Gia tăng Mek-Mapk trong ung thư tế bào gan: Vai trò trong diễn tiến của khối u và apoptosis

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học 11 GIA TĂNG MEK-MAPK TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN: VAI TRÒ TRONG DIỄN TIẾN CỦA KHỐI U VÀ APOPTOSIS Nguyễn Thanh Hùng1, Nguyễn Thị Thanh Tuyền1, Chow Pierce2,5, Tan Puay Hoon3, Soo Khee Chee4,2, Tran Evelyne1, Quách Thanh Hưng1, Văn Tần6 and Huỳnh Hùng1 TÓM TẮT Ung thư tế bào gan là một trong những bệnh lý ác tính thường gặp. Mặc dù hoạt hóa hệ thống tín hiệu qua MEK-MAPK dẫn đến tăng trưởng tế bào, vai trò của MEK-MAPK trong ung thư gan chưa được hiểu rõ. Trong nghiên cứu này chúng tôi phát hiện protein MEK1/2 được họat hóa trong 100% trường hợp ung thư gan. MAPK và dạng họat tính của nó (pMAPK) gia tăng trong 91% và 69% trường hợp. Địều trị các dòng tế bào ung thư gan với chất ức chế MEK1/2 (UO-126) dẫn đến sự giảm tăng sinh và chết tế bào theo chương trình (apoptosis). Chuyển nạp gen MEK1 vào các tế bào này gây ra hiện tượng kháng thuốc UO-126 và tăng trưởng khối u nhanh hơn trong in vivo. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy MEK-MAPK đóng vai trò quan trọng trong sự sống và tăng trưởng của tế bào ung thư gan, ức chế họat tính MEK-MAPK có thể là hướng điều trị mới cho ung thư gan. SUMMARY OVER –EXPRESSION OF MEK-MAPK IN HCC: ITS ROLE IN TUMOR PROGRESSION AND APOPTOSIS Nguyen Thanh Hung, Nguyen Thi Thanh Tuyen, Chow Pierce, Tan Puay Hoon, Soo Khee Chee, Tran Evelyne, Quach Thanh Hưng, Van Tan and Huynh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 8 * Supplement of No 1 * 2004: 81 – 88 Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies in South East Asia. Although activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase (MEK)-MAPK is often associated with cellular growth, the role of MEK-MAPK in growth and survival of hepatocarcinoma cells has not been established. Methods: Immuno-histochemistry was used to localize phosphorylated MAPK and MEK1/2 in the tissues. 3- (4, 5-Dimethylthiazol-2-y1)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay and ELISA were used to determine cell viability and cell proliferation. Deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling (TUNEL) assay was used to detect apoptotic cells. Western blots analysis was performed to determine the levels of proteins involved in the MEK-MAPK and apoptotic pathways. Transfection study was performed to assess the role of MEK-MAPK pathway in growth and survival of liver cancer cells. Conclusion: In conclusion, our results demonstrate that MEK-MAPK plays an important role in the growth and survival of liver cancer cells and suggest that blocking MEK-MAPK activity may represent an alternative approach for the treatment of liver cancer. 1Laboratory of Molecular Endocrinology, 1Division of Cellular and Molecular Research, 2National Cancer Centre of Singapore, 4Department of General Surgery, 3Department of Pathology, 5Department of Experimental Surgery, Singapore General Hospital, Singapore 169610, 6Binh Dan Hospital, HoChiMinh City, Vietnam. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 81 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tế bào gan là một trong những bệnh lý ác tính thường gặp nhất ở Đông Nam Á. Tần xuất mới phát hiện hàng năm khoảng 250 ngàn đến 1, 2 triệu trường hợp. Bệnh thường phối hợp với nhiễm virus gây viêm gan siêu vi B, C và Aflatoxin B11, 2. Điều trị chủ yếu là phẫu thuật, tuy nhiên phần lớn bệnh nhân được chẩn đóan ở giai đọạn trể, không thể phẫu thuật được. Kết quả điều trị thường rất hạn chế, tỉ lệ sống 5 năm sau phẫu thuật 15-39%3-5. Hiện chưa có điều trị hổ trợ nào cho thấy kéo dài thời gian sống của bệnh nhân ung thư gan6. Nhiều nghiên cứu cho thấy ung thư gan có thể là hậu quả của sự bất họat các gen ức chế khối u ( như p53, retinoblastoma, p21WAF1/CÍP, p16INK4A, p27Kip1, IGFBP-3, ), sự họat hóa các gen gây ung thư (như Ras, c-myc, c-fos, c-jun, MDM-2, ) và sự gia tăng quá mức các yếu tố gây tăng sinh khối u (như TGF-α, HGF, IGF-2, FGF, ) 7. Cơ chế phân tử đóng vai trò trung gian cho tác động của các chất gây ung thư và các yếu tố gây tăng sinh khối u là đường truyền tín hiệu qua MEK-MAPK 8, 9. MEK-1 đã được phát hiện gia tăng trong các dòng tế bào ung thư và sự họat hóa của nó cần thiết cho sự sống còn và di căn của các tế bào này 9. Cho đến nay MAPK được coi là đích tác dụng duy nhất của MEK và sự họat hóa của nó ảnh hưởng đến sự sống sót, tăng sinh và biệt hóa của tế bào ung thư (5537}. MAPK điều hòa họat tính của nhiều chất nền khác nhau, trong đó có các yếu tố sao mã (như Elk-1, c-myc, ATF2, c-jun, c-fos, ...) và liên quan trong các quá trình vận chuyển qua nhân tế bào, sắp xếp bộ nhiễm sắc thể và bộ xương tế bào10. Tính chọn lọc cùng với khả năng duy nhất gây họat hóa MAPK cho thấy MEK là đích tác dụng quan trọng cho hóa trị các bệnh ung thư 11, 12(4083}. Ở đây chúng tôi phát hiện sự gia tăng MEK1/2 và MAPK trong các mẩu mô ung thư gan. Do đó cần thiết xem xét vai trò của cơ chế phân tử này cũng như những ứng dụng có thể cho điều ung thư gan. PHƯƠNG PHÁP VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Mẩu bệnh Phân tích hóa miễn dịch mô học và Western blot Mẩu bệnh ung thư gan và mô lành kế cận được thu thậptrong lúc phẫu thuật từ 46 bệnh nhân ung thư gan được điều trị tại Singapore General Hospital. Chẩn đóan ung thư gan được khẳng định bằng giải phẫu bệnh. Phân lọai giai đọan khối u dựa theo hệ thống TNM. Đánh giá mức độ MEK1/2, MAPK và dạng họat tính của nó pMEK1/2, pMAPK bằng Western Blot và phương pháp hóa miễn dịch mô. Kết quả Hình 1 cho thấy MAPK và pMAPK được phát hiện trong khối u lẫn mô lanh kế cận. Tuy nhiên, qua phân tích định lượng MAPK gia tăng 1, 6 lần trong khối u hơn ở mô lành trong 91% trường hợp (42/46). 69% (32/46) biểu hiện gia tăng pMAPK và tỉ lệ pMAPK/MAPK cao hơn đáng kể (p<0, 01) trong mô ung thư so với mô lành (xác định bởi ANOVA test). Hình 1 100% (46/46) trường hợp mô ung thư cho thấy Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 82 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học dạng phospho hóa của MEK1/2, trong khi đó rất ít được phát hiện ở mô lành (hình 2 A, B, C). pMEK1/2 cao hơn 7 lần ở mô ung thư so với mô lành (hình 2D). Hóa miễn dịch mô