Gắn kết streptavidin lên hạt nano Fe3O4

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 1 GẮN KẾT STREPTAVIDIN LÊN HẠT NANO Fe3O4 Bùi Trung Thành*, Phạm Hùng Vân*, Trần Thị Kiều**, Trần Hồng Hải*** TĨM TẮT Mở đầu: Streptavidin (SA) cĩ giá thành thấp và cĩ khả năng liên kết đặc hiệu với biotin. Do đĩ, SA được nghiên cứu về khả năng gắn kết với các hạt nano Fe3O4. Qua đĩ, hạt nano cĩ thể gắn kết với kháng thể được biotin hĩa, được ứng dụng để làm giàu kháng nguyên đặc hiệu sẽ giúp chẩn đốn sớm. Mục tiêu: Tổng hợp hạt nano Fe3O4 để gắn kết SA và khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất gắn kết của SA với hạt nano. Đối tượng - Phương pháp: Hạt nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp solvothermal và được xử lý để hình thành cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO để gắn kết SA thơng qua liên kết cộng hĩa trị. Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), từ kế mẫu rung (VSM), giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD), phổ UV-Vis, ảnh hiển vi huỳnh quang và phương pháp Bradford tất cả được sử dụng để xác định hình dạng, kích thước, tính chất của các hạt nano và sự gắn kết của các hạt nano với SA. Kết quả: Tổng hợp được các hạt nano Fe3O4 cĩ kích thước 35 và 95 nm, hiệu suất gắn kết SA với các hạt nano ấy lần lượt là 75,57, 58,06 %. Và, độ pH phù hợp với cấu trúc này cĩ giá trị 7-8. Kết luận: Hạt nano Fe3O4 sau khi được chức năng hĩa đã gắn kết được với SA. Từ khĩa: Gắn kết, streptavidin, hạt nano Fe3O4. ABSTRACT IMMOBILIZATION OF STREPTAVIDIN ONTO THE MAGNETITE NANOPARTICLES Bui Trung Thanh, Pham Hung Van, Tran Thi Kieu, Tran Hoang Hai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 1 - 8 Background: Streptavidin (SA) has low cost and with the ability to conjugate of biotin. So, SA was used to study the ability to bind to the magnetite nanoparticles (MNPs). Thereby, the MNPs can bind with biotinylated antibodies, which can be applied to enrich the specific antigens for the early diagnosis. Objectives: To Synthesize the MNPs to bind to SA and to study the influence of some factors on the binding efficiency of the MNPs with SA. Methods: MNPs were synthesized by solvothermal method and treated to obtain the structure Fe3O4/SiO2/NH2/CHO to bind with SA by covalent bonds. The transmission electron microscopy (TEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), vibrating sample magnetometer (VSM), X-ray diffraction (XRD), ultraviolet–vis spectroscopy (UV-Vis), fluorescencemicroscope and the Bradford method were carried out to investigate the morphology, properties of the MNPs and the binding of SA to the MNPs. Results: The MNPs were synthesized with sizes of 35 and 95 nm, the SA binding efficiency of the MNPs was respectively 75.57, 58.06 %. And, the suitable pH values of this structure are 7-8. Conclusion: SA was successfully immobilized on the functionalized MNPs. Key words: immobilization, streptavidin, magnetite nanoparticles * Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh ** Nam Khoa Biotek Co ***Viện Vật lý Tp. Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ : ThS. Bùi Trung Thành ĐT: 0938795801 Email: btrthanh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Cơng cộng 2 MỞ ĐẦU Hạt nano Fe3O4 với thuộc tính siêu thuận từ, độ từ hĩa cao, khơng độc, và khả năng phân tán tốt trong nước, làm chúng trở thành vật liệu đầy hứa hẹn và tiềm năng với các ứng dụng như dẫn truyền thuốc, tách chiết trong y sinh, chất tương phản trong kỹ thuật ảnh cộng hưởng từ hạt nhân(9). Cĩ nhiều phương pháp tổng hợp hạt nano Fe3O4, nhưng phương pháp solvothermal tạo các hạt Fe3O4 siêu thuận từ, kích thước từ vài chục đến vài trăm nm, và độ từ hĩa cao hơn(11). Sau khi được tạo, các hạt nano Fe3O4 cĩ xu hướng kết tụ thành từng đám do tương tác lưỡng cực và lực van der Waals(11). Do vậy, để ngăn ngừa kết tụ cũng như tránh bị oxi hĩa, chúng thường được phủ bởi các chất silane(1,20). Hơn nữa, chất silane chứa các nhĩm chức, thơng qua các nhĩm chức, hạt nano cĩ thể gắn kết với protein(3). Hình 1. Sự tương tác SA-biotin(25) Để ứng dụng làm giàu kháng nguyên đặc hiệu, hạt nano cần phải gắn kết với kháng thể(6,16). Kháng thể cĩ giá thành rất cao. Ngồi ra, mỗi loại kháng thể cĩ cấu trúc khác nhau, do đĩ ở cùng điều kiện thì khả năng gắn kết của chúng với hạt nano cũng rất khác nhau. SA là protein cĩ giá thành thấp, cĩ khả năng liên kết đặc hiệu và bền vững với biotin. Hơn nữa, một SA cĩ bốn vị trí liên kết biotin(17) (Hình 1). Do vậy, trong nghiên cứu này, SA được sử dụng để gắn kết với các hạt nano, qua đĩ hạt nano cĩ thể gắn kết với kháng thể được biotin hĩa thơng qua liên kết SA-biotin. Ứng dụng hạt nano gắn kết SA để làm giàu kháng nguyên đặc hiệu sẽ giúp chẩn đốn sớm. ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Sự gắn kết SA với hạt nano Fe3O4 được chức năng hĩa. Vật liệu Ferric chloride hexahydrate (FeCl3.6H2O), ammonium hydroxide (NH3.H2O, 25%, w/w), ethylene glycol (EG, C2H6O2), sodium acetate trihydrate (NaAc, CH3COONa.3H2O), 2- propanol (C3H8O) do Merck sản xuất. Tetraethyl orthosilicate (TEOS, Si(OC2H5)4), 3- Aminopropyltriethoxysilane (APTES, C9H23NO3Si), glutaraldehyde (GA, CH2(CH2CHO)2, 25% v/v), bovine serum albumin (BSA, 96%), streptavidin (SA), biotin- fluorescein do Sigma Aldrich sản xuất. Và dung dịch Bradford, phosphate buffered saline (PBS) pha chế theo hướng dẫn(2,5). Phương pháp nghiên cứu Tổng hợp hạt nano Fe3O4: Các hạt nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp solvothermal(4). Theo đĩ, 1,35 g FeCl3.6H2O hịa tan trong 40 mL EG, thêm 4,8 g NaAc vào dung dịch trên và khuấy mạnh trong 30 phút ở nhiệt độ phịng, trong khí N2. Chuyển hỗn hợp dung dịch vào nồi hấp, tăng dần nhiệt độ và duy trì ở 2000C trong 5 và 12 h. Các mẫu được để nguội đến nhiệt độ phịng, rửa nhiều lần bằng nước cất, ethanol, tách bằng nam châm, sấy khơ trong chân khơng ở 700C và thu được hai mẫu hạt ứng với thời gian tổng hợp 5 và 12 h. Chức năng hĩa hạt nano: Hạt nano Fe3O4 được phủ SiO2 (Fe3O4/SiO2) theo phương pháp Stưber(21), 250 mg Fe3O4 hịa tan trong 40 mL 2- propanol/nước (tỷ lệ thể tích 3:2), sau đĩ lần lượt thêm 2 mL TEOS và 5 mL NH3.H2O vào hỗn hợp dung dịch trên và khuấy trong 24 h ở 400C trong mơi trường N2. Các mẫu hạt được tách bằng nam châm, rửa bằng nước cất và ethanol nhiều lần và sấy khơ trong chân khơng ở 700C. 250 mg mẫu hạt Fe3O4/SiO2 hịa tan trong 250 mL 2- propanol/nước (tỷ lệ thể tích 1:2), thêm 218 µL Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 3 APTES vào dung dịch và khuấy trong 7 h ở 400C trong mơi trường N2. Các mẫu hạt được tách bằng nam châm, rửa bằng nước cất và ethanol nhiều lần và sấy khơ trong chân khơng ở 700C, thu được hạt cĩ cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2. 