Kết quả tăng sinh , ly trích, và định lượng genomic DNA

57 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KẾT QUẢ TĂNG SINH , LY TRÍCH, VÀ ĐỊNH LƢỢNG GENOMIC DNA 4.1.1 Kết quả tăng sinh và ly trích Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tăng sinh trên môi trường LB 48 giờ ở 27oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, các dòng đều cho sinh khối. Chúng tôi đã ly trích được 34 dòng (phụ lục) trong tổng số 51 dòng từ bộ mẫu (phụ lục). Hình 4. 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trƣờng LB ở nhiệt độ 27oC. Kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy, hai mẫu 18, 128 không thu được DNA. Các mẫu 23, 65, 149, 154, 121, 123,127, 150 cho sản phẩm DNA tổng số ít lẫn tạp chất. Các mẫu 28, 129, 70 có sản phẩm DNA còn lẫn nhiều tạp chất. Các vệt sáng kéo dài phía dưới DNA tổng số có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể do thao tác, khi thu phần dịch nổi chứa DNA , chúng tôi đã hút lẫn phần cặn bên dưới, hoặc do thao tác quá mạnh nên làm đứt gãy DNA. Mặt khác, trong qui trình này chúng tôi không sử dụng men RNAse và protein K để loại bỏ các phân tử RNA và protein còn lẫn tạp trong mẫu. Tuy nhiên, do yêu cầu sử dụng mẫu DNA ly trích không cần đạt độ tinh khiết cao, vì thế với kết quả có được vẫn đảm bảo điều kiện để chúng tôi thiết lập qui trình. Từ thực nghiệm, chúng tôi rút ra được những điểm cần lưu ý trong quá trình ly trích: 70 121 123 127 128 150 154 23 28 65 67 18 129 149 154 58 - Dụng cụ ly trích cần khử trùng cẩn thận để phòng ngừa sự tạp nhiễm. - Mang bao tay, khử trùng tay cẩn thận bằng cồn 70 % trước khi tiến hành ly trích. - Bước thu sinh khối vi khuẩn rất dễ xảy ra sự tạp nhiễm giữa các mẫu với nhau, nên khử trùng tay cẩn thận khi thực hiện với những mẫu khác nhau. - Thao tác nhẹ nhàng trong khi ly trích, thao tác mạnh có thể làm đứt gãy DNA. - Thu dung dịch DNA chỉ hút phần dịch nổi, không nên hút lẫn phần cặn phía dưới. - DNA phải được làm khô hoàn toàn trước khi hòa tan với TE. - Eppendorf chứa mẫu DNA phải sạch. - Hóa chất ly trích như: phenol / chloroform / isoamyl alcohol; CTAB có khả năng gây độc cho người sử dụng, khi sử dụng và pha chế phải thực hiện trong buồng hút. - Khi nhuộm gel và đọc kết quả ly trích, không được tiếp xúc trực tiếp ethidium bromide và tia UV. 4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ Từ kết quả ly trích, chúng tôi có được các mẫu DNA với nồng độ khác nhau. Sau khi hiệu chỉnh nồng độ, chúng tôi có được độ tương đồng về nồng độ giữa các mẫu (hình 4.2). Để có được kết quả này, chúng tôi đã thực hiện nhiều thí nghiệm pha loãng dựa trên một mẫu làm chuẩn. Mẫu chuẩn cũng là mẫu gốc ly trích được có nồng độ loãng Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng Pseudomonas fluorescens khác nhau. 59 hơn các mẫu còn lại. Mẫu làm chuẩn phải có nồng độ thực nghiệm, nghĩa là có thể tiến hành các phân tích tiếp theo, không nên có nồng độ quá loãng. 4.1.3 Kết quả định lƣợng bằng phân tử Mass Chúng tôi sử dụng mẫu 130 làm mẫu đại diện để định lượng. Mẫu 130 sau khi được pha loãng 8 lần có độ sáng của band sau khi điện di tương đồng với band 200 bp của phân tử Mass (hình 4.3). Theo chuẩn của phân tử Mass, thì band 200 bp có nồng độ tương đương là 20 (ng / µl). Vậy mẫu 130 đạt được nồng độ tương đương 20 ng / µl sau khi đã thực hiện pha loãng 8 lần. Từ đây tính được nồng độ mẫu 130 trước khi pha loãng là 160 (ng / µl). Như vậy, các mẫu genomic DNA sau khi hiệu chỉnh đạt nồng độ tương đương 160 (ng / µl). 4.