Haemophilus influenzae tiết men beta-Lactamase - kết quả nghiên cứu đa trung tâm trên 248 chủng phân lập được tại Việt Nam

Haemophilus influenzae tiết men beta-lactamase - kết quả nghiên cứu đa trung tâm trên 248 chủng phân lập được tại Việt Nam P. H. Van(1), P. T. Binh(2), B. T. T. Thuy(3), V. T. C. Hai(4), L. Q. Thinh(5), N. T. N. Lan(6), N. T. Ninh(7), N. T. Cuc(8), T.T.T. Trinh(9), L. T. K. Anh(10), P. V. Ca(11), D. M. Phuong(12). Tóm tắt Đặt vấn đề: Có rất ít các nghiên cứu tại Việt Nam về tỷ lệ tiết beta-lactamse của H. influenzae, do vậy một nghiên cứu đa trung tâm về vi khuẩn này là một trong các đòi hỏi cấp thiết từ các nhà lâm sàng cũng như vi sinh lâm sàng tại Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu: Tìm hiểu tình hình H. influenzae tiết beta-lactamase và đề kháng kháng sinh dực trên một thiết kế nghiên cứu đa trung tâm tiến hành tại Việt Nam. Phương pháp nghiên cứu: Trong thời gian từ 1/2003 đến 6/2005, có 248 chủng H. influenzae bao gồm 194 chủng không xâm lấn và 54 chủng xâm lấn được thu nhận từ 10 bệnh viện khác nhau tại Việt Nam, bao gồm hai bệnh viện lớn tại Hà Nội, một bệnh viện lớn tại Đà Nẵng, và 7 bệnh viện tại TP.Hồ Chí Minh. Các chủng vi khuẩn này được làm thử nghiệm phát hiện beta-lactamase và làm kháng đồ phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch một số kháng sinh thường dùng trong cộng đồng. Kết quả: Kết quả cho thấy có đến 49% các chủng tiết được men beta-lactamase và hầu như tất cả các chủng kháng ampicillin đều là các chủng tiết beta-lactamase; 60% đề kháng sulfamethoxazol/trimethoprim và vi khuẩn tiết men beta-lactamase đề kháng kháng sinh này cao hơn (78%) vi khuẩn không tiết men betalactamase (44%); 8% đề kháng azithromycin và không có sự khác biệt về tỷ lệ đề kháng azithromycin giữa hai nhóm vi khuẩn tiết được hay không tiết được men beta-lactamase. Nghiên cứu cũng ghi nhận không có vi khuẩn nào đề kháng amoxicillin/clavulanic acid. Không có vi khuẩn beta-lactamase [-] nào đề kháng với cefaclor và cefuroxim, nhưng trong nhóm vi khuẩn beta-lactamase [+], dù không có vi khuẩn nào được ghi nhận đề kháng cefuroxim nhưng có 1% vi khuẩn kháng được cefaclor, 2% được ghi nhận nhạy cảm trung gian với cefuroxim và có đến 17% là nhạy cảm trung gian với cefaclor. Nghiên cứu cũng cho thấy không có sự khác biệt về tỷ lệ tiết men beta-lactamase và tỷ lệ đề kháng kháng sinh giữa vi khuẩn H. influenzae xâm lấn và H. influenzae không xâm lấn, nhưng các chủng H. influenzae phân lập từ trẻ em có tỷ lệ tiết beta-lactamase (65%) cao hơn là các chủng phân lập từ người lớn (36%). Kết luận: Vi khuẩn H. influenzae phân lập từ các bệnh phẩm khác nhau tại Việt Nam mang một tỷ lệ tiết men beta-lactamase khá cao, và kết quả nghiên cứu này đã khiến các nhà lâm sàng phải xem xét việc sử dụng kháng sinh amoxicillin-clavulanic acid như là kháng sinh hàng đầu điều trị nhiễm trùng do H. influenzae. Abstract Haemophilus influenzae with beta-lactamase – Results from the multicenter study on 248 strains isolated from Việt Nam Background: There are very few studies in Viet Nam on the ratio of beta-lactamase producing H. influenzae, and the muticenter study on this target bacteria is one of the hot requirements from the clinical physicians as well as the clinical microbiologists in Viet Nam. Objectives: Surveillance the ratio af beta-lactamase producing H. influenzae and the antibiotic resistance of this bacteria based on the multicenter study in Viet Nam Methods: From 1/2003 to 6/2005, 248 H. influenzae isolates with 194 non-invasive and 54 invasive were collected from 10 different hospitals in Việt Nam; including two big hospitals in Hanoi, one in Danang, and 7 in Hochiminh city. These isolates were carried out the beta-lactamase detection and the sensitivity testing by diffusion method against some most common used antibiotics in community. Results: The received results have demonstrated that 49% of the isolates were the beta-lactamase producers and all of the ampicillin resistant isolates were belong to these producers; 60% of the isolates were resistant to sulfamethoxazol/trimethoprim and the lactamase producers were resistant to this antibiotic with the higher ratio (78%) than the non-betalactamase producer (44%); 8% of the isolates were resistant to azythromycin and no difference in the resistant ratio between the producers and the nonproducers. The study has also reported that none of the isolates were resistant to amoxicillin/clavulanic acid; none of the isolates with beta-lactamase [-] were reported resistant to cefaclor and cefuroxime; but among the beta-lactamase [+], 1% were reported resistant to cefaclor, 2% intermediate to