220 mg hạt Fe3O4/SiO2/NH2 được phân tán trong 24,5 mL nước cất, thêm 0,5 mL dung dịch GA và khuấy ở nhiệt độ phịng trong 24 h, sau đĩ các hạt được tách bằng nam châm và rửa bằng nước cất nhiều lần, thu được hạt cĩ cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO. Gắn SA: 20 mg hạt nano Fe3O4/SiO2/NH2/CHO được hịa tan với 0,043 mg SA trong 0,2 mL dung dịch PBS (pH: 5-9), hỗn hợp dung dịch SA và các hạt nano được ủ ở 37 0C trong 8 h. Sau đĩ, được tách bởi nam châm và thu được các hạt nano gắn kết SA (Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA) và dung dịch SA sau khi gắn kết với các hạt nano. Các hạt nano Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA được rửa bằng dung dịch PBS ba lần và lưu ở 4 0C, dung dịch SA sau gắn kết với các hạt nano được dùng để định lượng SA cịn lại. Gắn biotin-fluorescein: 1 mg mỗi loại hạt Fe3O4/SiO2/NH2/CHO và Fe3O4/SiO2/NH2/ CHO/SA đã blocking bằng BSA được hịa tan trong 1 mL biotin-fluoresceinnồng độ 0,5 µg/mL và ủ ở 370C trong 1h. Hai mẫu hạt gắn kết biotin- fluorescein được rửa bằng PBS ba lần và lưu ở 40C. Các kỹ thuật phân tích Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM, JEM- 1400, Japan), phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR, TENSOR 27, Germany), đường cong từ hĩa (VSM, MicroSense, USA), giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD, D8–ADVANCE, Germany), phổ UV- Vis (UV-Vis, NanoDrop 2000, USA), và ảnh huỳnh quang (Fluorescence, Olympus BX51, USA) tất cả được dùng để xác định tính chất của vật liệu và khả năng gắn kết của vật liệu với SA. KẾT QUẢ - BÀN LUẬN Các hạt nano Fe3O4 được tổng hợp bằng phương pháp solvothermal, qua đĩ FeCl3 bị khử bởi EG và NaAc để hình thành Fe3O4. Ở 2000C, EG bị thủy phân và hình thành acetaldehyde (CH3CHO) và hydroxyl (OH), acetaldehyde khử Fe(III) thành Fe(II)(22). Tuy EG là chất khử mạnh nhưng chỉ EG, FeCl3 khơng thể bị khử để trở thành Fe3O4(4). Do vậy, hệ thống phản ứng được thêm vào NaAc để gia tăng tính kiềm nhằm hỗ trợ sự thủy phân FeCl3 và cùng với EG khử FeCl3 thành Fe3O4, ngồi ra NaAc cịn tạo độ ổn định tĩnh điện để ngăn ngừa các hạt kết tụ với nhau(4,18). Cơ chế hình thành Fe3O4 bằng phương pháp solvothermal dựa trên các phản ứng hĩa học(22): Fe3+ + 2CH3CHO → Fe2+ + 2H+ + CH3COCOCH3, Fe3++ 3OH- → Fe(OH)3, Fe2++ 2OH- → Fe(OH)2, Fe(OH)3 + Fe(OH)2 → Fe3O4+ 4H2O. 20 30 40 50 60 70 2Deg. (b) 12 h (220) (311) (400) (422) (511) (440) (220) (311) (400) (422) (511) (440) (a) 5 h In te n si ty Hình 2. Phổ XRD của các hạt nano Fe3O4được tổng hợp (a) 5h, (b) 12h. Ngồi ra, phổ XRD của các hạt nano được thể hiện ở Hình 2 cho thấy các đỉnh nhiễu xạ (220), (311), (400), (422), (511) và (440) khá phù với các đỉnh nhiễu xạ trong phổ XRD của Fe3O4 chuẩn (JCPDS file, No. 19-0629). Do đĩ, các hạt nano được hình thành chủ yếu là Fe3O4. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Cơng cộng 4 Hình 3. Ảnh TEM của (a) Fe3O4 được tổng hợp 5 h kích thước 35 nm, (b) hạt 35 nm được phủ SiO2, (c) Fe3O4 được tổng hợp 12 h kích thước 95 nm, (d) hạt 95 nm được phủ SiO2. Hình 3 thể hiện ảnh TEM của các hạt nano Fe3O4 và Fe3O4/SiO2. Ở Hình 3a, 3c cho thấy các hạt nano Fe3O4 cĩ dạng tương đối cầu, được tổng hợp với thời gian lần lượt 5 và 12 h, hạt thu được cĩ đường kính trung bình tương ứng 35 và 95 nm. Thời gian tổng hợp kéo dài kích thước hạt tăng, là do sau 5 h phản ứng trong hệ thống cịn vật liệu để hình thành Fe3O4, các phân tử Fe3O4 sau khi được tạo sẽ khuếch tán lên bề mặt của các hạt nano làm kích thước hạt tăng. Hình 3b, 3d lần lượt thể hiện các hạt nano Fe3O4 cĩ kích thước 35 và 95 nm được phủ SiO2, độ dày lớp phủ SiO2 khoảng 5 – 7 nm và hầu hết các hạt đã được phủ. Sau phủ, các hạt kết tụ thành từng đám, đường kính mỗi đám cĩ thể từ vài trăm nm đến 1 µm (Hình 3, 6). Tính chất từ của các hạt nano Fe3O4 và Fe3O4/SiO2 được xác định bằng kỹ thuật VSM ở nhiệt độ phịng. Hình 4a cho thấy các hạt nano Fe3O4 cĩ kích thước 35 nm, đạt giá trị bão hịa từ cực đại cao 89 emu/g, gần bằng giá trị bão hịa từ cực đại của Fe3O4 khối là 92 emu/g(24), và cĩ thể xem là siêu thuận từ. Giá trị bão hịa từ cực đại cao là do các hạt nano Fe3O4 kết tinh tốt trong điều kiện solvothermal(4). Hình 4b cho biết giá trị bão hịa từ cực đại 76 emu/g của các hạt nano Fe3O4 cĩ kích thước 35 nm phủ SiO2, sự giảm độ từ hĩa của hạt Fe3O4/SiO2 so với hạt Fe3O4 là do lớp phủ SiO2(23). Phổ FTIR của các hạt nano Fe3O4, Fe3O4/SiO2 và Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA được thể hiện ở Hình 5. Ở Hình 5a, phổ của các hạt nano kích thước 35 nm, các đỉnh gần 447 và 585 cm-1 là dấu hiệu của dao động kéo căng của liên kết Fe-O và điều này chứng tỏ sự tồn tại của Fe3O4. Sự xuất hiện của các đỉnh gần Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 5 3420 và 1628 cm-1 lần lượt là dao động kéo căng và dao động bị biến dạng O-H, cho thấy sự tồn tại của các nhĩm OH trên hạt nano Fe3O4(15). -15000 -10000 -5000 0 5000 10000 15000 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 (b) (a) (b) Fe 3 O 4 Fe 3 O 4 /SiO 2 H, Oe M , e m u/ g (a) Hình 4. Độ từ hĩa của (a) các hạt nano Fe3O4 kích thước 35 nm và (b) các hạt nano ấy được phủ SiO2. 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 29252966 1536 1079 447 585 1628 (c) Fe 3 O 4 /SiO 2 /NH 2 /CHO/SA (b) Fe 3 O 4 /SiO 2 T ra n s m it ta n c e Wave number, cm-1 (a) Fe 3 O 4 3420 973 803 Hình 5. Phổ FTIR của (a) các hạt nano Fe3O4 kích thước 35 nm, (b) các hạt ấy được phủ SiO2 và (c) gắn kết SA. Do cĩ các nhĩm OH trên bề mặt hạt nano, nên hạt nano cĩ thể gắn kết với chất kết nối silane như TEOS thơng qua liên kết cộng hĩa trị(26). Phổ của các hạt nano Fe3O4/SiO2 được thể hiện trên Hình 5b, đỉnh gần 1079 và 803 cm-1 lần lượt là dấu hiệu của dao động kéo căng bất đối xứng và đối xứng của Si-O-Si và dao động quanh đỉnh 973 cm-1 cho thấy sự xuất hiện của dao động kéo căng của Si-O- H(14). Trên Hình 5c, phổ của các hạt nano Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA, các đỉnh gần 1536 và 1628 cm-1 lần lượt liên quan đến các dải của amide I và amide II của các dao động cĩ trong các nhĩm amide (CO-NH) của protein(13). Hơn nữa, sự biến dạng của dao động O-H và của nhĩm amino tự do cĩ trong chất bao phủ APTES làm tăng cường độ dao động của nhĩm amide I tại đỉnh 1628 cm-1(12,13). Dao động kéo căng đối xứng và bất đối xứng của nhĩm CH2 và CH3 cũng xuất hiện trong vùng phổ 2925-2966 cm-1, được tìm thấy trong protein và lipid(13). Các kết quả cho thấy các hạt nano Fe3O4 sau khi được chức năng hĩa đã cĩ thể gắn kết SA. Hình 6. Sự phát quang của các hạt nano Fe3O4 kích thước 35 nm được chức năng hĩa (a) khơng gắn SA và (b) gắn SA. Các cấu trúc của các hạt nano Fe3O4 kích thước 35 nm