Độc tính của xi măng nhựa tự dán qua rào cản ngà trên nguyên bào sợi chuột 3T3

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 5 ĐỘC TÍNH CỦA XI MĂNG NHỰA TỰ DÁN QUA RÀO CẢN NGÀ TRÊN NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT 3T3 Đặng Thị Lan Anh*, Trần Xuân Vĩnh** TÓM TẮT Mục tiêu: Đánh giá độc tính của xi măng nhựa tự dán lưỡng trùng hợp (G Cem) qua rào cản ngà trên tế bào nguyên bào sợi 3T3, so sánh với xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và xi măng Glass Ionomer (Fuji I). Phương pháp nghiên cứu: Thu thập 48 răng khôn hàm trên. Tiến hành tạo các xoang I trên mặt nhai. Sau khi tách rời thân răng, thu được một bề mặt ngà phẳng và bề dày lớp ngà răng còn lại được điều chỉnh bằng 0,5mm. Sau đó, chia các xoang thành 3 nhóm và đặt vào ba loại xi măng: Nhóm I: Fuji I, Nhóm 2: Fuji Plus, Nhóm 3: G Cem. Dùng sáp inay dán kín bề mặt xoang. Các thân răng được ngâm trong môi trường nuôi cấy trong 24 giờ và độc tính của dung dịch thu được trên nguyên bào bào sợi 3T3 được đánh giá định lượng qua thử nghiệm MTS trên 5 nồng độ. Dữ liệu được phân tích bằng phép kiểm Kruskall Wallis và phép kiểm Mann- Whitney ở độ tin cậy 95%. Kết quả: Các loại xi măng đều gây giảm tỉ lệ tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3, theo thứ tự: Fuji I gây giảm tỉ lệ tế bào sống ít nhất, Fuji Plus gây giảm tỉ lệ tế bào sống trung bình, G Cem gây giảm tỉ lệ tế bào sống cao nhất. Tuy nhiên các loại xi măng đều không gây độc cấp tính (ISO 10993-5:2009) (tỉ lệ tế bào sống >70%). Kết luận: Nghiên cứu sử dụng mô hình rào cản ngà răng, điều này mô phỏng thực tế lâm sàng, xi măng gắn không tiếp xúc trực tiếp mà ngăn cách với mô tủy qua bề dày lớp ngà còn lại. Khi bề dày lớp ngà >= 0,5mm xi măng gắn không gây độc (độc cấp tính) với tế bào (ISO 10993-5:2009). Từ khóa: Tương hợp sinh học, độc tính tế bào, thử nghiệm rào cản ngà, xi măng nhựa tự dán, nguyên bào sợi 3T3. ABSTRACT CYTOTOXICITY OF SELF ADHESIVE RESIN CEMENT BY DENTIN BARRIER TEST ON 3T3 MOUSE FIBROBLASTS Dang Thi Lan Anh, Tran Xuan Vinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 5- 11 Objectives: The present study evaluated the cytotoxic effects of self adhesive resin cement (G Cem) by dentin barrier test on 3T3 fibroblasts, compared with Resin Modified Glass Ionomer cement (Fuji Plus) and Glass Ionomer cement (Fuji I) Method: Fourty-eight human upper wisdom teeth were included. Class I cavity preparations were prepared on occlusal surfaces. After crown separation, a flat dentinal surface was provided and RDT (remaining dentinal thickness) was adjusted at 0.5 mm. Then, cavities were treated in three groups with experimental cements: Group 1: Fuji I, Group 2: Fuji Plus, Group 3: G Cem. Blue inlay wax sealed the cavities. Crowns were immersed in culture medium for 24 hours and the cytotoxicity of the resultant toxic medium on 3T3 mouse fibroblast was measured quantitatively with MTS assay in 5 serial dilutions. Data were analyzed with Kruskall Wallis test and Mann-Whitney test at 95% significance level. Results: All experimental materials decreased the cell metabolic activity: Fuji I decreased the cell survival * Bệnh viện Răng Hàm Mặt Trung Ương, thành phố Hồ Chí Minh **Bộ môn Nha khoa cơ sở, Khoa Răng-Hàm-Mặt, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: : TS. Trần Xuân Vĩnh ĐT: 0946920818 Email: vinhdentist@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 6 rate the least, Fuji Plus came next, G Cem decreased the cell survival rate the most. However, all cements did not cause acute cytotoxicity (ISO 10993-5:2009)( all cell survival rate >70%) Conclusion: The study used the dentin barrier model, which