cefuroxime and 17% to cefaclor. The study also reported that there were no difference in the beta-lactamase produced ratio and the antibiotic resistant ratio between the invasive and non-invasive H. influenzae isolates, but the beta-lactamase producer ratio in the H. influenzae isolated from children were higher (65%) than from the adult (36%). Conclusions: The H. influenzae isolated from the different clinical samples in Vietnam did carry the beta-lactamase producing at the quite high ratio, and these findings have required the physicians to consider amoxicillin-clavulanic acid as the first antibiotic line for the treatment of infection causing by this pathogen. *Tác giả chính, (1)Đại Hoc Y Dược TP. HCM, (2)Công ty Nam Khoa, (3)Công ty GSK, (4)BV. Nhân Dân Gia Định, (5)BV. Nhi Đồng 1, (6)BV. Phạm Ngọc Thạch, (7)BV. Nguyễn Tri Phương, (8)BV. Tai Mũi Họng TP. HCM, (9)BV. An Bình, (10)BV. Đa Khoa Đà Nẵng, (11)BV. Lâm Sàng Bệnh Nhiệt Đới, (12)BV. Bạch Mai Đặt vấn đề H. influenzae là một trong các vi khuẩn được các nhà y học thừa nhận là hàng đầu, chịu trách nhiệm từ 10-30% các tác nhân gây nhiễm khuẩn hô hấp cấp trong cộng đồng tuỳ trường hợp bệnh lý và lứa tuổi(1,2,3,4). Trước đây ampicillin vẫn được coi là kháng sinh đặc trị hữu hiệu cho các nhiễm khuẩn H. influenzae. Tuy nhiên chỉ một thời gian ngắn sau đó, vào năm 1974 đã có các báo cáo về các trường hợp vi khuẩn H. influenzae kháng ampicillin (5,6,7,8). Cho đến nay tình hình đề kháng này ngày càng trầm trọng hơn, điển hình như ở Mỹ chỉ trong một thời gian ngắn từ 1984 đến 1997, tỷ lệ vi khuẩn H. influenzae kháng ampicillin bằng cơ chế tiết men b-lactamase gia tăng hơn gấp đôi: từ 15%(9,10) lên đến 42% và thậm chí ở vài bang lên đến trên 50%(11). Ngoài sự gia tăng tỷ lệ vi khuẩn kháng ampicillin bằng cơ chế tiết men b-lactamase, H. influenzae còn có thể có các cơ chế khác giúp đề kháng kháng sinh như cơ chế biến đổi protein gắn penicillin (PBP) để đề kháng ampicillin(12,13), amoxicillin/clavulanate(14) và các cephalosporin thế hệ 2 khác(15), cơ chế tăng thải và biến đổi ribosome để đề kháng các macrolides(9)...Chính những khuynh hướng đề kháng này đã khiến H. influenzae trở thành một đối tượng vi khuẩn rất cần phải được giám sát không chỉ trong phạm vi quốc gia mà cả phạm vi quốc tế để giúp các nhà y học có thể có được các chiến lược phòng chống cũng như điều trị kháng sinh hợp lý và hữu hiệu hơn trước các trường hợp nhiễm khuẩn H. influenzae, một nhiễm khuẩn rất thường gặp đối với các nhà lâm sàng. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Đây là nghiên cứu đa trung tâm với hai bệnh viện tại miền Bắc là Bệnh viện Bạch Mai và Viện Lâm Sàng Bệnh Nhiệt Đới, một bệnh viện tại miền Trung là Bệnh viện đa khoa Đà Nẵng, bảy bệnh viện tại TP. Hồ Chí Minh là Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Nhân Dân Gia Định, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Nhi Đồng 1, Bệnh viện Nguyễn Tri Phương, Bệnh viện An Bình và Bệnh viện Tai Mũi Họng. Thời gian nghiên cứu bắt đầu từ 1/2003 đến 6/2005. Đối tượng là vi khuẩn H. influenzae với tiêu chuẩn đưa vào là các chủng phân lập được từ các bệnh phẩm gửi đến xét nghiệm vi sinh thường qui tại các phòng thí nghiệm vi sinh các bệnh viện kể cả các bệnh phẩm là quệt họng nếu trên mặt thạch phân lập, vi khuẩn H. influenzae chiếm đa số. Tiêu chuẩn loại trừ không đưa vào nghiên cứu là các chủng vi khuẩn được phân lập trước tháng 1/2003 và được lưu trữ tại phòng thí nghiệm trước thời gian này, hay là các chủng phân lập được trên cùng một bệnh nhân ở hai vị trí lấy bệnh phẩm khác nhau hay là ở hai thời điểm khác nhau, hay là các chủng phân lập từ quệt họng của bệnh nhân khoẻ mạnh hay không bị nhiễm khuẩn hô hấp. Các chủng H. influenzae phân lập được từ các bệnh viện được cấy giữ trên mặt các ống thạch nâu (CA) chế từ máu ngựa và gửi ngay trong vòng không quá một tuần đến trung tâm nghiên cứu là phòng thí nghiệm vi sinh của Bộ môn Vi Sinh, Khoa Y, Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Tại trung tâm nghiên cứu, các chủng H. influenzae được cấy phân lập lại trên mặt các hộp thạch nâu chế từ máu ngựa và ủ trong bình nến ở 37oC qua đêm, sau đó định danh xác định lại là H. influenzae dựa trên nhu cầu X và V với các que X và V mua từ hãng Becton Dickenson (BD). Để thuận tiện cho việc nghiên cứu hàng loạt, các chủng được khẳng định là H. influenzae được trung tâm nghiên cứu giữ chủng trong các ống môi trường TSB (trypticase soy broth) có 20% glycerol và lưu trữ ở -70oC. Khi làm thử nghiệm hàng loạt, các chủng H. influenzae lưu trữ được cấy lại trên môi trường thạch nâu máu ngựa và sau đó được làm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch theo