Giải đoán cấu trúc của các sterol và triterpen cô lập từ lá bần ổi – sonneratia ovata

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 383 GIẢI ĐOÁN CẤU TRÚC CỦA CÁC STEROL VÀ TRITERPEN CÔ LẬP TỪ LÁ BẦN ỔI – SONNERATIA OVATA Nguyễn Thị Hoài Thu*, Nguyễn Kim Phi Phụng** TÓM TẮT Mở đầu: Cây Bần ổi cũng như các cây thuộc chi Bần được sử dụng trong dân gian để chữa hen suyễn, loét, bong gân, viêm gan và xuất huyết. Tuy nhiên các nghiên cứu về thành phần hóa học về Bần ổi chưa nhiều. Vì vậy, bài báo này tiếp tục công bố về các nghiên cứu hóa học trên lá Bần ổi. Mục đích: Khảo sát thành phần hóa học của cao ether dầu hỏa lá cây Bần ổi, Sonneratia ovata, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM. Phương pháp: Sử dụng phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng để cô lập các hợp chất hữu cơ, sau đó xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập bằng các phương pháp phổ nghiệm. Kết quả: đã cô lập và xác định cấu trúc của β–sitosterol (1), 3–O–palmitoyl–β–sitosterol (2), corosolic acid (3) và 3β–O–acetylursolic acid (4) từ cao ether dầu hỏa của lá Bần ổi. Kết luận: Lần đầu tiên ba hợp chất(2–4) được báo cáo có hiện diện trong lá Bần ổi. Nghiên cứu này, góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của cây Bần ổi nói riêng và chi Sonneratia nói chung. Từ khóa: Bần ổi, Sonneratia ovata, Sonneratiaceae, sterol, triterpen ABSTRACT STRUCTURE ELUCIDATION OF STEROLS AND TRITERPENS ISOLATED FROM LEAVES OF SONNERATIA OVATA Nguyen Thi Hoai Thu, Nguyen Kim Phi Phung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 383 – 388 Introduction: The Sonneratia ovata and other Sonneratia species have been used in folk medicine to treat different diseases such as asthma, febrifuge, ulcers, hepatitis, piles, sprain, and hemorrhages. However, the Sonneratia ovata has not much been chemically studied. Therefore, this paper reported the continuous study on chemical constituents of this species. Objectives: To investigate the chemical constituents from petroleum ether extract of leaves of Sonneratia ovata, growing in Can Gio mangrove forest in Ho Chi Minh City. Method: Using column chromatography on normal phase silica gel, preparative chromatography, and thin layer chromatography to isolate the organic compounds, and then determining the chemical structure of the isolated compounds by using spectroscopy methods. Results: Four compounds (β–sitosterol (1), 3–O–palmitoyl–β–sitosterol (2), corosolic acid (3) and 3β–O– acetylursolic acid (4)) were isolated and indentified the chemical structures from the petroleum ether extract of leaves of Sonneratia ovata. Conclusions: Three compounds (2–4) were reported for the first time in Sonneratia ovata species. Key words: Sonneratia ovata, Sonneratiaceae, sterol, triterpen * Đại học Y Dược TP. HCM ** ĐH Khoa Học Tự Nhiên-ĐHQG TP. HCM Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thị Hoài Thu ĐT: 0904203342 Email: hoaithudhyd@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Y tế Công cộng – Khoa học Cơ bản 384 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ lâu trái, vỏ và