simulates clinical reality, cement that does not contact directly but separates from the pulp tissue through the remaining dentinal thickness. When the thickness of dentin>= 0.5mm, cement is not toxic (acute toxic) to the cell (ISO 10993-5: 2009). Keywords: Biocompatibility, cytotoxicity, dentin barrier test, self ahesive resin cement, 3T3 mouse fibroblast. MỞ ĐẦU Từ thực tế gắn những phục hình cố định trên răng tủy sống, sẽ có sự tiếp xúc trực tiếp giữa xi măng gắn với phức hợp ngà tủy, được cho là một trong những nguyên nhân gây nhạy cảm và ê buốt sau can thiệp. Do đó, ngoài các đặc điểm cơ học đảm bảo khả năng gắn dính, đặc điểm tương hợp sinh học của xi măng gắn là một yêu cầu quan trọng và cần thiết. So sánh với các xi măng gắn truyền thống như xi măng Glass Ionomer (GIC) và Glass Ionomer tăng cường nhựa (RMGIC), xi măng nhựa có những ưu điểm về thẩm mỹ và khả năng gắn dính. Tuy nhiên xi măng được cho là gây độc do chứa các monomer nhựa và qui trình xử lí ngà răng bằng acid trước khi gắn làm tăng tính thấm ngà. Xi măng nhựa tự dán ra đời năm 2002, với các đặc điểm: lưỡng trùng hợp đảm bảo chất lượng polymer hóa của xi măng, kết hợp tác nhân dán và xi măng trong một sản phẩm, rút gọn qui trình gắn chỉ gồm một bước, giảm thời gian trên lâm sàng. Do không cần các bước xử lí bề mặt răng trước khi gắn, lớp mùn ngà không bị loại bỏ, nên được cho là không gây nhạy cảm sau gắn. Sự dán dính vào các cấu trúc mô răng không có sự hình thành của các đuôi nhựa trong ống ngà(2), từ đó có thể ngăn chặn làm giảm tác động gây hại cho tủy(6,14). Với tính thuận tiện và đa năng, xi măng nhựa tự dán hiện được nhiều nhà lâm sàng lựa chọn. Tuy nhiên, các nghiên cứu đánh giá độc tính tế bào của xi măng này vẫn chưa được thực hiện nhiều. Năm 2009, Ulker HE và Sengun A(14) kết luận trừ MaxCem, các loại xi măng nhựa tự dán gây độc tế bào. Trong khi đó, năm 2016, Fonseca(3) kết luận xi măng nhựa tự dán không gây độc cho tế bào. Từ các kết luận khác nhau như vậy, cho thấy đây cũng là vấn đề cần được nghiên cứu thêm. Nhiều nghiên cứu độc tính tế bào in vitro dựa trên đánh giá mức độ sống của tế bào khi tiếp xúc với dịch chiết trực tiếp của vật liệu. Tuy nhiên, trên thực tế, khả năng gây độc của vật liệu nha khoa, phụ thuộc vào khả năng của vật liệu khuếch tán qua ngà răng và tích lũy trong tủy ở nồng độ đủ cao để gây ra các vấn đề trên tủy. Vì vậy, mô hình sử dụng rào cản ngà răng là phương pháp tốt để đánh giá các độc tính trên tủy của vật liệu nha khoa. Vì vậy, nghiên cứu in vitro này được thực hiện nhằm đánh giá độc tính của xi măng nhựa tự dán lưỡng trùng hợp (G-Cem) qua rào cản ngà răng trên tế bào nguyên bào sợi 3T3, so sánh với hai loại xi măng thông dụng là xi măng Glass Ionomer tăng cường nhựa (Fuji Plus) và xi măng Glass Ionomer (Fuji I). ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dòng tế bào nguyên bào sợi chuột 3T3 được cung cấp từ phòng thí nghiệm trung tâm sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh. Các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu (Bảng 1). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 7 Bảng 1. Các loại xi măng sử dụng trong nghiên cứu Vật liệu Loại Số lô Cơ chế đông Thành phần Fuji I GIC 1607111 Hóa học Bột: fluoroaluminosilicate glass Lỏng: polyacrylic acid, nước, Fuji Plus RMGIC 1605261 Hóa học Bột: fluoroaluminosilicate glass; Lỏng: copolymer of acrylic and maleic acids, HEMA, UDMA, tartaric acid, nước, chất khơi mào hóa trùng hợp G cem Xi măng nhựa tự dán 1511261 Lưỡng trùng hợp Bột: fluoro-aluminio-silicate glass Lỏng: thành phần nhựa có tính axit, nước, UDMA, Dimethacrylates, 4-META, phosphoric ester monomer, camphorquinone Quy trình nghiên cứu Bốn