Hoạt chất kháng tế bào ung thư từ cao chiết etyl axetat của cây ngọc cầu (balanophora laxiflora) - Nguyễn Thị Phương Thanh

37 JOURNAL OF SCIENCE OF HNUE DOI: 10.18173/2354-1059.2017-0005 Natural Sci. 2017, Vol. 62, No. 3, pp. 37-41 This paper is available online at HOẠT CHẤT KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ TỪ CAO CHIẾT ETYL AXETAT CỦA CÂY NGỌC CẦU (Balanophora laxiflora) Nguyễn Thị Phương Thanh, Lê Thị Khánh Linh, Phạm Thành Chung và Đặng Ngọc Quang Khoa Hóa học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tóm tắt. Bốn hợp chất là methylcaffeate (1), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene- 1,2-dicarboxylate (2), methylgallate (3) và p-coumaric acid (4) đã được tinh sạch từ cặn chiết EtOAc của cây Ngọc Cẩu, thu hái ở Lào Cai, Việt Nam. Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương pháp phổ như phổ khối MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai chiều (1D và 2D NMR). Trong đó, methylcaffeate (1) và dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl] xanthene-1,2-dicarboxylate (2) có khả năng ức chế tốt sự phát triển của cả bốn dòng tế bào ung thư là ung thư biểu mô (KB), vú (MCF7), phổi (LU) và gan (HepG2). Từ khóa: Ngọc Cẩu, ung thư, methylcaffeate. 1. Mở đầu Ngọc Cẩu có tên khoa học là Balanophora laxiflora Hemsl., là một trong số các loài tương đối phổ biến của chi Balanophora. Ngọc Cẩu là một loại dược liệu quý, từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền để dùng làm thuốc bổ máu, phục hồi sức khỏe, kích thích ăn ngon miệng, chữa đau bụng, chữa nhức mỏi chân tay, làm thuốc bổ cho người già, người mới ốm dậy và nhất là dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ [1-4]. Ngọc cẩu còn có tên gọi khác là Tỏa Dương, củ Gió đất, củ Ngọt Núi, hoa Đất, Cu Chó, Xà Cô, cây không lá [4]. Loài thực vật này thường mọc và sống kí sinh trên rễ những cây gỗ lớn trong rừng sâu ẩm thấp, dưới tán rừng già hoặc ẩn mình trong bóng tối, dưới những lùm cỏ, khe đá hoặc gốc cây mục. Chúng được phân bố chủ yếu ở các khu rừng rậm nhiệt đới và cận nhiệt đới như ở Việt Nam, Lào, miền nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, cây Ngọc Cẩu được tìm thấy nhiều ở các tỉnh miền Tây Bắc như Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang, Hòa Bình, Điện Biên, Sơn La. Trong những năm gần đây, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm nghiên cứu về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của Ngọc Cẩu. Kết quả cho thấy Ngọc Cẩu và các hợp chất chính của nó có nhiều hoạt tính sinh học đáng chú ý như ức chế enzym xanthioxidase, giảm axit uric máu, kháng khuẩn, chống viêm [5] và chống oxy hóa [6]. Nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào cũng như khả năng ứng dụng của Ngọc Cẩu trong điều trị bệnh ung thư, chúng tôi đã thu thập và nghiên cứu thành phần hóa học của nó. Bài báo này mô tả quá trình tinh sạch, xác định cấu trúc và hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của các hợp chất tinh sạch từ cao chiết EtOAc của cây Ngọc Cẩu. Ngày nhận bài: 26/2/2017. Ngày nhận