lá một số loài cây Bần – Sonneratia – được dùng trong dân gian để chữa hen suyễn, loét, bong gân, viêm gan và xuất huyết(1). Các khảo sát trước đây về dược tính cho thấy, polysaccharide thu được từ dịch trích lá cây Bần trắng S. alba có khả năng trị tiểu đường(4). Trái Bần vô cánh S. apetala, đặc biệt là hạt, giàu các hợp chất phenol, flavonoid, chất kháng oxid hóa, chất có khả năng trị tiểu đường và các hợp chất kháng khuẩn(3). Cao methanol của hạt Bần chua S. caseolaris có hoạt tính ức chế acetylcholinesterase với giá trị IC50 là 10,52 g/mL(10). Trái Bần ổi được sử dụng trong dân gian để chống xuất huyết(1). Các hợp chất (–)–(R)–nyasol, (–)–(R)–4’–O–metylnyasol và acid maslinic cô lập từ trái Bần ổi, cho thấy có khả năng gây độc trên dòng tế bào u thần kinh đệm (C–6) của chuột với giá trị IC50 lần lượt là 19,02; 20,21 và 31,77 μg/mL(11). Tuy nhiên, hiện nay mới có vài tài liệu công bố về việc nghiên cứu thành phần hóa học(5,6,7,11,12) của loài cây này. Bài báo này tiếp tục công bố việc cô lập và giải đoán cấu trúc hóa học của 4 hợp chất (bao gồm β–sitosterol (1), 3–O– palmitoyl–β–sitosterol (2), corosolic acid (3) và 3β–O–acetylursolic acid (4)) (Hình 1) từ cao ether dầu hỏa của lá cây Bần ổi mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết bị Phổ NMR được đo trên máy Bruker Avance III, 400 MHz đối với phổ 1H, 100 MHz đối với phổ 13C. Sắc kí lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng Silica gel 60 F254 hoặc Silica gel 60 RP–18 F254 (Merck) và hiện hình bằng acid sulfuric 30%, đun nóng bảng. Sắc kí cột trên Silica gel 60 (0.040 – 0.063 mm, Himedia). Đối tượng Lá Bần ổi Sonneratia ovata được thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM vào tháng 3/2010. Tên khoa học của cây được định danh bởi Tiến sỹ Võ Văn Chi. Mẫu cây (số US–B006) được lưu trữ trong quyển tiêu bản thực vật, tại bộ môn Hóa, Đại học Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia TP HCM. Phương pháp nghiên cứu Bột lá cây khô (10,9 kg) được ngâm dầm trong methanol (50L x 3) tại nhiệt độ phòng trong vòng 24h. Lọc phần dịch trích, cô quay thu hồi dung môi thu được cao methanol thô 1,5 kg. Trích lỏng – lỏng cao methanol thô với các dung môi lần lượt là ether dầu hỏa (60–80ᵒC), sau đó là ethyl acetate. Sau khi cô quay thu hồi dung môi, thu được cao ether dầu hỏa (245 g), cao ethyl acetate (390 g) và cao methanol (800 g). Cao ether dầu hỏa được thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường (cột: 120 x 6 cm), giải ly với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetate (9:1, 4:1, 1:1, 0:1) và sau đó giải ly tiếp với hệ ethyl acetate – methanol (9:1, 4:1, 1:1), thu được 9 phân đoạn từ E1 đến E9. Phân đoạn E2 (17,4 g) được thực hiện sắc ký cột silica gel pha thường (cột: 100 x 4,5 cm), giải ly với hệ dung môi ether dầu hỏa – cloroform (9:1, 4:1, 1:1, 1:0) thu được 3 phân đoạn E2.1–E.2.3). Tiếp tục thực hiện sắc ký cột trên phân đoạn E2.2 (3,4 g), giải ly với với hệ dung môi ether dầu hỏa – cloroform (9:1; 4:1; 1:1) thu được 1 (260,4 mg), 2 (10,1 mg), 3 (15,1 mg) và 4 (972,3 mg). KẾT QUẢ Từ cao ether dầu hỏa của lá Bần ổi, 4 hợp chất được cô lập. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định dựa trên các phân tích phổ NMR một chiều và hai chiều, cũng như so sánh các dữ liệu phổ của các chất khảo sát với các công bố trước đó trong tài liệu tham khảo. Cấu trúc hóa học của 4 hợp chất được xác định là β– sitosterol (1), 3–O–palmitoyl–β–sitosterol (2), corosolic acid (3) và 3β–O–acetylursolic acid (4). Các hợp chất này thu được ở dạng rắn, màu trắng. Phổ 1H và 13C–NMR của các hợp chất được trình bày trong bảng 1. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 385 Hình 1. Cấu trúc hóa học của các chất cô lập từ cao ether dầu hỏa của lá Bần ổi. BÀN LUẬN Hợp chất 1 thu được từ cao ether dầu hỏa với dạng hình kim màu trắng. Phổ 1H–NMR của 1 cho thấy có tín hiệu proton olefin tại δH 5,35 (=CH–, H–6) và tín hiệu proton carbinol tại δH 3,52 (>CH–O, H–3). Phổ 13C–NMR của 1 có tín hiệu của 29 carbon, bao gồm 2 tín hiệu carbon tại δC 141,0 và 121,8 của nối đôi (>C=CH–), một tín hiệu carbon oxymethine tại δC 72,0 của C–3 đặc trưng cho –sitosterol. So sánh dữ liệu phổ NMR của 1 với –sitosterol cho thấy có sự tương hợp, vì vậy 1 được đề nghị có cấu trúc là – sitosterol(8). –Sitosterol là sterol thường gặp trong thực vật, nó có nhiều hoạt tính sinh học, bao gồm chống đột biến gen, kháng viêm, chữa ho, gây độc một số dòng tế bào ung thư P388 (ED50 = 15,87 μg/mL), A549 (ED50 > 50 μg/mL) và HT29 (ED50 > 50 μg/mL)(13). So sánh dữ liệu NMR của 2 với 1 cho thấy 2 cũng có cấu trúc của β–sitosterol. Tuy nhiên, 2 có thêm một nhóm alcyl của acid béo dây dài, mạch thẳng. Điều này được xác định dựa trên phổ proton của 2 còn có thêm tín hiệu proton tại δH 2,26 (t, 7,5 Hz, H–2’) là proton của nhóm methylen (H–2’) kề bên nhóm >C=O, nhiều tín hiệu proton methylen xuất hiện ở vùng trường cao δH 1,16–1,33 của dây béo dài và tín hiệu proton mũi ba tại δH 0,88 (3H, t, 7,5 Hz) của nhóm methyl đầu mạch. Bên cạnh đó, phổ 13C– NMR của 2 cũng cho thấy 1 tín hiệu carbon tại δC 173,4 của nhóm –COO–, nhiều tín hiệu carbon tại δC 29,3–29,9 của các nhóm methylen và tín hiệu tại 14,2 của nhóm methyl. Khối phổ phân giải cao cho mũi ion phân tử giả tại m/z 675,6079 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết của C45H80O2+Na là 675,6056). Từ những phân tích trên, kết hợp với so sánh dữ liệu NMR của 2 với tài liệu tham khảo(8), 2 được xác định là 3–O– palmitoyl–β–sitosterol. Phổ 1H và 13C–NMR của 3 cho thấy hợp chất có 30 carbon, trong đó có tín hiệu carbon tại δC 178,2 của nhóm chức acid, cặp tín hiệu đặc trưng của nối đôi C=C trong khung ursan–12–en tại δC 138,2 (C–13) và 124,4 (C–12), tương ứng với tín hiệu proton tại δH 5,14 ppm (1H, brs, H–12). Ngoài ra, phổ proton còn có 2 tín hiệu proton methyl mũi đôi và 5 tín hiệu proton methyl mũi đơn ở vùng trường cao từ δH 1,04–0,70 ppm trong khung ursan. Dự đoán hợp chất 3 là loại hợp chất acid triterpen có khung ursan–12–en. Phổ 13C–NMR của 3 còn cho thấy 2 tín hiệu carbon oxymethine tại δC 67,1 và 82,2. Điều này phù hợp với phổ proton của 3 có hai tín hiệu proton carbinol tại δH 3,42 (1H, m, H–2) và 2,75 (1H, d, 9,2 Hz, H–3). Hằng số ghép lớn 9,2 Hz của proton H–2 và H–3 giúp xác định vị trí 2β– và 3α của hai proton này. Từ những dữ kiện trên, kết hợp với việc so sánh dữ liệu phổ NMR của 3 với tài liệu tham khảo(9) cho thấy có sự tương hợp, cấu trúc của hợp chất 3 được xác định là 2α,3β–dihydroxyurs–12–ene–28–oic acid hay corosolic acid. Nhiều thử nghiệm cho thấy, corosolic acid có khả năng hạ đường huyết, kháng viêm, ức chế protein kinase C(9). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Y tế Công cộng – Khoa học Cơ bản 386 Bảng 1. Dữ liệu phổ của các chất (1) đến (4) STT 1c 2c 3d 4c–m δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC 1 37,5 37,2 47,0 38,4 2 31,9 22,8 3,42 m 67,1 28,6 3 3,52 m 72,0 4,62 m 73,9 2,75 d (9,2) 82,2 4,46 dd (11,0; 5,0) 82,3 4 42,5 38,4 * 37,7 5 141,0 140,0 54,7 56,3 6 5,35 m 121,8 5,38 m 122,7 18,0 19,0 7 32,1 32,1 32,6 33,8 8 32,1 32,1 * 39,9 9 50,4 50,3 47,0 42,9 10 37,5 36,8 37,5 37,7 11 21,3 21,2 22,9 21,5 12 40,0 40,0 5,14 brs 124,4 5,22 m 126,3 13 42,5 42,6 138,2 139,2 14 57,0 56,9 41,7 40,0 15 24,5 24,5 27,5 25,0 16 28,4 28,4 23,8 24,3 17 56,3 56,3 46,8 40,4 18 1,00 s 19,2 1,02 s 19,3 52,4 53,9 19 0,68 s 12,0 0,68 s 12,0 38,5 39,2 20 36,3 36,3 38,4 39,9 21 0,92 d (6,5) 19,0 0,93 d (6,5) 19,0 30,2 31,5 22 34,1 34,2 36,3 37,7 23 26,0 26,5 0,92 s 28,8 0,87 s 28,9 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 387 STT 1c 2c 3d 4c–m δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC δH; J (Hz) δC 24 46,1 46,1 0,74 s 17,1 0,87 s 17,1 25 29,4 29,5 0,70 s 16,9 0,83 s 16,0 26 0,82 d (7,0) 19,9 0,82 d (6,5) 20,0 0,92 s 16,9 0,96 s 17,5 27 0,84 d (6,5) 19,5 0,84 d (6,5) 19,5 1,04 s 23,2 1,10 s 24,1 28 23,3 23,3 178,2 181,3 29 0,84 t (7,5) 12,1 0,85 t (7,5) 12,2 0,82 d (6,4) 16,4 0,86 d (6,0) 17,5 30 0,92 d (6,4) 21,0 0,95 d (6.0) 21,3 1' 173,4 172,7 2' 2,26 t (7,5) 34,9 2,03 s 24,3 3' 1,59 m 25,3 4'–13' 1,16–1,33 m 29,3–29,9 14' 1,16–1,33 m 32,1 15' 1,16–1,33 m 22,8 16' 0,88 t (7,5) 14,2 Ghi chú: Độ dịch chuyển hóa học (δ), đơn vị là ppm. Hằng số ghép (J) được viết trong dấu ( ), đơn vị là Hz c: CDCl3 d: DMSO–d6 m: CD3OD *: Các tín hiệu bị che bởi dung môi Phân tích dữ liệu phổ NMR của 4 cho thấy, 4 cũng có các tín hiệu của acid triterpen khung ursan–12–en như hợp chất 3, bao gồm tín hiệu proton olefin tại δH 5,22 (1H, m, H–12), 2 tín hiệu proton methyl mũi đôi và 5 tín hiệu proton methyl mũi đơn cộng hưởng trong vùng trường cao từ 1,10–0,86 ppm trên phổ 1H–NMR; cũng như phổ 13C–NMR có tín hiệu carbon của nhóm carboxyl tại δC 181,3, tín hiệu của carbon olefin tại δC 139,2 (C–13) và 126,3 (C–12). Tuy nhiên, so với 3, hợp chất 4 có ít hơn 1 tín hiệu proton carbinol và 1 tín hiệu carbon carbinol, chứng tỏ 4 chỉ có một nhóm hydroxyl tại C–3. Ngoài ra, phổ NMR của 4 còn cho thấy có sự hiện diện của một nhóm acetyl. Điều này được chứng minh bởi tín hiệu proton tại δH 2,03 (3H, s, H–2') của nhóm methyl gắn vào nhóm carbonyl, tương ứng với phổ 13C–NMR có thêm hai tín hiệu carbon tại δC 172,7 (C–1') và 24,3 (C–2'). So sánh dữ liệu phổ NMR của 4 với tài liệu tham khảo(2) cho thấy có sự tương hợp, cấu trúc của 4 được đề nghị là 3β–O–acetylursolic acid. KẾT LUẬN Từ cao ether dầu hỏa của lá cây Bần ổi, 4 hợp chất bao gồm β–sitosterol (1), 3–O–palmitoyl–β– sitosterol (2), corosolic acid (3) và 3β–O– acetylursolic acid (4) đã được cô lập. Ngoại trừ hợp chất (1), cả 3 hợp chất còn lại lần tiên được báo cáo có hiện diện trong cây Bần ổi. Các nghiên cứu tiếp theo trên loài cây này vẫn đang được tiếp tục. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bandaranayake WM (2002). Bioactivities, bioactive compounds and chemical constituents of mangrove plants. Wetl. Ecol. Manag., 10: 421–452. 2. Gnoatto SCB, Dassonville–Klimpt A, Nascimento SD, Gale P, Boumediene K, Gosmann G, Sonnet P, Moslemi S (2008). Evaluation of ursolic acid isolated from Ilex paraguariensis and derivatives on aromatase inhibition. Eur. J. Med. Chem., 43: 1865– 1877. 3. Hossain SJ, Basar MH, Rokeya B, Arif KMT, Sultana MS & Rahman MH (2013). Evaluation of antioxidant, antidiabetic and antibacterial activities of the fruit of Sonneratia apetala (Buch.– Ham.). Orient. Pharm. Exp. Med., 13: 95–102. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Y tế Công cộng – Khoa học Cơ bản 388 4. Morada NJ, Metillo EB, Uy MM and Oclarit JM (2011). Anti– diabetic polysaccharide from mangrove plant. International Conference on Asia Agriculture and Animal, IPCBEE, 13: 197– 200. 5. Nguyen THT, Poul EH, Nguyen KPP (2014). Thành phần hóa học của cao etyl acetat của lá Bần ổi Sonneratia ovata, mọc ở rừng ngập mặn Cần Giờ TP HCM. Tạp chí Y học TP HCM, 18 (1): 217– 221. 6. Nguyen THT, Pham NKT, Khanitha P, Poul EH, Nguyen KPP (2014). Structure elucidation of four new megastigmanes from Sonneratia ovata Backer (Lythraceae). Magn. Reson. Chem., 52: 795–802. 7. Nguyen THT, Ca TT, Nguyen KPP (2017). Các hợp chất lignan cô lập từ cao ethyl acetate của lá Bần ổi Sonneratia ovata. Tạp chí Y học TP HCM, 21(1): 1–6. 8. Tian M, Dai H, Li X, Wang B (2009). Chemical constituents of marine medicinal mangrove plant Sonneratia caseolaris. Chin. J. Oceanol. Limnol., 27(2): 288–296. 9. Wen X, Sun H, Liu J, Wu G, Zhang L, Wu X, Ni P (2005). Pentacyclic triterpenes. Part 1: The first examples of naturally occurring pentacyclic triterpenes as a new class of inhibitors of glycogen phosphorylases. Bioorg. Med. Chem. Lett., 15: 4944– 4948. 10. Wetwitayaklung P, Limmatvapirat C, Phaechamud (2013). Antioxidant and anticholinesterase activities in various parts of Sonneratia caseolaris (L.). Indian J. Pharm. Sci., 75: 649. 11. Wu SB, Wen Y, Li XW, Zhao Y, Zhao Z, Hu JF (2009). Chemical constituents from the fruits of Sonneratia caseolaris and Sonneratia ovata (Sonneratiaceae). Biochem. Syst. Ecol., 37: 1–5. 12. Zheng and Pei (2008). Chemical constituents from Sonneratia ovata. J. Shenyang Pharm. Univ., 25(1): 35–38. 13. Zhou J, Xie G, Yan X (2011). Encyclopedia of traditional Chinese medicines, molecular structures, pharmacological activities, natural sources and applications. Springer Heidelberg Dordrecht London New York, 4: 561. Ngày nhận bài báo: 08/11/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 12/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018