mươi tám thân răng khôn hàm trên được cắt rời khỏi chân răng. Sau đó, bề mặt phía dưới của thân răng được mài cho đến khi được bề mặt ngà phẳng ngang mức trần tủy (không còn thấy được sừng tủy). Sau đó, từ phía mặt nhai thân răng, sửa soạn xoang hình trụ tròn với độ sâu của xoang được điều chỉnh cho đến khi bề dày ngà răng phía trên buồng tủy dày 0,5 mm. Bề mặt ngà răng phía tủy được xoi mòn với axit citric 50% trong 30 giây để loại bỏ lớp mùn ngà do tác động mài răng. Sau đó, hệ thống thân răng được hấp tiệt trùng. Hình 1. Hệ thống thân răng trong nghiên cứu. Trộn từng loại xi măng theo hướng dẫn của nhà sản xuất, cho vào xoang đã sửa soạn trong thân răng, chờ đến khi xi măng đông. Sử dụng sáp cứng inlay (Kerr, USA) che kín bề mặt xoang phía mặt nhai thân răng. Ngâm thân răng chứa xi măng vào môi trường DMEM/F12 theo tiêu chuẩn ISO 10993- 12:2012(13). Sau 24 giờ, thu được dịch chiết xi măng nồng độ 100% (nồng độ 1). Pha loãng dịch chiết thành các nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Chuyển tế bào 3T3 lên đĩa 96 giếng với mật độ 1x104 tế bào/ml rồi ủ 24 giờ. Sau đó, hút bỏ môi trường ở tất cả các giếng, rửa sạch nhẹ nhàng tế bào bằng dung dịch muối đệm phosphate PBS. Cho 100 µl dịch chiết xi măng vào giếng tương ứng (02 giếng/từng nồng độ dịch chiết của mỗi loại xi măng) rồi tiếp tục ủ 24 giờ. Sau 24 giờ, hút bỏ dịch chiết. Rửa với 100 µl BPS. Thêm vô mỗi giếng 100 µl môi trường DMEM và 20 µl MTS, trộn đều, ủ trong trong tủ ủ ở 370C, 5% CO2 trong 4 giờ. Tiến hành đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 492 nm bằng máy đo OD. Mô hình nghiên cứu sử dụng chứng âm là môi trường DMEM/F12 và chứng dương là dịch chiết latex theo tiêu chuẩn ISO 10993-5:2009(12). Số đo OD được chuyển thành tỷ lệ phần trăm tế bào sống theo công thức: OD492e: mật độ quang của dịch chiết vật liệu OD492b: mật độ quang của chứng âm Nếu tỉ lệ sống <70%: vật liệu có khuynh hướng độc. Lặp lại thử nghiệm 3 lần. Xử lý số liệu Nhập và xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16.0. Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê khi p<0,05. % Tế bào sống = 100 x OD 492e OD 492b Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 8 KẾT QUẢ Bảng 2. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3 khi tiếp xúc với dịch chiết của Fuji I, Fuji Plus, G- Cem ở các nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. Loại vật liệu Nồng độ dịch chiết gián tiếp Trung vị (Khoảng tứ phân vị) Chưa pha loãng Nồng độ 1/2 Nồng độ 1/4 Nồng độ 1/8 Nồng độ 1/16 Fuji I 86,48 (85,17-87,38) 94,67 (92,07-96,28) 100,03 (100,02-100,05) 100,11 (100,08-100,15) 100,19 (100,17-100,22) Fuji Plus 75,12 (73,78-75,94) 83,49 (81,39-84,86) 93,52 (91,81-95,26) 98,65 (96,30-99,83) 100,16 (100,06-100,25) G Cem 71,06 (70,16-72,72) 77,76 (76,09-78,50) 82,00 (79,34-84,23) 86,01 (82,82-86,81) 91,44 (88,46-92,23) Biểu đồ 1. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3 khi tiếp xúc với dịch chiết của Fuji I, Fuji Plus ở các nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. *: p<0,05 (Kiểm định Mann-Whitney U). Biểu đồ 2. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3 khi tiếp xúc với dịch chiết của Fuji I, G-Cem ở các nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. *: p<0,05 (Kiểm định Mann-Whitney U). * * * * * * * * * Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 9 Biểu đồ 3. Tỷ lệ phần trăm tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3 khi tiếp xúc với dịch chiết của Fuji Plus, G-Cem ở các nồng độ 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16. *: p<0,05 (Kiểm định Mann-Whitney U). Như vậy, các loại xi măng đều gây giảm tỉ lệ tế bào sống của nguyên bào sợi 