Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 & CALR trong bệnh tăng sinh tủy mạn tính

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 409 HOÀN THIỆN QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN JAK2 & CALR TRONG BỆNH TĂNG SINH TỦY MẠN TÍNH Trần Tuấn Anh*, Trần Mai Hồng*, Nguyễn Lê Anh*, Nguyễn Thùy Trang*, Nguyễn Vũ Bảo Anh*, Nguyễn Hà Thanh*, Bạch Quốc Khánh*, Dương Quốc Chính* TÓM TẮT Mục tiêu: Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR. Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính. Đối tượng: Tổng số 51 mẫu của bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể Ph 1, được chẩn đoán và theo dõi điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Phương pháp: Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, mô tả cắt ngang Kết quả: Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR gồm: giải trình tự gen JAK2, CALR bằng phương pháp NGS; xác định đột biến JAK2V617F bằng phương pháp mồi suy biến; đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến CALR type 1 và type 2 bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu. Ứng dụng quy trình hoàn thiện trên 51 bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính với kết quả phân tích đột biến: JAK2V617F chiếm 83,3% ở bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát và 66,7% ở bệnh nhân xơ tủy nguyên phát. Với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type 1 chiếm 11,4% và CALR type 2 chiếm 5,7% và JAK2V617F chiếm 71,4%. Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F bằng phương pháp mồi suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát hiện đột biến CALR type 1, type 2; và quy trình NGS phát hiện đột biến ít gặp. Bộ quy trình hoàn thiện đã được ứng dụng trong phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs. Từ khóa: MPNs, CALR, JAK2 ABSTRACT OPTIMIZATION OF DETECTION PROTOCOLS FOR JAK2 AND CALR MUTATION IN MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASM Tran Tuan Anh, Tran Mai Hong, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Trang, Nguyen Vu Bao Anh, Nguyen Ha Thanh, Bach Quoc Khanh, Duong Quoc Chinh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 – No. 6 - 2019: 409 - 415 Objectives: Optimizaion of detection protocols for JAK2 and CALR mutation. Then applying these protocols for Myeloproliferative neoplasm patients. Subjects: 51 Ph 1 negative MPNs patients have been diagnosed and treated in National Institute of Hematology and Blood Transfusion. Methods: Prospective, retrospective, and cross-sectional study. Results: The protocols for detecting JAK2 and CALR mutation included: JAK2 and CALR gene sequencing by NGS; detect JAK2V617F by degraded primer PCR; simplify protocol for detecting CALR type 1 and type 2 by specific primer PCR. When these protocols were applied for 51 MPNs patients, the results obtained: JAK2V617F 83.3% and 66.7% in polycythaemia vera and primary myelofibrosis respectively; CALR type 1 11.4%, CALR type 2 5.7% and JAK2V617F 71.4% in essential thrombocythemia. Conclusion: The optimizesd detection protocols for JAK2 and CALR mutation are effective and easy to *Bệnh viện Nhi Đồng 1 **Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh* Viện Huyết học -Truyền máu TW Tác giả liên lạc: TS. Dương Quốc Chính ĐT: 0962168505 Email: chinh.duong@nihbt.org.