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT DNA GENOMIC BẰNG ENZYME GIỚI HẠN Trong 34 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ly trích được, chúng tôi chọn ra các mẫu số 4, 16, 28, 67, 73, 123, 124, 127, 130, 152, 154 để thực hiện phản ứng cắt, nhằm chuẩn bị mẫu lai cho quá trình lai. a) b) M 130(1) 130(2) 130(3) 130(4) M M 130(5) 130(6) 130(7) 130(8) M Hình 4.3 Kết quả định lƣợng mẫu 130 bằng phân tử Mass (M: phân tử Mass) a)Mẫu 130(1); 130(2); 130(3); 130(4) được pha loãng 1 lần; 2 lần; 3 lần; 4 lần b) Mẫu 130(5); 130(7); 130(7); 130(8) được pha loãng5 lần; 6 lần; 7 lần; 8 lần 1000 bp 700 bp 500 bp 200 bp 100 bp 60 Kết quả ở hình 4.4a, mẫu số 4 cho phản ứng cắt hoàn toàn so với mẫu DNA tổng số chưa cắt (giếng 1 và 3 hình 4.4a), còn mẫu 130 chỉ cắt một phần, vẫn còn band genomic DNA rất đậm. Đối với hình 4.4b, mẫu 123 và 124 được cắt với ba enzyme BamH I, Eco RV và Hind III, cả hai mẫu đều bị cắt vụn, tạo nên những phân tử có Hình 4.4 Kết quả thực hiện phản ứng cắt DNA tổng số bằng enzyme giới hạn a) DNA mẫu số 4, 130 được cắt bằng BamH I và Eco RV; G: mẫu genomic DNA b) DNA mẫu số 123, 124 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III c) DNA mẫu số 4, 154 được cắt bằng 3 enzyme BamH I, Eco RV và Hind III d)DNA mẫu số130, 28, 152 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV. G G 61 trọng lượng thấp gần tương đương nhau dồn xuống đáy, hình thành nên một band đậm sau khi chạy điện di. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai. Những mẫu sản phẩm cắt có thể được dùng chuyển lên màng tạo mẫu lai là các mẫu 4, 154, 130, 28, 152 ở hình 4.4c và hình 4.4d. Tuy nhiên, những mẫu ở hình 4.4d có nồng độ mẫu quá thấp và không đều nhau, do đó cần phải tính toán lượng mẫu sao cho phù hợp trước khi chuyển lên màng. Khi sử dụng từng enzyme giới hạn, cần có các điều kiện nhiệt độ, độ pH và dung dịch đệm thích hợp. Nếu mẫu được cắt với nhiều loại enzyme khác nhau và có cùng dung dịch đệm thì lần lượt thực hiện phản ứng cắt ở từng enzyme đơn ở nhiệt độ thích hợp, sau đó làm bất hoạt enzyme đó và thực hiện phản ứng cắt cho enzyme kế tiếp. Nếu các enzyme sử dụng không cùng dung dịch đệm thì phản ứng cắt sẽ phức tạp hơn. Nhiệt độ phản ứng cắt phải luôn luôn ổn định, tránh có sự dao động lớn, nên ủ phản ứng trong bồn ổn nhiệt có nắp đậy. Bảo quản enzyme ở - 20oC. 4.3 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VỚI HAI CẶP PRIMER B2BF, BRR4 VÀ Phl - 2a, Phl - 2b Hình 4.5 Sản phẩm PCR với 2 cặp primer B2BF, BRR4 và ph l- 2a, ph l- 2b a) Sản phẩm PCR của các mẫu số 4, 28, 129, 130 với cặp primer B2BF, BRR4; L: Ladder (thang chuẩn 1000 bp). b) Sản phẩm PCR của các mẫu 130, 129, 121, 4, 28 với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl - 2a, ph l- 2b 62 Chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên các dòng số 4 (2P24), 28, 129, 130,121, 124 và 154 với cặp primer B2BF, BRR4. Kết quả là đã khuếch đại được trình tự đoạn DNA có chiều dài 629 bp chuyên biệt trên gene phlD (hình 4.5a). Sản phẩm PCR xuất hiện các band phụ phía dưới sản phẩm chính. Điều này chứng tỏ các thành phần tham gia phản ứng như dNTP, primer chưa phản ứng hết. Với cặp primer phl - 2a và phl - 2b, chúng tôi đã thực hiện phản ứng PCR trên hai dòng số 4 và 28. Kết quả đã khuếch đại được trình tự là 745 bp trên gene phlD (hình 4.5b), nhưng trong sản phẩm khuếch đại còn tồn tại nhiều band tạp. Do đó trong quá trình khuếch đại chưa tạo ra được sản phẩm chuyên biệt. Sản phẩm PCR cần được tinh sạch để thực hiện phản ứng đánh dấu, chuẩn bị probe cho quá trình lai. 4.4 KẾT QUẢ TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR BẰNG PHƢƠNG PHÁP CẮT GEL. Sử dụng sản phẩm khuếch đại của cặp primer B2BF, BRR4 đem tinh sạch và làm probe đánh dấu. Kết quả tinh sạch trên các dòng 4, 28, 129, 130, 154 đạt độ tinh khiết cao (Hình 4.6). Chúng tôi chọn dòng số 4 để thực hiện phản ứng đánh dấu, kết quả đánh dấu sẽ được thể hiện trên kết quả lai. Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28, 130, 129, 154 bằng phƣơng pháp cắt gel. sản phẩm PCR trước khi tinh sạch M 4 28 129 130 154 M sản phẩm PCR sau khi tinh sạch 629 bp 63 4.5 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG LAI Mẫu DNA tổng số cắt bằng enzyme giới hạn được dùng làm mẫu lai. Sản phẩm PCR được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Chúng tôi đã thiết lập phản ứng lai ở nhiệt độ, thời gian lai và thời gian ủ phát hiện khác nhau. Probe đánh dấu sử dụng cho phản ứng lai có chiều dài 629 bp. Thí nghiệm 1: Lai ở 55oC, thời gian lai là 12 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút. Hai mẫu 4 và 154 được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai. Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương. Kết quả lần phát hiện đầu tiên ở thí nghiệm này không có sản phẩm lai, nền phim bị đen hoàn toàn. Chúng tôi thực hiện lại bước ủ phim (dùng tấm phim mới) với màng lai 1 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện. Kết quả vẫn không phát hiện sản phẩm lai, nền phim vẫn bị đen hoàn toàn. Nguyên nhân nền phim bị đen có thể do buồng tối và dung dịch rửa phim chưa đạt yêu cầu. Chúng tôi tiến hành thiết kế lại buồng tối, pha dung dịch rửa phim mới để thực hiện lại thí nghiệm này. Màng lai có chứa DNA được bảo quản trong tối. Chúng tôi thực hiện lại bước phát hiện, tác nhân phát hiện được cho trực tiếp lên màng lai, để 2 – 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ tác nhân phát hiện thừa rồi ủ màng lai với phim trong thời gian 30 phút. Rửa phim với dung dịch rửa phim mới. Kết quả phát hiện được thể hiện trong hình 4.7 b. Sản phẩm lai xuất hiện trên nền phim sau khi rửa (hình 4.7 b). Đây là kết quả của sự bắt cặp giữa probe đánh dấu với sản phẩm PCR. Các mẫu 4, 154 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV thì sự bắt cặp với probe không xảy ra. Kết quả này chứng minh được với nhiệt độ lai là 55oC, thời gian lai là 12 giờ thì probe đã bắt cặp với trình tự DNA mục tiêu. Tuy nhiên, các mẫu 4, 154 sử dụng làm thí nghiệm thì không có hiện tượng bắt cặp. Vì vậy trong thí nghiệm 1, chúng tôi tạo một mẫu lai mới để kiểm tra lại qui trình và hoạt động của probe đánh dấu. Mẫu 16, 28 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai. Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương. Kết quả trên hình 4.8b cho thấy chỉ có sản phẩm PCR mới cho kết quả lai, các mẫu 16, 128 không cho sản phẩm lai. Với kết quả này, có thể khẳng định rằng qui trình lai đã ổn định, probe hoạt động rất hiệu quả. Tuy nhiên, các mẫu 4, 154, 16, 28 dùng làm thí nghiệm cho kết quả lai âm tính. Điều này có thể do các nguyên nhân: 64 Hình 4.7 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút a)Điện di trước khi chuyển lên màng. Thang chuẩn M 1000 bp, sản phẩm PCR mẫu số 4 với cặp primer B2BF, BRR4 làm đối chứng dương. Mẫu số 4, 154 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV làm mẫu lai b) Kết quả lai với probe đánh dấu, sản phẩm PCR cho kết quả dương tính, các mẫu lai 4, 154 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV cho kết quả âm tính. Hình 4.8 Kết quả thí nghiệm 1, lai ở 55oC, thời gian lai 12 giờ, ủ 30 phút a) Điện di trước khi chuyển lên màng. Thang chuẩn M 1000 bp, sản phẩm PCR mẩu số 4 với cặp primer B2BF, BRR4 làm đối chứng dương. Mẫu số16, 128 được cắt bằng 2 enzym BamH I và Eco RV làm mẫu lai b) Kết quả lai với probe đánh dấu, mẫu đối chứng dương cho kết quả dương tính, mẫu lai 16, 128 