3T3, theo thứ tự: Fuji I gây giảm tỉ lệ tế bào sống ít nhất, Fuji Plus gây giảm tỉ lệ tế bào sống trung bình, G Cem gây giảm tỉ lệ tế bào sống cao nhất. Tuy nhiên các loại xi măng đều không gây độc cấp tính theo chuẩn ISO (tỉ lệ tế bào sống >70%). BÀN LUẬN Nghiên cứu này sử dụng mô hình thân răng với bề dày lớp rào cản ngà răng là 0,5mm, được giới thiệu lần đầu tiên năm 1997 bởi Camps và cộng sự(1). Sự hiện diện của rào cản ngà mô phỏng điều kiện lâm sàng, do trên lâm sàng các vật liệu nha khoa gây độc phải khuếch tán qua được lớp ngà để tiếp xúc tủy răng. Nghiên cứu sử dụng nguyên bào sợi 3T3 do đây là dòng tế bào nguyên bào sợi chuẩn, thường được sử dụng trong các thử nghiệm độc tính. Việc lựa chọn dòng tế bào nguyên bào sợi cũng nhằm mô phỏng tình huống lâm sàng khi đánh giá độc tính của vật liệu trên tủy răng - một mô giàu nguyên bào sợi. Trong ba loại xi măng, Fuji I có tỉ lệ tế bào sống cao nhất. Kết quả xi măng GIC có đặc điểm tương hợp sinh học cao phù hợp với nhiều nghiên cứu(8,9). Nguyên nhân Fuji I gây giảm tỉ lệ tế bào sống có thể do khả năng phóng thích axit(11) và Fluor(9). Trong nghiên cứu của Hiraishi N và cộng sự (2003)(7), có sự khuyếch tán axit của xi măng GIC qua ngà răng, tuy nhiên bề dày ngà răng là 0,25mm. Nghiên này sử dụng lớp ngà răng dày hơn, là 0,5mm, lớp ngà răng dày có thể đóng vai trò là rào cản tốt, ngăn sự khuyếch tán của axit. Fuji Plus gây giảm tỉ lệ tế bào sống cao hơn Fuji I. Nguyên nhân có thể do: (1) Fuji Plus phóng thích Fluor cao hơn Fuji I(9). (2) Các phân tử monomer chưa phản ứng như HEMA, UDMA có thể thoát ra khỏi xi măng, khuếch tán qua ngà răng(4) và gây độc tế bào(6). Kết quả xi măng GIC lai có tác động gây độc tế bào cao hơn GIC được nhiều nghiên cứu chứng minh(8,9,11). Trong nghiên cứu của chúng tôi, G-Cem gây giảm phần trăm tế bào sống nhiều hơn so với Fuji Plus và Fuji I. Điều này có thể do G-Cem có các thành phần cấu tạo có tiềm năng gây độc: (1) Phần chất khơi mào trùng hợp camphoroquinone (CQ) không tham gia phản **** * Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 10 ứng có thể được phóng thích sau quá trình polyme hóa. CQ được đánh giá có mức độ gây độc trung bình khi so sánh với những chất quang hoạt hóa khác và hầu hết các monomer nhựa. Nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, CQ gây ra stress oxy hoá, tổn thương DNA và độc tính tế bào(15). (2) G-Cem có chứa monomer UDMA. Với trọng lượng phân tử cao, UDMA gây độc tế bào cao hơn HEMA(5,10). Với sự hiện diện của rào cản ngà, phần trăm tế bào sống của nhóm G-Cem ở nồng độ dịch chiết 100% đạt mức không gây độc tế bào theo chuẩn ISO (>70%) là 71,06%; khi pha loãng dịch chiết phần trăm tế bào sống tăng lên, tiến đến 91,44% ở nồng độ dịch chiết 6,25%. Trong nghiên cứu của Ulker và Sengun (2009)(14), khảo sát độc tính của các loại xi măng nhựa tự dán trên tế bào nhú răng bò qua rào cản ngà 0,5 mm, kết quả cho thấy ngoại trừ MaxCem cho kết quả phần trăm tế bào sống tương tự nhóm chứng, các loại xi măng còn lại đều gây độc tế bào, phần trăm tế bào sống từ 52%-73%, mức độ gây độc khác nhau tùy thuộc loại xi măng. Tuy nhiên, trong nghiên cứu năm 2015, Fonseca Roberti Garcia L, Pontes EC(3) đánh giá độc tính trên tế bào dạng nguyên bào ngà MDPC 23 và tế bào tủy răng người qua lớp rào cản ngà 0,4mm kết luận xi măng nhựa tự dán RelyX U200 không gây độc tính tế bào. Trong những nghiên cứu trên thế giới về xi măng nhựa tự dán, hiện chưa có nghiên cứu nào về xi măng G-Cem. Các nghiên cứu đã được thực hiện đánh giá độc tính về các loại xi măng nhựa tự dán khác cho kết quả không thống nhất. Việc so sánh chính xác kết quả giữa các nghiên cứu khác nhau gặp khó khăn do