Đồ án Ứng dụng enzyme protease trong sản xuất bia

LỜI MỞ ĐẦU Sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống là một vấn đề được các nhà khoa học và kỹ thuật chú ý từ lâu. Ngày nay, việc sử dụng này đã trở thành phổ biến ở nhiều nước và đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn. Enzyme là chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của thực vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến thực phẩm, trong y học, trong kỹ thuật phân tích, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Enzyme protease là nhóm enzyme thủy phân protein được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày, trong công nghiệp thuộc da, trong công nghiệp sữa và phomat. Đặc biệt trong quá trình sản xuất bia, protease đóng vai trò rất quan trọng trong việc tăng nhanh quá trình sản xuất, tăng hiệu suất trích ly, thủy phân hoàn toàn các chất protein, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục bia. Ngày nay, bia là loại đồ uống không thể thiếu đối với cuộc sống của con người. Bia là loại nước giải khát, có độ cồn thấp, giàu dinh dưỡng. Ngoài việc cung cấp một lượng calori khá lớn, trong bia còn chứa một hệ enzyme phong phú, kích thích tiêu hoá cho cơ thể con người. Hiện nay, các nhà máy bia ở nước ta chưa chú ý tới việc sử dụng enzyme trong quá trình sản xuất. Xuất phát từ những lý do trên em chọn đề tài “Ứng dụng của enzyme protease trong sản xuất bia” với mong muốn những ứng dụng của enzyme này sẽ được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất bia nói riêng. Chương I TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 1. Tổng quan về enzyme Protease [2] 1.1. Giới thiệu chung Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit. - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase. - Dipeptidhydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit. - Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...) [10]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng...[3]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN...[2]. So với Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease 1.2. Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [5] Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid. Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin (1 Protease xerin tiêu biểu) Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động ph của chúng bao gồm: Protease-acid, Protease trung tính, Protease kiềm. Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa. Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa. Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1 Bảng 1.1. Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật Nhóm Nguồn E Chất kìm hãm Đặc điểm TTHĐ pH tối thích P-Xerin Bac.subtilis Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae E.coli DFP+ Xerin Kiềm P-tiol Streplococcus Clostridium histoly-ticum Indoaxeta-mit Ps.cloromer-curbenzoat -SH 7,5 7,0 P-kim loại Bac.subtilus Bac.subtilus NRRL B3411 Bac. Subtilisamy Losaccarilicis Bac. Megaterium Psuedomonasaeruginoa Atreptomeces naraensis Asp. Oryzae Acremonium kiliense Clostridiumhisttolytium EDTA++ 1,10octa-fenantrolin Kim loại hóa trị hai Trung tính P-Acid Asp.niger Asp.Awamori Sailoi,penicillium Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica Dizoaxetil Dlnorlox-inmetil este COOH Acid 1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [5] Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S enzyme – S enzyme – S + P1 enzyme + P2 Hình 1.4. Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 2. Nguồn thu nhận Protease [3] Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3]. Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau: Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao. Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắt khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác. Vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [5]. Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học. Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. 3. Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 3.1. Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến. - Phương pháp biến nạp. - Phương pháp tiếp hợp gene. - Phương pháp tải. 3.2. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 3.2.1. Nguồn cacbon [1],[9] Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. 3.2.2. Nguồn nitơ [1]. Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22 - 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung. Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp protease VSV. 3.2.3. Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1] - Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. +Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi vi sinh vật. + Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. + Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất. 3.3. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt [3] Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. - Ưu, nhược điểm + Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. + Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20 tấn/ngày. + Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn. 3.4. Thu nhận enzyme (E) 3.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3] Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào. - Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. + Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. - Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. - Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. - Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. - Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như: + Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi. + Để tế bào tự phân hủy. + Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ. + Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp. - Thẩm tích [8] Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc ký ái lực… người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm, chứa dịch chiết E, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hòa tan cần được loại bỏ. Chất hòa tan khuếch tán ra khỏi màng cho đến khi nồng độ chất hòa tan trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ bằng nhau. - Làm đặc [8] Trong quá trình tinh sạch enzyme, có thể phải làm đặc dịch E, nhất là sau khi qua giai đoạn sắc ký dịch chứa enzyme đã bị pha loãng ra nhiều. Làm đặc dịch chứa enzyme bằng cách cho bốc hơi trong chân không, bằng cách thẩm thấu ngược (tạo áp suất thẫm thấu làm cho dung dịch đi qua một màng bán thấm và giữ lại các protein E) hoặc bằng siêu lọc (dung dịch enzyme được dẫn qua một màng có lỗ nhỏ bằng áp suất hoặc bằng ly tâm). 4. Quy trình thu nhận enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae [8],[18] 4.1. Quy trình thu nhận Thu nhận sinh khối (enzyme thô) Chế phẩm enzyme thô đem tinh chế Nghiền mịn Trích ly Chế phẩm ezyme thô đem sử dụng Khoáng hỗn hợp Nguyên liệu dinh dưỡng (bột bắp, cao nấm men, pepton) Hấp thanh trùng Làm nguội đến 300C Nước Đỗ lên khay Giống Asp.oryzae Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng 0,5-2% Dùng trong chăn nuôi Lọc Kết tủa enzyme Thu nhận kết tủa Sấy Tinh chế Bã Chế phẩm ezyme Kỹ thuật Thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết Sấy Hình 1.5. Quy trình thu nhận enzyme protease 4.2. Thuyết Minh Quy Trình và đề xuất thiết bị 4.2.1. Lý do chọn chủng nấm mốc Asp.oryzae Asp. oryzae là một loại nấm vi thể thuộc bộ Plectascales, lớp Ascomycetes. Cơ thể sinh trưởng của nó là một hệ sợi bao gồm những sợi rất mảnh, chiều ngang 5 - 7µm, phân nhánh rất nhiều và có vách ngang , chia sợi thành nhiều bao tế bào (nấm đa bào). Đặc điểm của giống Asp.oryzae giàu các enzyme thủy phân nội bào và ngoại bào (amylase, protease, pectinasa,…), ta rất hay gặp chúng ở các kho nguyên liệu, trong các thùng chứa đựng bột, gạo…đã hết nhưng không được rửa sạch, ở cặn bã bia, bã rượu, ở lỏi ngô, ở bã sắn… Chúng mọc và phát triển có khi thành lớp mốc, có màu sắc đen, vàng… Màu do các bào tử già có màu sắc. Các bào tử này, dễ bị gió cuốn bay xa và rơi vào đâu khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành mốc mới. 4.2.2. Kỹ thuyật nuôi cấy Sau khi đã trộn giống, môi trường được trải đều ra các khay với chiều dài 2 - 3cm, rồi được đưa vào phòng nuôi cấy, đặt trên những giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí. Nhiệt độ thích hợp cho nấm sợi phát triển là 28 - 320C. Nhiệt độ thấp quá hoặc cao quá đều ảnh hưởng không tốt cho nấm sợi phát triển. Trong quá trình nuôi cấy, ta hoàn toàn không cần điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít khi ảnh hưởng đến toàn bộ khối môi trường. Thời gian nuôi nấm sợi thu nhận enzyme vào khoảng 36 - 60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng nấm mốc Asp.oryzae và điều kiện môi trường cũng như phụ thuộc vào điệu kiện nuôi cấy. Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau: Ø Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10 - 14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Enzyme mới bắt đầu đươc hình thành. Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 300C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Ø Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 - 18 giờ. Enzyme protease được tổng hợp mạnh. Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29 - 300C là tốt nhất. Ø Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10 - 20 giờ. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20 - 25 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ. Nhiệt dộ nuôi duy trì ở 300C, trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó lượng Enzyme protease tạo ra sẽ giảm xuống. Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzym rất cần thiết. 4.2.3. Thu nhận sản phẩm Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là chế phẩm enzyme thô. Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau: Ø Nghiền mịn Toàn bộ khối lượng enzyme thô protease được đem đi nghiền nhỏ. Mục đích của qúa trình này là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật. Ø Trích ly Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc (chú ý cần loại bỏ cát thạch anh và bột thủy tinh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn). Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy. Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này. Ø Kết tủa enzyme protease Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa. Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon. Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác. Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme. Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính. Các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70% W). Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyme protease ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 - 8% W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương). Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài enzyme ta quan tâm. 4.2.4. Đề xuất thiết bị Hình 1.6. Nồi hấp khử trùng. môi trường Ø Nồi hấp khử trùng môi trùng Mục đích của quá trình thanh trùng là tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật tạp nhiểm còn tại trong môi trường dinh dưỡng, ngoài quá trình gia nhiệt sẽ làm cho môi trường dinh dưỡng chuyển hóa vi sinh vật dễ dàng đồng hóa chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. Ta tiến hành thanh trùng trong thời gian 45 - 60 phút, áp suất 1at, nhiệt độ 118 – 1250C. Ø Máy nghiền búa Loại thiết bị này được dùng để nghiên cứu các chủng nấm mốc. Sản phẩm ban đầu có kích thước các tiểu phần nhỏ đến 50 mm qua đoạn ống ở trên nắp của thiết bị, được cho vào tâm rôto một cách liên tục, dưới tác động của lực ly tâm sản phẩm qua khoảng giữa các búa bị va đập nhiều lần và bị vỡ ra. Hình 1.7.Thiết bị nghiền búa Hình 1.8. Máy trích ly kiểu vít tải Ø Máy trích ly Để trích ly enzyme, acid amin và các chất khác từ vật liệu rắn trong điều kiện sản xuất lớn, người ta ứng dụng trích ly tác động liên tục. Bộ nạp liệu kiểu vít tải chuyển pha rắn của canh trường nấm mốc vào phần trên của cột nạpliệu. Canh trường nấm mốc từ cột nạp liệu qua cột chuyển nằm ngang vào cột nâng và sau khi vắt thì thải ra ngoài. Nước dâng lên trong cột nạp liệu được bảo hòa liên tục và sau khi qua bộ lọc thì đưa ra ngoài. Thời gian trích ly 40 - 60 phút ở 250C. Ø Máy sấy phun sương Hình 1.9. Máy sấy phun sương LPG Hình 1.10. Thiết bị sấy phun hình đáy bằng Không khí đi qua bộ lọc và bộ gia nhiệt được đưa vào bộ phân phối không khí ở trên đỉnh thiết bị; khí nóng được đưa vào buồng sấy đều theo hình xoáy trôn ốc. Nguyên liệu dạng lỏng từ máng nguyên liệu đi qua bộ lọc được bơm lên bộ phun sương ở trên đỉnh của buồng sấy làm nguyên liệu trở thành dạng hạt sương cực nhỏ, khi tiếp xúc với khí nóng, lượng nước có trong nguyên liệu nhanh chóng bay hơi, nguyên liệu dạng lỏng được sấy khô thành thành phẩm trong thời gian cực ngắn. Thành phẩm được phần đáy của buồng sấy và bộ phân li gió xoáy đùn ra ngoài, phần khí thừa còn lại được quạt gió hút và đẩy ra ngoài. Ø Thiết bị lọc Máy lọc chân không dạng thùng quay: Loại này được ứng dụng để tách sinh khối vi sinh vật khỏi dung dịch canh trường. Chất lỏng canh trường chảy vào nhánh trên của băng tải và khi chuyển dịch trên các phòng chân không, phần chiết qua lỗ lọc vào các khoang, còn các tiểu phần rắn của huyền phù bị giữ lại trên bề mặt của băng tải. Hình 1.11. Sơ đồ thiết bị lọc chân không dạng thùng quay tác động liên tục 5. Tình hình nghiên cứu enzyme protease 5.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [3]. Và gần đây nhất là những sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như: + Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1; pH 9,5; nhiệt độ 350C; thời gian chiết 10 phút. [12]. + Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Protease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [13]. + Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [14],[4]. + “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C. + Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993 - 1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [5] 5.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [9]. Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin… [9]. Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [9]. Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sữa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da, Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là một trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [11]. Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5% - 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4], [1]. Enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Chương 2. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ THIẾT BỊ I. Đối tượng nghiên cứu 1.Giới thiệu nguyên liệu [6] Nguyên liệu chính dùng để sản xuất bia là malt đại mạch, hoa houblon, nước và sử dụng nguyên liệu thay thế là ngô, gạo. 1.1. Malt đại mạch 1.1.1. Vai trò của malt trong sản xuất bia Trong công nghiệp sản xuất bia malt là nguồn nguyên liệu chủ yếu được dùng để sản xuất bia vì vậy nó có vai trò rất quan trọng trong công nghiệp sản xuất bia. Thành phần của malt là những nhân tố quyết định đến chất lượng của bia thành phẩm sau này, chúng giúp cho bia có hương vị đặc trưng, có vị đắng dịu hài hòa tạo cảm giác thú vị cho người sử dụng. Trong thành phần của malt có chứa một lượng Enzyme khá phong phú. Trong những điều kiện thuận lợi về nhiệt độ, pH thì các Enzyme này hoạt động mạnh phân cắt các hợp chất hữu cơ có phân tử lớn thành những hợp chất có phân tử lượng thấp. Mặc khác trong thành phần của malt có chứa nhiều tinh bột, các đường đơn, protein, các sắc tố tạo màu, mùi, vị làm cho bia có hương vị đặc trưng. Malt đại mạch vừa là tác nhân đường hoá, vừa là nguyên liệu đặc trưng dùng sản xuất bia, bia sản xuất từ malt đại mạch có mùi vị và tính chất công nghệ hơn hẳn so với bia được sản xuất từ malt của các loại hạt hoà thảo khác. Một số đặc tính của malt Malt là một loại ngũ cốc được sản xuất từ lúa đại mạch. Malt đại mạch gieo trồng là loại thực vật xếp vào họ hordeum gồm: hordeum sativum, hordeum murium, hordeum jubatum… Tùy theo mục đích sử dụng mà malt đại mạch được chia thành 2 nhóm: đại mạch mùa đông (gieo hạt mùa đông, thu hoạch mùa hè) và đại mạch mùa xuân (gieo hạt mùa xuân, thu hoạch mùa thu). Thường chu kỳ sinh trưởng của đại mạch 100 – 120 ngày. Trong công nghiệp thì người ta thường dùng dại mạch để chế biến bia là giống đại mạch 2 hàng (hordeum distichum). Dấu hiệu đặc trưng của đại mạch Trong nông nghiệp người ta dùng đại mạch làm thức ăn gia súc chăn nuôi hoặc hai hàng là hình dáng rất cân đối tùy thuộc vào tư thế và đặc điểm của bông. Đại mạch hai hàng được chia thành ba nhóm nhỏ: đại mạch bông cúi, bông đứng và bông xòe. Đại mạch bông cúi có đặc điểm là trục bông rất dẻo, gié của hạt dài, sau khi trổ hoa và làm đòng thì bông bắt đầu cúi xuống. Đại mạch bông đứng có đặc điểm là cây to cứng, bông dày hạt. Loại này được trồng nhiều ở một số nước Tây Âu. Đại mạch bông xòe thì có gié rất ngắn, có hạt dường như được tính vuông góc với trục bông chủ yếu trồng nhiều ở Anh, Ailen và Bắc Mỹ chế biến thức ăn cho gia súc, gia cầm,…thường dùng đại mạch đa hàng (hordeum polystychum). Giống đại mạch đa hàng này được chia làm hai nhóm: đại mạch bốn hàng (H.hexatichum) và đại mạch sáu hàng (H. tetratichum) thông thường giống đại mạch bốn hàng cũng được dùng để sản xuất bia nhưng không được phổ biến. Hình 1.12. Đại mạch hai hàng Hình 1.13. Đại mạch nhiều hàng 1.1.2. Thành phần cấu tạo của malt Hạt của malt đại mạch có ba bộ phận chính: vỏ, nội nhũ và phôi. Ø Vỏ Vỏ hạt chiếm tỉ lệ khá lớn nhưng không có giá trị dinh dưỡng. Đối với công nghệ sản xuất bia vỏ hạt gây ảnh hưởng hai mặt: mặt bất lợi là trong vỏ có chứa các chất màu,các chất đắng và các chất chát nếu các chất này hòa tan vào dịch đường sẽ làm giảm chất lượng của sản phẩm. Mặt lợi của lớp vỏ là đóng vai trò xây dựng màng lọc trong quá trình tách bả khỏi khối cháo. Vỏ hạt đại mạch từ ngoài vào trong chia làm ba lớp: vỏ trấu, vỏ quả, vỏ hạt. Phần này chiếm từ 8 - 15% trọng lượng hạt. Vỏ trấu là cấu tử chiếm nhiều nhất trọng lượng của vỏ, nó được hình thành từ đài hoa. Đài hoa dưới hình thành nên vỏ trấu phía ngoài (phía lưng) và kết thúc bằng sợi râu, còn đài hoa hình thành nên vỏ trấu phía trong (phía bụng) của hạt…Đài hoa là công cụ để bảo vệ các cơ quan bên trong của hạt trong quá trình hình thành và chuyển hóa của nó. Thành phần hóa học của vỏ trấu chủ yếu là xellulose kết chặt lại nhờ chất khoáng và linhin. Dưới lớp vỏ trấu là lớp vỏ quả được cấu tạo từ lớp tế bào, cứ một lớp xếp ngang thì tiếp đến là một lớp xếp dọc. Với cấu trúc như vậy lớp vỏ quả sẽ rất dai và bền vững. Dưới lớp vỏ quả là lớp vỏ hạt bai gồm hai lớp tế bào, tế bào của lớp ngoài có thành rất dày, lớp trong thì trong suốt. Lớp vỏ hạt có vai trò như một màng bán thấm: chỉ cho nước thấm vào bên trong hạt đồng thời giữ các chất hòa tan trong hạt không cho thấm ra ngoài. Lớp vỏ quả và lớp vỏ hạt liên kết chặt với nhau, mối liên kết đó chắt hơn rất nhiều so với sự liên kết giữa chúng với lớp vỏ trấu. Ø Nội nhũ hạt: Nội nhũ hạt là thành phần lớn nhất đồng thời là phần có giá trị nhất của hạt, chiếm từ 45 – 68% trọng lượng hạt. Phần này của hạt đại mạch giữ vai trò quyết định đến chất lượng của đại mạch trong sản xuất bia. Ngoài cùng của nội nhũ tiếp giáp với lớp vỏ hạt là lớp aloron. Lớp aloron này rất giàu protein, chất béo, đường xelluloza, pentoza, vitamin và chất tro. Dưới lớp aloran mới đến phần nội nhũ thật của hạt. Cấu trúc của nội nhũ gồm các tế bào lớn có thành mỏng chứa đầy các hạt tinh bột, một ít protein, xelluloza, chất béo, tro và đường. Các hạt tinh bột trong nội nhũ malt có dạng hình tròn có kích thước rất lớn 20 - 30 mm hoặc rất bé từ 2 – 10 mm có rất ít những hạt có kích thước trung bình, trọng lượng riêng của hạt tinh bột khá cao 1,5 – 1,6 vì vậy chúng lắng xuống nhanh, tinh bột không tan trong nước kể cả những dung môi hữu cơ trung tính, có nhiệt độ hồ hóa là . 