các chuẩn mực của NCCLS với các đĩa kháng sinh ampicillin (10mcg), amoxicillin-clavulanic acid (10-5mcg), cefuroxime (30mcg), cefaclor (30mcg), azithromycin (15mcg) và sulfamethoxazol-trimethoprim (27.75-1.25mcg) mua từ hãng Biorad. Môi trường làm kháng sinh đồ là môi trường HTM (Haemophilus Test Media) do trung tâm nghiên cứu pha chế theo hướng dẫn của NCCLS từ môi trường thạch Mueller Hinton Agar mua từ hãng BD, yếu tố V và bovine hemin mua từ Sigma. Song song với làm kháng sinh đồ, vi khuẩn H. influenzae cũng được làm thử nghiệm phát hiện men beta-lactamase bằng đĩa giấy cefinase cũng mua từ hãng BD theo qui trình hướng dẫn kèm theo. Vi khuẩn được dùng kiểm tra chất lượng các đĩa kháng sinh và qui trình kháng sinh đồ phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch là H. influenzae ATCC 49247 và H. influenzae ATCC 49766; vi khuẩn được dùng kiểm tra chất lượng đĩa Cefinase và qui trình phát hiện beta-lactamase là S. aureus ATCC 29213 và S. aureus ATCC 25922. Các thử nghiệm kiểm tra chất lượng được làm song song với mỗi lần làm thử nghiệm hàng loạt. Các kết quả được ghi nhận đồng thời trên giấy và trên file Exel để dễ dàng cho việc thồng kê và phân tích sau này. Kết quả Trong thời gian từ 1/2003 đến 6/2005, có 248 chủng H. influenzae được thu nhận từ 10 bệnh viện khác nhau, bao gồm: Viện Lâm Sàng Bệnh Nhiệt Đới (33 chủng), Bệnh Viện Bạch Mai (50 chủng), Bệnh Viện Nhân Dân Gia Định (39 Chủng), Bệnh Viện Đa Khoa Đà Nẵng (17 chủng), Bệnh Viện Phạm Ngọc Thạch (62 chủng), Bệnh Viện Nhi Đồng 1 (28 chủng), Bệnh Viện Chợ Rẫy (9 chủng), Bệnh Viện An Bình, Bệnh Viện Nguyễn Tri Phương, và Bệnh Viện Tai Mũi Họng TP. Hồ Chí Minh (10 chủng). Xét về nguồn gốc bệnh phẩm, có 194 chủng được coi là chủng không xâm lấn (nin-INV=non-invasive) vì được phân lập chủ yếu từ các bệnh phẩm là đàm, dịch phế quản hay dịch tị hầu (trẻ em) lấy từ bệnh nhân bị viêm phổi hay là mủ xoang lấy từ các bệnh nhân bị viêm xoang; 54 chủng còn lại là các chủng xâm lấn (INV=invasive) vì được phân lập chủ yếu từ dịch não tuỷ hay máu lấy từ các bệnh nhân bị viêm màng não mủ với hầu hết là trẻ em từ 2 tháng đến 2 tuổi, hay từ tràn dịch màng phổi lấy từ bệnh nhân bị viêm phổi, hay mủ tai giữa lấy từ các bệnh nhân bị viêm tai giữa. Về lứa tuổi của các bệnh nhân, có 92 chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh nhân 2 tháng đến 2 tuổi, 22 chủng phân lập từ bệnh nhân trên 2 tuổi đến 15 tuổi, 79 chủng phân lập từ bệnh nhân 16 đến 69 tuổi, và 55 chủng phân lập từ bệnh nhân trên 60 tuổi. Xét về giới tính, 133 chủng phân lập từ bệnh nhân nam và 115 phân lập từ bệnh nhân nữ. Phân tích tình hình đề kháng kháng sinh của các 248 chủng H. influenzae nghiên cứu được, chúng tôi nhận thấy có 49% (122 chủng) các chủng là tiết được men beta-lactamase, và gần như 100% các chủng tiết beta-lactamase là đề kháng với Ampicillin. Kết quả về tính hình vi khuẩn tiết beta-lactamase và đề kháng các kháng sinh khác được trình bày trong biểu đồ 1 sau đây: Qua phân tích trên biểu đồ 1, chúng tôi nhận thấy 100% các chủng H. influenzae là nhạy cảm với Amoxicillin/clavulanic acid. Không có chủng nào là kháng với cefuroxime và chỉ có 1 chủng được ghi nhận là đề kháng cefaclor. Xét về tỷ lệ nhạy cảm thì có đến 99% là nhạy cảm và 1% là trung gian với cefuroxime, 92% nhạy cảm và 8% là trung gian với cefaclor. Có 8% các chủng đề kháng với azithromycin, 48% kháng ampicillin, và 60% kháng sulfamethxazol-trimethoprim. Bảng 1 theo sau đây trình bày tỷ lệ tiết men beta-lactamse và đề kháng một số kháng sinh của H. influenzae theo các bệnh viện tham gia nghiên cứu. Phân tích chi tiết chúng tôi nhận thấy các vi khuẩn H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân tại Bệnh viện Bạch Mai và Viện Lâm Sàng Nhiệt Đới có tỷ lệ tiết men beta-lactamase cao nhất, 78% và 61%; kế đó là các chủng H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân bệnh viện đa khoa Đà Nẵng, 59%. Tại TP. Hồ Chí Minh, các chủng H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân tại bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và bệnh viện Nhân Dân Gia Định có tỷ lệ tiết men beta-lactamase thấp hơn khá nhiều, 27% và 26%; nhưng các chủng H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân tại bệnh viện Nhi Đồng 1 và các bệnh viện khác tham gia nghiên cứu lại khá cao, 57% và 53%. Đi kèm với tỷ lệ thấp hơn tiết men beta-lactamse, các vi khuẩn H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân tại các bệnh viện Phạm Ngọc Thạch và bệnh viện Nhân Dân Gia Định cũng có tỷ lệ kháng ampicillin và azithromycin cũng thấp hơn các vi khuẩn H. influenzae phân lập từ các bệnh nhân tại bệnh viện Bạch Mai, viện Lâm Sàng Bệnh Nhiệt Đới, bệnh