịch trích hạt cho tính kháng mạnh hơn dịch trích từ lá và vỏ với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 16,29 mm, 11,84 mm và 11,44 mm. Tính kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu ở các tỷ lệ phối trộn nước cất, giảm dần theo sự tăng dần nước cất, cụ thể, đường kính vòng kháng khuẩn ở NT1 là 14,15 mm, ở NT2 là 13,25 mm, ở NT3 là 14,09 mm và ở NT4 là 12,28 mm. MIC của dịch trích hạt trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5) đối với Vibrio parahaemolyticus là 7,5 µL/mL. An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 2 1. GIỚI THIỆU Khi diện tích nuôi trồng thủy sản ngày càng được mở rộng thì dịch bệnh là một trong những yếu tố gây khó khăn lớn nhất cho nghề nuôi. Các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay rất đa dạng và phức tạp với nhiều dạng khác nhau như Aeromonas sp., Edwardsiella sp., Vibrio sp., Streptococcus sp.,... Trong đó, loài gây bệnh nguy hiểm cho động vật thủy sản phổ biến là loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Chúng có khả năng bùng phát và lây lan nhanh chóng vì thế vấn đề kiểm soát, tiêu diệt loài vi khuẩn này gặp rất nhiều khó khăn. Do tác nhân gây hội chứng EMS trên tôm là loài vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus khi bị nhiễm bacteriophage hiện nay ngày càng trở nên phổ biến, dẫn đến nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh do loài vi khuẩn này gây ra cũng ngày một tăng cao, nếu không xử lý triệt để sẽ gây mất mùa và thiệt hại nặng nề, vì vậy nhu cầu sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh do loài vi khuẩn này gây ra cũng ngày một tăng cao. Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh không đúng quy cách, không đúng liều lượng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe động vật thủy sản, môi trường sinh thái, an toàn vệ sinh thực phẩm và đặc biệt là tạo ra các chủng vi khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh; đồng thời tăng nguy cơ nhiễm các loài vi khuẩn có khả năng kháng thuốc cho con người, động vật và tồn dư trong thịt động vật thủy sản (Thành Công, 2016). Hiện nay có rất nhiều loại thảo mộc như cây nhọ nồi, cây sài đất, cây chó đẻ, cây sim, củ tỏi... đang được ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản, giúp đảm bảo an toàn và hiệu quả cao trong việc điều trị bệnh cho động vật thủy sản. Đặng Thị Lụa và cs. (2015), Nguyễn Thị Hạnh và cs. (2015), đã thử nghiệm tác dụng kháng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) trên tôm nuôi nước lợ của dịch chiết hạt sim, lá sim và dịch chiết cây diệp hạ châu đắng. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của cây màng tang (Litae cubela) đã được thử nghiệm trong nghiên cứu của Nguyễn Hải Vân và cs. (2015). Riêng cây trâm bầu, đặc biệt là bộ phận hạt có chứa nhiều tinh dầu và hợp chất flavonoid (Bùi Xuân Hào, 2013). Theo Adnyana et al. (2000), hạt cây trâm bầu có chứa 6 loại glucosides triterpene là ursane - (1 - 4), oleanane - và các loại lupane có tác dụng diệt các loài vi khuẩn Alcaligenes faecalis, Bacillus cereus và Staphylococcus typhimurium. Bên cạnh đó, hạt cây trâm bầu còn diệt các loài ký sinh trùng gây bệnh trên các loài động vật thủy sản nuôi (Bùi Quang Tề, 2011). Tuy nhiên nghiên cứu về tính kháng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh trên động vật thủy sản hiện nay của cây trâm bầu vẫn chưa được thực hiện. Trong nghiên cứu này, dịch trích từ cây trâm bầu được dùng để thử nghiệm, đánh giá khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus, làm cơ sở khoa học cho việc chế tạo các sản phẩm thảo dược để phòng trị bệnh cho tôm nuôi. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các bộ phận (vỏ, lá, hạt) của cây trâm bầu được thu hái vào tháng 01/2017, tại xã Thân Cửu Nghĩa và Long An, huyện Châu Thành, tỉnh Tiền Giang. Lá trâm bầu được thu hái là các lá xanh, già, không sâu bệnh, nấm mốc hay vàng úa. Vỏ cây trâm bầu được tách ra từ thân cây trâm bầu tươi khỏe, chọn vỏ cây già, không bị sâu đục thân. Trái trâm bầu được thu hái là những trái già, nguyên vẹn, sau khi thu hái, trái được tách lấy hạt và sử dụng hạt để nghiên cứu. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được mua tại Phòng Thí nghiệm Bệnh học Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Nguyên vật liệu khác bao gồm môi trường chọn lọc của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là Chrom agar (thành phần gồm agar, peptone, dịch trích nấm men, chromogenic mix) được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn; môi trường MHA (thành phần gồm beef extract, casein thủy phân trong An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 3 acid, tinh bột, agar) dùng để khảo sát tính kháng khuẩn; môi trường BHIB (thành phần gồm brain heart infusion, pancreatic digest of casein, dịch trích nấm men, peptone, muối NaCl, agar, dextrose) dùng để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC). Nghiên cứu sử dụng các môi trường dựa theo tham khảo tài liệu của Lưu Thị Thanh Trúc (2014). Một số dụng cụ, thiết bị gồm pipet, đèn cồn, giấy lọc, ống nghiệm, tủ cấy vô trùng, tủ ủ, tủ sấy, máy quang phổ, nồi hấp, đĩa petri, que cấy, que trang, dụng cụ đục lỗ trên đĩa thạch, thước kẻ có chia vạch, đầu tips, kính hiển vi, v.v. Hóa chất gồm cồn 90o, nước muối sinh lý, nước cất, H2SO4, BaCl2.2H2O, các đĩa giấy tẩm hóa chất thực hiện phản ứng oxidase, bộ hóa chất nhuộm gram và H2O2 10%. 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Trích dịch cây trâm bầu Theo phương pháp Dodia và cs. (2008), các bộ phận cây trâm bầu sau khi thu hái tiến hành rửa sạch, sau đó sấy ở 60 0C trong 30 phút. Phân loại và xay nhuyễn thành bột thô. Ngâm bột nguyên liệu trong nước cất vô trùng theo các tỷ lệ khối lượng nguyên liệu với nước cất là 1/3 (NT1), 1/4 (NT2), 1/5 (NT3) và 1/6 (NT4); sau đó hấp cách thủy hỗn hợp ở 98 0C trong 3 giờ; để hỗn hợp nguội, lọc qua giấy lọc để thu dịch trích và bảo quản dịch trích trong tủ lạnh. Trước mỗi lần sử dụng, dịch trích được khử trùng bằng tia UV trong thời gian 30 phút. 2.2.2 Chuẩn bị vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus Vi khuẩn thuần Vibrio parahaemolyticus sau khi mua về để ở nhiệt độ phòng 6 giờ; sau đó cấy lên đĩa thạch chứa môi trường Chrom agar; tiến hành ủ các đĩa ở nhiệt độ 30 0C trong 24 giờ. Sau đó, chúng ta kiểm tra tính thuần của vi khuẩn trước khi sử dụng bằng phương pháp quan sát màu sắc và hình dạng khuẩn lạc, kiểm tra tính di động, nhuộm gram, thực hiện phản ứng catalase, phản ứng oxidase. 2.2.3 Khảo nghiệm tính kháng khuẩn Khảo nghiệm được thực hiện theo phương pháp Schillinger và Luke (1989), Sarkar et al. (1996). Chúng ta chuẩn bị vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ. Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch MHA với 20 ml MHA/đĩa, đục 5 lỗ trên mặt thạch MHA ở các vị trí 12 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ và ở vị trí trung tâm, mỗi lỗ có đường kính 4 mm. Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn, so sánh với độ đục McFarland 0.5 (OD = 0,125; λ=550 nm), sau đó pha loãng huyền phù 100 lần trước khi sử dụng. Nhỏ 1 mL dung dịch huyền phù vi khuẩn lên đĩa thạch MHA, chan đều, đổ bỏ huyền phù dư và dùng que cấy trải chan huyền phù đến khi khô. Nhỏ 0,15 mL dịch trích vào mỗi lỗ (chỉ nhỏ 4 lỗ, lỗ còn lại nhỏ 0,15 mL nước muối sinh lý để làm đối chứng). Ủ đĩa trong tủ ủ ở 30 0C trong 24 giờ, sau đó ta tiến hành đo đường kính vòng vô khuẩn bằng thước đo có chia vạch (mm). 2.2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC - Minimum inhibitory concentration) Do hạt cây trâm bầu cho tính kháng Vibrio parahaemolyticus mạnh hơn 2 bộ phận còn lại, nên chúng tôi quyết định chọn hạt để thử nghiệm xác định MIC. MIC được xác định theo tiêu chuẩn của NCCLS (2005), trích bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014). Dịch trích hạt trâm bầu ở tỷ lệ trích 1/5 với nước cất được xem là dung dịch mẹ, môi trường BHIB (được hấp vô trùng); pha loãng dung dịch mẹ với nước cất để đạt nồng độ pha loãng khác nhau. Chúng ta chuẩn bị huyền phù vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có thời gian phát triển từ 18 - 24 giờ, so sánh với độ đục chuẩn McFarland 0.5 (OD = 0,125 với λ = 550 