sử dụng kháng thể đặc hiệu với pMEK1/2 cho thấy hàm lượng pMEK1/2 rất nhiều trong nhân tế bào gan ung thư, trong khi không phát hiện được ở tế bào gan bình thường (hinh 3A, B). Bảng 1 cho thấy phân tích tóm tắt của pMEK1/2. Tỉ lệ phần trăm cho thấy dương tính với pMEK1/2 có vẻ gia tăng cùng với giai đọan tiến triển của khối u. Trong khi đó, với cùng mẩu mô, hóa miễn dịch mô cho thấy pMAPK dương tính mạnh ở tế bào ung thư và rất yếu ở tế bào gan bình thường (hình 3C, D). Hình 2 Hình 3 Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 83 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Bảng 1. Phân tích hóa miễn dịch mô của MEK1/2 và dạng phospho hóa của nó tại serine 217/221 (pMEK1/2) trong các mẩu bệnh. Khối u (n=46) Gen Mô lành kế cận Giai đoạn MEK1/2 46/46 (100%) I II III IV n=4 n=25 n=11 n=6 4/4 (100%) 25/25 (100%) 11/11 (100%) 6/6 (100%) Phosphorylated MEK1/2 (pMEK1/2) 0/0 Điểm (% tế bào dương tính) 0% 1 (<1) 0 2/4 (50%) 20/25 (80%) 4/11 (36, 36%) 1/6 (16, 67%) 2 (1-5) 0 4/25 (16%) 4/11 (36, 36%) 3 (5-10) 0 1/4 (25%) 1/25 (4%) 1/11 (9, 09%) 3/6 (50%) 4 (>10) 0 1/4 (25%) 2/11 (18, 19%) 2/6 (33, 33%) Hình 4 Hóa trị tế dòng tế bào ung thư gan với thuốc ức chế MEK1/2 Hình 5 Hóa miễn dịch mô và Western Blot cho thấy sự liên kết chặt chẽ giữa ung thư gan và họat hóa tín hiệu qua MEK-MAPK. Các nghiên cứu trước đó cũng cho thấy sự họat hóa MEK-MAPK đóng vai trò quyết định trong sự tăng sinh của tế bào và apoptosis. Do đó để làm rõ vai trò của sự họat hóa MEK1/2 trong ung thư gan, chúng tôi tiến hành điều trị dòng tế bào ung thư gan HepG2 với 2 thuốc ức chế chọn lọc cao MEK1/2: UO-126 và PD98059. Để so sánh với các cơ chế phân tử chủ yếu khác đã được chứng minh đóng vai trò quan trọng trong quá trình bệnh sinh ung thư, HepG2 cũng được điều trị với SB203580 (ức chế đường tín hiệu qua p38 MAPK), SP600125 (ức chế đường tín hiệu qua JNK) và L294002 (ức chế đường tín hiệu qua PI-3K). KẾT QUẢ Xét nghiệm MTT (colorimetric microtiter assay) cho thấy UO-126 và PD98059 gây chết tế bào HepG2, trong khi đó SB203580, SP600125 và LY294002 có rất ít tác dụng lên sự sống còn của các tế bào này (hình 4A, B). Kết quả tương tự cũng đạt được khi hóa trị dòng tế bào ung thư gan khác Hep3B. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 84 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học Hình 6 HepG2 sau đó được điều trị với UO-126 hoặc PD98059 với nồng độ và thời gian khác nhau. Khả năng tăng trưởng và sống sót được đánh giá bằng MTT và xét nghiệm gắn kết BrdU. Kết quả cho thấy UO-126 ức chế tế bào HepG2 theo kiểu phụ thuộc liều và xảy ra sớm trong vòng 24 giờ. Với nồng độ khá thấp 4μM, UO-126 ức chế 50% khả năng sống và tăng trưởng của các tế bào này (hình 5). Ảnh hưởng của UO-126 trên khả năng sống và tăng trưởng xảy ra ở liều gây ra ức chế sự phospho hóa của MAPK (hình 8). Hình thái tế bào HepG2 được điều trị với UO-126 có đặc điểm điển hình của apoptosis: bào tương xẹp lại, màng tế vào vỡ (hình 6). Xét nghiệm TUNEL được thực hiện cho thấy những mãnh vỡ phân tử DNA điển hình của apoptosis (hình 7 và 8B). Do các báo cáo trước đó cho thấy cytochrome c đóng vai trò