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 410 apply in any molecular diagnostic laboratory and the analysis results of 51 MPNs patients confirmed the effectiveness of the methods. Key words: MPNs, CALR, JAK2 ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sinh tủy mạn tính (Myeloproliferative neoplasm – MPNs) là nhóm bệnh lý đơn dòng của tế bào gốc tạo máu. Bệnh gây nên do sự tăng sinh không kiểm soát của các tế bào gốc sinh máu trong tủy xương, tiến triển mạn tính do liên quan đến khả năng biệt hóa đến giai đoạn trưởng thành của tế bào dẫn tới tăng sinh các tế bào trưởng thành ở máu ngoại vi(5). Bệnh được đặc trưng bởi sự xuất hiện của các đột biến trên gen JAK2, CALR hoặc MPL. Đột biến trên những gen này là đặc trưng quan trọng được sử dụng cho chẩn đoán, tiên lượng và lựa chọn phương thức điều trị bệnh. Kể từ những công bố đầu tiên về đột biến trên gen JAK2 (2005)(2) và đột biến gen CALR (2013)(9), các phòng nghiên cứu và xét nghiệm sinh học phân tử đã xây dựng nhiều phương pháp khác nhau để phát hiện đột biến gồm: PCR đặc hiệu alen, PCR phân tích đoạn, giải trình tự Sanger, giải trình tự NGS (Next-Generation Sequencing)(2,9,10,14). Khi vận dụng những phương pháp trên trong xét nghiệm thường quy thì ngoài tính chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu; còn một yếu tố quan trọng hơn cả là mức độ ổn định của mỗi quy trình xét nghiệm. Bên cạnh đó, cần hiểu rõ mặt hạn chế và vận dụng điểm mạnh của mỗi phương pháp xét nghiệm trong những trường hợp cụ thể; đồng thời việc đơn giản hóa quy trình kỹ thuật cũng cần được cân nhắc khi xây dựng một quy trình xét nghiệm thường quy. Do đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR trong bệnh tăng sinh tủy mạn tính”. Mục tiêu Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR. Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính. ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Tổng số 51 mẫu của bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể Ph 1, được chẩn đoán và theo dõi điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương. Phương pháp Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang, tiến cứu kết hợp hồi cứu. Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến JAK2V617F, CALR type 1, type 2 Kỹ thuật PCR mồi đặc hiệu sử dụng mồi bổ sung hoàn toàn với alen mang đột biến và chỉ sai khác với alen bình thường tại một vị trí đột biến. Với một sai khác duy nhất mồi vẫn có thể bắt cặp vào sợi alen bình thường để tạo nên các đoạn sản phẩm không đặc hiệu. Kỹ thuật PCR mồi suy biến sử dụng mồi suy biến có sửa đổi 1 nucleotide trong phạm vi 5 nucleotide đầu 3’ của mồi. Như vậy mồi suy biến sẽ khác alen bình thường tại 2 vị trí: (1) vị trí đột biến và (2) vị trí suy biến có chủ ý nằm trong phạm vi 5 nu đầu tiên đầu 3’ của mồi. Thiết kế này nhằm giảm khả năng bắt cặp của mồi với alen bình thường trong khi vẫn khuếch đại thành công alen đột biến; như vậy sẽ giải quyết được tình trạng hình thành các băng sản phẩm không đặc hiệu. KẾT QUẢ Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 Kết quả hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F Kết quả điện di trong Hình 1 cho thấy hiện tượng xuất hiện băng sản phẩm không đặc hiệu trùng với kích thước băng đột biến JAK2V617F ở tất cả các mẫu. Kết quả điện di trong Hình 2 không xuất hiện băng sản phẩm không đặc hiệu ở tất cả các mẫu mà chỉ xuất hiện băng đột biến Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 411 và đặc hiệu ở những mẫu dương tính với đột biến JAK2V617F (Hình 1, 2). Hình 1. Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện đột biến JAK2V617F theo phương pháp PCR mồi đặc hiệu Hình 2. Kết quả hoàn thiện quy trình phát hiện đột biến JAK2V617F bằng phương pháp PCR mồi suy biến Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen CALR Kết quả giải trình tự gen CALR bằng phương pháp NGS Hình 4 là kết quả phân tích dữ liệu NGS bằng phần mềm IGV: với mẫu 30205 mang mất đoạn chèn 5 nucleotide “TTGTC” hay CALR type 2 (Hình 4a) và mẫu 30124 không phát hiện được bất thường (Hình 4b). Hình 3. Kết quả phân lập gen CALR exon 1 đến exon 9, có chiều dài ~6 kb Hình 4. Kết quả phân tích dữ liệu NGS gen CALR bằng phần mềm IGV Kết quả hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến CALR type 1, type 2 Kết quả xét nghiệm đột biến CALR type 1, type 2 bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu Hình 5 biểu hiện kết quả xác định mất đoạn