Khả năng bám dính in vitro của nguyên bào xương người lên xi măng trám bít ống tủy calcium silicate

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 232 KHẢ NĂNG BÁM DÍNH IN VITRO CỦA NGUYÊN BÀO XƯƠNG NGƯỜI LÊN XI MĂNG TRÁM BÍT ỐNG TỦY CALCIUM SILICATE Võ Thị Thủy Tiên*, Trần Xuân Vĩnh** TÓM TẮT Mở đầu: Sự bám dính tế bào là bước đầu tiên trước khi tế bào có thể tăng sinh, biệt hóa và sản xuất khuôn ngoại bào trên chất nền. Do đó, đây được xem là một trong những tiêu chuẩn đánh giá tương hợp sinh học của vật liệu. Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm khảo sát khả năng bám dính của nguyên bào xương người lên xi măng trám bít ống tủy nền tricalcium silicate mới (BioRoot RCS; Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp). Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Tạo và xử lý các khối xi măng BioRoot RCS, sau đó cấy chuyển nguyên bào xương người lên bề mặt vật liệu. Cố định mẫu vật liệu tế bào rồi quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Kết quả: Hình ảnh quan sát SEM cho thấy có sự bám dính của nguyên bào xương người trên bề mặt xi măng. Kết luận: BioRoot RCS có tính chất thuận lợi cho sự bám dính của nguyên bào xương người lên bề mặt vật liệu. Từ khóa: bám dính tế bào, BioRoot RCS, nguyên bào xương người, xi măng trám bít ống tủy calcium silicate. ABSTRACT IN VI TRO CELL ATTACHMENT OF HUMAN OSTEOBLASTS ON CALCIUM SICILATE-BASED ROOT CANAL SEALER Vo Thi Thuy Tien, Tran Xuan Vinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 22 - No 3- 2018: 232 - 236 Background: Cell attachment is the first step before cells can proliferate, differentiate and produce extracellular matrix on substrate. Thus, it is generally considered as one of criteria for evaluating biological properties of materials. Objectives: The aim of this study was to assess cell adhesion of human osteoblasts on a newly developed calcium silicate-based root canal sealer BioRoot RCS (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, France). Method: BioRoot RCS samples were prepared and treated prior to seeding human osteoblasts onto the surfaces. Material-cell samples were fixed and then observed under scanning electron microscopy (SEM). Result: The observation showed that human osteoblasts adhered onto surface of BioRoot RCS. Conclusion: BioRoot RCS had favorable properties for the attachment of human osteoblasts onto its surface. Key words: Cell attachment, BioRoot RCS, human osteoblasts, calcium silicate-based root canal sealer. MỞ ĐẦU Khảo sát sự bám dính của tế bào lên bề mặt vật liệu sinh học từ lâu là một lĩnh vực được quan tâm và nghiên cứu nhiều. Trong đó, kính hiển vi điện tử quét (SEM) là một công cụ hữu ích giúp hỗ trợ quan sát hình thái tế bào và sự tương tác giữa vật liệu tế bào, từ đó cung cấp thông tin quan trọng về tính tương hợp sinh học * Khoa Răng-Hàm-Mặt, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh ** Bộ môn Nha khoa cơ sở, Khoa Răng-Hàm-Mặt, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Trần Xuân Vĩnh ĐT: 0946920818 Email: vinhdentist@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học 233 của vật liệu(1). Những vật liệu nền calcium silicate như ProRoot MTA (Dentsply, Montigny-le- Bretonneux, Pháp) và Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp) đã được chứng minh là có hoạt tính sinh học(4,5). Nhiều nghiên cứu đã ghi