viện Nhi Đồng 1, và các bệnh viện khác. Biểu đồ 1: Tỷ lệ tiết men beta-lactamase và đề kháng kháng sinh của vi khuẩn H. influenzae Ac Amoxicillin-Clavulanic acid Cu Cefuroxime Cr Cefaclor Am Ampicillin Az Azithromycin Bt Sultamethoxazol-Trimethoprim BLM Beta-lactamase Nguyên nhân của các sự khác biệt này có phải là do tỷ lệ khác nhau về nguồn gốc bệnh phẩm phân lập được vi khuẩn hay không? Phân tích trên bảng 2 trình bày về nguồn gốc các vi khuẩn H. influenzae phân lập được theo các bệnh viện và tỷ lệ tiết men beta-lactamase tương ứng, chúng ta thấy sự khác biệt về tỷ lệ tiết beta-lactamase của H. influenzae theo bệnh viện không có mối quan hệ rõ nét với nguồn gốc vi khuẩn là invasive hay non-invasive. Nhận xét này cũng phù hợp với kết quả phân tích được trình bày trong biểu đồ 2 cho thấy tỷ lệ tiết beta-lactamase của H. influenzae là hoàn toàn không liên quan đến nguồn gốc invasive hay non-invasive của vi khuẩn (R=0.29). Tỷ lệ đề kháng azithromycin và sulfamethoxazol-trimethoprim giữa hai nhóm invasive và non-invasive cũng hầu như không khác nhau (P>0.05). Tuy nhiên nếu xét về tuổi của bệnh nhân thì chúng ta sẽ thấy đa số bệnh phẩm từ bệnh viện Bạch Mai (28/50), viện LSNĐ (30/33), bệnh viện đa khoa Đà Nẵng (17/17), bệnh viện Nhi Đồng 1 (28/28) là lấy từ trẻ em so với 100% bệnh phẩm từ bệnh viện PNT (62) và bệnh viện NDGĐ (39) là từ người lớn và chính sự khác biệt này đã tạo nên sự khác biệt về tỷ lệ tiết beta-lactamase ở hai bệnh viện NDGĐ và bệnh viện PNT so với các bệnh viện khác. Nhận xét này hoàn toàn phù hợp với phân tích mà chúng tôi đã thực hiện trên công trình này cho thấy tỷ lệ tiết beta-lactamase của H. influenzae phân lập từ bệnh nhân người lớn là chỉ 36% (49/135) khác biệt rất có ý nghĩa thống kê (P<0.001) với tỷ lệ tiết beta-lactamase của H. influenzae phân lập từ trẻ em 65% (73/113). Bảng 1: Tỷ lệ tiết men beta-lactamase và đề kháng một số kháng sinh của H. influenzae theo các bệnh viện tham gia nghiên cứu Amox/Clav.acid Cefuroxime Cefaclor Ampicillin Azithromycin SMX/TMP BLM R I S R I S R I S R I S R I S R I S (+) BV. Bạch Mai 0% 0% 100% 0% 4% 96% 0% 14% 86% 78% 4% 18% 12% 0% 88% 78% 4% 18% 78% Viện LSNĐ 0% 0% 100% 0% 0% 100% 3% 21% 76% 58% 15% 27% 12% 0% 88% 58% 3% 39% 61% BV. NDGĐ 0% 0% 100% 0% 0% 100% 0% 0% 100% 26% 3% 72% 5% 0% 95% 49% 3% 49% 26% BVĐK. Đà Nẵng 0% 0% 100% 0% 0% 100% 0% 6% 94% 59% 6% 35% 0% 0% 100% 71% 18% 12% 59% BV. PNT 0% 0% 100% 0% 0% 100% 0% 5% 95% 26% 6% 68% 5% 0% 95% 50% 0% 50% 27% BV. NĐ1 0% 0% 100% 0% 0% 100% 0% 0% 100% 54% 11% 36% 11% 0% 89% 64% 7% 29% 57% Các BV. Khác 0% 0% 100% 0% 0% 100% 0% 16% 84% 58% 5% 37% 16% 0% 84% 63% 0% 37% 53% Tổng 0% 0% 100% 0% 1% 99% 0% 8% 91% 48% 7% 45% 8% 0% 92% 60% 4% 36% 49% Bảng 2: Nguồn gốc các vi khuẩn H. influenzae phân lập được theo bệnh viện và tỷ lệ tiết beta-lactamase Bệnh viện Invasive Non-invasive BLM (+) BV. Bạch Mai 1( 2%) 49( 98%) 78% BV. LSNĐ 7( 21%) 26( 79%) 61% BV. NDGD 0( 0%) 39(100%) 26% BVĐK. Đà Nẵng 17(100%) 0( 0%) 59% BV. PNT 0( 0%) 62(100%) 27% BV. NĐ1 28(100%) 0( 0%) 57% Các BV khác 1( 5%) 18( 95%) 53% Total 54( 22%) 194( 78%) 49% Biểu đồ 3: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của H. influenzae tiết men beta-lactamase so với không tiết men beta-lactamase Ac Amoxicillin-Clavulanic acid Cu Cefuroxime Cr Cefaclor Am Ampicillin Az Azithromycin Bt Sultamethoxazol-Trimethoprim Biểu đồ 3 trình bày trên đây cho thấy vi khuẩn H. influenzae tiết beta-lactamase có tỷ lệ đề kháng cao SMX/TMP (Bt) so với vi khuẩn không tiết beta-lactamase, tuy nhiên đối với azithromycin thì vi khuẩn tiết hay không tiết beta-lactamase đều có tỷ lệ đề kháng như nhau (P>0.05). Kết quả nghiên cứu cũng ghi nhận được 1% H. influenzae tiết men beta-lactamase là đề kháng và 17% nhạy cảm trung gian với cefaclor, trong khi đó trong nhóm không tiết beta-lactamase, chúng tôi ghi nhận không có vi khuẩn nào đề kháng hay nhạy cảm trung gian với kháng sinh này. Đối với kháng sinh cefuroxime, có 2% vi khuẩn tiết beta-lactamase là nhạy cảm trung gian, và không có vi khuẩn nào trong nhóm các vi khuẩn không tiết beta-lactamase là đề kháng hay nhạy cảm trung gian với cefuroxime. Bàn luận Mặc dù H. influenzae là một trong các tác nhân vi khuẩn rất thường gặp trong những bệnh lý cũng rất thường gặp đối với các nhà lâm sàng – bệnh lý nhiễm khuẩn hô hấp cấp cộng đồng(1,2,3,4) – nhưng cho đến nay các nghiên cứu vi sinh lâm sàng về tác nhân này rất ít khi được thực hiện tại Việt Nam. Do vậy chúng ta hiếm khi tìm thấy được các tài liệu, không chỉ trên các y văn quốc tế mà cả y văn trong nước, ghi nhận về tần suất gây bệnh cũng như tỷ lệ đề kháng kháng sinh của H. influenzae phân lập được tại Việt Nam. Nguyên nhân chính của thực tế này là vì đa số các phòng thí nghiệm lâm sàng tại Việt Nam không phát triển mấy về các xét nghiệm vi sinh lâm sàng, đặc biệt không có các môi trường nuôi cấy thích hợp cho các vi khuẩn dù rất thường gặp nhưng lại rất khó mọc như H. influenzae(16). Vì men b-lactamse của vi khuẩn H. influenzae không có tác dụng trên các cephalosporin thế hệ 2 cũng như không bền vói các b-lactamase inhibitor như clavulnate, sulbactam..(17,18,19); do vậy trả lời được câu hỏi vi khuẩn H. influenzae có khả năng tiết được b-lactamase hay không sẽ giúp các nhà lâm sàng quyết định được kháng sinh điều trị thích hợp mà không cần phải có kết quả kháng sinh đồ đối với các kháng sinh khác(17,18,19). Tuy nhiên, hiện nay các nhà y học đã ghi nhận vi khuẩn H. influenzae có thể có khả năng, dù còn rất hiếm, đề kháng được các kháng sinh b-lactam không phải do cơ chế tiết men b-lactamase mà do các cơ chế khác(20,11) với các kiểu hình đề kháng như không tiết b-lactamase mà vẫn kháng ampicillin(20,11,12,13) (gọi là BLNAR = b-lactamase negative ampicillin resistance) hay tiết b-lactamase và kháng được amoxicillin-clavulanate(20,11,14,12) (gọi là BLPACR = b-lactamase positive amoxicillin clavulanate resistance), hay các kiểu hình kháng được các cephalosporin thế hệ 2 như cefuroxime(21,22,23,24,25), cefaclor(22,23,25)..Chính vì vậy việc thực hiện kháng sinh đồ trên vi khuẩn H. influenzae cũng rất cần thiết trong các nghiên cứu giám sát khả năng phát triển các đề kháng này, hay là trong trường hợp trên lâm sàng bệnh nhân bị dị ứng với các kháng sinh b-lactam và cần phải sử dụng các kháng sinh khác thay thế. Tuy nhiên, khác với đa số các vi khuẩn khác, môi trường thực hiện kháng sinh đồ chuẩn mực HTM (Haemophilus Test Media) mà NCCLS khuyến cáo(26) cũng như được đánh giá qua các nghiên cứu so sánh với các phương tiện được thương mại hoá khác(27,28,29,30) dành cho vi khuẩn H. influenzae thường khó có thể tự pha chế được tại các phòng thí nghiệm lâm sàng; và đây cũng chính là một lý do tại sao các nghiên cứu về đề kháng kháng sinh của H. influenzae thường chỉ có thể thực hiện được trong các công trình nghiên cứu tại Âu Mỹ mà rất ít tại các quốc gia đang phát triển như Việt Nam. Các nghiên cứu trên thế giới cho đến hiện nay cho thấy tỷ lệ vi khuẩn H. influenzae tiết men b-lactamase tại các nước tiên tiến dao động từ 15% đến trên 50% và có khác nhau tuỳ quốc gia(31,32,21,22,23, 24,25,10), trong đó có lẽ đáng chú ý là Tây Ban Nha 26-32%(31), Pháp 28-32%(32,22), Hoa Kỳ 34->50%(31,22,23,10), Singapore 25-27%(22,24), Hồng Kông 29-39%(31,32), và Đài Loan 56-60%(24,25). Trong công trình nghiên cứu này của chúng tôi, kết quả ghi nhận cho thấy tỷ lệ H. influenzae tiết b-lactamase là 49%, nếu so sánh với các nghiên cứu quốc tế thì Việt Nam đứng trong hàng các quốc gia có tỷ lệ H. influenzae tiết b-lactamase cao nhất thế giới chỉ sau Đài Loan, hơn cả Hong Kong và Singapore. Có lẽ tỷ lệ cao vi khuẩn H. influenzae tiết b-lactamase tại Việt Nam có liên quan khá nhiều với tình hình sử dụng kháng sinh không kiểm soát hiện nay(33). Bên cạnh ghi nhận tỷ lệ cao H. influenzae tiết men b-lactamase, công trình nghiên cứu của chúng tôi cũng ghi nhận một tỷ lệ đề kháng cao với kháng sinh sulfamethoxazol-trimethoprim (60%). Tỷ lệ đề kháng này là khá cao, tương đương với Đài Loan 51-62%(24,25) và Trung Quốc 65%(24). Nổi bật trong đề kháng kháng sinh của H. influenzae là sự đề kháng ampicillin, chủ yếu bằng cơ chế tiết men b-lactamase, đó là TEM-1 và ROB-1(34) với TEM-1 chiếm đến 90-92%(35,36). Tuy nhiên các nhà lâm sàng cũng như nghiên cứu cũng đã ghi nhận H. influenzae còn có cơ chế biến đổi protein gắn penicillin (PBP=penicillin binding protein) giúp chúng có thể đề kháng được ampicillin mà không qua cơ chế tiết men b-lactamase(12,13,37,38,39,40). Kiểu hình đề kháng BLNAR này bắt đầu được ghi nhận từ thập niên 80(41,42), và dù rằng ở Nhật chiếm tỷ lệ khá cao đến 28-29%(38,39,40), nhưng vẫn còn rất thấp tại Hoa Kỳ hay các nước khác(22,25,37). Trong công trình nghiên cứu của chúng tôi, chỉ có một chủng BLNAR được ghi nhận trong 126 chủng H. influenzae không tiết b-lactamase, nhưng có đến 23/128 (18%) chủng có đường kính nhạy cảm trung gian với ampicillin. Chính kết quả này đã làm chúng tôi lo ngại cơ chế biến đổi PBP giúp H. influenzae đề kháng được ampicillin có thể sẽ trở nên trầm trọng trong tương lai tại Việt Nam. Sở dĩ cơ chế biến đổi PBP trên H. influenzae cần được quan tâm vì cũng qua cơ chế này, H. influenzae có thể kháng được amoxicillin-clavulanate(14,12) hay cefuroxim(15). Tuy nhiên cũng rất may mắn là hiện nay tỷ lệ vi khuẩn H. influenzae tiết hay không tiết b- lactamase kháng được amoxicillin-clavulanate