gen CALR bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu: mẫu dương tính đột biến mất đoạn 52 nucleotide hay CALR type 1 xuất hiện băng nội kiểm 141 bp và băng đặc hiệu đột biến 89 bp (Hình 5a); mẫu dương tính đột biến mất đoạn 31 nucleotide xuất hiện băng nội kiểm 192 bp và băng đặc hiệu đột biến 161 bp (Hình 5b). Hình 6 thể hiện kết quả xác định đột biến chèn 5 nucleotide “TTGTC” hay CALR type 2 bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu, mẫu dương tính xuất hiện băng nội kiểm 265 bp và băng đặc hiệu đột biến 156 bp. Kết quả xác định mất đoạn gen CALR bằng phương pháp giải trình tự Sanger Kết quả xác nhận giá trị hay tính chính xác Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 412 của quy trình xét nghiệm mất đoạn CALR type 1 được thể hiện trong Hình 7 và mất đoạn 31 nucleotide được thể hiện trong Hình 8. Kết quả ứng dụng trong phân tích đột biến gen cho nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính Bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát và xơ tủy nguyên phát chỉ mang đột biến JAK2V617F với 83,3% ở bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát và 66,7% ở bệnh nhân xơ tủy nguyên phát. Với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type 1 chiếm 11,4% và CALR type 2 chiếm 5,7% và JAK2V617F chiếm 71,4% (Bảng 1). Hình 5. Kết quả xác định (a) đột biến CALR type 1 và (b) mất đoạn 31 nucleotide Hình 6. Kết quả xác định đột biến CALR type 2 chèn 5 nucleotide “TTGTC” Hình 7. Kết quả phân tích vùng đứt gãy đột biến CALR type 1 Hình 8. Kết quả phân tích vùng đứt gãy mất đoạn 31 nucleotide gen CALR Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 413 Bảng 1. Kết quả thống kê đột biến gen JAK2, CALR trong 51 bệnh nhân MPNs Đột biến gen Tổng Âm tính JAK2 V617F CALR type 1(*) CALR type 2 TTCTP Số trường hợp (n) 4 25 5 2 36 Tỷ lệ với chẩn đoán (%) 11,4% 71,4% 11,4% 5,7% 100% ĐHCNP Số trường hợp (n) 2 10 0 0 12 Tỷ lệ với chẩn đoán (%) 16,7% 83,3% 0% 0% 100% XTNP Số trường hợp (n) 1 2 0 0 3 Tỷ lệ với chẩn đoán (%) 33,3% 66,7% 0% 0% 100% Tổng Số trường hợp (n) 7 37 5 2 51 Tỷ lệ với chẩn đoán (%) 13,7% 72,5% 9,8% 4% 100% (*) 5 mẫu đột biến mất đoạn gồm 4 mẫu đột biến CALR type 1 mất 52 nucleotide và một mẫu đột biến hiếm gặp mất đoạn 31 nucleotide BÀN LUẬN Tăng sinh tủy mạn tính là nhóm bệnh lý được đặc trưng bởi sự xuất hiện của đột biến trên các gen JAK2, CALR hoặc MPL. Năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập về hội chứng tăng sinh tủy đã lần lượt công bố đột biến trên gen JAK2 làm biến đổi acid amin valine ở codon 617 thành phenylalanine – được ký hiệu là JAK2V617F(2,6,11,12). Đây là đột biến điểm xuất hiện trong hơn 95% trường hợp đa hồng cầu và trong hơn 60% trường tăng tiểu cầu tiên phát hoặc xơ tủy nguyên phát. Phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất để phát hiện đột biến JAK2V617F là PCR đặc hiệu alen. Trên cơ sở đó, chúng tôi đã xây dựng quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu. Sau hơn 4 năm áp dụng (2012 - 2017), quy trình này còn tồn tại một vấn đề là nhiều mẻ xét nghiệm băng sản phẩm đột biến xuất hiện không đặc hiệu ở cả mẫu âm tính, gây khó khăn trong phân tích kết quả (Hình 1). Qua tham khảo tài liệu, chúng tôi nhận thấy hiện tượng xuất hiện sản phẩm không đặc hiệu thường gặp phải khi xác định các đột biến điểm bằng PCR mồi đặc hiệu. Nguyên nhân của hiện tượng này là do mồi đặc hiệu cho alen đột biến chỉ sai khác với alen bình thường 1 nucleotide, vì vậy mồi đặc hiệu vẫn có thể bắt cặp alen bình thường với hiệu suất thấp hơn. Nhằm ổn định quy trình xét nghiệm và giải quyết triệt để hiện tượng sản phẩm không đặc hiệu, chúng tôi đã thay đổi thiết kế của mồi đặc hiệu sang mồi suy biến. Đối với mồi suy biến thì ngoài nucleotide sai khác tại vị trí đột biến còn chủ ý tạo thêm một sai khác nữa so với alen bình thường tại vị trí thứ 3 từ đầu 3’ của mồi. Như vậy, với 2 sai