được chức năng hĩa khơng gắn SA: Fe3O4/SiO2/NH2/CHO và gắn SA: Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA, được blocking bởi bovine serum albumin (BSA), và sau đĩ được cho gắn kết với biotin-fluorescein. Biotin- Fluorescein, chất cĩ thể gắn kết với SA thơng qua tương tác SA-biotin và phát huỳnh quang ở bước sĩng 485 nm. Trong thực nghiệm này, biotin-fluorescein được dùng để chứng tỏ sự gắn kết của SA với các hạt nano. Sau khi được chiếu xạ, các cấu trúc hạt nano cĩ sự phát quang khác nhau và được thể hiện trên Hình 6. Hình 6a cho thấy, các hạt nano thuộc cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO khơng phát quang, là do các hạt nano thuộc cấu trúc này khơng được phủ SA, nên khơng thể tĩm bắt biotin-fluorescein. Trong khi đĩ, ở Hình 6b cấu trúc Fe3O4/SiO2/NH2/CHO/SA gắn kết SA, đã tĩm bắt biotin-fluorescein thơng qua tương tác SA-biotin, và cĩ thể phát ánh sáng xanh. Kết quả này cho Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Cơng cộng 6 thấy, hầu hết các hạt nano được chức năng hĩa đã gắn kết được SA. Đỉnh tại 280 nm trong phổ UV-Vis đặc trưng cho protein, do vậy phổ UV-Vis cũng được sử dụng để xác định khả năng gắn kết của protein với các hạt nano(14). Hình 7 cho thấy sự giảm cường độ hấp thụ gần đỉnh 280 nm của các dung dịch SA sau khi gắn kết với các hạt nano so với trước khi gắn kết. Sự giảm này do một lượng SA đã gắn kết được với các hạt nano Fe3O4/SiO2/NH2/CHO, nên nồng độ SA trong dung dịch sau gắn kết giảm, làm giảm cường độ hấp thụ tại đỉnh 280 nm. Ngồi ra, Hình 7b, 7c cịn chỉ ra rằng các hạt nano Fe3O4 kích thước 35 nm, sau khi được chức năng hĩa, cĩ khả năng gắn kết SA tốt hơn so với nano Fe3O4 kích thước 95 nm trong cùng điều kiện. Với cùng một lượng Fe3O4, nếu kích thước hạt giảm, số hạt sẽ nhiều hơn, và tổng diện tích bề mặt của các hạt cũng tăng lên. Do vậy, hạt nhỏ cĩ khả năng gắn kết protein tốt hơn. 240 260 280 300 320 340 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 (c) (b) A b s o rb a n c e Wavelength, nm 280 (a) Hình 7. Phổ UV-Vis của dung dịch SA trước và sau khi gắn kết với các hạt nano. (a) Trước khi gắn kết. (b) Sau khi gắn kết, kích thước hạt Fe3O4 95 nm. (c) Sau khi gắn kết, kích thước hạt Fe3O4 35 nm. Dung dịch SA sau khi gắn kết với các hạt nano được sử dụng để xác định hiệu suất gắn kết của SA với các hạt nano thơng qua phương trình 0 1 0 C C E% 100 C (12), trong đĩ C0 và C1 lần lượt là nồng độ dung dịch SA trước và sau khi gắn kết. Bằng phương pháp Bradford(2) cĩ thể xác định được nồng độ của dung dịch SA cịn lại sau khi gắn kết với các hạt nano từ đĩ suy ra hiệu suất gắn kết. Theo đĩ, 3 mL dung dịch Bradford được cho vào 100 µL dung dịch mẫu, trong đĩ một mẫu trắng, năm mẫu đã biết trước nồng độ và hai mẫu dung dịch cần xác định nồng độ. Độ hấp thụ của các mẫu được ghi ở bước sĩng 595 nm và từ các mẫu chuẩn suy được phương trình: 2f x 1,1232x 0,0059;R 0,9945 . Từ đây suy ra nồng độ SA sau gắn kết và hiệu suất gắn kết của các mẫu. Kết quả ở Bảng 1 cho thấy, hạt nhỏ cho hiệu suất gắn kết tốt hơn và đạt 75,57 % trong khi đĩ hạt lớn chỉ đạt 58,06 %. Và, với 0,043 mg SA cĩ trong 0,2 mL dung dịch đã cĩ thể gắn kết được 0,033 mg SA lên 20 mg hạt nano nhỏ, trong khi đĩ ở cùng điều kiện, hạt lớn chỉ gắn kết được 0,025 mg SA. Bảng 1. Hiệu suất gắn kết SA với các hạt nano. Khối lượng hạt nano Fe3O4/SiO2/N H2/CHO, mg Kích