hay cefuroxim dù đã được ghi nhận ở nhiều nghiên cứu tại các quốc gia tiên tiến nhưng hãy còn rất thấp(21,22,23,25). Trong công trình nghiên cứu này của chúng tôi, không có chủng H. influenzae nào được ghi nhận đề kháng amoxicillin/clavulanate hay cefuroxime, tuy nhiên cũng có một tỷ lệ khá thấp là 2% các chủng tiết b-lactamase nhạy cảm trung gian với cefuroxim. Công trình nghiên cứu của chúng tôi cũng ghi nhận có 1% vi khuẩn tiết men b-lactamase là kháng với cefaclor, và có lẽ kết quả này cũng phù hợp với các công trình nghiên cứu cho là H. influenzae kháng được cefaclor qua cơ chế tiết men b-lactamase loại ROB-1(43), và tỷ lệ vi khuẩn H. influenzae tiết men ROB-1 rất thấp so với tỷ lệ tiết men TEM-1(10). Tuy nhiên nếu tìm hiểu trên các công trình nghiên cứu khác, cefaclor không phải là kháng sinh có hiệu quả trên H. influenzae vì tỷ lệ đề kháng được ghi nhận là khác cao(22,23,25), đặc biệt nếu so với điểm gãy PK/PD của kháng sinh này thì tỷ lệ đề kháng có thể lên đến 97-100%(22). Công trình nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có đến 8% vi khuẩn kháng được azithromycin và không có sự khác biệt giữa hai nhóm tiết và không tiết được men b-lactamase. Có lẽ sự không khác biệt này là do cơ chế đề kháng azithromycin của H. influenzae hoàn toàn không có liên quan gì đến khả năng tiết men b-lactamase của vi khuẩn mà chính là do cơ chế bôm đẩy (efflux pump) kháng sinh ra ngoài và cơ chế biến đổi ribosome của vi khuẩn(44,45). Tỷ lệ đề kháng azithromycin được ghi nhận trong công trình nghiên cứu của chúng tôi là khá cao so với các công trình nghiên cứu khác tại Mỹ chỉ 0.2-0.5%(21,23,9), tuy nhiên hãy còn khá thấp nếu so với tỷ lệ đề kháng 97% trong công trình nghiên cứu của Jacobs khi so sánh MIC của H. influenzae đối với Azithromycin với điểm gãy PK/PD(22). Kết luận Công trình nghiên cứu này được thực hiện nhằm mục đích chính là phát hiện tỷ lệ tiết được men b-lactamase của vi khuẩn H. influenzae phân lập được trên các bệnh nhân tại các bệnh viện lớn tại Việt Nam hiện nay. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam cũng là một trong những điểm nóng của thế giới rất cần phải quan tâm để giám sát tình hình đề kháng kháng sinh của H. influenzae vì tỷ lệ khá cao vi khuẩn tiết được men b-lactamase. Mặc dầu kết quả nghiên cứu cũng đã cho thấy tỷ lệ hãy còn rất thấp H. influenzae không tiết b-lactamase và kháng được ampicillin, nhưng lại có đến 18% các chủng không tiết b-lactamase có kiểu hình nhạy cảm trung gian với ampicillin và có thể đây là dấu hiệu báo động H. influenzae tại Việt Nam đã có biến đổi PBP và sẽ trở thành một mối nguy trong điều trị vì cơ chế kháng thuốc này còn có thể giúp vi khuẩn kháng được các cephalosporin thế hệ 2 và cả amoxicillin/clavulanate, một kháng sinh hiện nay được thừa nhận là hiệu quả nhất để điều trị nhiễm khuẩn hô hấp cấp do H. influenzae. Tuy nhiên nhận định và dự báo này cần được nghiên cứu thêm, đặc biệt là phải có các nghiên cứu phân tử xác định các đột biến gen gây nên biến đổi PBP của vi khuẩn như đã được rất nhiều tác giả nước ngoài thực hiện(14-34,38-15). Tài liệu tham khảo Fang G, Fine M, Orloff J, et al (1990). New and emerging etiologies for community-acquired pneumonia with implications for therapy. Medicine 69, 307-316. Zeckel ML, Jacobson JD, Guerra FJ,Therasse DG, Farlow D (1992). Loracarbef (LY163892) versus amoxicillin/clavulanate in the treatment of acute bacterial exacerbations of chronic bronchitis. Clin Ther 14, 214-229. Hoberman A, Paradise JL, Block S, et al. (1996). Efficacy of amoxicillin/clavulanate for acute otitis media: Relation to Streptococcus pneumoniae susceptibility. Pediatr Infect Dis J 15, 955-962. Gwaltney JM. Sinusitis. In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R, eds. (1995). Mandell, Douglas and Bennett’s Principles and Practices of Infectious Diseases, 4th ed. New York, NY: Churchill Livingstone Inc; 585-590. Gunn BA, Woodall JB, Jones JF, Thornsberry C (1974) Ampicillin-resistant Haemophilus influenzae. Lancet 11:845. Khan W, Ross S, Rodriguez W, Controni G, Saz AR (1974) Haemophilus influenzae type b resistant to ampicillin. JAMA 229:298. Thomas WJ, McReynolds JW, Mock CR, Bailey DW (1974) Ampicillin-reistant Haemophilus influenzae. Lancet 1:313. Tomeh M, Starr SE, McGowan JE, Terry PM, Nahmias AJ (1974) Ampicillin-resistant Haemophilus influenzae type b infection. JAMA 229:295-297. Doern, G. V., A. B. Brueggemann, G. Pierce, H. P. Holley, Jr., and A. Rauch (1997). Antibiotic resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae in the United States in 1994 and 1995 and detection of beta-lactamasepositive strains resistant to amoxicillin-clavulanate: results of a national multicenter surveillance study. Antimicrob. Agents Chemother. 