Góp phần nghiên cứu sự tạo phức của methionine với nguyên tố vi lượng đồng (Cu)

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU SỰ TẠO PHỨC CỦA METHIONINE VỚI NGUYÊN TỐ VI LƯỢNG ĐỒNG (Cu) Nguyễn Hoàng Hà*, Nguyễn Thị Tuyết Trinh*, Ca Thị Thúy*, Nguyễn Thành Trung* TÓM TẮT Đồng có trong thành phần của enzim, nó đóng vai trò quan trọng trong nhiều chức năng sinh lý của con người và động vật. Đồng cần trong lĩnh vực phát triển và bảo vệ hệ tim mạch, xương, cấu tạo và chức năng của thần kinh trung ương và chức năng tạo hồng cầu bao gồm cả sự chuyển hóa sắt. Gần như tất cả ion đồng trong dịch và tế bào tồn tại dưới dạng liên kết với protein và ít hơn như là hợp chất phức với acid amin. Đề tài khảo sát sự tạo thành phức chất giữa đồng và methionine được thực hiện bằng phương pháp quang phổ tử ngoại – nhìn thấy và ứng dụng để định lượng methionine. SUMMARY RESEARCH COMPLEX – FORMATION OF METHIONINE WITH MICROELEMENT Cu Nguyen Hoang Ha, Nguyen Thi Tuyet Trinh, Ca Thi Thuy, Nguyen Thanh Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 9 * Supplement of No 1 * 2005: 1 - 5 Copper, as a component of numerous cuproenzymes, play a vital role in many physiologic function in man and animals. Copper is involved the development and mantenance of cardiovascular and skeletal integrity, centra nervous system structure and function, and erythropoietic function including iron metabolism. Nearly all the copper ions in fluids and cells exists in a protein- bound form and lesser extent, as complexes with amino acids. The study on the complex formation between copper and methionine was carried out by UV-VIS spectrophotometry method and its use for quantitative determination. TỔNG QUAN Methionine: (acid D,L-α-amino-γ-metyltiobutiric) H3C S CH2 CH2 CH NH2 C OH O hay R CH NH2 COOH Methionine là bột tinh thể màu trắng, có mùi đặc trưng, vị hơi ngọt, hơi khó tan trong nước. Methionine là một acid amin thiết yếu có trong thành phần của chế độ ăn và trong công thức của các chế phẩm đa acid amin để nuôi dưỡng. Methionine tăng cường tổng hợp gluthation và được sử dụng thay thế cho acetylcystein để điều trị ngộ độc paracetamol. Methionine sử dụng để chữa, phòng các bệnh và bị ngộ độc gan: sơ gan, bệnh gan do nhiễm arsenit, nhiễm cloroform, benzol và các hóa chất khác, bệnh nghiện rượu mãn tính. Methionine thể hiện công hiệu trong điều trị bệnh nhiễm mỡ gan. Ngoài ra, methionine sử dụng để trị bệnh loạn dưỡng do thiếu protit ở trẻ em và người lớn bị mắc bệnh lỵ và các bệnh nhiễm khuẩn mãn tính. Đối với bệnh sơ vữa động mạch, methionine làm giảm cholesteron và tăng phospholipit trong máu. * Khoa Khoa Học Cơ Bản, Đại Học Y Dược - TP.HCM Khoa Học Cơ Bản 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học Nguyên tố vi lượng đồng (Cu) Đồng rất cần thiết cho cơ thể, nhưng với hàm lượng rất nhỏ, dư đồng thường gặp hơn thiếu và rất nguy hiểm. Đồng là hợp