75 – 800C. Ngoài thành phần là tinh bột còn có chứa một số tạp chất khác như nito 0,5 – 1,5%; tro 0,2 – 0,7%; axit béo 0,6%. Cấu tạo tinh bột gồm hai dạng polysacharide: amylo và amypectin. - Amylo: chiếm từ 17 -24% trọng lượng tinh bột là một polyme ở dạng xoắn – thẳng gồm 60 – 600 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu oxy & - 1,4 glucozit. - Amylopectin: chiếm từ 76 – 83% trọng lượng tinh bột, là một polyme ở dạng xoắn –nhánh gồm khoảng 2000 gốc glucoza được nối với nhau qua cầu oxy - 1,4 glucozit ở mạch chính và - 1,6 glucozit ở mạch nhánh. Tinh bột sẽ chịu tác động xúc tác của hệ enzyme amylaza, hiệu quả xúc tác này sẽ tùy thuộc vào nhiệt độ và pH. Ø Phôi Phôi là cơ quan sống, hô hấp của hạt. Phôi thường chiếm 2,5 – 5% trọng lượng hạt. Trong phôi có từ 37 - 50% chất khô là thành phần nito, khoảng 7% chất béo, 5 – 6% đường saccaroza, 7 – 7,5% pentoza, 6 – 6,5% chất tro và một ít thành phần khác. Vai trò của phôi có tầm quan trọng đặc biệt không những đối với sự sống lưu truyền của cây mà ngay cả trong công nghiệp sản xuất bia. Quá trình chế biến hạt đại mạch để trở thành hạt malt được đặt nền tảng trên sự nảy mầm của hạt, tức là sự phát triển của phôi. Trong giai đoạn này quá trình sinh học chủ yếu xảy ra là sự hoạt hóa và tích lũy hoạt lực của enzyme trong hạt. Nhờ quá trình này mà một chất dinh dưỡng cao phân tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân tử. Một phần các chất thấp phân tử này được chuyển về phôi để nuôi cây non, phần còn lại tồn tại trong hạt để sau này biến thành chất hòa tan của dịch đường. Phôi nằm ở phía dưới gần đế của hạt bao gồm phôi lá , phôi rễ và nằm giữa chúng là phôi thân. Tiếp giáp giữa phôi và nội nhũ là lớp ngù. Ngù là một lớp màng bán thấm: nó chỉ cho phép các chất hòa tan từ nội nhũ thấm qua để chuyển về phôi và nước từ phía phôi đi vào nội nhũ. 1.1.3. Thành phần hoá học của malt Thành phần hóa học của malt đại mạch rất phức tạp. Nó phụ thuộc vào giống đại mạch, điều kiện đất đai, khí hậu, kĩ thuật canh tác và điều kiện bảo quản.Thành phần hóa học của malt là nhân tố quyết định chất lượng của đại mạch để xem xét loại đại mạch đó có đủ tiêu chuẩn để sản xuất bia hay không. Ø Nước Thủy phần của đại mạch có ảnh hưởng lớn đến quá trình vận chuyển và bảo quản hạt. Hàm ẩm cao sẽ kích thích quá trình hô hấp và tự bốc nóng của hạt. Hai quá trình này là nhân tố quan trọng làm hao tổn chất khô. Thủy phần cao quá mức cho phép tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển. Đặc biệt nguy hiểm là các loại vi khuẩn hoại sinh gây thối rữa cho hạt. Đại mạch có thủy phần cao sẽ làm tăng chi phí vận tải một cách vô ích. Người ta xác định được hàm ẩm của đại mạch tăng 1% thì hiệu suất thu hồi chiết giảm 0.76%, hàm ẩm tối đa cho phép của đại mạch khi đưa vào bảo quản là 13%. Ø Gluxit Gluxit được chia làm bốn nhóm: mono, disacharide, trisacharide và polysacharide. Monosaccharide trong đại mạch bao gồm glucoza, fructoza và xitaza. Trong thành phần của disaccharide thì chủ yếu là saccharoza và maltoza còn thành phần của trisaccharude là đường rasinoza. Polysaccaride là hợp phần chiếm nhiều nhất trong thành phần gluxit của hạt đại mạch. Chúng bao gồm tinh bột, xelluloza, hemixelluloza, pentoza, amylan và các hợp chất hợp kẹo. Ba cấu từ có ý nghĩa quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất bia. Tinh bột Tinh bột là cấu từ chiếm vị trí hơn một nửa khối lượng chất khối lượng chất khô của đại mạch là chủng giống có chất lượng cao thì cao thì con số này có thể lên đến 70%. Trong công nghệ sản xuất malt và bia thì tinh bột có hai chức năng: - Thứ nhất nó là nguồn thức ăn dự trữ cho phôi. - Thứ hai nó là nguồn cung cấp hoà tan cho dịch đường trước lúc lên men. Tinh bột được phân bố ở nội nhũ và một phần rất ít ở phôi. Chúng tồn tại dưới dạng những khối lập thể, có kích thước khá bé ta gọi là hạt tinh bột. Hạt tinh bột của đại mạch có hai kích cỡ: hạt to và hạt bé. - Hạt to là hạt có kích thước đường kính khoảng 20 - 30 um, dạng hình cầu hoặc hình ovan. - Hạt loại bé có dạng hình cầu hay hình que, kích thước khoảng 2 - 10um. Tinh bột của hạt đại mạch có tỷ trọng 1.5 - 1.6, nhiệt lượng riêng là 0.27 kcal/kg, dễ kết lắng trong nước, quay mặt phẳng của ánh sáng phân cực sang bên phải có giới hạn góc quay là 201.5 - 204.30 Tinh bột không tan trong nước lạnh và các dung môi hữu cơ trung tính,khi tiếp xúc với nước thì tinh bột sẽ hút nước và trương nở. Tính chất hồ hóa của tinh bột có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ sản xuất bia vì tinh bột đã qua hồ hóa sẽ được đường hóa nhanh hơn và triệt để hơn. Tinh bột gồm hai polysaccharide hợp thành: amyloza và amylopectin: - Amyloza: chiếm từ 17 - 24% bao gồm từ 60 - 600 gốc glucoza liên kết với nhau qua cầu oxi và đến 1.4 - glucozit và tạo mạch thẳng: phía đầu là cực kín còn đầu kia là cực aldehit. Mạch amylose được xoắn theo vòng và có cấu trúc không gian giống một chiếc lò xo. Khi tiếp xúc với dung dịch ion thì chúng bị hấp thu vào khoảng không của chiếc lò xo này và tạo phức chức phản quang màu xanh. Khi cấu trúc lò xo này bị phá vỡ thì tính chất này cũng không còn. Amyloza có dạng tinh thể có phân tử lượng khoảng 10.000 - 100.000 đơn vị, dễ hòa tan trong nước nóng để tạo thành dung dịch không bền vững với độ nhớt khá thấp. Dưới tác dụng của enzyme amyloza mạch amyloza này sẽ bị phân cách thành các đường đơn giản maltoza và glucoza. - Amylopectin: chiếm khoảng 76- 83% được tạo nên bởi khoảng 2.000 gốc đường glucoza, xếp thành một trục chính, trên đó có nhiều mạch nhánh. Tại những điểm phân nhánh các gốc đường glucoza liên kết với nhau qua cầu nối oxi – 1.6 - glucozit, còn các điểm khác thì mối nối liên kết là oxi - 1.4 glucozit. Amylopectin là chất vô định hình với khối lượng phân tử từ 400.000 – 1.000.000 đơn vị. Nó không hòa tan trong nước nóng mà chỉ tạo thành hồ với tác dụng của dung dịch ion thì amylopectin chuyển thành màu tím. Trong mối trương giàu nước tinh bột bị thủy phân bởi hệ enzim amylaza để tạo thành đường dextrin, đường kép mantoza, một lượng ít glucoza và một số oligozaccharide này cùng với các dextrin bậc thấp hòa tan bền vững vào nước để trở thành chất hòa tan của dung dịch đường trước lúc lên men. Xelluloza Xenlluloza của hạt đại mạch được phân bố chủ yếu ở vỏ trấu và chiếm khoảng 20% chất khô của vỏ. Xenlluloza bao gồm khoảng 2.000 - 10.000 gốc glucoza, xấp xếp một mạch dài, xoắn lại thành từng chùm nên cấu trúc của xenllucoza rất dai và rất khó bị phân cắt trong môi trường thường. Xenllucoza không tan trong nước, hầu như không thay đổi gì về thành phần và cấu trúc trong suốt quá trình sản xuất bia. Xenllucoza đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình lọc dịch đường vì lớp vỏ trấu là vật liệu tạo màng lọc phụ rất hữu hiệu góp phần lọc trong bia hơn. Hemixelluloza Hemixelluloza là thành phần chủ yếu tạo nên thành tế bào, là một phức hệ bao gồm pentozan, hexozan và acid uronic. Dưới xúc tác của nhóm enzyme sitaza thì hemixelloza bị thủy phân thành hexoza (galactoza và manoza) và pentoza (arabinoza và xiloza), chúng hòa tan bền vững vào dung dịch đường và tạo thành chất chiết là nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho nấm men sử dụng. Quá trình phá vỡ thành tế bào bởi enzyme sitaza đóng vai trò quan trọng ở giai đoạn ươm mầm vì đây là bước đột phá để các enzyme khác xâm nhập vào bên trong tế bào. Các hợp chất pectin và các hợp chất dạng keo Các hợp chất dạng pectin được phân bố thành tế bào tạo ra màng trung gian chủ yếu là protopectin. Các chất dạng keo khi chúng hòa tan vào nước nóng thì tạo thành dung dịch có độ nhớt cao vì bản chất của nó là một hydratcacbon nên khi thủy phân cho sản phẩm là đường đơn galactoza và xitoza. Sự tồn tại của hợp chất pectin và các chất dạng keo trong dung dịch đường mang tính chất hai mặt: Mặt bất lợi gây cho dung dịch có độ nhớt cao nên khó lọc, mặt có lợi tạo cho bia có vị đậm đà, tăng khả năng tạo bọt và giữ bọt của sản phẩm. Saccharide thấp phân tử Saccharide chủ yếu là một số đường đơn và đường kép, cấu tử chiếm nhiều nhất là saccharoza tới 1,8% chất khô của hạt. Loại đường này phân bố ở phôi chiếm đến 5,5% trọng lượng của bộ phận này. Lượng glucoza và fructoza trong hạt đại mạch là không đáng kể, tổng lượng đường ngược khoảng 0,3 - 0,4% trong đó trọng lượng glucoza cao hơn một ít so với fructoza. Các loại đường đơn trong hạt đại mạch không nhiều nhưng có vai trò quan trọng đối với sự phát triển của phôi đặc biệt ở giai đoạn đầu của quá trình ươm mầm. 1.3.3. Các hợp chất chứa nitơ Hàm lượng các hợp chất chứa nitơ tuy chiếm tỷ lệ thấp trong đại mạch khoảng 9 - 10% so với lượng chất khô của hạt nhưng nó có vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất bia vì nó ở chừng mực nào đó chúng quyết định chất lượng của sản phẩm cuối cùng. Phần lớn các hợp chất này tồn tại dưới dạng cao phân tử chúng được gọi là protit, còn một phần rất nhỏ tồn tại dưới dạng phân tử thấp, dễ hòa tan, có các tính chất khác với nhóm cao phân tử. Protit Protit là chỉ số quan trọng thứ hai sau tinh bột để đánh giá xem lô hạt đó có đủ tiêu chuẩn để sản xuất bia hay không. Nếu hàm lượng cao quá bia dễ bị đục, rất khó bảo quản, nếu quá thấp quá trình lên men sẽ không triệt để, bia kém bọt, vị kém đậm đà và kéo theo nhiều chỉ số non yếu khác. Hàm lượng protit tốt nhất cho sản xuất bia là 8 - 10%. Protit phân bố chủ yếu ở lớp vỏ alơron và phôi, một phần nhỏ ở tế bào xung quanh nội nhũ. Sự thủy phân protit là một trong những quá trình quan trọng nhất trong công nghệ sản xuất malt và bia vì các sản phẩm của quá trình này đều đóng vai trò nhất định, đặc biệt là sản phẩm tạo thành do quá trình tương tác giữa sản phẩm thủy phân của các hợp phần trong nội nhũ như melanoid-một hỗn hợp vàng óng, có vị ngọt và thơm dịu, là nhân tố quyết định hương và vị của bia đen. Khả năng tạo bọt và giữ bọt cũng như độ bền keo của chúng phụ thuộc vào mức độ thủy phân của protit và tỉ lệ các cấu tử sản phẩm