thước hạt nano Fe3O4, nm Độ hấp thụ của dung dịch SA sau gắn kết Nồng độ dung dịch SA, mg/mL Hiệu suất gắn kết, % Trước gắn kết Sau gắn kết 20 35 0,065 0,217 0,053 75,57 20 95 0,108 0,217 0,091 58,06 5 6 7 8 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 E ff ic ie n cy , % pH Hình 8. Sự ảnh hưởng của độ pH lên hiệu suất gắn kết SA với các hạt nano. Độ pH, thơng số giữ vai trị quan trọng trong quá trình gắn kết protein với hạt nano là vì nĩ tác động đến độ ổn định của dung dịch huyền phù và độ hoạt động của protein được gắn kết(10). Độ pH của dung dịch đệm PBS được thay đổi từ 5-9. Từ Hình 8 cho thấy giá trị pH < 7, hiệu suất gắn kết SA với các hạt nano giảm, điều này được cho là: (i) hoặc SA hoặc các hạt nano kém ổn định trong mơi trường pH thấp dẫn đến dễ kết tụ thành từng đám(7), và (ii) khĩ xảy ra phản ứng gắn kết Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 7 giữa các nhĩm NH2 của SA với các nhĩm CHO của các hạt nano do sự kém ổn định trong mơi trường acid yếu(8) dẫn đến giảm hiệu suất gắn kết của SA với các hạt nano. Kết quả ở Hình 8 cũng thể hiện sự giảm hiệu suất gắn kết khi pH > 8. Điểm đẳng điện của SA xấp xỉ 5(8), của glutaraldehyde<6(19). Khi độ pH của dung dịch cao hơn điểm đẳng điện của chúng thì chúng tích điện âm(7). Do vậy, xuất hiện lực đẩy tĩnh điện giữa SA và các hạt nano, là rào cản làm chúng khĩ gắn kết được với nhau(8). Kết quả thực nghiệm ở đây chỉ ra rằng giá trị pH của dung dịch trong khoảng 7-8 cho hiệu suất gắn kết tốt nhất. KẾT LUẬN Hạt nano Fe3O4 với nhiều kích thước được tổng hợp bằng phương pháp solvothermal, sau khi được chức năng hĩa, hạt đã gắn kết được với SA. Hạt nhỏ cho hiệu suất gắn kết cao hơn so với hạt lớn và với cấu trúc hạt nano này, độ pH của dung dịch PBS khoảng 7-8 cho hiệu suất gắn kết SA tốt nhất. Lời cảm ơn: Nhĩm tác giả xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Y Dược TP.HCM, Nam Khoa Biotek Co. và Phịng Năng lượng và mơi trường Viện Vật lý TP.HCM đã hỗ trợ kinh phí, thiết bị để thực hiện nghiên cứu này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bach LG, Islam MR, Kim JT, Seo S, et al (2012). Encapsulation of Fe3O4 magnetic nanoparticles with poly(methyl methacrylate) via surface functionalized thiol-lactam initiated radical polymerization. Applied Surface Science, 258: 2959- 2966. 2. Bradford MM (1976). A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 3. Can K, Ozmen M, and Ersoz M (2009). Immobilization of albumin on aminosilane modified superparamagnetic magnetite nanoparticles and its characterization. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces, 71: 154-159. 4. Deng H, Li X, Peng Q, Wang X, et al (2005). Monodisperse Magnetic Single-Crystal Ferrite Microspheres. Angewandte Chemie, 117: 2842-2845. 5. Dulbecco R and Vogt M (1954). Plaque Formation and Isolation of Pure Lines with Poliomyelitis Viruses. J. Exp. Med., 99: 167-182. 6. Dyal A, Loos K, Noto M, Chang SW, et al (2003). Activity of Candida rugosa Lipase Immobilized on -Fe2O3 Magnetic Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc., 125: 1684-1685. 7. El-kharrag R, Amin A, and Greish YE (2012). Low temperature synthesis of monolithic mesoporous magnetite nanoparticles. Ceramics International, 38: 627-634. 8. Erdem A, Papakonstantinou P, Murphy H, McMullan M, et al ( 2010). Streptavidin Modified Carbon Nanotube Based Graphite Electrode for Label-Free Sequence Specific DNA Detection. Electroanalysis, 22: 611 – 617. 