phần cấu thành nhiều enzime kim loại. Đồng hoạt động như coenzime, chất dẫn truyền thần kinh của khả năng thức tỉnh và chú ý. Nó cũng là coenzime cần thiết cho quá trình tạo thành melamin sắc tố của da, đồng thời can thiệp vào hoạt động chuyển hóa mô liên kết cũng như tham gia vào chuỗi hô hấp. Đồng đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa sắt, thiếu đồng dẫn tới rối loạn chuyển hóa sắt và dẫn tới thiếu máu. Phức methionine với Cu2+ H3C S CH2 CH2 CH NH2 C O O Cu O O C H2N CH CH2 CH2 S CH3 [Cu(Meth)2] là phức chelat, trong đó ion Cu2+ đóng vai trò là chất tạo phức và methionine là các phối tử. Mỗi phân tử methionine sử dụng cả hai nhóm chức. Trường hợp thứ nhất nó liên kết với ion Cu2+ qua nitơ của nhóm amin theo cơ chế cho nhận, trường hợp thứ 2 nó liên kết qua oxy của nhóm carbonyl bởi liên kết cộng hóa trị thông thường. Ứng dụng của phức methionin-Cu2+ Phức methionin-Cu2+ góp phần giải thích sự vận chuyển của Cu2+ và methionin trong cơ thể người. Methionin là acid amin quan trọng do tính chất dược lý cũng như ứng dụng, những hiểu biết về phức methionin-Cu2+ góp phần làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của methionin cũng như của nguyên tố vi lượng. Phương pháp phổ UV-VIS Sơ đồ tổng quát của máy so màu Ion Cu2+ tạo phức màu xanh dương với hai phân tử methionin. Phức bền khoảng pH từ 2,0-3,0, có λmax ở 748nm. Dựa vào các dữ kiện này ta tính được lượng methionin có trong chế phẩm. Phương pháp Pope-stevens Nguyên lý Ở môi trường dung dịch đệm borat hoặc phosphat, các acid amin kết hợp với muối đồng thành một phức chất “acid amin-đồng” hòa tan theo phản ứng: R CH COOH NH2 + Cu2+ RCH HOOC H2N CH NH2 C O O Cu O O C H2N CH RR+ Nguồn sáng hν Đơn sắc Cuvet đựng mẫu hν Khuyếchđại Phát hiện tín hiệu Thu bức xạ hν Chuyên đề Khoa Học Cơ Bản và Y Tế Công Cộng 2 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Định lượng Cu2+ trong phức chất theo phương pháp định lượng bằng iod gián tiếp: 2Cu2+ + 4KI 2CuI + I2 I2 + 2Na2S2O3 Na2S4O6 + 2NaI Từ đó tính ra hàm lượng nitơ acid amin trong mẫu thử. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Quét bước sóng để tìm bước sóng cực đại (λmax) của phức methionin-Cu2+ Chuẩn bị dung dịch phức methionin (0,08M) – Cu2+ (0,04M). Tiến hành quét bước sóng từ 1100- 190nm, thu được λmax = 748nm. Khảo sát sự thay đổi nồng độ methionin tham gia phản ứng Chúng tôi giữ nồng độ Cu2+ không đổi, tăng dần nồng độ methionin. Sau đó đo độ hấp thu của phức chất. Kết quả thu được như sau: 1 2 3 4 5 6 [Cu2+] (M) 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 [Methionin] (M) 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 Độ hấp thu (A) 0,639 0,813 0,940 0,997 0,972 0,867 Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 0 0.05 0.1 0 [Methionine] .15 Từ những kết quả trên, chúng tôi kết luận, khi tăng tỉ lệ nồng độ methionin tham gia phản ứng thì có sự tăng độ hấp