tạo thành trong quá trình thủy phân. Protit trong đại mạch được chia thành hai nhóm: protit đơn giản hay gọi là protein và protit phức tạp còn gọi là proteid. Các đại diện tiêu biểu của protein là levkozin, edestin, hodein và glutein. Còn proteid là những hợp chất được tạo thành từ một phân tử có bản chất prtein và một khác có bản chất phi protein đại diện là nucleoproteid, lipoproteid, glucoproteid và phosphoproteid. Đặc điểm của proteid là kém hòa tan không bền vững gây ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng của sản phẩm do đó cần loại bỏ tối đa cấu tử này khỏi dịch đường là cần thiết nhưng cũng rất khó khăn. Các hợp chất chứa nitơ và phi protit Các đại diện tiêu biểu của nhóm này là albumoza, penton, pentid, polypentid và acid amin. - Albumoza và penton có vai trò rất lớn trong việc tạo và giử bọt, đồng thời làm tăng thêm vị đậm đà của bia, nhưng ở hàm lượng cao sẽ làm giảm độ bền của keo của bia gây đục bia. - Peptid là hỗn hợp nhiều hợp chất mà phân tử của chúng cũng được tạo thành từ các gốc acid amin nhưng ít hơn nhiều so với albumoza và penton. Căn cứ vào số gốc acid amin hợp thành, chúng được chia ra: di-, tri- và polypeptid chúng dễ dàng hòa tan vào dịch đường tạo thành dung dịch bền vững tồn tại trong bia như một thành phần dinh dưỡng. - Acid amin tự do tồn tại trong đại mạch với một lượng không nhiều khoảng 0.1% so với lượng chất khô của hạt. Tuy chiếm tỉ lệ nhỏ nhưng vai trò của nó trong công nghệ sản xuất bia lại rất lớn: là nguồn cung cấp chất nitơ cho nấm men, là tác nhân chính tạo melanoid, tham gia tạo bọt và tồn tại trong bia như một thành phần dinh dưỡng quan trọng. 1.3.4. Các hợp chất không chứa nitơ Bao gồm các hợp chất hữu cơ và vô cơ không chứa nitơ, chúng hòa tan thành dung dịch khi chiết ly bằng nước các đại diện tiêu biểu polyphenol, chất đắng, fitin, acid hữu cơ, vitamin và chất khoáng. Polyphenol và chất đắng Polyphenol tập trung chủ yếu ở lớp vỏ hạt đại mạch, phần lớn là những hợp chất hòa tan được và tồn tại trong bia đều là những dẫn xuất của catechin thuộc nhóm flavonid. Những hợp chất này dễ dàng kết hợp protit cao phân tử để tạo phức chất dễ kết lắng, làm tăng độ bền keo của sản phẩm. Tuy nhiên sự hòa tan của polyphenol vào dịch đường lại là nhân tố làm xấu đi hương vị của bia. Chất chát và chất đắng trong đại mạch thuộc nhóm lipoid là nhân tố chính gây ra vị đắng khó chịu cho bia. Hầu hết các chất đắng, chất chát, polyphenol và các chất màu của hạt được phân bố chủ yếu ở lớp vỏ, muốn loại trừ chúng thì ngâm hạt trong môi trường kiềm nhẹ. Fitin Fitin là muối đồng thời là của canxi và magie với acid inozitphosphoric C6H6O6(H2PO3)6. Chúng tập trung chủ yếu ở lớp vỏ và chiếm 0,9% chất khô của vỏ. Khi bị thủy phân sẽ tạo thành inozit C6H6(OH)6 và acid phosphoric. Hợp chất cuối cùng này là nguồn cung cấp phospho cho nấm men, đồng thời làm tăng độ chua tác dụng của dịch cháo ở giai đoạn đường hóa. Vitamin Trong đại mạch có nhiều loại Vitamin B1, B2, B6, C, tiền vitamin A, E, acid pantotenic, biotin, acid pholievic và nhiều dẫn xuất vitamin khác. Mặc dù chiếm tỷ lệ ít nhưng chúng có vai trò rất quan trọng trong công nghệ sản xuất malt vì chúng là nhân tố điều hòa sinh trưởng của mầm. Chất khoáng Các chất khoáng trong đại mạch đóng vai trò quan trọng trong quá trình sản xuất malt và bia đặc biệt là phospho vì nó đóng vai trò chủ yếu trong việc hình thành hệ thống đệm của dịch đường. 1.3.5. Chất béo và lipid Hàm lượng chất béo và lipoid trong hạt đại mạch giao động trong khoảng 2,5 - 3% lượng chất khô của hạt. Chúng tập trung chủ yếu ở phôi và lớp alơron. Chúng là những dầu béo màu vàng - cà phê nhạt, có mùi thơm rất nhẹ và dễ chịu. Thành phần chủ yếu của các loại dầu béo. Thành phần chủ yếu của các loại chất béo trong đại mạch là este của glyxerin với các acid béo bậc cao. Ở giai đoạn ươm mầm một phần chất béo và lipoid bị thủy phân bởi enzyme lipaza, một số sản phẩm thủy phân được chuyển đến phôi để nuôi cây non, số còn lại tồn tại trong dịch đường hoặc bị thải ra ngoài theo bã malt. Chất béo và lipoid tồn tại trong bia sẽ làm giảm độ bền keo của sản phẩm. 1.3.6. Enzyme Enzyme là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học rất cao, có cấu tạo phân tử rất phức tạp và giữ vai trò đặc biệt trong công nghệ sản xuất bia. Trong hạt đại mạch có chứa một lượng enzyme khá phong phú, chúng được xếp vào hai nhóm: nhóm enzyme thủy phân và nhóm enzyme oxi hóa khử. Ø Nhóm enzyme thủy phân (Hydrolaza) Cacbohydraza Nhóm enzyme này thủy phân các glucoxit cao phân tử thành các sản phẩm thấp phân tử hơn. Trong nhóm này có chia nhóm nhỏ là polyaza và hexozidaza. - Hexozidaza là những enzyme tham gia xúc tác thủy phân disacharide, trisacharide và một số glucozid khác thành các đường đơn. - Polyaza là những enzyme thủy phân gluxit cao phân tử amylaza (diastaza) và sitaza. +Amylaza phân cắt tinh bột thành các sản phẩm dạng đường và dextrin. Amylaza bao gồm hai enzyme là - amylaza và β - amylaza. * Enzim - amylaza phân cắt các tinh bột thành glucoza và dextrin làm cho độ nhớt của dịch cháo nhanh chóng giảm xuống, chúng chỉ được hoạt hóa trong giai đoạn ngâm và ươm mầm. Là enzyme chịu nhiệt tốt nhất, nhiệt độ tối thích là 700C, pH=5,7. * Enzim β - amylaza tác động trực tiếp lên mạch amyloza, mạch nhánh và hai đầu mạch chính của amylopectin. Sản phẩm của quá trình phân cắt này là đường maltoza và dextrin. Nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động là 630C, pH = 4.7. + Sitaza gồm hai enzyme sitolactaza và sitolitaza. Enzyme đầu thủy phân hemixelluloza thành các sản phẩm trung gian, còn enzyme sau thủy phân các sản phẩm trung gian thành các sản phẩm cuối cùng là pentoza và hexoza. Nhờ có quá trình phân cách này mà tế bào mới bị phá hủy tạo điều kiện thuận lợi cho các enzyme khác xâm nhập vào và nâng cao hoạt lực. Proteaza Thủy phân các sản phẩm trung gian và một số trong các chất này tiếp tục bị phân cách đến các sản phẩm cuối cùng là acid amin và amoniac NH3. Proteinaza thúy phân thành albumoza và pepton, chúng tiếp tục bị phân cắt thành peptit, polypeptid. Enzyme hoạt động tốt ở pH = 4.6 - 5.0 và nhiệt độ là 500C. Peptidaza gồm hai enzyme dipeptidaza và polypeptidaza, chúng tác động lên dipeptid và polypeptid để phân cắt chúng thành acid amin. Enzyme này hoạt động mạnh nhất ở pH = 7.5 và nhiệt độ là 50 - 520C. Nếu pH < 5 enzyme này trở thành vô hoạt. Amidaza cắt nhóm amin khỏi acid amin để tạo thành acid hữu cơ và giải phóng NH3. Chúng có thể phá vỡ liên kết peptid (- CO-NH-) của các amin để phá hủy chúng. Esteraza Enzyme này phân cắt mối liên kết este giữa các hợp chất hữu cơ khác nhau hoặc các hợp chất hữu cơ và vô cơ. Chúng chia làm hai nhóm: lipaza và phospataza. - Lipaza phá vỡ liên kết este giữa rượu đơn hoặc đa chức với các acid bậc cao. Enzyme này được phân bố chủ yếu ở phôi và lớp alơron, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động là 350C, pH = 5. - Amilophosphataza tham gia hỗ trợ thủy phân tinh bột, chúng cắt mối liên kết este của acid phosphoric trong phân tử amylopectin nhờ vậy mà tinh bột được hồ hóa một cách dễ dàng. Nhiệt độ tối ưu là 700C, pH = 5,6. - Fitaza có chức năng phá vỡ liên kết este giữa acid phosphoric với inozit, tức là chúng tham gia thủy phân fitin. Quá trình này đóng vai trò quan trọng vì H3PO4 được giải phóng sẽ làm tăng độ chua tác dụng và tăng cường lực đệm của dịch đường. Ø Nhóm enzyme oxy hóa khử (Decmolaza) Nhóm enzyme này xúc tác phản ứng oxy hóa khử của quá trình hô hấp và phân giải yếm khí gluxit, nghĩa là chúng tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của tế bào. Nhóm enzyme này đóng vai trò quyết định trong việc hoạt hóa và phát triển của phôi ở giai đoạn ươm mầm. Một số enzyme khác trong nhóm này còn tham gia vào phản ứng oxy hóa khử các hợp chất poliphenol, protein và các hợp chất khác vì vậy chúng đã gây ảnh hưởng gián tiếp đến các chỉ số chất lượng của dịch đường và bia thành phẩm tiêu biểu là dehidraza, oxydaza và catalaza. 1.3.7. Yêu cầu về chất lượng Malt dùng để sản xuất bia phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Sạch, có mùi thơm đặc trưng, có vị ngọt, màu vàng sáng đồng đều. Không được có mùi vị lạ, không mốc, không hôi khói. - Kích thước hạt malt phải đồng đều: hạt trên sàng 2,8 mm và chiếm 94%, hạt dưới sàng 2,2 mm không quá 0,5%. - Khối lượng riêng của malt: 520 ÷ 600 g/l - Độ ẩm của malt không quá 6% - Malt có thời gian đường hoá 10 ÷ 35 phút, hoạt lực amylaza là 100 ÷ 300 đơn vị. Malt sau khi nhập từ nước ngoài về được bảo quản trong kho với thời gian dự trử sản xuất khoảng một tháng. 1.2. Nguyên liệu thay thế đại mạch 1.2.1. Giới thiệu chung về nguyên liệu thay thế Hình 1.14. Nguyên liệu thay thế Ngoài đại mạch là nguyên liệu chủ yếu được dùng trong sản xuất thì trong công nghiệp sản xuất bia người ta còn đưa ra một số nguyên liệu khác để thay thế. Mục đích: - Giảm giá thành sản phẩm. - Cải thiện một vài tính chất của sản phẩm. - Tạo ra chủng loại bia có mức độ phẩm chất khác nhau. - Đáp ứng yêu cầu đơn đặt hàng của người tiêu dùng. Các loại nguyên liệu thay thế có thể được chia làm hai nhóm: nhóm dạng hạt và nhóm dạng đường. Nhóm dạng hạt thường là các hạt thường loại cốc dùng để thay thế malt đại mạch chủ yếu là gạo, ngô, tiểu mạch…Các loại hạt này thường đưa vào chế biến cùng với bột malt dưới dang bột nghiền mịn. Nhóm dạng đường thường là đường saccharoza và glucoza. Đường saccharoza có nhiều trong mía và củ cải đường, lượng saccharoza đưa vào thay thế không quá 20% so với lượng chất khô đã được trích ly từ malt vào dịch đường. Hai loại đường này đưa vào sử dụng ở dạng hạt tinh luyện. Còn đường glucoza (đường thủy phân) thu nhận bằng cách thủy phân tinh bột khoai tây hoặc tinh bột ngô bằng acid sau đó trung hòa ,lọc, cô chân không đến 77 - 84% chất khô. Lượng đường thủy phân thường dùng là 10 - 15%. 1.2.2. Vai trò của nguyên liệu thay thế Thực tế hiện nay thì có nhiều nhà máy bia sử dụng nguyên liệu thay thế là gạo điển hình là nhà máy bia Tân Hiệp Phát với tỷ lệ malt/gạo là 8/2.Gạo được coi là thế liệu hàng đầu trong sản xuất bia do hàm lượng gluxit và protein khá cao, khả năng chuyển hóa thành chất hòa tan tốt (có thể đạt đến 90% chất khô). 