có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào. Thứ nhất, có sự khác nhau giữa tỉ lệ môi trường nuôi cấy và vật liệu để tạo dịch chiết giữa các nghiên cứu. Thứ hai, việc đánh giá độc tính được thực hiện trên các dòng tế bào khác nhau có thể cho kết quả tỉ lệ sống tế bào khác nhau. Do những hạn chế của nghiên cứu in vitro, nghiên cứu này không bao quát được hết các yếu tố đa dạng tác động lên xi măng gắn trên thực tế lâm sàng. KẾT LUẬN Nghiên cứu cung cấp chứng cứ khoa học về độc tính của ba loại xi măng gắn. Nghiên cứu sử dụng mô hình rào cản ngà răng, điều này mô phỏng thực tế lâm sàng, xi măng gắn không tiếp xúc trực tiếp mà ngăn cách với mô tủy qua bề dày lớp ngà còn lại. Khi bề dày lớp ngà ≥ 0,5mm xi măng gắn không gây độc (độc cấp tính) với tế bào (ISO 10993-5:2009). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Camps J, Tardieu C, Dejou J, Franquin JC, Ladaique P, Rieu R (1997). “In vitro cytotoxicity of dental adhesive systems under simulated pulpal pressure”, Dent mater, 13, pp. 34-42. 2. Costa CAD; Hebling J; Randall RC (2006). “Human pulp response to resin cements used to bond inlay restorations”, Dent Mater, 22, pp. 954–962. 3. da Fonseca RGL, Pontes EC (2016). “Transdentinal cytotoxicity of resin-based luting cements to pulp cells”, Clin Oral Investig, 20 (7), pp. 1559–1566. 4. Gerzina TM, Hume WR (1996). “Diffusion of monomers from bonding resin-resin composite combinations through dentine in vitro”, J Dent, 24, pp. 125-128. 5. Geurtsen W, Lehmann F, Spahl W, Leyhausen G (1998). “Cytotoxicity of 35 dental resin composite monomers/additives in permanent 3T3 and three human primary fibroblast cultures”, J Biomed Mater Res, 41, pp. 474- 480. 6. Goldberg M (2008). “In vitro and in vivo studies on the toxicity of dental resin components: a review”, Clin Oral Investig, 12, pp. 1–8. 7. Hiraishi N, Kitasako Y, Nikaido T, Foxton RM, Tagami J, Nomura S (2003). “Acidity of conventional luting cements and their diffusion through bovine dentine”, Int Endod J, 36, pp. 622-628. 8. Sun J, Weng Y, Song F, Xie D (2011). “In vitro responses of human pulp cells and 3T3 mouse fibroblasts to six contemporary dental restoratives”, J Biomedical Science and Engineering, 4, pp. 18-28. 9. Kanjevac T, Milovanovic M (2012). “Cytotoxic effects of glass ionomer cements on human dental pulp stem cells correlate with fluoride release”, Med Chem, 8 (1), pp. 40-45. 10. Ratanasthien S, Watnha JC, Hanks CT, Dennison JB (1995). “Cytotoxic interactive effects of dentin bonding components on mouse fibroblasts”, J Dent Res, 74, pp. 1602–1606 11. Rita Trumpaite-Vanagiene, Virginija Bukelskiene (2015). “Cytotoxicity of commonly used luting cements - An in vitro study”, Dental Materials Journal, 34(3), pp. 294–301. 12. The European Union Per Directive 90/385/EEC. (2009). ISO 10993-5:2009, Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity”, pp. 1-34. 13. The European Union Per Directive 90/385/EEC. (2012). ISO 10993-12:2012, Biological evaluation of medical devices-Part 12: Sample preparation and reference materials, pp. 1-20. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 2 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Răng Hàm Mặt 11 14. Ulker HE, Sengun A (2009). “Cytotoxicity evaluation of self adhesive composite resin cements by dentin barrier test on 3D pulp cells”, Eur J Dent, 3, pp. 120–126. 15. Volk J, Ziemann C, Leyhausen G, Geurtsen W (2009). “Non- irradiated campherquinone induces DNA damage in human gingival fibroblasts”, Dent Mater, 25(12), pp. 1556-1563. Ngày nhận bài báo: 09/02/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 22/02/2018 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018