thu của phức, đồng thời có sự dịch chuyển cực đại hấp thu về bước sóng ngắn hơn và có sự tăng cường độ màu của phức tạo thành. Điều này cho thấy phản ứng tạo phức đã xảy ra. Và khoảng nồng độ tuyến tính ứng với [methionin]: 0,01-0,08M Khảo sát thời gian tạo phức bền Pha dung dịch phức với nồng độ Cu2+ (0,04M)- methionin (0,08M). Đo độ hấp thu của phức theo thời gian tạo phức ta được kết quả sau: Đo liền Sau 10 phút Sau 20 phút Sau 30 phút 1,043 1,016 0,934 0,748 Với kết quả trên ta thấy nên đo liền mẫu sau khi pha xong để đạt được độ hấp thu tối ưu. Xác định gần đúng hằng số bền của phản ứng tạo phức methionin-Cu2+ (0,08M – 0,04M) bằng phương pháp đo quang phổ hấp thu UV-VIS. [Methionin] ]Methionin[ 1 Abs phức phứcAbs]Cu.[AbsCu ]Cu[ 22 2 −++ + 0,02 50 0,650 - 0,0669 0,03 33,33 0,707 - 0,0588 0,04 25 0,770 - 0,0541 0,06 16,66 0,880 - 0,0471 0,08 12,5 0,980 - 0,0426 [Cu2+] = 0,04M; Abs Cu2+ = 0,517; b = -3,937; tgα = -0,0006; β = 6,56.103 Khoa Học Cơ Bản 3 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Nghiên cứu Y học -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0 0 20 40 X Y 60 Với X: ]Methionin[ 1 Y: phứcAbs]Cu.[AbsCu ]Cu[ 22 2 −++ + Xác định methionin trong dược phẩm dạng viên nang. Xác định theo phương pháp quang phổ UV-VIS Lập đồ thị chuẩn Cho vào 5 bình định mức 10 ml chính xác 1 ml dung dịch Cu2+ 0,2M. Thêm chính xác vào các bình lần lượt các thể tích: 1; 1,5; 2; 3; 4 ml dung dịch methionin 0,2M. Rồi thêm nước cất 2 lần đến vạch mức, lắc đều. Đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn này trong cuvet 1 cm. Kết quả thu được như sau: Số thứ tự 1 2 3 4 5 [Methionin] (M) 0,02 0,03 0,04 0,06 0,08 Abs 0,650 0,707 0,770 0,880 0,980 Đồ thị đường chuẩn: phương trình tuyến tính y = 5,5207x + 0,5434; R2 = 0.9985 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1Methionin (M) Đ ộ ha áp th u (A ) α Chuẩn bị mẫu Cân chính xác 20 viên nang methionin 250 mg (sản xuất tại: công ty cổ phần hóa – dựoc phẩm MEKOPHAR, số lô sản xuất: 0070904), tính ra khối lượng trung bình của mỗi viên 0,3086 g. Trộn đều, nghiền mịn. Cân chính xác 0,4992 g đem hòa tan trong nước cất hai lần đun nóng và định mức đến 50 ml bằng nước cất hai lần. Để yên 30 phút, lọc qua giấy lọc khô và hứng dung dịch lọc vào 1 bình khô khác. Thu được dung dịch mẫu. Cách tiến hành: Chuẩn bị 3 bình định mức 10 ml, thêm vào mỗi bình 1 ml dung dịch Cu2+ 0,2M và 8 ml dung dịch mẫu. Định mức bằng nước cất 2 lần đến vạch. Kết quả thu được như sau: Bình 1 Bình 2 Bình 3 [Cu2+] (M) 0,02 0,02 0,02 V dung dịch mẫu (ml) 8 8 8 Độ hấp thu (Abs) 0,773 0,774 0,772 Độ hấp thu trung bình 0,773 Dựa vào đồ thị chuẩn tính ra hàm lượng methionin có trong 1 viên nang là: m = 245 14 mg. ± Xác định bằng phương pháp Pope – Stevens Chuẩn bị dung dịch - Dung dịch thymolphatalein 0,25% trong cồn. - Hỗn dịch đồng photphat gồm 3 dung dịch, khi dùng pha với nhau: Chuyên đề Khoa Học