1.2.3. Đặc tính của nguyên liệu thay thế Cũng giống như malt đại mạch hạt khác bao gồm các bộ phận : Vỏ trấu, vỏ hạt, vỏ quả, lớp alơron, nội nhủ và phôi. Trong thành phần chất khô của gạo thì tinh bột chiếm 75% protein 8% , chất béo 1- 1,5%, xenluloza 0,5- 0,8%, chất khoáng 1- 1,2% . Qua thành phần của gạo ta thấy hàm lượng tinh bột cao, protein ở mức vừa phải còn chất béo và xenluloza ở giới hạn thấp vì vậy có thể nói gạo là một loại nguyên liệu thay thế khá lý tưởng cho việc sản xuất bia với lượng gạo thay thế đến 20% hoàn toàn có thể sản xuất được các loại bia có chất lượng hảo hạng. 1.2.4. Yêu cầu chất lượng của nguyên liệu thay thế Màu sắc đồng nhất . Không có hạt mốc,không có mùi lạ. Tỉ lệ tạp chất < 2%. Hàm lượng tinh bột > 65%. Hàm lượng protein 8%. Chất béo 1,9%. Xenluloza 0,9%. Độ hòa tan 79 - 80%. 1.3. Nước 1.3.1. Vai trò của nước trong công nghệ sản xuất bia Nước có vai trò quan trọng nó ảnh hưởng đến chất lượng của bia đặc biệt là hương vị của thành phẩm. Với một tỷ lệ lớn 77- 90% trong bia thành phẩm, nước được xem là một trong những nguyên liệu chính để sản xuất bia vì hàm lượng các chất hòa tan trong dung dịch đường trước lúc lên men là 10 – 13% trọng lượng đối với bia vàng và 16 –22% ở bia đen. Hình 1.15. Nước 1.3.2. Nước sử dụng trong nhà máy bia Ø Nước dùng để ngâm đại mạch Yêu cầu quan trọng nhất đối với nước dùng để ngâm đại mạch là không chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Mặc dù khi đại mạch đưa vào thùng ngâm không được sạch lắm song vi sinh vật trong nước gây tác dụng xấu đối với dại mạch nhanh hơn nhất là trong thời gian hạt bắt đầu trương nở. Ảnh hưởng của thành phần các muối trong nước đối với quá trình ngâm đại mạch qua hai chiều hướng: hòa tan các chất trong vỏ hạt và sau đó các muối hòa tan ngấm vào bên trong hạt. Muối trong nước ảnh hưởng đến những quá trình bên trong thời kì bắt đầu này mầm. Qua đó cho thấy ảnh hưởng của muối đến quá trình ngâm hạt rất phức tạp. Do đó nước dùng để ngâm đại mạch phải là nước mềm với môi trường acid yếu (pH = 6 – 7) riêng trong bước rửa hạt nên dùng nước có độ cứng tạm thời cao. Nếu nước có nhiều sắt và mangan nên loại bỏ bớt trước khi ngâm vì nó ảnh hưởng xấu trực tiếp đến hạt. Để rửa hạt tốt hơn và sát trùng nhiều trường hợp người ta cho thêm Ca(OH)2 vào nước ngâm. Ø Nước dùng để sản xuất dịch đường Thành phần và tính chất của nước ảnh hưởng đến mùi vị và một vài tính chất của bia. Các biacacbonat và cacbonat trong nước sẽ hòa tan những chất đắng trong vỏ malt tạo vị đắng khó chịu cho dịch đường và bia đặc biệt là NaCO3 và NaHCO3. Tất cả bicacbonat và cacbonat có trong nước dùng để chế biến dịch đường đều làm kém chất lượng của thành phẩm vì chúng có ảnh hưởng xấu đến các quá trình hồ hóa và đường hóa. Ø Nước dùng để rửa men và thiết bị Giống như nước dùng để ngâm đại mạch, nước dùng để rửa men và thiết bị đòi hỏi phải sạch không chứa nhiều tạp chất hữu cơ và vi sinh vật. Đặc biệt các vi sinh vật và vi khuẩn có ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sản xuất bia, nên phải dùng thường xuyên kiểm tra bằng kính hiển vi, nếu lượng này nhiều quá phải sát trùng nước. Nước dùng để rửa thiết bị không được chứa NH3 các nitrit, nên dùng nước có độ cứng thấp đến độ cứng trung bình. Các cơ sở làm bia thường dùng hơi nước trực tiếp để gia nhiệt phải đảm bảo hơi nước đạt chất lượng thực phẩm. 1.3.3. Yêu cầu chất lượng của nước đối với công nghệ sản xuất bia Nước dùng trong lên men nói chung phải đạt tiêu chuẩn dùng cho nước uống, không có mùi vị lạ, không màu, trong suốt, đặc biệt không cho phép có mùi amoniac, vết của kim loại nặng (thủy ngân, bari…). Chỉ tiêu Yêu cầu Mùi vị Tinh khiết, không mùi Độ đục 1 – 9% pH 6.8 – 7.2 Độ mặn 11.7 mg/l Độ cứng tạm thời 0.72 mg/l Độ cứng vĩnh cửu 0.26 – 0.72 mg/l Độ kiềm tổng ≤ 4.0 (0F) Độ cứng tổng cộng ≤ 5.0 (0F) Hàm lượng muối CO32- <50 mg/l lit H2O Hàm lượng muối Mg2+ <100 mg/l lit H2O Hàm lượng clorua 75 – 100mg/l Hàm lượng CaSO4 130 – 200 mg/l lit H2O Hàm lượng Fe2+ < 0.2 – 0.5 mg/l Vi sinh vật <100 tế bào / 1 lít H2O Chỉ số E.coli < 3 tế bào/ 1 lit H2O NH3 và muối NO3- , NO2- Không được có Bảng 1.2. Một số chỉ tiêu chất lượng 1.4. Hoa houblon Hình 1.16. Hoa houblon 1.4.1. Vai trò Hoa houblon là nguyên liệu không thể thiếu được trong sản xuất bia. Làm cho bia có vị đắng dễ chịu, hương thơm đặc trưng, làm tăng khả năng tạo và giữ bọt, làm tăng độ bền keo và ổn định thành phần sinh học của sản phẩm. Trong sản xuất bia người ta sử dụng hoa cái chưa thụ phấn vì hoa đã thụ phấn sẽ tạo hạt làm giảm chất lượng bia. Hoa được sử dụng dưới nhiều dạng khác nhau: dạng hoa nguyên cánh, hoa viên, cao hoa,… Tuy nhiên, không sử dụng 100% cao hoa vì sẽ làm cho mùi, vị của bia bị giảm sút. Nhà máy sử dụng hoa houblon ở dạng hoa nguyên và dạng viên. Sử dụng hoa nguyên có ưu điểm là bảo toàn được chất lượng, nhưng đồng thời cũng có nhược điểm là giá thành cao, khó bảo quản. 1.4.2. Thành phần hoá học - Thành phần hoá học của hoa houblon gồm nhiều chất khác nhau, nhưng các chất có giá trị trong công nghệ sản xuất bia là nhựa hoa houblon, các tanin và tinh dầu. Ngoài ra trong hoa còn chứa một số các chất khác như: protein, mỡ, sáp, các tạp chất phi protein. - Nhựa hoa là thành phần chính, bao gồm nhựa cứng và nhựa mềm: Trong nhựa mềm gồm các dạng axit đắng là α, β, γ, δ - axit đắng. Vị đắng của bia chủ yếu là do α - axit đắng tạo nên, còn các dẫn xuất của β - axit đắng tạo nên vị đắng hài hoà dễ chịu. - Các chất tanin của hoa houblon là các polyphenol, dễ hoà tan trong nước, dễ bị oxi hoá nên nó bảo vệ nhựa hoa houblon. Trong quá trình nấu bia, hầu hết tanin của hoa houblon liên kết với protein của malt, do đó hàm lượng polyphenol ở trong bia chủ yếu là của malt và chỉ khoảng 10÷20% là polyphenol của hoa. - Tinh dầu hoa houblon là một hỗn hợp phức tạp của các hyđratcacbon và nhiều hợp chất chứa oxi dạng tecpen. Tinh dầu hoa houblon không hoà tan trong nước nhưng dễ bay theo hơi nước. Trong quá trình sản xuất khoảng 98% lượng tinh dầu bị bay hơi, chỉ tồn tại khoảng 2% để tạo hương thơm cho bia. Trong quá trình bảo quản, tinh dầu sẽ dần mất đi do bay hơi và bị oxi hoá. Do đó không dùng hoa cũ để sản xuất bia vì các sản phẩm chuyển hoá của tinh dầu nếu đưa vào bia sẽ làm giảm chất lượng bia. 1.5. Men bia Hình 1.17. Nấm men bia 1.5.1. Vai trò Nấm men có khả năng chuyển hóa đường thành cồn ethylic, khí cacbonic, nước, các sản phẩm trung gian và sản sinh ra nhiệt trong quá trình lên men. Ø Chủng loại nấm men trong sản xuất bia. Trải qua quá trình sàng lọc và phân lập rất kỹ lưỡng qua hàng trăm năm, một loại nấm men được lựa chọn để chuyên dùng trong sản xuất bia: đó là chủng nấm men Saccharomyces Cerevisiae, Saccharomysec Carlsbergensis. 1.5.2. Lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia Việc lựa chọn chủng nấm men trong sản xuất bia là việc hết sức quan trọng góp phần quyết định chất lượng của sản phẩm. Dưới đây là các đặc tính cơ bản mong muốn có đối với bất kì chủng nấm men nào dùng trong sản xuất bia: Tốc độ len men nhanh. Sử dụng đường có hiệu quả, tạo độ cồn cao. Có khả năng chịu cồn, áp suất thẩm thấu, oxy, nhiệt độ và nồng độ CO2 phù hợp với từng nhà máy. Có khả năng kết lắng tốt. Có khả năng sống sót cao cho khả năng tái sử dụng. Sản phẩm tạo ra bao gồm các hợp chất hương và vị đặc trưng cho bia. Đặc tính di truyền ổn định cao. II. Thiết bị trong sản xuất bia. Thiết bị. Hình 1.18. Hệ thống xử lý nguyên liệu Hình 1.19. Hệ thống xử lý nước nấu Hình 1.20. Thiết bị lên men. Hình 1.21. Hệ thống lò hơi. Hình 1.22. Nồi nấu hoa bia Hình 1.23. Hệ thống máy làm lạnh Hình 1.24. Hệ thống nồi nấu bia Hình 1.25. Hệ thống tank lên men Hình 1.26. Hệ thống chiết lon Hình 1.27. Hệ thống chiết chai 2. Nguyên lý hoạt động 2.1. Sơ đồ thiết bị nhà nghiền Hình 1.28. Sơ đồ thiết bị nhà nghiền 2.1.1. Nghiền gạo (Van V2, V7 đóng) Cảm biến mức trong thùng chứa gạo sẽ báo mức gạo, nếu mức gạo trong thùng nằm trong phạm vi cho phép thì hệ thống làm việc (nếu không đủ lượng gạo băng tải liệu hoạt động để cấp liệu). Van V3 đóng van V1 mở, gạo sẽ vào cân nếu khối lượng gạo đạt mức yêu cầu thì van V1 đóng van V3 mở máy nghiền hoạt động. Đồng thời van V4 mở để cho nước trộn cùng với gạo. Van V6 mở (van V7 đóng) máy bơm M2 sẽ đẩy nguyên liệu sang nồi nấu gạo. 2.1.2. Nghiền malt (Van V1, V6 đóng) Cảm biến mức trong thùng chứa malt sẽ báo mức malt, nếu mức malt trong thùng nằm trong phạm vi cho phép thì hệ thống làm việc (nếu không đủ lượng malt băng tải liệu hoạt động để cấp liệu). Van V3 đóng van V2 mở, malt sẽ vào cân nếu khối lượng malt đạt mức yêu cầu thì van V1 đóng van V3 mở máy nghiền hoạt động. Đồng thời van V4 mở để cho nước trộn cùng với malt. Van V7 mở (van V6 đóng) máy bơm M2 sẽ đẩy nguyên liệu sang nồi nấu malt. 2.1.3. Làm vệ sinh Quá trình làm vệ sinh máy thực hiện khi kết thúc một mẻ nấu, công đoạn làm vệ sinh được tiến hành như sau: Máy ngừng hoạt động, các van V1, V2, V3, V4 đóng. Van V5 mở để cho dịch CIP vào trong máy nghiền (hai lô nghiền) làm vệ sinh. Dịch CIP chính là dung dịch sút (NaOH) nồng độ loãng có tác dụng tẩy rửa. Van V6, V7 mở và bơm M2 hoạt động để bơm dịch CIP sang hai tank nấu gạo và malt, thực hiện làm vệ sinh nhà nấu. Quá trình nghiền gạo và malt được thực hiện riêng biệt, sau khi nghiền gạo hoàn thành thì mới nghiền malt hay ngược lại. 2.2. Sơ đồ thiết bị nhà nấu Nhà nấu gồm có hai tank lớn, trong đó một tank để nấu gạo và một tank để nấu malt. Gạo và malt từ nhà nghiền sẽ được đưa đến hai tank này có pha trộn với nước nhờ bơm M2, quá trình bơm nhiên liệu kết thúc khi cảm biến báo mức đầy trong tank có tín hiệu. Nhiệt để cung cấp cho nhà nấu là hơi nước nóng được gia nhiệt tại khu vực cung cấp nhiệt và CO2. Quá trình nấu được diễn ra trong một thời gian nhất định, nguyên liệu sẽ được gia nhiệt đến nhiệt độ không đổi và được duy trì nhiệt độ này trong thời gian nhất định. Quy trình nấu đòi hỏi yêu cầu kỹ thuật về thông số nhiệt độ là rất cao, độ chính xác nhiệt độ trong tank nấu là yếu tố góp phần quyết định chất lượng sản phẩm bia. Quá trình trao đổi nhiệt nhờ hệ thống ống dẫn hơi nước nóng, nguyên liệu đi từ trên xuống và hơi nước nóng đi theo chiều ngược lại từ dưới lên. Hình 1.29. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của tank nấu. Hoạt động đồng bộ cùng với quá trình nghiền, khi bắt đầu nghiền lò sẽ được gia nhiệt. Nguyên liệu từ nhà nghiền sẽ được bơm M2 chuyển sang, khi nguyên liệu vượt quá mức thấp thì lò bắt đầu hoạt động. Van V8 mở để tăng lượng nước vào tank lượng nước và nguyên liệu sẽ được pha trộn theo đúng tỷ lệ đã quy định.Thì van V12 mở hơi nước nóng theo hệ thống ống đi vào tank, quá trình gia nhiệt bắt đầu. Cho đến khi nguyên liệu vào đầy tank, cảm biến báo mức cao L1 có tín hiệu thì sẽ tạm dừng hoạt động nghiền nguyên liệu cần nấu và sẽ chuyển sang nghiền nguyên liệu khác, bơm M2 (bơm nguyên liệu từ nhà nghiền ) dừng hoạt động đồng thời van V9 đóng. Quá trình nấu bắt đầu, hơi nước nóng cung cấp nhiệt cho nhà nấu. Các cảm biến nhiệt độ có nhiệm vụ đo các thông số nhiệt độ và khối lượng được thể hiện trên panel điều khiển. Nhiệt độ trong tank nấu, có ba cảm biến nhiệt độ để tổng hợp nhiệt độ từ tank nấu nhằm tăng sự đồng đều nhiệt độ trong tank. Quá trình nấu kết thúc, van V12 đóng, van V10 mở đồng thời bơm M3 hoạt động để tháo nguyên liệu. Quá trình làm vệ sinh tank nấu tiến hành như sau: Khi kết thúc quá trình tháo nguyên liệu, tất cả các van sẽ đóng. Quá trình làm vệ sinh này tiến hành cùng với nhà nghiền, dịch CIP từ nhà nghiền theo van V9 chảy vào tank để làm vệ sinh tank. Đồng thời van V11 mở để tháo dịch CIP ra khỏi tank. Sau đó, van V8 mở để cho nước sạch chảy vào làm sạch dịch CIP còn lại trong tank. Van V11 mở để tháo sạch các chất còn lại trong tank. Tại nhà nấu có ba tank nấu, trong đó có hai tank nấu hoạt động giống hệt nhau là tank nấu gạo và malt. Một tank còn lại là nấu houblon để cung cấp dịch cho nhà lọc và đồng thời trộn với nguyên liệu sau khi nấu nhằm tạo hương vị và màu cho bia. Nguyên lý hoạt động của tank này cũng tương tự như trên. Tuy nhiên kích thước của tank này là không lớn, cho nên nó chỉ sử dụng một cảm biến đo nhiệt độ. Sau khi nấu xong, nguyên liệu gạo và malt sẽ được các bơm chuyển sang bộ phận lọc để loại bỏ bã nguyên liệu. Bộ phận lọc này có nhiệm xới trộn hai nguyên liệu trên lại với nhau trước khi lọc .Kết thúc quá trình lọc sẽ được dịch gạo và malt. Dịch gạo và malt tiếp tục chuyển đến tank trộn cùng với houblon để tạo hương vị bia chuẩn bị lên men. Ngoài ra khu vực nấu còn có một tank trung gian phòng khi sự cố nồi nấu thì có thể nồi còn lại nấu xong chuyển đến nồi trung gian chứa .Sau đó cho nguyên liệu còn lại vào tank để nấu tiếp. Nấu xong thì trộn hai nguyên liệu vào nồi lọc để tiến hành lọc bả và nước dịch. 2.3. Sơ đồ hoạt động của khâu trộn màu và houlon như sau Hình 1.30. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của khâu trộn. Nguyên lý hoạt động: Van V13, V14 (van V15 đóng) đồng thời mở cảm biến báo mức thấp L3 có tín hiệu, động cơ M4 quay tốc độ chậm cho đến khi nguyên liệu vào đầy. Cảm biến báo mức cao L4 có tín hiệu van V13, V14 đóng đồng thời động cơ M4 chuyển sang chế độ quay nhanh sau thời gian định trước. Sau thời gian này, động cơ M4 chuyển sang chế độ quay chậm van V15 mở, bơm M5 hoạt động chuyển dịch sang nhà lên men. Kết thúc chu kỳ trộn. 2.4. Quá trình lên men và lọc bia Khâu hạ nhiệt Dịch từ khâu trộn được bơm M5 chuyển đến nhà lên men. Trước khi đưa vào tank lên men thì dịch phải hạ nhiêt độ xuống còn 100c nhờ bộ phận hạ nhiệt. Hình 1.31. Quá trình hạ nhiệt. Quá trình hạ nhiệt bao gồm: Cánh tản nhiệt có nhiệm vụ thoát nhiệt. Ống dẫn nước lạnh ( nước được làm lạnh xuống 20c ). Ống dẫn dịch nước nha. Hình 1.32. Nguyên lý hoạt động Nguyên lý hoạt động: Dựa trên nguyên lý trao đổi năng lượng, nhiệt trong dịch sẽ truyền qua nước lạnh, cánh tản nhiệt ra ngoài môi trường. Lưu lượng dịch và nước lạnh sẽ được điều khiển bằng van lưu lượng V16, V17 đảm bảo dịch ra khỏi bộ phận hạ nhiệt đạt 100C. Dịch sau khi được hạ nhiệt độ, sẽ được chuyển đến một tank để trộn men. Sau khi quá trình trộn men kết thúc sẽ được đưa vào tank lên men. Trong nhà lên men có tổng cộng 12 tank lên men. Mỗi tank đều có cảm biến nhiệt độ (cặp nhiệt độ) để đo nhiệt độ, thiết bị điều khiển nhiệt độ. Quá trình lên men: Quá trình lên men được tóm tắt làm 4 giai đoạn chính: Giai đoạn đầu: Tạo bọt trắng và mịn xung quanh bề mặt dịch lên men, nấm men nảy chồi và phát triển, giai đoạn này kéo dài từ 1 – 5 ngày. Giai đoạn 2: Giai đoạn bọt rất thấp, có rất nhiều bọt đặc trắng, chật, bồng lên một lớp trên bề mặt dịch trong thời gian 1 – 2 ngày. Giai đoạn 3: Giai đoạn bọt cao, quá trình lên men diễn ra mạnh mẽ nhất, bọt xốp và bồng lên rất cao, bề mặt bọt chuyển từ trắng sang màu nâu. Giai đoạn này kéo dài 3 – 4 ngày. Giai đoạn cuối: Bọt bệt xuống, bề mặt bọt lên men phủ lớp màu nâu. Tế bào nấm men tạo thành lớp bông và lắng xuống đáy thùng. Sản phẩm thu được là bia non tiến hành tiếp quá trình ủ bia từ 6 – 10 ngày để nồng độ CO2, hàm lượng cồn diaxentin, độ axit ...đạt chỉ tiêu yêu cầu. Làm trong bia Để đạt được độ trong cần thiết phải tiến hành lọc làm trong bia. Có thể sử dụng nhiều thiết bị khác nhau và nhiều chất trợ lọc khác nhau. Lọc tách triệt để các phần tử rắn lóng, khuyếch tán trong bia, lọc loại bỏ hầu hết các vi sinh vật, kể cả nấm men, làm cho bia có độ trong sáng đúng yêu cầu chất lượng làm ổn định và gia tăng độ bền vững sinh học, hoá học. Các quá trình khác Ngoài ra trong nhà lên men còn có các tank chứa NaOH để làm vệ sinh cho các tank lên men sau khi kết thúc quá trình lên men. Kết thúc quá trình hoạt động tại nhà lên men và lọc, dịch sẽ chuyển thành bia. Sau đó bia được chuyển đến nhà chiết. 2.5. Máy rửa chai Dùng dung dịch NaOH 2% và nước nóng phun xịt rửa sạch cả bên trong lẫn bên ngoài vỏ chai bia và bóc nhãn, để đưa vào máy chiết bia. Chai bẩn được đưa vào máy rửa bằng băng tải đầu vào. Khi chai đến cửa vào của máy rửa, động cơ chọn lựa sẽ đưa chai vào hệ thống rọ chai, hệ thống rọ chai được động cơ chính dẫn động thông qua hộp giảm tốc, sẽ chuyển động theo chu kỳ khép kín hệ thống rọ sẽ mang chai đi qua các hầm tẩy rửa như : hầm ngâm nước nóng, hầm xút, và các vòi phun. Nhờ hệ thống vòi phun xút và nước nóng với áp suất lớn, nên chai ra khỏi máy rửa theo cửa ra chai hầu hết đều rất sạch và được băng tải đưa vào máy chiết bia. Quá trình hoạt động của máy diễn ra như sau: Chai sẽ được ngâm vào bể chứa nước nóng 350C để thấm ướt nhãn trên vỏ chai nhằm loại bỏ nhãn. Sau đó chai tiếp tục được rửa bằng vòi phun nước nóng. Hình 1.33. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của máy rửa chai Kế đến là chai được ngâm vào trong một bể chứa dung dịch NaOH có nhiệt độ là 750C. Sau khi ngân sút kết thúc, chai được qua vòi phun nhằm loại bỏ hoàn toàn nhãn trên chai bia. Nhãn bia được lấy đi và đưa ra ngoài nhờ một băng tải, trên băng tải này có trang bị một bàn chải xoay để làm sạch các nhãn bám trên băng tải này. Chai tiếp tục đưa lên phía trên của máy rửa cao áp, máy rửa này có nhiệm vụ rửa sạch cả bề mặt bên trong lẫn bên ngoài chai nhờ vào một dãy các vòi phun cao áp đặt kế tiếp nhau. Kết thúc bằng vòi phun nước sạch có nhiệt độ bình thường. 2.6. Máy chiết Công suất của máy chiết bia là 15000 chai/h, quá trình chiết hoạt động theo nguyên tắc chiết đẳng áp. Hình 1.34. Hoạt động của cơ cấu nâng chai bằng cam và con lăn Cơ cấu cam cố định với thân máy, còn các con lăn chuyển động xoay tròn. Khi con lăn quay, kết hợp cùng với cơ cấu cam thực hiện nâng chai tiếp xúc với đầu chiết bia. Nguyên lý làm việc: Chu kỳ 1: Nhờ có trục vít dẫn hướng chai mà chai đi đúng vào vị trí cần chiết. Cơ cấu cam nâng vỏ chai vào đúng vị trí của đầu chiết, lúc này đường đẳng áp ngược chiều được thông giữa chai và thùng trữ bia và do chênh lệch áp suất giữa thùng và chai mà khí CO2 đi vào trong chai theo ống. Chu kỳ 2: Lúc này đường đẳng áp mở ra để thông khí ra ngoài, khí CO2 vào để thổi hết không khí trong chai. Đường đẳng đóng lại, trong chai còn CO2 đến khi nào áp suất trong chai bằng áp suất trong thùng thì bia chảy vào chai. Chu kỳ 3: Bia tự động chảy vào chai theo đúng định mức do cân bằng áp suất. Lúc này CO2 không tạo áp suất ngược chiều được do đó bia ngừng chảy vào chai. Quá trình chiếc một chai bia kết thúc một khi chai quay đến vị trí đóng cưỡng bức vòi chiếc. Chu kỳ 4: Phải mở cửa với thời gian nhất định để áp suất trong chai bia cân bằng với áp suất bên ngoài. Rồi mới đưa chai bia ra khỏi chụp chai, điều này nhằm mục đích tránh trào bia khi mở đột ngột đầu chụp chai. 2.7. Máy đóng nắp chai Yêu cầu kỹ thuật - Để bia không bị giảm chất lượng thì thời gian từ khi bia được rót đến lúc đóng nắp xong không được quá 5 giây. - Nắp phải được đóng kín không được làm thất thoát CO2 và nhiểm khuẩn. - Không được gây mẻ miệng chai. Hình 1.35. Sơ đồ máy đóng nắp chai Nguyên lý hoạt động - Nắp chai từ thùng chứa xuống đầu đóng nắp chai nhờ có cơ cấu dẫn hướng nắp chai. - Khi chai vào đúng vị trí đóng nắp (nhờ cảm biến quang phát hiện), sẽ có trục chuyển động tịnh tiến dọc để đóng nắp chai. - Chai sau khi được đóng nắp sẽ tiếp tục theo băng tải đi vào máy thanh trùng. 