9. Ge J, Hu Y, Biasini M, Beyermann WP, et al (2007). Superparamagnetic magnetite colloidal nanocrystal clusters. Angew Chem Int Ed Engl, 46: 4342-4345. 10. Hou Y, Han X, Chen J, Li Z, et al (2013). Isolation of PCR- ready genomic DNA from Aspergillus niger cells with Fe3O4/SiO2 microspheres. Separation and Purification Technology, 116: 101-106. 11. Hu B, Pan J, Yu HL, Liu JW, et al (2009). Immobilization of Serratia marcescens lipase onto amino-functionalized magnetic nanoparticles for repeated use in enzymatic synthesis of Diltiazem intermediate. Process Biochemistry, 44: 1019-1024. 12. Jamin N, Dumas P, Moncuit J, Fridman WH, et al (1998). Highly resolved chemical imaging of living cells by using synchrotron infrared microspectrometry. Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 4837–4840. 13. Khatiri R, Reyhani A, Mortazavi SZ, and Hossainalipour M (2013). Immobilization of serum albumin on the synthesized three layers core–shell structures of super-paramagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19: 1642-1647. 14. Liu X, Ma Z, Xing J, and Liu H (2004). Preparation and characterization of amino–silane modified superparamagnetic silica nanospheres. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 270: 1-6. 15. Liu Y and Li Y (2001). An Antibody-Immobilized Capillary Column as a Bioseparator/Bioreactor for Detection of Escherichia coli O157:H7 with Absorbance Measurement. Anal. Chem., 73: 5180-5183. 16. Louis C and Prank JW (1964). The Properties of Streptavidin, a Biotin-Binding Protein Produced by Streptomycefes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 106: 1-5. 17. Luo B, Song XJ, Zhang F, Xia A, et al (2010). Multi-functional thermosensitive composite microspheres with high magnetic susceptibility based on magnetite colloidal nanoparticle clusters. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids, 26: 1674-1679. 18. Migneault I, Dartiguenave C, Bertrand J M, and Waldron CK (2004). Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. BioTechniques, 37: 790-802. 19. Minko S (2008). Grafting on Solid Surfaces: “Grafting to” and “Grafting from” Methods. Springer, Chapter 11: 215-233. 20. Stober W and Fink A (1968). Controlled Growth of Monodisperse Silica Spheres in the Micron Size Range. Journal of colloid and interface science, 26: 62-69. 21. Sun H, Zeng X, Liu M, Elingarami S, et al (2012). Synthesis of Size-Controlled Fe3O4@SiO2 Magnetic Nanoparticles for Nucleic Acid Analysis. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 12: 267-273. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Cơng cộng 8 22. Thanh BT, Van PH, Hai TH, Tung LM, et al (2015). Detection of liver cancer cells by using ELISA and coupling of anti- glypican 3 antibody and magnetite nanoparticles. Geosystem Engineering, 18: 219-225. 23. Wang B, Wei Q, and Qu S (2013). Synthesis and Characterization of Uniform and Crystalline Magnetite Nanoparticles via Oxidation-precipitation and Modified co- precipitation Methods. Int. J. Electrochem. Sci., 8: 3786 - 3793. 24. www.innovabiosciences.com/innova/biotin-streptavidin.html (2015). The Biotin Streptavidin Interaction. Innova Biosciences Ltd., 25. Zhao J, Milanova M, Warmoeskerken MMCG, and Dutschk V (2012). Surface modification of TiO2 nanoparticles with silane coupling agents. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 413: 273-279. Ngày nhận bài báo: 24/11/2015 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 30/11/2015 Ngày bài báo được đăng: 15/02/2016 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 20 * Phụ bản của Số 1 * 2016 Nghiên cứu Y học Khoa học Cơ bản 9 THU NHẬN PROTEIN ĐIỀU CHỈNH MIỄN DỊCH FIP TỪ HỆ SỢI NẤM GANODERMA COLOSSUM DONK Lê Nguyễn Uyên Chi* TĨM TẮT Mở đầu: Các hoạt chất trong nấm Hồng chi (Ganoderma colosum Donk) của Việt Nam cho đến nay vẫn chưa cĩ nhiều nghiên cứu, đặc biệt là loại protein điều chỉnh miễn dịch – FIP – đang được giới khoa học hết sức chú ý trong việc nghiên cứu sử dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo. Mục tiêu: Thu nhận FIP từ nuơi cấy sợi nấm Hồng chi, xác định khối lượng phân tử và đánh giá khả năng chống ngưng kết máu của FIP. Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Sinh khối hệ sợi nấm Hồng chi thu được từ việc nuơi cấy dịch thể. FIP được thu nhận và tinh sạch bằng sắc ký lọc gel. Protein được định khối lượng phân tử bằng điện di SDS- PAGE. Hoạt tính chống ngưng kết máu của FIP tách chiết được chứng minh trên máu người và máu cừu. Kết quả: Mẫu protein thu được từ sợi nuơi cấy nấm Hồng chi cĩ khối lượng là 13,114 kiloDalton (kDa) và mang hoạt tính của họ FIP là gây ngưng kết đối với máu cừu, nhưng hồn tồn làm tan đối với 4 nhĩm máu người. Kết luận: Nghiên cứu lần đầu tiên xác định sự hiện diện của dịng protein điều chỉnh miễn dịch ly trích từ hệ sợi nuơi cấy nấm Hồng chi ở Việt Nam. Kết quả này là cơ sở để thực hiện những nghiên cứu về tìm hiểu trình tự gen mã hĩa cho FIP, ứng dụng tiếp theo trong cơng nghệ sản xuất FIP tái tổ hợp để bào chế dược liệu từ thảo mộc, giúp phịng và hỗ trợ điều trị bệnh. Từ khĩa: Ganoderma colossum, nuơi cấy hệ sợi, FIPs. ABSTRACT AN IMMUNOMODULATORY PROTEIN EXTRACTED FROM THE MYCELIUM OF GANODERMA COLOSSUM DONK Le Nguyen Uyen Chi * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 20 - Supplement of No 1 - 2016: 9 - 14 Background – Objectives: Active elements of the Ganoderma colossum – one type of lingzhi mushroom found in Vietnam – have not been much studied till now. One of them was the immunomodulatory protein - FIP, which was promised as an efficient medical herbal drug for treatment of diseases. Methods: FIP was isolated from the cultured mycelium of G. colossum. Its molecular weight was measured by SDS-PAGE electrophoresis. The ability of hemaglutination of FIP was tested with human and sheep red blood cells. Results: FIP’s molecular weight was 13.114 kDa. Aggregation was observed from sheep red blood cells in the presence of purified FIP of G. colossum. However, no aggregation was seen for any type of human red blood cells. Conclusions: This research was firstly determined the presence of an immunomodulatory protein isolated from cultured mycelia of G. colossum in Vietnam. This finding served as a foundation for further experiments of FIP gene, as well as the production of recombinant FIP in herbal drugs to prevent and support the treatment for diseases. Keywords: Ganoderma colossum, mycelium, FIPs. *Khoa Khoa học cơ bản, ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Địa chỉ liên hệ : TS. Lê Nguyễn Uyên Chi ĐT: 012-1639-5936 Email: uyenchile@hotmail.com