đăng: 27/3/2017. Tác giả liên hệ: Đặng Ngọc Quang, e-mail: quangdn@hnue.edu.vn Nguyễn Thị Phương Thanh, Lê Thị Khánh Linh, Phạm Thành Chung và Đặng Ngọc Quang 38 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Thực nghiệm * Mẫu cây Toàn bộ cây Ngọc Cẩu (Balanophora laxiflora) được thu hái tại Lào Cai, Việt Nam vào ngày 16/10/2014 và đã được TS. Đỗ Hữu Thư, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật xác định tên khoa học. * Phương pháp chung - Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn Kieselgel 60 F254 của hãng Merck, CHLB Đức. Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại có ba bước sóng ở 254, 302 và 366 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu. - Sắc kí cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường (cỡ hạt 60 - 100 M, Merck) và sephadex LH-20 (GE Healthcare Life Sciences). - Phổ khối phân giải cao ghi trên máy Bruker Apex III Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) và phổ khối (ESI-MS) đo trên máy Finnigan MAT TSQ Quantum Ultra AM system. - Sắc kí lỏng điều chế (prep. HPLC) được thực hiện trên máy Jasco PU-2087 instrument với detector là UV-2070 và RI-2031, sử dụng cột Waters 5C 18-AR-II (10.0 × 250 mm), tốc độ dòng 1.0 mL/min. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được đo trên máy Bruker AMX-500 (500 MHz cho phổ 1H NMR và 150 MHz cho phổ 13C NMR) với chất nội chuẩn là TMS. Độ chuyển dịch hóa học () được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm). * Tách các hoạt chất Mẫu Ngọc Cẩu tươi (4,0 kg) được ngâm chiết trong dung môi metanol và chiết siêu âm nhiều lần. Lọc lấy dịch chiết và cất quay dưới áp suất thấp ở 45 oC để đuổi hết dung môi thu được 320 g cao tổng. Cao tổng được phân bố lần lượt trong các dung môi có độ phân cực tăng dần là n-hexan, etyl axetat (EtOAc), butanol. Cô cạn dịch chiết EtOAc thu được 28,0 g cao EtOAc. Chạy sắc kí cột nhồi silica gel, dung môi n-hexan-EtOAc (3/1) thu được 10 phân đoạn. Phân đoạn 7 (1,64 g) được tiếp tục tinh sạch với cột silica gel với hệ dung môi CHCl3/n-hexan (98/2) thu được hợp chất 1 (20,9 mg) và hỗn hợp (314 mg). Chạy sắc kí cột nhồi sephadex LH-20, dung môi CHCl3/MeOH (1/2) và sắc kí lỏng điều chế, cột RP-18, dung môi CH3OH/H2O (7/3) thu được các hợp chất 2 (5,3 mg), 3 (1,6 mg) và 4 (4,2 mg). Hợp chất 1: Phổ 1H NMR (CDCl3): H 7,58 (1H, d, J = 16 Hz, H-7), 7,08 (1H, s, H-2), 7,01 (1H, dd, J = 8,0, 1,5 Hz, H-6), 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 6,26 (1H, d, J = 16 Hz, H-8), 3,80 (3H, 9-OMe). Phổ 13C NMR (CDCl3): C 127,7 (C-1), 115,2 (C-2), 146,8 (C-3), 149,5 (C-4), 116,5 (C-5), 122,8 (C-6), 144,6 (C-7), 115,1 (C-8), 169,4 (C-9), 51,7 (9-OCH3). ESI-MS: m/z 193,0536 [M-H]-, tính toán cho C10H9O4 là 193,0501. Hợp chất 2: Phổ 1H NMR (CD3OD): H 8,11 (1H, s, H-3), 7,40 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-4), 7,25 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,08 (1H, s, H-7), 6.73 (1H, s, H-8), 4,04 (3H, s, 1-OMe), 3,91 ppm (3H, s, 2-OMe). Phổ 13C NMR (CD3OD): C 125,7 (C-1), 121,2 (C-2), 130,1 (C-3), 128,1 (C-3a), 122,4 (C-4), 120,9 (C-5), 143,2 (C-6), 138,3 (C-6a), 149,8 (C-7a), 105,0 (C-8), 148,4 (C-9), 143,2 (C-10), 112,3 (C-11), 110,9 (C-11a), 125,9 (C-11b), 124,7 (C-11c), 173,5 (1-C=O), 168,2 Hoạt chất kháng tế bào ung thư từ cao chiết etyl axetat của cây ngọc cầu (Balanophora laxiflora) 39 (2-C=O), 53,5 (1-OMe), 52,9 (2-OMe). ESI-MS: m/z 381,0684 [M-H]-, tính toán cho C20H13O8 là 381,0610. Hợp chất 3: Phổ 1H NMR (CD3OD): H 7,06 (2H, s, H-2 và H-6), 3,84 (3H, s, H-8). Phổ 13C NMR (CD3OD): C 121,5 (C-1), 110,1 (C-2), 146,5 (C-3), 139,8 (C-4), 146,5 (C-5), 110,1 (C-6), 169,0 (C-7), 52,3 (C-8). Hợp chất 4: Phổ 1H NMR (CD3OD): H 7,62 (1H, d, J = 16 Hz, H-7), 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2 và H-6), 6,83 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3 và H-5), 6,30 (1H, d, J = 16 Hz, H-8). Phổ 13C NMR (CD3OD): C 127,3 (C-1), 131,1 (C-2, C-6), 116,8 (C-3, C-5), 161,1 (C-4), 146,6 (C-7), 115,7 (C-8), 170,0 (C-9). * Thử hoạt tính sinh học Các chất sạch được thử khả năng kháng tế bào ung thư theo phương pháp của Scudiero và cộng sự [7] tại phòng Thử hoạt tính sinh học, Viện Hóa học. 2.2. Kết quả và Thảo luận 2.2.1. Xác định cấu trúc các hợp chất (1-4) Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 1 có pic ion giả phân tử ở m/z 193,0536 [M-H]-, như vậy chất 1 có khối lượng phân tử là m/z 194, ứng với công thức phân tử là C10H10O4. Từ phổ 1H NMR của hợp chất 1, chúng ta thấy có 3 tín hiệu proton có độ chuyển dịch hóa học ở các vị trí 6,88 ppm (1H, d, J=8,5 Hz), 7,01 ppm (1H, dd, J = 8,0 Hz, 1,5 Hz), 7,08 ppm (1H, s). Dự đoán, đây là ba proton trong nhân thơm. Căn cứ vào hằng số J có thể dự đoán có hai proton ở vị trí octo với nhau và một proton ở vị trí meta. Ngoài ra còn có hai proton của liên kết đôi có cấu hình trans (J = 16 Hz) và một nhóm –OMe ở 3,80 ppm. Phổ 13C NMR của 1 có 10 cacbon, trong đó đáng chú ý có một nhóm cacbonyl ở 169,4 ppm. Cấu trúc của 1 được quy kết bằng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều gồm HSQC và HMBC. Nhóm –OCH3 (3,80 ppm) tương tác xa với nhóm >C=O (169,4 ppm), chứng tỏ có nhóm metyl este trong hợp chất 1. Đồng thời H-8 (6,26 ppm) tương tác với >C=O, C-1 (127,6 ppm) và H-7 (7,58 ppm) tương tác với C-2 (114,3 ppm), C-6, C=O, chứng tỏ nhóm thế gắn với nhân thơm ở C-1. Từ các phân tích trên, và so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố [8], hợp chất 1 được xác định là methyl caffeate có cấu trúc như trong Hình 1. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất 2 có pic ion giả phân tử ở m/z 381,0684 [M-H]-, ứng với công thức phân tử là C20H14O8. Từ phổ 1H NMR của 2 có 5 tín hiệu ứng với 5 nguyên tử hidro của nhân thơm có độ chuyển dịch hóa học là 8,11 ppm (1H, s), 7,40 ppm (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,25 ppm (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,08 ppm (1H, s) và 6,73 ppm (1H, s) và hai nhóm –OMe ở 4,04 ppm, 3,91 ppm. Phân tích phổ 13C NMR của 2, cho thấy hợp chất này có 20 cacbon. Trong đó có 16 cacbon lai hóa sp2 và hai nhóm C=O ở 173,5 ppm và 168,2 ppm. Trên phổ HMBC ta thấy có hai nhóm –OMe có tương tác HMBC với hai nhóm C=O chứng tỏ sự tồn tại của hai nhóm –COOMe. Hai nhóm này gắn với vị trí C-1 và C-2 do H-3 có tương tác với nguyên tử C-2, C-4, C-11c, C-3a và 2-C=O (168,2 ppm). Ngoài ra còn có các tương tác HMBC: i) H-4/ C-11c, C-3a, C-3 và C-6; ii) H-5/ C-4, C-3a, C-6a và C-6; iii) H-8/ C-11a, C-10, C-9 và C-7a; iv) H-11/ C-11b, C-10 và C-7a; kết hợp với việc so sánh với các dữ liệu phổ đã công bố [9], chúng tôi xác định hợp chất 2 là dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate. Đây là lần đầu tiên tìm thấy hợp chất 2 trong tự nhiên. Phổ 1H NMR của hợp chất 3 có hai proton cộng hưởng ở 7,06 ppm và một nhóm –OMe ở 3,84 ppm. Trong khi đó phổ 13C NMR cho ta biết hợp chất này có tám nguyên tử cacbon. Phân tích phổ HMBC cho thấy có các tương tác xa giữa nhóm –OCH3 (3,84 ppm) với nguyên tử C trong nhóm >C=O (169,0 ppm) chứng tỏ sự tồn tại của nhóm metyl este. Ngoài ra, H-2, H-6 Nguyễn Thị Phương Thanh, Lê Thị Khánh Linh, Phạm Thành Chung và Đặng Ngọc Quang 40 (7,06 ppm) tương tác với >C=O (169,0 ppm), C-3, C-5 (146,50 ppm), C-4 (139,8 ppm), C-1 (121,5 ppm) đã quy kết cấu trúc của 3 là methyl gallate [10]. OH OH O OCH3 1 3 4 6 7 8 9 2 5 1 O HO C C OH OH O O 1 2 3 3a 4 5 6 6a 8 9 10 11 11a 11b 11c 7a 7 OCH3 OCH3 2 OH OH O 1 2 3 4 5 7 HO O 6 CH38 3 OH COOH 4 Hình 1. Cấu trúc của các chất 1-4 Phổ 1H NMR của hợp chất 4 có 2 tín hiệu ứng với 4 nguyên tử H của nhân thơm có độ chuyển dịch hóa học ở các vị trí 6,83 ppm (2H, d, J = 8,5 Hz) và 7,47 ppm (2H, d, J = 8,5 Hz) gợi ý sự có mặt của nhân thơm có hai nhóm thế ở vị trí para. Ngoài ra còn hai proton ở 6,30 ppm và 7,62 ppm có cùng J = 16 Hz, gợi ý sự có mặt của liên kết đôi có cấu hình trans. Phổ 13C NMR có tín hiệu của C=O ở 170,0 ppm. Từ kết quả phân tích các phổ ở trên kết hợp với tài liệu [11], cho phép xác định hợp chất 4 là p-coumaric acid. Các dẫn xuất của axit coumaric là những chất có hoạt tính chống oxi hóa mạnh [6] và hợp chất 2 chưa được nghiên cứu hoạt tính sinh học. Do vậy, chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng kháng tế bào ung thư của hai chất 1 và 2. Kết quả cho thấy, cả hai hợp chất đều kháng bốn dòng tế bào ung thư là ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU-1) và ung thư vú (MCF-7) (Bảng 1). Đây là phát hiện mới về các chất có hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư từ cây Ngọc Cẩu. Bảng 1. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của 1 và 2 (IC50, g/mL). Stt Tên mẫu Giá trị IC50 (g/mL) trên dòng tế bào KB Hep-G2 Lu-1 MCF-7 1 1 20,77 43,75 106,5 87,17 2 2 30,7 55,9 55,4 68,02 Ellipticine 0,25 0,67 0,27 0,29 3. Kết luận Chúng tôi đã tinh sạch và xác định cấu trúc của bốn hợp chất trong cặn chiết EtOAc của cây Ngọc Cẩu là methylcaffeate (1), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate (2), methylgallate (3) và p-coumaric acid (4). Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tìm thấy hợp chất 2 từ thiên nhiên cũng như nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thư của nó. Kết quả nghiên cứu đã góp phần mở ra triển vọng chữa bệnh ung thư của cây Ngọc Cẩu. Lời cảm ơn. Nghiên cứu này được tài trợ bởi Bộ Giáo dục và Đào tạo, đề tài mã số B2016-SPH-18. Hoạt chất kháng tế bào ung thư từ cao chiết etyl axetat của cây ngọc cầu (Balanophora laxiflora) 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D. H. Bích, Đ. Q. Trung, B. X. Chương, N. T. Dong, Đ. T. Đàm, P. V. Hiển, V. N. Lộ, P. D. Mai, P. K. Mãn, Đ. T. Nhu, N. Tập, T. Toàn, 2006. Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1. Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr. 555-556. [2] V. V. Chi, 2012. Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 1. Nxb Y học, tr. 803. [3] P. H. Hộ, 2004. Cây cỏ Việt Nam, tập 2. Nxb Trẻ, tr. 140-141. [4] Đ. T. Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nxb Y học, Hà Nội, tr. 914. [5] T. S. Wu, Y. F. Chen, C. Ching, C. R. Wu, W. T. Hsieh, i H. Y. Tsa, 2012. Balanophora spicata and lupel acetate possess antinociceptive and anti-inflammatory activities in vivo and in vitro. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, pp. 273-371. [6] G. M. She, Y. J. Zhang and C. R. Yang, 2009. Phenolic constituents from Balanophora laxiflora with DPPH radical - scavenging activity. Chemistry and biodiversity, Vol. 6, pp. 875-880. [7] D.A. Scudiero, R.H. Shoemaker, D.P. Kenneth, A. Monks, S. Tierney, T.H. Nofziger, M.J. Currens, D. Seniff, M.R. Boyd, 1988. Evaluation of a soluable tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Can. Res., Vol. 48, pp. 4827-4833. [8] W. F. Chiou, C. C. Shen, L. C. Lin, 2011. Anti-inflammatory principles from Balanophora laxiflora. Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 4, pp. 502-508. [9] C. Daquino, A. Rescifina, C. Spatafora, C. Tringali, 2009. Biomimetic synthesis of natural and unnatural lignans by oxidative coupling of caffeic esters. Eur. J. Org. Chem., pp. 6289-6300. [10] M. T. Ekaprasada, H. Nurdin, S. Ibrahim and D. Hamidi, 2009. Antioxidant activity of methyl gallate isolated from the leaves of Toona sureni. Indo. J. Chem., Vol. 9, pp. 457-460. [11] N. Durust, S. Ozden, E. Umur, Y. Durust, M. Kucukislamoglu, 2001. The isolation of carboxylic acids from the flowers of Delphinium formosum. Turk. J. Chem., Vol. 25, pp. 93-97. ABSTRACT CYTOTOXIC CONSTITUENTS FROM THE ETHYL ACETATE EXTRACT OF NGOC CAU PLANT (Balanophora laxiflora) Nguyen Thi Phuong Thanh, Le Thi Khanh Linh, Pham Thanh Chung and Dang Ngoc Quang Faculty of Chemistry, Hanoi National University of Education Four compounds, methylcaffeate (1), dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2- dicarboxylate (2), methylgallate (3), and p-coumaric acid (4) were purified from EtOAc extract of Balanophora laxiflora collected in Lao Cai province, Vietnam. Their structures were determined by a combination of MS, 1D and 2D NMR spectroscopy. In addition, methylcaffeate (1) and dimethyl-6,9,10-trihydroxybenzo[kl]xanthene-1,2-dicarboxylate (2) have cytotoxicity against four cancer cell lines such as KB, MCF7, LU and HepG2. Keywords: Ngoc Cau, cancer, methylcaffeate.