2.8. Máy thanh trùng Công dụng Đình chỉ sự hoạt động của nấm lên men bia, tiêu diệt các vi sinh vật còn sót lại trong bia (do công nghệ sản xuất ). Để làm tăng thời gian bảo quản bia, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm. Hình 1.36. Sơ đồ máy thanh trùng Yêu cầu kỹ thuật - Đảm bảo đúng nhiệt độ yêu cầu ở từng khoang thanh trùng. - Thời gian chai lưu lại trong mỗi khoan. - Tốc độ chai chạy tùy theo lượng chai có trong máy mà biến tần sẽ điều chỉnh tốc độ của băng tải để đưa chai ra ngoài theo đúng tiến độ. Nguyên lý hoạt động - Ngăn 1 (Heating 1): Ở ngăn này chai từ máy chiết đi vào, nên chai được giữ ở nhiệt độ bình thường (nhiệt độ đặt là 280C). Chai tiếp tục đi vào ngăn hai nhờ băng tải. - Ngăn 2 (Heating 2): Tại ngăn này chai được gia nhiệt, nhiệt độ trong ngăn được tăng nhiệt đến 400C. Tốc độ chai chạy qua ngăn này phụ thuộc vào nhiệt độ trong ngăn. Nếu nhiệt độ đặt cao thì chai sẽ chạy nhanh để đảm bảo nhiệt độ trong chai không vượt quá mức cho phép. Tốc độ chai được điều khiển bởi các động cơ xoay chiều và biến tần VLT series 5004, VLT 3004. - Ngăn 3 (Heating 3): Trong ngăn tiếp tục gia nhiệt lên đến520C, nhờ nhiệt trong ngăn mà nhiệt độ trong chai tăng lên khoảng 500C. Với nhiệt độ này, tốc độ chai đi qua ngăn chậm để đảm bảo nhiệt độ của chai. Kết thúc ngăn này chai sẽ được hạ nhiệt. - Ngăn 4: ngăn tiếp tục được gia nhiệt, nhiệt độ trong ngăn được tăng lên 680C. Tốc độ chai đi qua ngăn này là tương đối chậm để đảm bảo nhiệt độ trong chai là 680C và diệt khuẩn an toàn. Nhiệm vụ của ngăn này là “tiền diệt khuẩn ” vì ở nhiệt độ này sẽ hạn chế được sự hoạt động, phát triển của các vi sinh vật còn sót lại. - Ngăn 5: nhiệt độ trong ngăn được hạ xuống 640C, đây là giai đoạn diệt khuẩn toàn bộ. - Ngăn 6 ( Cooling 1 ): Chai được hạ nhiệt độ xuống nhiệt độ520C. - Ngăn 7 ( Cooling 2 ): Chai được hạ xuống nhiệt độ 420C. - Ngăn 8 ( Cooling 3): Chai đưa về nhiệt độ bình thường (thông thường là 280C). Hình 1.37. Bố trí nhiệt độ trong các ngăn Nhiệt cung cấp cho quá trình thanh trùng được cung cấp nhờ hơi nước nóng ở nhà nhiệt. Hơi nước nóng sẽ được thổi vào bộ trao đổi nhiệt giữa nước với hơi nước nóng. Nhiệt độ nước được đảm bảo yêu cầu nhờ các bơm để tăng giảm tốc độ trao đổi nhiệt. Nước được gia nhiệt sẽ được phun vào trong ngăn, nhiệt độ ngăn tăng lên là nhờ quá trình trao đổi nhiệt giữa nước nóng với không khí trong ngăn. Vì do yêu cầu nhiệt độ trong ngăn phải đảm bảo chính xác so với nhiệt độ đặt nên trong mỗi ngăn đều có các quạt thông gió, các quạt này đảm bảo nhiệt độ trong ngăn không tăng đột ngột. Khi nhiệt độ trong ngăn vượt quá nhiệt độ đặt thì quạt sẽ hoạt động cho đến khi nhiệt độ trong ngăn thấp hơn nhiệt độ đặt 5%. 2.9. Máy dán nhãn. Nguyên lý hoạt động Chai từ băng tải đi vào, bàn xoay I có nhiệm vụ đưa chai vào bàn xoay II. Bàn xoay II mang chai chạy theo đường tròn, lúc đó bàn thoa keo IV sẽ quay tròn, thực hiện việc lấy nhãn tai hộp chứa nhãn và dán vào chai. Sự ăn khớp giữa chai vào nhãn giống với sự ăn khớp của bánh răng. Sau khi được dán nhãn xong chai tiếp ttục theo bàn xoay III ra ngoài băng tải. Hình 1.38. Nguyên lý hoạt động của máy dán nhãn 2.10. Máy in ngày sản xuất. Hình 1.39. Nguyên lý hoạt động máy in ngày sản xuất Nguyên lý hoạt động của máy in ngày sản xuất Chai chạy trên băng tải chai, khi cảm biến quang mất tín hiệu (tức là có chai đi qua vị trí in ngày) thì máy in phun thực hiện in ngày sản xuất lên chai. Với vị trí vòi phun đã định vị sao cho phun đúng cổ chai. Chai bia sau khi đã in ngày sản xuất sẽ được băng tải chuyển lên máy bốc. Chương 3 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME PROTEASE TRONG SẢN XUẤT BIA Nguyên liệu I. QUY TRÌNH SẢN XUẤT BIA Bã malt Xử lý nguyên liệu Nghiền nguyên liệu Nấu nguyên liệu Lọc tách bã malt Houblon hóa Lắng trong và làm lạnh Lên men chính Lên men phụ và tàng trữ bia non Lọc trong bia Ổn định bia sau khi lọc Chiết chai Thanh trùng Bia thành phẩm Bã hoa Men giống II. Thuyết minh quy trình. 1. Xử lý nguyên liệu. Nguyên liệu nấu bia có thể 100% malt đại mạch hoặc hỗn hợp malt đại mạch với thứ liệu. Thứ liệu lớn hơn 30%. Ø Làm sạch nguyên liệu. Mục đích: Tách hết bụi bẩn, loại bỏ tạp chất kim loại lẫn trong nguyên liệu, đối với malt còn để loại bỏ mầm rễ còn sót lại. Quá trình này đảm bảo nguyên liệu phải được sạch, kích thước hạt đồng đều, không ảnh hưởng đến chất lượng bia, thuận lợi cho quá trình nghiền. Ø Phương pháp làm sạch: Dùng sàng, nam châm... Ø Cân nguyên liệu: Cân để biết chính xác khối lượng nguyên liệu chính xác đưa vào nấu để tính được hiệu suât nấu. 2. Nghiền nguyên liệu: Mục đích: Dùng lực cơ học phá vỡ cấu trúc nguyên liệu thành những mảnh nhỏ giup cho quá trình ngấm nước, hồ hoá, thuỷ phân xảy ra nhanh. Nguyên tắc nghiền: Đối với thứ liệu là hạt chưa nảy mầm thì nghiền càng mịn càng tốt, đối với malt đại mạch chỉ cần nghiền thô không cần nghiền mịn vì làm nát vỏ trấu gây chát và lọc chậm và do cấu trúc malt đại mạch đã bị phá vỡ. Phương pháp nghiền: Dùng nghiền trục. 3. Nấu nguyên liệu: Ø Mục đích: Chuyển các chất có trong nguyên liệu từ trạng thái không hoà tan sang trạng thái hoà tan nhờ tác động của các hệ enzim thuỷ phân.Và cùng với các chất hòa tan trong quá trình thủy phân tạo thành chất chiết của dịch đường (nước nha). Ø Phương pháp nấu: Có ba phương pháp nấu bia là phương pháp ngâm, phương pháp đun sôi và phương pháp kết hợp giữa đun sôi với ngâm. Ưu điểm của phương pháp ngâm là thời gian nấu ngắn nên ít tốn năng lượng, nhưng có nhược điểm là khối nấu không được đun sôi nên đường hoá không triệt để. Ưu điểm của phương pháp đun sôi là phá vỡ triệt để cấu trúc tế bào tinh bột nên tăng hiệu suất quá trình thuỷ phân. Nhược điểm của phương pháp này là thời gian nấu kéo dài, tốn nhiều năng lượng và có thể xảy ra các phản ứng phụ không cần thiết. Ø Lựa chọn phương pháp đun sôi: Các biện pháp xử lý nguyên liệu khi nấu bia dùng nguyên liệu thay thế lớn hơn 30%: Bổ sung chế phẩm enzyme: β – glucanase; α, β – amylase; protease. Thứ liệu nghiền mịn, malt nghiền thô. Dùng nước mềm và điều chỉnh PH = 5,2 – 5,6. Nồi nấu nguyên liệu thay thế: Toàn bộ nguyên liệu thay thế (đã nghiền mịn) 10 – 15% bột malt trộn đều với nước ấm, nâng đến nhiệt độ 500C, điều chỉnh PH= 5,2 – 5,5 (thường dùng acid lactic… để điều chỉnh). Duy trì ở nhiệt độ 500C trong vòng 30 – 40 phút. Bổ sung chế phẩm enzyme Sau đó nâng nhiệt độ lên 750C trong vòng 10 – 20 phút tạo điều kiện cho enzyme α – amylase hoạt động cắt ngắn mạch tinh bột tạo thành các dextrin, làm giảm độ nhớt của khối cháo. Nâng nhiệt 90 – 950C trong vòng 25 phút. Nồi malt: Bột malt còn lại hoà với nước ấm nâng lên nhiệt độ 500C trong vòng 20 phút, pH = 5,2 – 5,6, bổ sung muối và enzyme, bơm khối cháo ở nồi nấu nguyên liệu thay thế về nồi malt và khống chế nhiệt độ 650C trong vòng 40 phút, sau đó nâng nhiệt độ lên 750C trong 10 – 15 phút, cuối cùng nâng nhiệt độ lên 780C rồi tiến hành lọc. Kết thúc quá trình nấu ta được dịch đường hoá. Các quá trình xảy ra khi nấu nguyên liệu: Quá trình dịch hoá: (cnez nguyễn đức lượng chủ biên) Dịch hoá là quá trình cắt tinh bột thành những đoạn ngắn, tạo điều kiện cho quá trình đường hoá và tránh hiện tượng thoái hoá tinh bột. Ở giai đoạn này, người ta thường sử dụng enzyme amylase và protease của vi khuẩn. Các loại enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao và có khả năng chịu nhiệt độ cao rất tốt, nhiệt độ cao thường làm biến tính enzyme có trong malt, do đó việc bổ sung enzyme có khả năng chịu nhiệt từ nguồn vi sinh vật là rất cần thiết. Khi ta cho nguyên liệu thay thế malt vào trong hỗn hợp, các loại nguyên liệu này không được thủy phân triệt để, dễ dàng tạo ra độ nhớt cao, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng đường hoá và lên men sau này. Nếu ta cho enzyme chịu nhiệt từ nguồn vi sinh vật thì sẽ cải thiện được những nhược điểm trên. Quá trình đường hoá: (cnsxm&bnxbkh&kt pgs ts hoang dinh hoa, cnlm nxbđn chu biên kỹ sư phan bich ngọc ) Khi đường hoá dưới tác dụng của các enzyme protease protein bị thuỷ phân thành các axitamin, các peptide, polypeptide… một phần các chất này sẽ là thức ăn cho nấm men, một phần khác là phần không thể thiếu được của bia thành phẩm. Có khoảng 30 – 40% tổng số lượng đạm trong nguyên liệu được chuyển vào nước dưới dạng hòa tan làm cho nước nha trở nên giàu chất dinh dưỡng cho nấm men sinh trưởng và phát triển. Khi đường hoá enzyme protease thuỷ phân proteinase thể hiện hoạt tính lớn nhất. Nó thuỷ phân protein thành các polypeptide không đông tụ. Tiếp theo dưới tác dụng của enzyme polypeptidase các polypeptide chuyển thành axitamin, lúc chế biến malt nếu sấy malt cao quá nhiệt độ quy định, enzyme này bị mất hoạt lực nên khâu chuyển hoá quan trọng này không thể tiến hành nhanh chòng được, trong trường hợp này bản thân protease phải phân cắt không chỉ các mối liên kết peptide trong protein, mà trong cả polypeptide khác nhau thậm chí cả trong dipeptide. Mặc dù lượng protein có trong dịch lên men rất ít nhưng nó ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo bọt và độ bền của bia. Các sản phẩm thuỷ phân của protein không tách khỏi dung dịch khi đun sôi, nhưng nó có tính keo. Albumoza, pepton và các polypeptide tham gia vào việc tạo bọt và tăng vị cho bia, còn peptide và axitamin cần thiết cho sự sinh trưởng của nấm men về sau. Quá trình thuỷ phân protein dưới tác dụng của enzyme protease phụ thuộc vào nhiệt độ và PH của môi trường. Ở nhiệt độ 500C và PH = 5,6 – 5,9 là điều kiện thuận lợi để tích luỹ các sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng nhỏ như axitamin. Ngược lại ở nhiệt độ 600C sẽ tích luỹ các sản phẩm thuỷ phân có phân tử lượng cao như polypeptide. Cùng với sự thuỷ phân, trong quá trình đường hoá một phần protein bị đông tụ dưới tác dụng của nhiệt độ cao. Sự đông tụ bắt đầu ở nhiệt độ trước 600C ở nhiệt độ này leucozin bắt đầu đông tụ. Khi tăng nhiệt độ đến 900C globulin bắt đầu đông tụ. Khi đun sôi một số protein khác bắt đầu biến tính và đông tụ. Mặt khác một phần protein kết tủa do liên kêt với các tannin có trong vỏ malt, quá trình đông tụ và kết tủa này rất quan trọng đối với các giai đoạn công nghệ về sau. 4. Lọc tách bã malt. Ø Mục đích: Tách các chất hoà tan ra khỏi các chất không hoà tan. Ø Tiến hành: Quá trình lọc dịch đường gồm hai giai đoạn: lọc dịch và rửa bã. Chọn thiết bị lọc thùng vì cho dịch đường có chất lượng cao và dễ vệ sinh. Trước hết là lọc khối cháo thu được dịch đường đầu, sau đó dùng nước nóng 780C để rửa bã. Không được dùng nước có nhiệt độ lớn hơn 780C để rửa bã vì nước quá nóng sẽ làm vô hoạt hệ enzyme amylaza và các tinh bột sót được hồ hoá nhưng không được đường hoá, kết quả làm cho dịch lên men bị đục và bia cũng đục theo. Khi tiến