được cắt bằng 2 enzyme BamH I và Eco RV cho kết quả âm tính. - Phản ứng cắt genomic DNA bằng enzyme giới hạn chưa hoàn chỉnh. a) b) M PCR 4(BamH I) 154(Eco RV) 154(BamH I) E4(Eco RV) M PCR 4(B) 4(E) 154(B) 154(E) sản phẩm lai a) b) M PCR 16(BamH I) 16(Eco RV) 28(BamH I) 28(Eco RV) M 28 (B) 28 (E) PCR 16(B) 16 (E) sản phẩm lai 65 - Quá trình chuyển DNA lên màng chưa hoàn toàn. - Trình tự DNA mục tiêu hiện diện trên màng ít, probe không thể phát hiện được. - Sự liên kết giữa trình tự DNA mục tiêu với probe đánh dấu lỏng lẻo, nên trong quá trình rửa màng, probe đã bị cuốn trôi theo dung dịch rửa. Thí nghiệm 2: Lai ở 55oC, thời gian lai 16 giờ, thời gian ủ 30 phút và 2 giờ. Chúng tôi đã tạo ba mẫu lai mới, các mẫu 4, 73, 127 được cắt bằng ba enzyme BamH I, Eco RV và Hind III độc lập với nhau. Sản phẩm PCR làm đối chứng dương, hai đối chứng âm là sản phẩm ly trích từ một dòng vi khuẩn khác và một mẫu nấm, hai mẫu này được cắt bằng enzyme BamH I. Kết quả thu được sau thời gian ủ phát hiện 30 phút (hình 4.9 b), sản phẩm lai thể hiện trên phim cũng chỉ là những mẫu PCR được sử dụng làm probe, còn những mẫu 4, 73, 127 vẫn không có tín hiệu lai. So với thí nghiệm 1 nền phim xuất hiện những đốm đen nhiều hơn, lỗi này có thể do thời gian lai kéo dài, màng rửa chưa sạch hoặc màng lai bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, với thời gian ủ phát hiện 30 phút, sản phẩm lai có màu nhạt hơn sản phẩm lai ở thí nghiệm 1, rất có thể lượng probe đánh dấu cho vào phản ứng lai hoặc thời gian để tạo nên những phân tử phát sáng chưa đủ. Do đó, để xác định rõ nguyên nhân không có sản phẩm lai trên mẫu genomic DNA dùng làm thí nghiệm, chúng tôi đã tiến hành ủ màng với phim trong 2 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện kết quả hình 4.9c. Kết quả thu được sau thời gian ủ 2 giờ (hình 4.9 c), không có gì khác biệt so với thời gian ủ 30 phút. Chỉ có sự khác biệt là những band thể hiện trên phim đậm hơn rất nhiều và các đốm tạp cũng xuất hiện nhiều hơn so với thời gian ủ 30 phút. Như vậy, có thể kết luận rằng, lượng probe đánh dấu cho vào phản ứng lai và thời gian ủ 30 phút là đủ để phát hiện sản phẩm lai. Vấn đề đặt ra, với nhiệt độ lai là 55oC thì sự bắt cặp giữa probe và trình tự DNA mục tiêu đã ổn định chưa ? Chúng tôi tiến hành thí nghiệm 3 với nhiệt độ lai là 48oC (thay vì là 55oC như ban đầu). Thí nghiệm 3: lai ở 48oC, thời gian lai 16 giờ, thời gian ủ phát hiện 1 giờ. Để giảm bớt thời gian cho việc chuẩn bị mẫu lai mới, chúng tôi đã sử dụng lại màng lai ở thí nghiệm 2. Các phân tử probe đánh dấu được loại bỏ trước khi thực hiện 66 Hình 4.9 Kết quả lai ở thí nghiệm 2 a) Sản phẩm điện di trước khi chuyển lên màng; b) Kết quả lai ở 55oC, khi ủ 30 phút; c) Kết quả lai ở 55oC, khi ủ 2 giờ; (M)DNA marker; (1,6,11) sản phẩm PCR; (2) sản phẩm PCR được cắt bởi BamH I; (3, 4, 5) mẫu được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; ( 7, 8, 9) mẫu 73 được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; (10) mẫu nấm được cắt bằng BamH I; (12, 13, 14) mẫu 127 được cắt lần lượt bởi các enzyme BamH I, Eco RV, Hind III; (15) mẫu vi khuẩn được cắt bằng BamH I a) b) c) PCR M PCR(B) 4(BamH I) 4(Eco RV) 4(Hind III) M PCR 73(BamH I) 73(Eco RV) Nấm (BamH I) 73(Hind III) M PCR 127(BamH I) 127(Eco RV) 127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI) M PCR 73(BamH I) 73(Eco RV) Nấm (BamH I) 73(Hind III) M PCR 127(BamH I) 127(Eco RV) 127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI) PCR M PCR(B) 4(BamH I) 4(Eco RV) 4(Hind III) M 1 2 3 4 5 M 11 12 13 14 15 M 6 7 8 9 10 67 phản ứng lai. Các bước thực hiện loại bỏ probe như sau: ủ màng với dung