Cơ Bản và Y Tế Công Cộng 4 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 9 * Phụ bản của Số 1 * 2005 Dung dịch A: - CuCl2.2H2O 27,3g; nước cất vừa đủ 1000 ml Dung dịch B: - Na2HPO4.12H2O 64,5 g; NaOH 7,2 g; nước cất vừa đủ 2000 ml. Dung dịch C: - Na2HPO4.12H2O 64,5 g; nước cất vừa đủ 1000 ml. Dung dịch treo đồng photphat gồm: Dung dịch A: 1 thể tích Dung dịch B: 1 thể tích Dung dịch C: 4 thể tích Lắc đều. Dung dịch treo này cần chuẩn bị 2, 3 ngày khi dùng. - Acid acetic đậm đặc - Kali iodur tinh thể - Dung dịch NaOH 1N - Dung dịch Na2S2O3 0,01N - Dung dịch hồ tinh bột 1% trong nước. Cách tiến hành Cho vào bình định mức 100 ml: chất thử 5 ml, thymolphtalein: 4 giọt. Nhỏ từng giọt NaOH 1N cho đến khi có màu xanh nhạt. Cho 30 ml dung dịch treo đồng photphat và thêm nước cất vừa đủ 100 ml (lượng đồng photphat phải chắc chắn thừa đối với lượng acid amin). Lắc kỹ, để yên 5 phút, lọc qua giấy lọc khô. Cho vào bình nón dung tích 100 ml: dịch lọc 40 ml, acid acetic đậm đặc 2 ml, KI tinh thể 2 g. Chuẩn độ iod được giải phóng ra bằng Na2S2O3 0,01N cho đến vàng nhạt cho thêm 1 ml hồ tinh bột và tiếp tục chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,01N cho đến mất màu hoàn toàn. Làm song song một mẫu trắng, trong đó 400 ml nước cất 2 lần thay cho 40 ml dịch lọc. Tính kết quả 322 OSNa V (ml) Vtb Mẫu 1 3,30 3,20 3,30 3,267 Mẫu 2 3,10 3,20 3,20 3,167 Mẫu 3 3,40 3,30 3,30 3,333 Hàm lượng nitơ acid amin trong 1000 ml chất thử nitơ acid amin (g/l) m = 0,00028(N – n) 1V 100 . 2V 1000 Với: N: số mol Na2S2O3 0,01N sử dụng để định lượng mẫu thử. n: số mol Na2S2O3 0,01N sử dụng để định lượng mẫu trắng. V1: số ml chất thử (ở đây là 10 ml) V2: số ml dịch lọc (ở đây 40 ml) Vậy hàm lượng methionin có trong viên nang methionin 250 mg: m = 240,2 4,4 (mg) ± KẾT LUẬN Sau một thời gian thực hiện đề tài chúng tôi đã thu được một số kết quả: - Đo được phổ của phức methionin với Cu2+ theo tỷ lệ nồng độ 2:1 có giá trị bước sóng cực đại khác với phổ riêng của methionin và ion Cu2+. - Độ hấp thu của phức methionin – đồng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của methionin. Vì vậy có thể sử dụng để xác định định lượng methionin trong các chế phẩm. - Xác định được lượng methionin có trong thuốc methionin bằng phổ UV-VIS và bằng phương pháp hóa học. Kết quả thu được có thể chấp nhận được theo tiêu chuẩn của dược điển Việt Nam, 2002, NXB Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Dược điển Việt Nam, NXB Hà Nội, 176 – 177, 2002 2. British Pharmacopoeia 2001 3. Dược thư quốc gia Việt Nam – Bộ y tế, 678, Hà Nội 2002 4. Jean – Paul Curtay Josette Lyon, Bách khoa toàn toàn thư về vitamin, muối khoáng và các nguyên tố vi lượng, NXB Y học, 271 (2001). 5. Osterberg R. J. Biol. Chem, 243 (1968). 6. Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận, Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, 141 (1975). Khoa Học Cơ Bản 5