hành lọc, phải cho nước nóng vào dưới đáy lưới. Nước vào đáy lưới chiếm đầy các ống dẫn, khoá, khoảng không gian giữa đáy chính và đáy lưới nên đẩy không khí ra ngoài. Sau khi lọc xong thì tiến hành rửa bã bằng nước nóng 780C cho đến khi nồng độ chất hoà tan còn lại trong bã khoảng 1% là được. Nếu rửa quá kỹ thì chất đắng, chất cay trong bã sẽ tan vào dịch đường làm cho bia có mùi, vị lạ, dịch đường sẽ bị loãng. Quá trình lọc và rửa bã kéo dài khoảng 4h. Sau khi rửa xong, bã được tháo ra và đưa ra ngoài, thiết bị phải vệ sinh, sát trùng để chuẩn bị cho mẻ sau. Ø Yêu cầu: Dịch đường và nước rửa bã sau khi lọc phải trong hoàn toàn. 5. Houblon hoá: Ø Mục đích: Trích ly các chất có giá trị của hoa như chất đắng, tinh dầu để cho dịch đường có mùi thơm va đắng đặc trưng. Polyphenol + protein làm trong dịch đường (tạo kết tủa, kết tủa kếo theo các chất lơ lửng làm trong dịch đường.). Sát trùng dịch đường. Xảy ra phản ứng tạo màu và tạo mùi. Loại bỏ, làm bay hơi các chât gây mùi không tốt. Điều chỉnh nồng độ dịch đường trước khi lên men. Ø Tiến hành: Thiết bị houblon hoá về cấu tạo cũng giống với thiết bị nấu nhưng bề mặt truyền nhiệt lớn hơn vì cần bốc hơi một lượng lớn hơi nước trong quá trình đun sôi. Liều lượng hoa houblon được sử dụng là 3g/1 lít dịch đường. Hoa được dử dụng dưới hai dạng: hoa nguyên cánh chiếm 35% và hoa viên chiếm 65%. Chọn phương án cho hoa 3 lần: - 1/2 hoa viên cho vào lúc dịch đường vừa lấp đáy nồi. - 1/2 hoa viên còn lại cho vào sau khi sôi 30 phút. - Hoa nguyên cánh cho vào 30 phút trước khi nấu kết thúc. Tiến hành: dịch đường và nước rửa bã từ thiết bị lọc chuyển vào nồi houblon hoá. Khi dịch đường vừa lấp đáy nồi thì bắt đầu cung cấp nhiệt để nhiệt độ dịch đường luôn giữ ở 750C, đồng thời cho 1/2 lượng hoa viên vào để lấy chất đắng. Sau khi dịch đường và nước rửa bã chuyển hết vào nồi houblon thì tiến hành nâng nhiệt đến nhiệt độ sôi. Giữ sôi 30 phút rồi cho 1/2 lượng hoa viên còn lại vào nhằm lấy chất đắng, tạo hương và kết lắng protein. Trước khi kết thúc quá trình houblon hoá 30 phút thì cho hoa nguyên cánh vào để tạo hương vị đặc trưng của bia. Tổng thời gian đun sôi là 120 phút. Sau khi đun sôi xong, dịch đường được bơm sang thiết bị lắng trong. Ø Tách bã hoa: Sau khi đun sôi xong, dịch đường được chuyển sang thùng lọc bã hoa để tách dịch đường ra ngoài, còn bã thì được giữ lại bên trong. Sau khi giải phóng hết dịch đường, thiết bị houblon hoá được tráng qua nước nóng, nước nóng này dùng để rửa bã hoa, nước rửa bã được dùng vào việc đường hoá mẻ sau hoặc bổ sung vào dịch đường ở phân đoạn nấu bia. Bã được thu gom và chuyển ra ngoài như một loại phế thải. Dịch đường nóng nhờ bơm ly tâm chuyển đến thiết bị lắng trong và làm lạnh. 6. Lắng trong và làm lạnh. Ø Mục đích: Hạ nhiệt độ dịch đường đến nhiệt độ lên men, kết tủa các huyền phù và bão hoà oxi cho dịch đường. Ø Tiến hành: Đảm bảo thiết bị kín, vô trùng, tiến hành nhanh. Tiến hành lắng trong trong thiết bị whirlpool và làm lạnh bằng thiết bị làm lạnh bản mỏng với chất tải lạnh là glycol. Thiết bị whirlpool có ưu điểm là đảm bảo vô trùng vì dịch đường khi đưa vào thiết bị cũng như ra khỏi thiết bị ở nhiệt độ rất cao (khoảng 900C) và thời gian lắng chỉ khoảng 20 phút. Dịch đường vào thiết bị ở nửa phần dưới và theo phương tuyếp tuyến với vận tốc khoảng 10 ÷ 14 m/s, dịch đường sẽ chuyển động tròn trong thiết bị, các kết tủa sẽ lắng xuống tâm của thiết bị. Sau khi để lắng 20 phút, dịch trong được đưa đi làm lạnh đến nhiệt độ lên men, còn cặn được loại bỏ. Tại thiết bị làm lạnh, dịch lên men nóng tiến hành trao đổi nhiệt gián tiếp với glycol, nhiệt độ của dịch đường hạ dần xuống khoảng 90C, thời gian làm lạnh không vượt quá 1 giờ. Bổ sung oxy nhằm mục đích bổ sung một lượng oxi thích hợp để tạo điều kiện hiếu khí cho nấm men tăng sinh khối trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Cần phải khống chế hàm lượng oxi 6 – 8 g/lít nước nha. 7. Lên men chính. Ø Mục đích: Chuyển hoá các chất đường và dextrin thấp phân tử trong nước nha thành C2H5OH, CO2. Đồng thời, còn tạo ra các sản phẩm phụ như este, axit hữu cơ, rượu bậc cao, aldehyt, glyxerin … hoà tan vào dịch lên men tạo thành bia non. Tiến hành: Dịch lên men sau khi làm lạnh được bổ sung không khí vô trùng (khoảng 8mg O2/lít dịch đường) rồi đưa vào thùng lên men. Dịch men giống được chuyển vào thùng lên men theo luồng dịch đường với tỷ lệ 1 lít men giống đặc/100 lít dịch lên men nhằm tạo điều kiện cho nấm men tiếp xúc tốt với môi trường. Nhiệt độ lên men chính là 90C, áp suất dư trong thiết bị lên men chính là 0,2 ÷ 0,4at, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ hoà tan vào bia non một phần. Độ hoà tan của CO2 vào bia non sẽ tăng khi nhiệt độ giảm, do đó để đảm bảo lượng CO2 hoà tan trong bia nhiều thì nhiệt độ thời kỳ cuối của quá trình lên men khoảng 50C, hàm lượng CO2 trong bia non phải đạt 0,2%. Thời gian lên men chính phụ thuộc vào nồng độ dịch lên men đầu tiên và nhiệt độ lên men. Lên men chính được xem là kết thúc khi chất chiết trong dịch lên men giảm đi từ 0,15÷0,2% ngày đêm. Đối với dịch lên men có nồng độ 16% thì thời gian lên men chính chọn 9 ngày. Ø Nấm men bia: Có 2 chủng: + Saccharomyces cerevisiae: thuộc loại lên men nổi + Saccharomyces carlsbergensis: thuộc loại lên men chìm Nhà máy sử dụng chủng nấm men chìm, quá trình lên men xảy ra trong lòng môi trường, khi lên men xong các tế bào kết thành chùm lắng xuống đáy. Do đó, bia chóng tự trong hơn so với lên men nổi. Dịch lên men có nồng độ khá cao nên yêu cầu chủng nấm men có khả năng chịu được áp suất thẩm thấu lớn. Ø Các quá trình cơ bản xảy ra khi lên men chính: Ø Quá trình sinh lý: Xảy ra ở giai đoạn đầu của quá trình lên men. Trong giai đoạn này do dịch đường có khí oxi, nấm men hô hấp hiếu khí tăng sinh khối, tổng hợp enzyme. Ø Quá trình sinh hóa: Xảy ra cuối quá trình sinh lý khi trong dịch đường không còn khí oxi, nấm men trở sang hô hấp kị khí. Trong quá trình sinh hóa có các quá trình chuyển hóa các chất hữu cơ khác để tạo ra các sản phẩm thứ cấp như glycerin, andehyt, rượu bậc cao, diacetyl. Quá trình lên men đường thành rượu etylic va dioxide cacbon. C6H12O6 → C2H5OH + CO2 + Q. Các lọai đường khác nhau thì tốc độ lên men khác nhau: - Hecxose: Glucose, fructose là đường lên men khởi động. - Disaccharide: maltose, saccharose lên men chính. - Maltotniose: Đường có 3 gốc glucose lên men chậm hơn, lên men phụ ủ chín bia. Quá trình hình thành và chuyển hóa các hợp chất thứ cấp: Mùi bơ trong bia là do 80% diacetyl và 20% các Vicinal Diketon gây ra. Diacetyl nguyên chất là chất lỏng không màu hoặc có màu vàng nhạt có mùi hôi mạnh tác động nhiều đến hệ thần kinh. Với hàm lương > 0,1ppm gây ra mùi vị khó chịu cho bia. Do vậy bia có hàm lượng diacetyl < 0,1ppm là đạt yêu cầu. Đường bậc cao: Không tan trong nước, có dạng như dầu có mùi hôi do vậy còn có tên là dầu fusel. Nhìn chung đường bậc cao có ảnh hưởng không tốt đặc biệt khi hàm lượng lớn hơn 100mg/lít. Andehyl: Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất. Gây mùi bia non không thơm dịu, trong quá trình ủ chín bào tử bia thì hàm lượng andehyt giảm dần. Các biến đổi lý hóa khác: Giảm pH: pH trong quá trình lên men giảm dần, trước khi lên men pH = 5,2 – 5,6, sau khi lên men pH = 4,2 – 4,6. Giảm độ màu: (EBC) Trong quá trình lên men độ màu giảm khoảng 3EBC do pH giảm và so tế bào nấm men phát triển hấp thụ màu. Sự tạo bọt: Là hệ khí trong lỏng, trong quá trình lên men tạo CO2 và tạo thành bọt. Protein kết hợp với acid đắng làm bền bọt. 8. Lên men phụ và tàng trữ bia non: Ø Mục đích: Tiếp tục lên men phần đường còn lại sau khi lên men chính, bão hoà CO2 và tăng cường mùi vị cho bia. Thực hiện quá trình chín của bia (ổn định chất lượng bia). Ø Tiến hành: Quá trình lên men phụ được tiến hành trong các thùng kín đặt trong phòng lạnh từ 1 ÷ 20C. Nhiệt độ lên men phụ khoảng 10C, áp suất dư 0,3 ÷ 0,7 at. Trong quá trình lên men phụ cần theo dõi áp suất trong thiết bị lên men, mức độ trong của bia, nhiệt độ trong phân xưởng. Bia non được chuyển vào từ đáy thiết bị nhằm giảm sự tạo bọt và giảm mất mát CO2. Đầu tiên có thể cho bia chảy nhanh nhưng về sau do có sự tạo bọt nên cho bia chảy gián đoạn. Khi bia non đã đầy thùng bắt đầu thải không khí trên bề mặt bia non. Để đảm bảo bia thành phẩm có chất lượng như nhau về màu sắc, mùi vị cũng như thành phần hoá học thì bia non từ một thùng lên men chính có thể chuyển vào nhiều thùng lên men phụ. Quá trình chuyển bia non vào thiết bị lên men phụ có thể tiến hành từ từ và kéo dài 1 ÷ 2 ngày đêm. Tuy nhiên, sau 2 ngày đêm thì thùng lên men phụ cần phải chứa đầy bia non nếu không thì dễ bị nhiễm vi sinh vật và sự bão hoà CO2 khó do sự bốc hơi của nó. Khi bia chứa đầy thùng thì đóng van điều chỉnh áp suất, tiến hành thải không khí trên bề mặt bia và nâng áp suất đạt theo yêu cầu. Quá trình nâng cao áp suất kéo dài 1 ÷ 3 ngày kể từ lúc chuyển xong bia non vào. Nếu nâng áp suất quá nhanh thì không khí trên bề mặt bia sẽ hoà tan vào bia và oxy không khí sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng bia thành phẩm. Thời gian lên men phụ là 40 ngày. Sau khi lên men phụ bia được chuyển vào thùng chứa và đem đi lọc. Trong giai đoạn ủ chín bia các quá trình oxi hóa khử có ý nghĩa rất quan trọng vì nhờ các quá trình này mà lượng diacetyl có thể giảm đi 50%. Cũng ở giai đoạn ủ chín bia này, một số tế bào nấm men chết và tự phân bởi các enzyme protease. Sản phẩm tự phân là các peptid, các axitamin, vitamin và một vài thành phần của axit nucleic, các enzyme trong đó chủ yếu là nhom peptidase và protease. Chính các sản phẩm tự phân của nấm men có ảnh hưởng nhiều đến hương vị của bia. Nếu quá trình công nghệ diễn ra bình thường, lượng nấm men tự phân vừa phải thì các sản phẩm này có lợi ngược lại nếu có quá nhiều tế bào tự phân thì mùi vị bia sẽ không bình thường thậm chí hơi khó chịu. Một trong các phương pháp phổ biến thường được dùng để nâng cao độ bền của bia là xử lý bia bằng các enzyme và các chất ổn định khác. Phương pháp đơn giản v