chính điều hòa apoptosis, chúng tôi tiến hành xem xét khả năng apoptosis do UO-126 gây phóng thích cytochrome c ra bào tương. Kết quả cho thấy thích cytochrome c ra bào tương. Kết quả cho thấy mức độ gia tăng rất cao của protein này (hình 4). Các khảo sát tiếp theo ho thấy sự gia tăng theo liều và thời gian của các chất gây ly giải protein và DNA đóng vai trò trung tâm gây ra hiện tượng apoptosis như cleaved caspase 3, cleaved caspase 7 và cleaved PARP (hình 8A). Hình 7 Trong khi đó, điều trị với SB203580, SP600125 và LỲ294002 không làm thay đổi đáng kể các protein này (hình 4A). Kết quả trên khẵng định hơn nữa MEK-MAPK chứ không phải p38, JNK hay PI-3K có tác động sống còn đối với tế bào ung thư gan. Họat hóa MEK1 ở các dòng tế bào ung thư gan Hình 8 Để xem xét khả năng họat hóa MEK1 phối hợp với sự tăng trưởng và sống còn của tế bào ung thư gan, chúng tôi tiến hành chuyển pUSE-MEK1 (Ha- Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 85 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Tagged rat MEK1 cDNA, plasmid DNA của MEK1) và pUSE (không có MEK1, để so sánh) vào tế bào HepG2. Kết quả kiểm tra protein Ha-MEK1 cho thấy quá trình chuyển gen thành công (hình 9B). Hàm lượng của MEK1 và pMAPK ở nhóm có chuyển gen cao hơn so với nhóm so sánh (hình 9D). Hình 9 Tuy nhiên quan sát cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về số lượng tế bào giữa 2 nhóm (hình 9E), kết quả này gợi ý rằng họat hóa MEK1 không ?”làm thay đổi tốc độ tăng trưởng của tế bào HepG2 trong in vitro. Các nhóm tế bào có và không có chuyển gen họat hóa MEK1 được điều trị với UO-126. Kết quả cho thấy các protein làm chất đánh dấu phát hiện apoptosis như cleaved caspase 3, cleaved caspase 7 và cleaved PARP biểu hiện tương tự dữ liệu trước đó ở nhóm so sánh (pUSE), trong khi không phát hiện được ở nhóm có chuyển gen (pUSE-MEK1) (hình 10). pUSE-12 pUSE-9 Hình 10 Điều này cho thấy họat hóa MEK-MAPK làm gia tăng đề kháng thuốc và hổ trợ cho sự sống còn củatế bào ung thư gan. Nghiên cứu in vivo (chuột SCID) cho thấy sự thành lập khối u sớm hơn và phát triển nhanh hơn ở dòng tế bào pUSE-MEK1 (hình 11). Sự khác biệt thể tích khối u giữa 2 nhóm có ý nghĩa thống kê (p<0, 01). Chỉ số tăng sinh tế bào (Ki67) cao hơn ở nhóm pUSE-MEK1 (p<0, 05) (hình 12A, B). Kết quả này cho thấy hoạt hóa MEK1 tăng cường khả năng sống và tăng sinh tế bào ung thư gan trong in vivo. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 60 65 70 80 85 90 Days (Post-injection) pUSE-9 pUSE-12 H-MEK1-15 H-MEK1-17 Hình 11 Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 86 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 Nghiên cứu Y học A B Hình 12 (Ki-67) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 9 12 15 17 K i-6 7 in de x in tu m ou r c el ls (p er 5 00 c el ls ) BÀN LUẬN Các nghiên cứu sinh hóa và di truyền phân tử cho thấy nhiều bằng chứng bất thường trong các cơ chế tín hiệu của các yếu tố tăng trưởng đóng vai trò quan trọng trong bệnh sinh ung thư gan. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy dạng hoạt hóa của MEK1/2 (pMEK1/2) trong 100% trường hợp ung thư gan (cả giai đoạn sớm và trể) và chỉ những tế bào ung thư cho thấy gia tăng protein này. Phân tích các mẩu bệnh ung thư gan cho thấy hàm lượng tăng lên của chất nền của nó, pMAPK, trong 91% khối u so với mô lành kế cận. Điều trị các dòng tế bào ung thư gan với chất ức chế MEK1/2 cho gây chết tế bào theo liều và thời gian. Dữ kiện của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu trước đó 13báo cáo PD98059 gây apoptosis ở tế bào HepG2. Hơn nữa, hoạt hóa gia tăng MEK1 làm tăng trưởng khối u nhanh hơn trong in vivo và làm cho tế bào HepG2 đề kháng với vớ apoptosis cho thấy sự cần thiết của hoạt hóa MEK-MAPK cho sự sống và tăng trưởng của tế bào ung thư gan. Trong nghiên cứu này, MEK-MAPK tập trung chủ yếu trong các nốt khối u, điều này có thể phản ánh cho cơ chế tín hiệu theo kiểu tự tiết và cận tiết. Hoạt hóa MEK-MAPK bởi các yếu tố tăng trưởng theo kiểu tự tiết và cận tiết có thể giúp tế bào ung thư sống sót trong trường hợp thiếu hụt dinh dưỡng và gia tăng bài tiết các chất gây tăng sinh mạch máu 14, 15. Trong in vivo, các yếu tố này kích thích tạo ra hệ thống mạch máu mới nuôi dưỡng khối u và đóng vai trò quan trọng cho sự tăng trưởng, sống sót, xâm nhập và di căn của tế bào ung thư gan. H-MEK1-15 H-MEK1-17 Nghiên cứu của chúng tôi nêu bật vai trò MEK- MAPK trong sự tăng trưởng khối u và sống sót của tế bào ung thư gan. Qua đó, ức chế MEK-MAPK có thể là tiếp cận mới cho điều trị bệnh nhân ung thư gan. CÁC CHỮ VIẾT TẮT MAPK:mitogen-activated protein kinase. pMAPK: phosphorylated mitogen-activated protein kinase. pUSE H-MEK-1 MEK: mitogen-activated protein kinase kinase. pMEK: phosphorylated mitogen-activated protein kinase kinase. JNK: c-jun N-terminal kinase. PI-3 K: phosphatidylinositol 3-kinase. PARP: poly ADP-ribose polymerase. MTT: 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyltetrazolium bromide. SCID: severe combined immune deficiency. TUNEL: Deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labelling. BrdU: BromodeoxyUridine. N:normal. T: tumour. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Hussain, S. A., et al, ann. oncol., 12: 161-172, 2001. 2. Ince, N. and, N. Engl. J Med, 340: 798-799, 1999. 3. Okuda, K. et al. Study of 850 patients. Cancer, 56: 918-928, 1985. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 87 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 8 * Phụ bản của Số 1 * 2004 4. Lai, E. C, et al Ann. Surg., 221: 291-298, 1995. 11. Dudley, D. Tet al Proc Natl Acad Sci U. S. A, 92: 7686-7689, 1995. 5. Takenaka, K., et al Arch. Surg., 131: 71-76, 1996. 12. Sebolt-Leopold, J. S, et al. Nat. Med, 5: 810-816, 1999. 6. Chan, E. S, et al Cochrane. Database. Syst. Rev., CD001199, 2000. 13. Mitsui, H., et al. Int. J Cancer, 92: 55-62, 2001. 7. Zeng, J. Z., et al. Oncogene, 21: 4932-4943, 2002. 14. Petit, A. M, et al. Am. J. Pathol., 151: 1523-1530, 1997. 8. Lewis, T. Set al. Adv. Cancer Res, 74: 49-139, 1998. 9. Ballif, B. A. et al. Cell Growth Differ., 12: 397-408, 2001. 10. Hoshino, Ret al. Oncogene, 18: 813-822, 1999. 15. Eliceiri, B. P, et al. J Cell Biol., 140: 1255-1263, 1998. Chuyên đề Hội nghị Khoa học Kỹ thuật BV. Bình Dân 2004 88