khác mồi suy biến sẽ mất khả năng bắt cặp alen bình thường. Kết quả áp dụng quy trình hoàn thiện từ năm 2018 đến nay cho thấy hiện tượng sản phẩm không đặc hiệu được giải quyết triệt để và đã giúp ổn định xét nghiệm thường quy đột biến JAK2V617F (Hình 2). Trong tăng sinh tủy mạn tính đột biến trên gen CALR tuy mới được phát hiện gần đây (2013) nhưng đã cho thấy vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh, với tần suất từ 17% đến 27% ở bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát hoặc xơ tủy nguyên phát(9). Cho đến nay, hơn 50 đột biến đã được công bố trên gen CALR exon 9 trong đó 2 thể phổ biến nhất là CALR type 1 mất 52 nucleotide (chiếm hơn 50%) và CALR type 2 chèn 5 nucleotide “TTGTC” (chiếm hơn 30%)(4). Nhờ vào những ưu điểm vượt trội về cỡ mẫu lớn trong một mẻ chạy, đòi hỏi rất ít lượng ADN/ARN đầu vào và độ chính xác cao mà công nghệ giải trình tự NGS đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều bệnh lý huyết học. Hơn nữa, NGS còn một thế mạnh là phát hiện được nhiều dạng đột biến như: biến đổi đơn nucleotide (SNV), chèn và mất đoạn nhỏ (ins/dels), biến đổi số lượng bản sao (CNV)(10,14,15). Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng thành công giải trình tự NGS để phân tích đột biến trên Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 414 toàn bộ gen CALR (exon 1 đến exon 9). Khi phân tích dữ liệu NGS chúng tôi đã xác định được những trường hợp mang đột biến CALR type 2 và các biến thể chèn 5 nucleotide tương tự (Hình 4a). Tuy nhiên không xác định được đột biến CALR type 1 mà thay vào đó là những mẫu gọi ra hàng loạt biến thể trong vùng ~50 bp khi phân tích trên CLC và không phát hiện thấy đột biến khi phân tích trên IGV (Hình 4b). Như vậy kết quả trên CLC cho thấy sự bất thường về dữ liệu sau khi phân tích. Qua tìm hiểu nghiên cứu của Kluk (2016), chúng tôi biết được hạn chế khi phân tích đột biến bằng công nghệ NGS của Illumina là không thể xác định được những mất đoạn lớn hơn 25 bp(10). Đây là lý do mà chúng tôi không thể xác định đột biến CALR type 1 mất đoạn 52 bp khi phân tích kết quả NGS. Như vậy quy trình xét nghiệm bằng NGS giúp phân tích hiệu quả đột biến trên gen CALR ngoại trừ những mất đoạn >25 bp. Một số giải pháp đã được bổ sung để phát hiện những mất đoạn này gồm: phân tích đường cong biến tính (HRM), PCR phân tích đoạn trên máy điện di mao quản, giải trình tự trực tiếp theo phương pháp Sanger(3,5). Cả 3 giải pháp trên đều cho phép phát hiện đột biến CALR type 1 và những mất đoạn khác, tuy nhiên đây đều là những phương pháp khá phức tạp và yêu cầu thiết bị đặc thù. Với HRM được thực hiện trên máy realtime PCR và khá nhạy cảm; PCR phân tích đoạn đòi hỏi máy điện di mao quản. Đối với giải trình tự theo phương pháp Sanger, việc phân tích kết quả đột biến mất đoạn tương đối khó khăn do hiện tượng chồng đỉnh tín hiệu khi giải trực tiếp từ sản phẩm PCR. Phương pháp này đòi hỏi phải tinh sạch đoạn sản phẩm chứa vùng mất đoạn bằng thôi gel. Trong nghiên cứu này chúng tôi đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến CALR type 1 bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu. Kết quả trong Hình 5a cho thấy mẫu dương tính đột biến CALR type 1 thì ngoài băng nội kiểm còn xuất hiện thêm một băng sản phẩm kích thước 89 bp. Tính chính xác của quy trình xét nghiệm được kiểm chứng và xác nhận giá trị thông qua việc giải trình tự đoạn sản phẩm đặc hiệu (89 bp) trên hệ thống AB3500, kết quả phân tích trong Hình 7. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng xác định một trường hợp mang mất đoạn 31 nucleotide hiếm gặp (Hình 5b). Mất đoạn này cũng được chúng tôi xây dựng quy trình xét nghiệm bằng PCR mồi đặc hiệu và xác nhận giá trị bằng phương pháp giải trình tự theo nguyên lý Sanger (Hình 8). Nhằm đơn giản hóa hơn nữa quy trình xét nghiệm đột biến gen CALR chúng tôi tiếp tục xây dựng quy trình PCR xác định đặc hiệu đột biến CALR type 2, kết quả được thể hiện trong Hình 6. Sau khi đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và gen CALR, chúng tôi đã áp dụng bộ quy trình hoàn thiện cho 51 mẫu bệnh nhân MPNs. Kết quả về tỷ lệ đột biến gen cũng tương đồng với nghiên cứu của tác giả Kim, Seon Young và Lin, Yani(8,13). Với đột biến gen CALR, chúng tôi mới phát hiện trên các bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát (11,4% type 1 và 5,7% type 2) mà chưa có trường hợp nào với bệnh lý xơ tủy nguyên phát. Điều này có thể do số lượng bệnh nhân xơ tủy nguyên phát của chúng tôi chưa đủ lớn. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F bằng phương pháp mồi suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát hiện đột biến CALR type 1, type 2; và quy trình NGS phát hiện đột biến ít gặp. Bộ quy trình hoàn thiện đã được ứng dụng trong phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al (2016). The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood, 127(20):2391–2405. 2. Baxter EJ, et al (2005). Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. The Lancet, 365(9464):1054–1061. 3. Chi J, Manoloukos M, Pierides C, et al (2015). CALReticulin mutations in myeloproliferative neoplasms and new methodology for their detection and monitoring. Annals of Hematology, 94(3):399–408. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 6 * 2019 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học BV. Truyền máu Huyết học 415 4. Chi J, Nicolaou KA, et al (2014). CALReticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis. Leukemia, 28(5):1152–1154. 5. Doyle LJ, Betz BL, Weigelin HC, et al (2019). Comparison of real‐time PCR vs PCR with fragment length analysis for the detection of CALR mutations in suspected myeloproliferative neoplasms. International Journal of Laboratory Hematology, 25(7):1429-1431. 6. James C, et al (2005). A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, 434(7037):1144–1148. 7. Jones AV, et al (2015). Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms. Leukemia Research, 39(1):82–87. 8. Kim SY, Im K, Park SN, Kwon J, Kim JA (2015). CALR, JAK2, and MPL Mutation Profiles in Patients with Four Different Subtypes of Myeloproliferative Neoplasms. American Journal of Clinical Pathology, 143(5):635–644. 9. Klampfl T., et al (2013). Somatic Mutations of CALReticulin in Myeloproliferative Neoplasms. New England Journal of Medicine, 369(25):2379–2390. 10. Kluk MJ, Lindsley RC, Aster JC, et al (2016). Validation and Implementation of a Custom Next-Generation Sequencing Clinical Assay for Hematologic Malignancies. Journal of Molecular Diagnostics, 18(4):507–515. 11. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al (2005). A Gain-of- Function Mutation of JAK2 in Myeloproliferative Disorders. New England Journal of Medicine, 352(17): 1779–1790. 12. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al (2005). Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell, 7(4):387–397. 13. Lin Y, et al (2015). The Prevalence of JAK2, MPL and CALR Mutations in Chinese Patients with BCR-ABL1 –Negative Myeloproliferative Neoplasms. American Journal of Clinical Pathology, 144(1):165–171. 14. Murugesan G, Guenther-Johnson J, et al (2016). Validation of a molecular diagnostic assay for CALR exon 9 indels in myeloproliferative neoplasms: identification of coexisting JAK2 and CALR mutations and a novel 9 bp deletion in CALR. International Journal of Laboratory Hematology, 38(3):284–297. 15. Palumbo GA, Stella S, Pennisi MS, et al (2019). The Role of New Technologies in Myeloproliferative Neoplasms, Frontiers in Oncology, 9: 321. 16. Pavlov I, Hadjiev E, Alaikov T, et al (2018). CALReticulin Mutations in Bulgarian MPN Patients. Pathology & Oncology Research, 24(1):171–174. Ngày nhận bài báo: 22/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019