nhận được sự bám dính của các loại tế bào khác nhau trên loại vật liệu này, chẳng hạn như tế bào gốc tủy răng người(11), tế bào gốc trung mô(9), nguyên bào sợi dây chằng nha chu(2), dòng tạo cốt bào người MG-63(3). Trên cơ sở đó, một xi măng trám bít ống tủy nền calcium silicate mới là BioRoot RCS (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp) đã được phát triển và biến đổi từ Biodentine. Nó gồm bột chứa tricalcium silicate, zirconium oxide và povidone, cùng với chất lỏng nền nước chứa calcium chloride và polymer giảm nước. Thành phần của BioRoot RCS đã được biến đổi so với Biodentine để phù hợp với việc thao tác trong ống tủy và tránh gây đổi màu răng, do đó có thể ảnh hưởng đến tính chất sinh học của xi măng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khả năng bám dính in vitro của nguyên bào xương người lên xi măng trám bít ống tủy nền calcium silicate”. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu sử dụng nguyên bào xương người (được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ) được cung cấp bởi Bộ môn Mô- Phôi-Di truyền, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch. Nghiên cứu khảo sát xi măng trám bít ống tủy nền calcium silicate BioRoot RCS (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Pháp), dạng bột và chất lỏng, số lô B18997, hạn sử dụng tháng 08/2018. Phương pháp nghiên cứu Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 11/2016 đến tháng 05/2017. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu in vitro có nhóm chứng. Quy trình nghiên cứu - Trộn BioRoot RCS theo hướng dẫn của nhà sản xuất (tỷ lệ 1 muỗng bột : 5-7 giọt chất lỏng, thời gian làm việc 10 phút), cho vào khuôn có đường kính 4 mm và chiều cao 1 mm, chờ đến khi xi măng đông (thời gian đông 4 giờ). - Ngâm khối xi măng trong dung dịch muối đệm phosphate (PBS)trong 2 tuần với tỷ lệ 1:9,v/v. Thay dung dịch PBS mới mỗi 2 ngày.Sau 2 tuần, rửa khối xi măng bằng nước cất rồi hấp khử trùng. Tiếp theo, ngâm khối xi măng trong môi trường biệt hóa và nuôi cấy nguyên bào xương (gọi tắt là môi trường biệt hóa) rồi bảo quản trong tủ nuôi tế bào. - Sau 24 giờ, thu nhận nguyên bào xương và chuyển lên bề mặt BioRoot RCS với mật độ 107- 108 tế bào/cm2.Ngâm khối xi măng-tế bào trong môi trường biệt hóa thêm 24 giờ trong tủ nuôi tế bào.Sau đó, hút bỏ môi trường, rửa sạch nhẹ nhàng khối xi măng-tế bào bằng dung dịch PBS lạnh 3 lần. - Cố định mẫu bằng dung dịch NBF 4% với tỷ lệ 1:9,v/v trong 45 phút.Rửa lại bằng nước cất 3 lần.Khử nước bằng cách ngâm mẫu lần lượt trong dung dịch ethanol 25%, 50%, 70%, 90%, 100% với tỷ lệ 1:9, v/v trong 5 phút ở mỗi nồng độ.Để khô ở nhiệt độ phòng. - Quan sát mẫu dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) để xác định sự hiện diện của nguyên bào xương người phát triển trên bề mặt BioRoot RCS. Ngoài ra, khối xi măng BioRoot RCS không cấy chuyển nguyên bào xương(chứng âm) cũng được khảo sát bằng SEM để xác định tính chất bề mặt của vật liệu. KẾT QUẢ Hình ảnh SEM cho thấy bề mặt xi măng BioRoot RCS nhám, có các vi lỗ (vòng tròn) và có sự hiện diện của nguyên bào xương người (mũi tên) trên bề mặt xi măng (Hình 1). Bề mặt xi măng BioRoot RCS có các vi lỗ Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 234 với kích thước khoảng 10 μl và các nguyên bào xương hình tròn hoặc đa diện bám dính lên bề mặt xi măng (Hình 2). Hình 1. Cấu trúc