nm); pha loãng huyền phù ra 100 lần để sử dụng. Sau đó đánh dấu ống nghiệm từ 1 đến n; từ ống 1 đến ống n nhỏ 1,98 mL môi trường BHIB; từ ống 1 đến ống n - 1 nhỏ 2 mL dịch trích hạt trâm bầu được pha loãng với các nồng độ tương ứng; riêng ống n không nhỏ dịch trích (ống đối chứng) mà nhỏ 2 mL nước cất vô trùng. Tiếp đến, chúng ta nhỏ tiếp 0,02 mL An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 4 huyền phù vi khuẩn vào tất cả ống nghiệm; lắc đều các ống nghiệm, ủ 22 - 24 giờ ở 30 0C. Đọc kết quả MIC, tìm MIC của dịch trích hạt trâm bầu cho vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Ống n (ống đối chứng) đục do vi khuẩn phát triển và không có dịch trích hạt trâm bầu. Một loạt ống nghiệm đục hướng về ống số n và một loạt ống nghiệm trong hướng về ống số 1. Quan sát dãy ống nghiệm, tìm xem ống nào cuối cùng trong dãy và ghi nhận nồng độ của dịch trích hạt trâm bầu ở ống đó (đơn vị tính là µL/mL). 2.3 Xử lý số liệu Nghiên cứu dùng phần mềm SPSS 16.0 và Excel 2010 để nhập và xử lý số liệu. Nghiên cứu phân tích ANOVA bằng phép thử Duncan để so sánh tính kháng khuẩn của dịch trích hạt, lá và vỏ cây trâm bầu ở các tỷ lệ phối trộn khác nhau giữa bột nguyên liệu cây trâm bầu với nước cất đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. 3. Kết quả và thảo luận 3.1 Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu Với phương pháp đục lỗ thạch trên đĩa petri bằng môi trường MHA (Hình 1), chúng tôi đã khảo sát được tính kháng Vibrio parahaemolyticus bằng cách đo đường kính vòng kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu từ các tỷ lệ phối trộn nguyên liệu ban đầu với nước cất cũng như từ các bộ phận của chúng lên chủng Vibrio parahaemolyticus và dựa theo tiêu chuẩn của Schillinger và Luke (1989) đánh giá đường kính vòng kháng khuẩn. Hình 1. Đĩa thạch khảo sát khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu Bảng 2. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích các bộ phận cây trâm bầu Bộ phận Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) Vỏ 11,44 ± 0,19a Lá 11,84 ± 0,29a Hạt 16,30 ± 0,38b Ghi chú: Các giá trị trong bảng là giá trị trung bình và sai số chuẩn. Các giá trị trong cùng một cột có chứa các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Kết quả đã trừ ra 4 mm đường kính lỗ thạch. Kết quả Bảng 2 cho thấy, tính kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu giảm dần từ dịch trích hạt, lá và cuối cùng là vỏ với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 16,30 mm; 11,84 mm và 11,44 mm. Khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích hạt trâm bầu có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với dịch trích lá và vỏ, tuy nhiên tính kháng Vibrio parahaemolyticus giữa dịch trích lá và vỏ trâm bầu có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Điều này cho thấy, khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích hạt cây trâm bầu mạnh nhất so với vỏ và lá, riêng vỏ và lá trâm bầu thì dù sử dụng bộ phận nào cũng không làm ảnh hưởng đến khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus. 3.2 Xác định MIC của dịch trích hạt trâm bầu An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 5 Theo kết quả khảo sát thì khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của dịch trích cây trâm bầu là tốt nhất. Bên cạnh đó, do khả năng kháng khuẩn của dịch trích ở NT1, NT2 và NT3 là như nhau và nhằm thuận tiện trong quá trình lắng lọc dịch trích hạt cây trâm bầu cũng như nâng cao khả năng ứng dụng cây trâm bầu vào thực tiễn trong thời gian tới thì chúng tôi chọn tỷ lệ trích 1/5 để xác định MIC. Từ kết quả thăm dò, chúng tôi quyết định chọn dãy nồng độ 2,5; 5; 10; 20; 40; 80; 160; 320 µL/mL để xác định MIC; dịch trích hạt trâm bầu ở tỷ lệ trích 1/5 với nước cất được xem là dung dịch mẹ và sau đó pha ra thành dãy nồng độ trên. Kết quả MIC đã xác định được MIC của dịch trích hạt trâm bầu đối với loài Vibrio parahaemolyticus là 7,5 µL/mL. Thông qua kết quả khảo sát có thể nhận thấy, việc xác định MIC của dịch trích hạt cây trâm bầu cũng như việc kết hợp với tính kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu đã mở ra hướng ứng dụng mới của cây trâm bầu trong thực tiễn nuôi trồng thủy sản thời gian tới. Từ đó, chúng ta có thể thấy được triển vọng ứng dụng cây trâm bầu thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, tuy không thay thế hoàn toàn kháng sinh trong thực tiễn nhưng có thể góp một phần nhỏ trong việc điều trị bệnh cho một số loài động vật thủy sản; đặc biệt là khả năng ứng dụng phòng trị bệnh gan tụy, hội chứng EMS trên các loài tôm nuôi hiện nay. 4. KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dịch trích cây trâm bầu có tính kháng mạnh đối với Vibrio parahaemolyticus với đường kính vòng kháng khuẩn 13,2 mm. Đường kính vòng kháng khuẩn của dịch trích hạt, vỏ và lá cây trâm bầu đối với Vibrio parahaemolyticus lần lượt là 16,29 mm; 11,44 mm và 11,84 mm. Ở các tỷ lệ phối trộn bột nguyên liệu cây trâm bầu với nước cất 1/3, 1/4, 1/5, 1/6 cho đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 14,15 mm; 13,25 mm; 14,09 mm; 12,28 mm. Đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus, dịch trích từ hạt cây trâm bầu ở tỷ lệ 1/3 cho khả năng kháng mạnh nhất. Dịch trích từ hạt cây trâm bầu (tỷ lệ trích 1/5 với nước cất) ở nồng độ 7,5 µL/mL ức chế được vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. 4.2 Khuyến nghị Chúng ta cần có thêm nghiên cứu về tính kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu đối Vibrio parahaemolyticus trong điều kiện in vitro trong môi trường nuôi tôm để tìm ra khả năng ứng dụng của cây trâm bầu trong thực tiễn. Cần nghiên cứu thêm khả năng kháng khuẩn của dịch trích cây trâm bầu và xác định thêm MIC đối với các loài vi khuẩn khác gây bệnh cho động vật thủy sản như Streptococcus agalactiae, Edwardsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, v.v. TÀI LIỆU THAM KHẢO Adnyana I. K, Yasuhiro T, Suresh A, Arjun H. B, Kim Qui T & Shigetoshi K. (2000). Quandranosides VI-XI, Six New Triterpene Glucosides from the seeds of Combretum quadrangulare. Chem. Pharm. Bull, 48(8), 1114 - 1120. Bùi Xuân Hào. (2013). Góp phần tìm hiểu thành phần hóa học của lá cây trâm bầu - Combretum quadrangulare kurz. thanh-phan-hoa-hoc-cua-la-cay-tram-bau- combretum-quadrangulare-kurz-37353/, truy cập ngày 30/5/2017. Bùi Quang Tề. (2011). Một số thảo dược thay thế kháng sinh. uocthiennhien, truy cập ngày 20/06/2017. Dodia, D. N., Patel, I. S. & Patel, G. M.. (2008). Botanical pesticides for pest management. Scientific publishere (India), 5, 276 - 282. Đặng Thị Lụa, Lại Thị Ngọc Hà & Nguyễn Thanh Hải. (2015). Tác dụng diệt khuẩn của dịch chiết lá sim và hạt sim (Rhodomyrtus tomentosa) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 1 – 6 6 cấp trên tôm nuôi nước lợ. Tạp chí Nghiên cứu Khoa học, 7, 1101 - 1108. Lưu Thị Thanh Trúc. (2014) Thực hành chuẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản. TP. HCM: Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Nguyễn Thị Hạnh & Đặng Thị Lụa. (2015). Tác dụng diệt khuẩn của cây diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) đối với vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm nuôi nước lợ. Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 5. Nguyễn Hải Vân, Caruso Domenico, Meile Jean- Christophe, Trịnh Thị Trang, Nguyễn Ngọc Tuấn, Lebrun Marc, Chu Kỳ Sơn & Sarter Samira. (2015). Khả năng kháng khuẩn của cây màng tang (Litae cubela) ở Việt Nam và ảnh hưởng của tinh dầu lên đáp ứng sinh học của cá chép (Cyprinus carpio). Hội nghị Khoa học trẻ Thủy sản toàn quốc lần thứ VI, RIA3, trang 7. Sarker, M. G. A, Faruk, M. A. R & Uddin, U. U. (2002). Virulence and drug sensitivity of Flavobaterium columnare, the causative agent of columnaris disease, the causative agent of columnaris disease. Biological Science, 5, 204 - 207. Schillinger, V. and Luke, K.K. (1989). Antibacterial activity of Lactobacillus sake isolated from meat. Appl. Environ. Microbiol, 55, 1091 - 1096. Thành Công. (2016). Cần tăng cường quản lý kháng sinh trong nuôi thủy sản. 1/88241/An-toan-ve-sinh-thuc-pham/Can- tang-cuong-quan-ly-khang-sinh-trong-nuoi- thuy-san.aspx, truy cập ngày 30/5/2017.