dịch SDS 0,5 % (w/v) ở nhiệt độ 60oC trong 1 giờ; rửa màng bằng Tris 100 mM (pH 8,0) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng; đem màng đi làm khô và cross - linker để chuẩn bị cho việc lai. Kết quả lai ở 48oC (Hình 4.10) sự bắt cặp giữa probe và trình tự DNA mục tiêu vẫn xảy ra, sản phẩm PCR vẫn cho kết quả dương tính, các mẫu 4, 73, 127 cho kết quả lai âm tính. So với ủ 2 giờ, các đốm tạp trên nền phim giảm xuống khi ủ 1 giờ. Hình 4.10 Kết quả lai ở nhiệt độ 48oC * Những điều cần lƣu ý khi thực hiện chuyển DNA đến màng lai 1. Mang bao tay không phấn, sử dụng kẹp không răng khi thao tác với màng lai. 2. Kích thước màng lai, giấy thấm phải bằng với kích thước gel. 3. Màng phải được làm ướt hoàn toàn trước khi đặt lên trên gel, giữa màng lai và gel không để có bọt khí. 4. Chồng giấy thấm phía trên phải được đặt cân bằng. 5. Cắt một góc màng để đánh dấu mặt có DNA. 6. Làm khô màng hoàn toàn trước khi chiếu dưới tia UV, màng có thể được làm khô ở nhiệt độ 80oC hoặc có thể làm khô ở nhiệt độ phòng qua đêm. * Những lƣu ý trong quá trình lai 1. Dung dịch lai phải được làm nóng đến nhiệt độ lai trước khi tiền lai. 2. Khi đặt màng vào dung dịch lai, màng phải được thấm ướt hoàn toàn, giữa màng lai và thành ống lai không được có bọt khí. 3. Không nên cho probe trực tiếp lên màng lai. Không được biến tính probe trước khi sử dụng. Hình 4.11 Kết quả thí nghiệm 3, lai ở nhiệt độ 48oC, thời gian lai 16 giờ, ủ 1 giờ. M M PCR PCR 73(BamH I) 73(Eco RV) Nấm (BamH I) 73(Hind III) 127(BamH I) 127(Eco RV) 127(Hind III) Vi Khuẩn(BamHI) PCR M PCR(B) 4(BamH I) 4(Eco RV) 4(Hind III) sản phẩm lai sản phẩm lai sản phẩm lai 68 4. Nhiệt độ lai có thể dao động trong khoảng 50oC - 70oC. Nhiệt độ lai dưới 50oC chỉ thích hợp cho những probe ngắn. Không nên lai ở nhiệt độ trên 85oC. * Lƣu ý khi rửa màng lai 1. Dung dịch rửa 1 phải làm nóng đến nhiệt độ lai. 2. Sau khi rửa bằng dung dịch rửa 2, màng có thể để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút trước khi phát hiện. * Lƣu ý trong khi phát hiện 1. Tác nhân phát hiện nên được chuyển qua một tip sạch với lượng thích hợp cho mỗi lần sử dụng. Không được làm bẩn tác nhân phát hiện. 2. Màng đặt trong saran wrap không được có bọt khí. Nếu có bọt khí, cần loại bỏ bằng cách dùng que thủy tinh gạt nhẹ nhàng trên bề mặt màng, tác nhân phát hiện còn dư cũng được loại bỏ. 3. Không được dịch chuyển phim khi đặt phim lên trên màng. Kéo dài thời gian tiếp xúc phim với màng lai sẽ làm cho phần nền của phim bị đậm màu hoặc có thể làm phim bị đen hoàn toàn. * Chú ý khi rửa phim phát hiện 1. Khi lấy phim ra ủ với màng lai, phải thực hiện trong buồng tối, không được cho phim tiếp xúc với ánh sáng. 2. Vì phim rất nhạy với ánh sáng nên buồng tối rửa phim phải đảm bảo tối hoàn toàn. Dung dịch rửa phim phải pha đúng theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục). Khi thực hiện rửa phim không nên để phim tiếp xúc với thành chứa dung dịch. Qua 3 thí nghiệm, ở những điều kiện khác nhau, chúng tôi chỉ thu được sản phẩm lai ở mẫu PCR (mẫu đối chứng dương). Các mẫu genomic DNA được cắt bằng enzyme khác nhau thì không thu được sản phẩm lai. Nguyên nhân có thể là phản ứng cắt chưa hoàn chỉnh; DNA không hiện diện trên màng lai trên màng lai sau quá trình chuyển. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, chúng tôi chưa thể hoàn thiện phản ứng cắt, cũng như việc khảo sát nhiệt độ lai - thời gian lai cao hơn. Tuy nhiên, với kết quả đạt được sau khi khảo sát nhiệt độ lai (48oC; 55oC) và thời gian lai (12 giờ; 16 giờ) khác nhau, chúng tôi khẳng định qui trình lai đã ổn định, phản ứng đánh dấu DNA sử dụng làm probe đã thành công. 69 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Chúng tôi bước đầu đã thiết lập được qui trình Southern blot, với các kết quả đạt được là đã tạo được mẫu lai, tạo thành công phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR, đã thực hiện được phản ứng lai và phát hiện được sản phẩm lai trên phim. Các bước chính trong qui trình là: * Ly trích DNA 1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng / 5 phút / 4oC. Rửa sinh khối thu được với 1 ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng vortex (2 – 3 lần). 2. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% , đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở 37oC khoảng 1 - 2 giờ. 3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl, hòa tan thật kỹ bằng vortex. Bước 4: Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ ở 65oC trong 10 phút. 5. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24: 1; v/v). Hòa lẫn đều (lắc tay), ly tâm 10 phút ở 12000 vòng, 4oC (hoặc 13500 vòng). 6. Thu dung dịch bên trên (dung dịch DNA) cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt bề mặt chung giữa các dung dịch, ly tâm lại lần nữa ở tốc độ lớn hơn). 7. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1; v/v). Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000 vòng / 10 phút/ 4oC. 8. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (khoảng 500 µl). Kết tủa DNA với isopropanol, dùng khoảng 0,6 thể tích cùa dung dịch (khoảng 300µl) và ủ ở - 20oC / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng / 10 phút / 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm. 9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % (khoảng 500 µl) lạnh, nghiêng nhẹ qua lại, ly tâm 13000 vòng / 10 phút / 4oC. Đổ ethanol ra hết và làm khô bằng cách cho cồn bay hơi. 70 10. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem mẫu giữ ở tủ mát 4oC. * Tạo probe đánh dấu từ sản phẩm PCR 1. Cho 10 µl DNA đã pha loãng vào eppendorf 200 µl và làm biến tính hoàn toàn bởi nhiệt độ bằng cách đun 5 – 7 phút trong nước đang sôi mạnh. 2. Làm lạnh nhanh trên đá trong 5 phút, đem ly tâm nhanh ở tốc đô 4000 vòng / 30 giây để dồn dung dịch xuống đáy ống. 3. Thêm 10 µl dung dịch đệm phản ứng reaction buffer (có sẵn trong bộ kit) vào DNA đã được làm lạnh. Đảo trộn nhẹ cho đều, phản ứng nên giữ trên đá. 4. Thêm 2 µl chất đánh dấu labelling reagent (có sẵn trong bộ kit), trộn nhẹ, đều. 5. Thêm 10 µl dung dịch phản ứng cross-linker. Trộn đều, ly tâm nhanh 4000 vòng trong 30 giây để dồn hỗn hợp xuống đáy. 6. Ủ 30 phút ở 37oC cho phản ứng xảy ra. * Chuyển DNA đến màng lai 1. Sau khi điện di, biến tính DNA bằng cách ngâm gel trong dung dịch biến tính ở nhiệt độ phòng 15 phút, lắc nhẹ. 2. Loại bỏ dung dịch biến tính và rửa gel bằng nước khử ion. Ngâm gel trong dung dịch biến tính mới ở nhiệt độ phòng 15 phút, lắc nhẹ. 3. Lấy gel ra và rửa gel bằng nước khử ion. Sau đó ngâm gel trong dung dịch trung tính ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ. Thay dung dịch và tiếp tục ngâm thêm 15 phút. Bước 4: Trong khi ngâm, chuẩn bị màng nylon theo các bước sau: - Dùng kéo (đã vô trùng) cắt màng sao cho kích thước màng bằng kích thước gel. - Làm ướt màng lai trong dung dịch chuyển 5 phút. 5. Lấy gel ra khỏi dung dịch trung tính, rửa bằng nước khử. 6. Đổ 250 ml dung dịch SSC 6X vào khay sạch, đặt miếng kiếng thủy tinh trên thành khay. Phủ tấm giấy lọc đã làm ướt trước với dung dịch SSC 6X sao cho 2 đầu tấm giấy nhúng vào trong dung dịch SSC 6X. 7. Đặt gel lên trên tấm giấy sao cho không có bọt khí (mặt lưng của gel hướng lên). 