41:292–297. Michael R. Jacobs (1999). Emergence of Antibiotic Resistance in Upper and Lower Respiratory Tract Infections. The American Journal Of Managed Care 5:11, S651-S661 Jacobs MR, Bajaksouzian S, Lin G, Appelbaum PC (1998). Susceptibility of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae to oral agents: Results of a 1997 epidemiological study. Presented at the 98th General Meeting of the American Society for Microbiology; May 17-21, 1998; Atlanta, GA. [Abstract A-31]. Henri Dabernat, Catherine Delmas, Martine Seguy, Roseline Pelissier, Genevieve Faucon, Safia Bennamani, and Christophe Pasquier (2002). Diversity of beta-Lactam Resistance-Conferring Amino Acid Substitutions in Penicillin-Binding Protein 3 of Haemophilus influenzae. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 46:7 2208–2218 Frank S. Kaczmarek, Thomas D. Gootz, Fadia Dib-Hajj, Wenchi Shang, Shawn Hallowell, and Melissa Cronan (2004). Genetic and Molecular Characterization of beta-Lactamase-Negative Ampicillin-Resistant Haemophilus influenzae with Unusually High Resistance to Ampicillin. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 48:5, 1630–1639 Matic V; Bozdogan B; Jacobs MR; Ubukata K; Appelbaum PC (2003). Contribution of beta-lactamase and PBP amino acid substitutions to amoxicillin/clavulanate resistance in b-lactamase-positive, amoxicillin/ clavulanate resistant Haemophilus influenzae. J Antimicrob Chemother 52(6):1018-21 K. Straker, M. Wootton, A. M. Simm, P. M. Bennett, A. P. MacGowan and T. R. Walsh (2003). Cefuroxime resistance in non--lactamase Haemophilus influenzae is linked to mutations in ftsI. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 51, 523–530 P. H. Van (2006). In: Cay dam va cac benh pham co dam – Cac cau hoi thuong gap. Cac ky thuat xet nghiem vi sinh lam sang cac benh pham khac nhau. Nha xuat ban Y hoc. Xuat ban lan 1 (đang in). 85-86. Geo. F. Brooks, Janet S Butel, Stephen A Morse (2004). Jawetz, Melnick, & Adelberg’ s Medical Microbiology. Mc Graw Hill 23rd edition, 279-289 Betty A. Forbes, Daniel F. Sahm, Alice S Weissfeld (2002). Baily & Scott’ s Diagnostic Microbiology. Mosby 11th edition, 462-469 NCCLS (2004). In Introduction to Table 1 through 1A and 2A through 2I for Use With M2-A8 – Disk Diffusion. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. 17-29 Jones RN, Jacobs MR, Washington JA, Pfaller MA (1997). A 1994-95 survey of Haemophilus influenzae susceptibility to ten orally administered agents. Diagn Microbiol Infect Dis 27, 75-83. D.M. Johnson, H.S. Sader, T.R. Fritsche, D.J. Biedenbach, Ronald N. Jones (2003). Susceptibility trends of Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis against orally administered antimicrobial agents: five-year report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 47, 373–376 Michael R. Jacobs, David Felmingham, Peter C. Appelbaum, Reuben N. Grüneberg and the Alexander Project Group (2003). The Alexander Project 1998–2000: susceptibility of pathogens isolated from community-acquired respiratory tract infection to commonly used antimicrobial agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 52, 229–246 Gary v. Doern, Ronald N. Jones, Michael A. Pfaller, Kari Kugler, and the Sentry Participants group (1999). Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis from Patients with Community-Acquired Respiratory Tract Infections: Antimicrobial Susceptibility Patterns from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (United States and Canada, 1997). Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43: 2, 385–389 J. D. Turnidge, J. M. Bell, and the SENTRY Western Pacific Plus Participants. Major Regional Variation in Haemophilus influenzae Resistance in the Western Pacific: Results from SENTRY Western Pacific Plus (WP+) 1998-2000 Po-Ren Hsueh, Yung-Ching Liu, Jainn-Ming Shyr, Tsu-Lan Wu, Jing-Jou Yan, Jiunn-Jong Wu, Hsieh-Shong Leu, Yin-Ching Chuang, Yeu-Jen Lau, and Kwen-Tay Luh (2000). Multicenter Surveillance of Antimicrobial Resistance of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis in Taiwan during the 1998–1999 Respiratory Season. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 44:5, 1342–1345 NCCLS (2004). In Table 2E: Zone Diameter Interpretive Standars and Equivalent Minimal Inhibitory Concentration (MIC) breakpoints for Haemophilus spp. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. 