bề mặt xi măng và sự bám dính của nguyên bào xương người lên bề mặt xi măng (độ phóng đại x300). Hình ảnh SEM cho thấy (A) bề mặt xi măng BioRoot RCS nhám, có các vi lỗ (vòng tròn) và (B) có sự hiện diện của nguyên bào xương người (mũi tên)trên bề mặt xi măng. Hình 2. Cấu trúc bề mặt xi măng và sự bám dính của nguyên bào xương người trên bề mặt xi măng (độ phóng đại x1000). Hình ảnh SEM cho thấy (A) bề mặt xi măng BioRoot RCS có các vi lỗ với kích thước khoảng 10 μl (vòng tròn) và (B) có các nguyên bào xương hình tròn hoặc đa diện (mũi tên) bám dínhlên bề mặt xi măng. BÀN LUẬN Những tiến bộ trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã cung cấp một mô hình hữu ích để đánh giá tính tương hợp sinh học in vitro của vật liệu. Các tế bào từ các mô hoặc cơ quan khác nhau của động vật có vú sẽ được sử dụng để xác định những chức năng của tế bào như bám dính, di cư, tăng sinh, tổng hợp và lắng đọng các chất nền ngoại bào trên vật liệu. Tuy nhiên, cần lưu ý một điều rằng tế bào nuôi cấy từ những mô khác nhau sẽ biểu hiện các enzyme chuyển hóa khác nhau, từ đó có thể ảnh hưởng đến tính nhạy cảm với các sản phẩm gây độc ngoại sinh của tế bào. Y văn đã cho thấy dòng tế bào sarcom xương người (MG-63 và Saos-2) là những tế bào được sử dụng phổ biến nhất để đánh giá khả năng bám dính tế bào của vật liệu nền calcium silicate(1). Cả hai dòng tế bào nói trên đều sở hữu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 Nghiên cứu Y học 235 một số đặc trưng của nguyên bào xương; tuy nhiên, chúng lại biểu hiện chức năng phân tử và tế bào bất thường do sự thay đổi nhiễm sắc thể(6). Do đó, nghiên cứu của chúng tôi đã sử dụng nguyên bào xương người được phân lập và nuôi cấy theo quy trình chuẩn(12) để đánh giá chính xác hơn khả năng bám dính của tế bào(7). Mẫu vật liệu calcium silicate thường được khảo sát SEM sau khi đông bởi vì vật liệu ở dạng mới trộn thường phóng thích một lượng đáng kể các sản phẩm hóa học phụ gây độc tế bào. Tuy nhiên, trong thực tế lâm sàng, những sản phẩm phụ này thường bị hòa tan trong dịch mô kẽ và bị thải trừ qua mạch máu(8), do đó chúng tôi cũng khảo sát các mẫu BioRoot RCS sau khi đông. Hình ảnh SEM trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có sự bám dính của nguyên bào xương người trên bề mặt BioRoot RCS, đa số có hình dạng tròn và một số có hình đa diện (Hình 1). Điều này có thể là do những chất còn sót lại sinh ra từ phản ứng hóa học giữa vật liệu calcium silicate với hóa chất sử dụng trong quá trình xử lý, từ đó làm phức tạp việc diễn giải hình thái tế bào. Do BioRoot RCS là một vật liệu mới nên những nghiên cứu về nó còn khá khiêm tốn, đặc biệt là chưa có nghiên cứu nào khảo sát khả năng bám dính của tế bào lên xi măng này để có thể so sánh với kết quả trong nghiên cứu của chúng tôi. Tuy nhiên, hình ảnh quan sát được trong nghiên cứu này cũng phù hợp với những nghiên cứu khác về khả năng bám dính tế bào trên vật liệu có thành phần tương tự như MTA hay Biodentine(3). Khi quan sát bề mặt BioRoot RCS, chúng tôi nhận thấy bề mặt của xi măng này nhám và có các vi lỗ (Hình 2). Theo Sarkar và cộng sự(10), những vi lỗ trên bề mặt vật liệu calcium silicate sẽ cho phép nước thâm nhập vào bên trong khối vật liệu để phản ứng cộng nước tiếp tục xảy ra và phóng thích calcium hydroxide. Calcium hydroxide sẽ phân ly thành ion calcium và ion hydroxyl. Các ion này sẽ phản