8. Đặt màng nylon lên gel, không để có bọt khí. 9. Đặt tiếp 2 tấm giấy lọc có kích thước bằng với gel (đã làm ướt trước với dung dịch SSC 6X) lên trên màng nylon. Nếu có bọt khí, dùng que thủy tinh để loại bọt khí. 71 10. Đặt 1 chồng giấy thấm (đã cắt sẵn, kích thước bằng với kích thước của gel) lên trên giấy lọc. Sau đó đặt tiếp vật nặng lên chồng giấy thấm. 11. Quá trình chuyển DNA từ gel lên màng nylon được thực hiện trong 16 giờ. Làm khô và cố định DNA trên màng 1. Loại bỏ chồng giấy thấm và 2 tấm giấy lọc, cắt một góc màng để đánh dấu mặt có DNA trên màng nylon. 2. Màng được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 65oC trong 1 giờ. 3. Đặt màng đã làm khô vào tủ gen cross - linker (mặt có DNA hướng lên trên) cố định DNA dưới tia UV trong 50 giây. * Thực hiện phản ứng lai 1. Cho 18 ml dung dịch lai vào ống lai và làm nóng đến 55oC trong tủ lai. 2. Đặt màng lai vào dung dịch lai đã làm nóng và tiền lai 15 phút trong ống lai. 3. Cho 18 µl probe đã đánh dấu vào ống lai. 4. Quá trình lai được thực hiện 12 giờ trong tủ lai. * Rửa màng sau khi lai 1. Cho 40 ml dung dịch rửa 1 vào bình tam giác sạch và làm nóng đến 55oC. 2. Đổ hết dung dịch lai trong ống lai ra, cho 40 ml dung dịch rửa 1 vào ống lai. Rửa màng lai bằng dung dịch rửa 1 khoảng 10 phút ở 55oC trong tủ lai. 3. Lấy hết dung dịch rửa 1 trong ống lai ra. Rửa màng lai lần thứ 2 bằng dung dịch rửa 1 mới với thời gian và nhiệt độ như trên. 4. Cho dung dịch rửa 2 vào khay sạch, chuyển màng lai vào dung dịch rửa 2, lắc nhẹ trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. 5. Đổ hết dung dịch rửa 2, cho vào khay dung dịch rửa 2 mới, tiếp tục rửa màng trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. * Phát hiện sản phẩm lai trên phim Mang bao tay không phấn trước khi tiến hành. 1. Đổ bỏ dung dịch rửa 2 đi và đặt màng lên tấm Saran wrap (mặt có DNA hướng lên trên) 2. Hút 900 µl tác nhân phát hiện cho lên màng. Sau đó phủ tấm Saran wrap lên trên màng. Dùng que thủy tinh gạt nhẹ trên bề mặt màng sao cho tác nhân phát hiện trải đều trên màng trong 5 phút. 72 3. Bao kín màng bằng tấm saran wrap khác. Đặt màng vào cassette (mặt có DNA hướng lên trên). 4. Trong phòng tối, đặt phim lên trên màng và đậy cassette lại. Thời gian để phim tiếp xúc với màng là 30 phút ở nhiệt độ phòng. 5. Rửa phim, ngâm phim trong dung dịch developer 5 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó chuyển phim sang dung dịch fixer, ngâm 3 phút ở nhiệt độ phòng. 6. Lấy phim ra và phân tích kết quả. 5.2 ĐỀ NGHỊ Tiếp tục khảo sát nhiệt độ lai và thời gian lai khác nhau trong điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm để qui trình hoàn thiện hơn. Qui trình đề nghị thay thế  Nếu không đủ điều kiện ly trích DNA theo phương pháp CTAB, thì có thể ly trích theo qui trình sử dụng SDS, các bước thực hiện như sau: 1. Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng qua đêm. 2. Ly tâm thu sinh khối và rửa trong 5 ml Tris 50 mM (pH 8,0), 50 mM EDTA. 3. Đông huyền phù ở - 20oC. 4. Thêm 0,5 ml Tris 250 mM (pH 8,0), lysozyme 10 mg / ml để giảm xốc. Khi đông đá và làm tan ở nhiệt độ phòng. Khi đã tan để trên đá 45 phút. 5. Thêm 1 ml SDS 0,5 %, Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 0,4 M, proteinase K 1mg / ml. Đem ủ ở bồn ủ nhiệt ở 50oC trong 60 phút. 6. Đem ly trích với 6 ml Tris được cân bằng phenol và ly tâm 10000 vòng/15 phút, chuyển phần dịch nổi bên trên cho vào một tip mới. 7. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ. Sau đó thêm vào 2 thể tích 95% ethanol, lắc đều. 8. Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, RNAse 200 mg / ml, để qua đêm ở 4oC. 9. Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng / 5 phút. Chuyển phần dịch bên trên vào một tip mới. 10. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ, cho vào 2 thể tích ethanol 95 %, lắc đều. 11. Làm tủa và hòa tan DNA trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM. 73  Nếu không có đủ kinh phí để mua kit tinh sạch thì có thể sử dụng qui trình tinh sạch theo phương pháp dùng phenol. Qui trình tinh sạch được thực hiện theo các bước sau. 1. Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5 ml. 2. Dùng pipette hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol cho vào eppendorf chứa mẫu DNA. 3. Lắc nhẹ bằng tay 10 giây, ly tâm 12000 vòng / 1 phút trong 20 phút ở nhiệt độ phòng. 4. Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên trên bằng pipette cho vào eppendorf sạch. 5. Cho isopropanol vào eppendorf chứa DNA, ủ ở nhiệt độ - 20oC trong 20 phút. 6. Ly tâm tốc độ 12000 vòng / 1 phút, loại bỏ isopropanol, thu DNA kết tủa. 7. Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70%, ly tâm 12000 vòng / 1 phút trong 20 phút, loại bỏ ethanol, thu lấy DNA kết tủa. 8. Làm khô và hòa tan DNA trong dung dịch TE 1X.  Để có thể tạo được probe có tính đặc hiệu cao, đồng nhất và nhạy có thể chuyển đoạn DNA cần làm probe phát hiện vào một vector để chúng nhân lên với số lượng lớn. Sau đó, sản phẩm này có thể thực hiện đánh dấu theo phương pháp biotin gồm các bước như sau: 1. Hòa lẫn 5 ng – 1 µg DNA trong tổng thể tích là 34 µl. Thêm vào 2 µl chất điều khiển phản ứng (unbiotinylated lambda) với 32 µl nước sạch. 2. Biến tính trong nước đang sôi mạnh trong 5 phút. 3. Đặt nhanh trên đá 5 phút. 4. Ly tâm nhanh ở 4oC. 5. Thêm các tác nhân đánh dấu theo tứ tự sau: - 10 µl hỗn hợp labeling 5X (chứa biotinylated random octamers) - 5 µl hỗn hợp dNTP (chứa dNTP và biotin - dATP) - 1 µl đoạn Klenow (3’ – 5’ exo -) 6. Ủ ở 37oC, tính toán thời gian phản ứng. 7. Kết thúc phản ứng bằng cách thêm vào 5 µl EDTA 0,2 M, pH 8,0. 8. Kết tủa probe bằng cách thêm vào 5 µl LiCl 4 M và 150 µl ethanol, ủ ở - 70oC trong 30 phút, quay tròn và rửa bằng ethanol 70%. 9. Lấy kết tủa hòa tan với 20 µl TE 1X. 74  Để giảm thời gian trong việc hoàn thành một qui trình lai, chúng tôi đề nghị nên thực hiện chuyển DNA lên màng bằng phương pháp chuyển bằng điện, bằng việc sử dụng máy Trans – blot R SD DNA/RNA blotting Kit (Bio - Rad). Qui trình thực hiện chuyển (Catalog number 170 - 3940) như sau: 1. Chuẩn bị đệm chuyển và gel acrylamide đối trọng trong dung dịch đệm 20 – 60 phút. 2. Cắt màng và giấy lọc bằng kích thước của gel và làm ướt trong dung dịch đệm 5 – 10 phút. 3. Chuẩn bị gel sandwich cẩn thận theo thứ tự sau: - Dưới cùng là bệ của anode (cực dương) - Tấm giấy lọc được làm ướt bằng dung dịch đệm - Gel đối trọng - Tấm giấy lọc được làm ướt bằng dung dịch đệm. 4. Đặt tấm thép cathode (cực âm) ở trên một cách an toàn. 5. Chạy blot - Gel nhỏ: 10 V trong 30 phút hoặc 15 V trong 15 phút. - Gel lớn: 25 V trong 30 phút hoặc 15 V trong 60 phút.  Cùng với việc rút ngắn thời gian trong việc cải tiến qui trình, chúng tôi đề nghị nên rút ngắn thời gian làm khô màng lại, bằng cách sấy màng ở nhiệt độ 80oC trong 10 – 15 phút.  Chúng tôi sử dụng ống lai để ủ phản ứng lai; nếu không có ống lai thì chúng tôi đề nghị nên sử dụng túi lai để ủ phản ứng lai. Một số hƣớng phát triển của đề tài - Đề tài của chúng tôi chỉ dừng lại ở mức genomic DNA, có một số kết quả vẫn chưa thỏa mãn mục tiêu đề tài đưa ra. Chúng tôi nhận thấy nên hoàn thiện lại qui trình này và nghiên cứu sự đa dạng di truyền trên các sản phẩm lai. - Tiến hành thực hiện lai trên khuẩn lạc, sẽ giảm bớt được rất nhiều một số khâu trong quá trình tạo mẫu lai như tăng sinh, ly trích.