52-54 Michael R. Jacobs and Saralee Bajaksouzian (1997). Evaluation of Haemophilus influenzaeIsolates with Elevated MICs to Amoxicillin/Clavulanic Acid. Diagn Microbiol Infect Dis 28, 105-112. Jane M. Gould, Gwendolyn J. Heidecker, and John J. LiPuma (1996). Nontypeable Haemophilus influenzaeSusceptibility: Effect of Inoculum Size and b-Lactamase Production. Diagn Microbiol Infect Dis 26, 95-98 Olarae Giger, Joel E. Mortensen, Richard B. Clark, and Alan Evangelista (1996). Comparison of Five Different Susceptibility Test Methods for Detecting Antimicrobial Agent Resistance Among Haemophilus influenzae Isolates. Diagn Microbiol Infect Dis 24, 145-153 Michael R. Jacobs, Saralee Bajaksouzian, Anne Windau, Peter C. Appelbaum, Gengrong Lin, David Felmingham, Christine Dencer, Laura Koeth, Mendel E. Singer, and Caryn E. Good (2002). Effects of Various Test Media on the Activities of 21 Antimicrobial Agents against Haemophilus influenzae. Journal Of Clinical Microbiology 40:9,. 3269–3276 David Felmingham, Reuben N. Gruneberg and the Alexander Project Group (2000). The Alexander Project 1996-97: Latest susceptibility from this international study of bacterial pathogens from community-acquired lower respiratory tract infections. Journal of Antimicrobial Therapy 45, 191-203 Susan E. Beekmann, Kris P. Heilmann, Sandra S. Richter, Juan Garc´ıa-de-Lomas, Gary V. Doern, The GRASP Study Group (2005). Antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis and group A b-haemolytic streptococci in 2002–2003. Results of the multinational GRASP Surveillance Program. International Journal of Antimicrobial Agents 25, 148–156 Okumura J; Wakai S; Umenai T(2002). Drug utilisation and self-medication in rural communities in Vietnam. Soc Sci Med. 54(12),1875-86 Scriver, S. R., Walmsley, S. L., Kau, C. L. et al. (1994). Determination of antimicrobial susceptibilities of Canadian isolates of Haemophilus influenzae and characterization of their beta-lactamases. Canadian Haemophilus Study Group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 1678–80. Daum RS, Murphey-Corb M, Shapira E, Dipp S. Epidemiology of Rob ß-lactamase among ampicillin-resistant Haemophilus influenzae isolates in the United States. J Infect Dis 1988;157:450-455. Scriver SR, Walmsley SL, Kau CL, et al. Determination of antimicrobial susceptibilities of Canadian isolates of Haemophilus influenzae and characterization of their ßlactamases. Antimicrob Agents Chemother 1994;38:1678-1680. Jacobs, M. R., Bajaksouzian, S., Zilles, A. et al. (1999). Susceptibilities of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae to 10 oral antimicrobial agents based on pharmacodynamic parameters: 1997 USA surveillance study. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43, 1901–8. Seki, H., Kasahara, Y., Ohta, K. et al. (1999). Increasing prevalence of ampicillin-resistant, non-beta-lactamase-producing strains of Haemophilus influenzae in children in Japan. Chemotherapy 45, 15–21. Ubukata, K., Shibasaki, Y., Yamamoto, K. et al. (2001). Association of amino acid substitutions in penicillin-binding protein 3 with betalactam resistance in beta-lactamase-negative ampicillin-resistant Haemophilus influenzae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45, 1693–9 Keiko Hasegawa, Naoko Chiba, Reiko Kobayashi, Somay Y. Murayama, Satoshi Iwata, Keisuke Sunakawa, and Kimiko Ubukata. Rapidly Increasing Prevalence of beta-Lactamase-Nonproducing, Ampicillin-Resistant Haemophilus influenzae Type b in Patients with Meningitis. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 48:5, 1509–1514 Markowitz, S. M. 1980. Isolation of an ampicillin-resistant, non-beta-lactamase-producing strain of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 17:80–83. 26. Mendelman, P. M., D. O. Chaffin, T. L. Stull, C. E. Rubens, K. D. Mack, and A. L. Smith. 1984. Characterization of non-beta-lactamase-mediated ampicillin resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 26:235–244. James A Karlowsky, Geetika Verma, George G. Zhanel, Daryl J Hoban (2000). Presence of ROB-1 beta-lactamase correlates with cefaclor resistance among recent isolates of Haemophilus influenzae. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 45, 871–875 Mihaela Peric, Bu¨lent Bozdogan, Michael R. Jacobs, and Peter C. Appelbaum (2003). Effects of an Efflux Mechanism and Ribosomal Mutations on Macrolide Susceptibility of Haemophilus influenzae Clinical Isolates. Antimicrobial Agents And Chemotherapy 47:3, 1017–1022 Mihaela Peric, Bu¨ lent Bozdogan, Chad Galderisi, Dan Krissinger, Terry Rager and Peter C. Appelbaum1 (2004). Inability of L22 ribosomal protein alteration to increase macrolide MICs in the absence of efflux mechanism in Haemophilus influenzae HMC-S. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 54, 393–400