ứng với ion phosphate trong dịch sinh lý tạo thành các tinh thể hydroxyapatite, từ đó tạo ra bề mặt năng động tương hợp với tế bào. Đây có thể là cơ sở giải thích cho sự bám dính của nguyên bào xương trên bề mặt BioRoot RCS. Mặc dù SEM cung cấp thông tin hữu ích về khả năng bám dính tế bào trên vật liệu nhưng nó chủ yếu là phân tích định tính. Do đó, những thử nghiệm sự bám dính định tính và/hoặc định lượng luôn cần kết hợp với các thử nghiệm khác về sự tăng sinh và độ sống tế bào để đánh giá toàn diện tính tương hợp sinh học của một vật liệu. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu cho thấy nguyên bào xương người có khả năng bám dính lên bề mặt BioRoot RCS. Như vậy, xi măng trám bít ống tủy nền calcium silicate BioRoot RCS là vật liệu có tính tương hợp sinh học tốt. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ahmad A (2014). Cell attachment properties of Portland cement-based endodontic materials: biological and methodological considerations. J Endod, 40(10): 1517-1523. 2. Akbulut MB, Uyar Arpaci P, Unverdi Eldeniz A (2016). Effects of novel root repair materials on attachment and morphological behaviour of periodontal ligament fibroblasts: Scanning electron microscopy observation. Microsc Res Tech, 79(12): 1214-1221. 3. Attik GN, Villat C, Hallay F et al (2014). In vitro biocompatibility of a dentine substitute cement on human MG63 osteoblasts cells: BiodentineTM verus MTA(®. IntEndod J, 47(12): 1133-1141. 4. Gandolfi MG, Iezzi G, Piattelli A et al (2017). Osteoinductive potential and bone-bonding ability of ProRoot MTA, MTA Plus and Biodentine in rabbit intramedullary model: Microchemical characterization and histological analysis. Dent Mater, 33(5): e221-e238. 5. Han L, Okiji T (2013) Bioactivity evaluation of three calcium silicate-based endodontic materials. Int Endod J, 46(9): 808-814. 6. Pautke C, Schieker M, Tischer T et al (2004). Characterization of osteosarcoma cell lines MG-63, Saos-2 and U-2OS in Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số 3 * 2018 236 comparison to human osteoblasts. Anticancer Res, 24: 3743- 3748. 7. Pérez AL, Spears R, Gutmann JL, Opperman LA (2003). Osteoblasts and MG-63 osteosarcoma cells behave differently when in contact with ProRoot MTA and White MTA. IntEndod J, 36(8): 564-570. 8. Perinpanayagam H (2009). Cellular response to mineral trioxide aggregate root-end filling materials. J Can Dent Assoc, 75: 369-372. 9. Sara AA, Sarah S Al-F, Razan AA et al (2016). Biocompatibility and Mineralization Potential of ProRoot Mineral Trioxide Aggregate and Biodentine on Mesenchymal Stem Cells. J Biomater Tissue Eng, 6(4): 323-328. 10. Sarkar NK, Caicedo R, Ritwik P et al (2005). Physicochemical basis of the biologic properties of mineral trioxide aggregate. J Endod, 31(2): 97-100. 11. Tomás-Catalá CJ, Collado-González M, García-Bernal D et al (2017). Biocompatibility of New Pulp-capping Materials NeoMTA Plus, MTA Repair HP, and Biodentine on Human Dental Pulp Stem Cells. J Endod, S0099-2399(17): 30906-8. 4 12. Tran CT, Gargiulo C, Thao HD et al (2011). Culture and differentiation of osteoblasts on coral scaffold from human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell and Tissue Banking, 12(4): 247-261. Ngày nhận bài báo: 28/01/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 05/03/2018 Ngày bài được đăng: 10/05/2018