Đồ án Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM *** ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (MSMH: 603136) ĐỀ TÀI TỔNG QUAN ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM SVTH: NGUYỄN HOÀNG PHONG MSSV: 60701792 Lớp: HC07TP2 Ngành: Công nghệ thực phẩm GVHD: TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2011 Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm ii Đại Học Quốc Gia TP .HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Trường Đại học Bách Khoa Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Khoa Kỹ Thuật Hóa Học ---------//--------- Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm ĐỒ ÁN MÔN HỌC CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM (MÃ SỐ: 603136) Họ và tên sinh viên: NGUYỄN HOÀNG PHONG Mã số sinh viên: 60701792 1. Đầu đề đồ án Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm . 2. Nhiệm vụ (nội dung yêu cầu) Tổng quan tài liệu về ứng dụng collagen trong thực phẩm . 3. Nội dung các phần Chương 1 - TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN 1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen 1.2 Thành phần và cấu trúc 1.3 Phân loại 1.4 Tính chất 1.5 Thu nhận collagen 1.6 Ứng dụng của collagen Chương 2 - ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM 2.1 Collagen bột 2.2 Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm thức uống 2.3 Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa 2.4 Ứng dụng collagen trong chế biến thịt và thủy sản 2.5 Collagen được ứng d ụng trong nhiều sản phẩm khác nhau có tác dụng tốt cho xương 4. Các bản vẽ và đồ thị: không 5. Ngày giao đồ án: ngày 01 tháng 03 năm 2011. 6. Ngày hoàn thành đồ án: ngày 31 tháng 05 năm 2011. Ngày … tháng … năm 2011 Ngày … tháng … năm 2011 Chủ nhiệm bộ môn Người hướng dẫn Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm iii NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm iv NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... .......................................................................................................................................... Mục lục Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm v MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................ix LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................ x Chương 1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN ............................................................... 1 1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen ........................................................................ 2 1.2 Thành phần và cấu trúc ................................................................................... 3 1.2.1 Cấu trúc phân tử collagen ..............................................................................4 1.2.2 Thành phần hóa học của collagen .................................................................6 1.3 Phân loại .......................................................................................................... 9 1.4 Tính chất ....................................................................................................... 11 1.4.1 Độ tinh sạch của collagen ............................................................................11 1.4.2 Thành phần cấu trúc và khối lượng phân tử ................................................12 1.4.3 Nhiệt độ biến tính ........................................................................................14 1.4.4 Thành phần amino acid ...............................................................................17 1.4.5 Khả năng trương nở, hòa tan .......................................................................18 1.4.6 Điểm đẳng điện (pI) .....................................................................................19 1.5 Thu nhận collagen ......................................................................................... 20 1.5.1 Sự phá vỡ tế bào ..........................................................................................20 1.5.2 Phương pháp tinh sạch collagen ..................................................................21 1.5.3 Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen ...................................................22 1.5.4 Sử dụng CO2 siêu tới hạn trong tinh sạch collagen ....................................22 1.6 Ứng dụng của collagen ................................................................................. 26 1.6.1 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. ....................................................26 1.6.2 Ứng dụng trong y học và dược phẩm ..........................................................28 1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm .......................................................30 Chương 2 ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM ............................. 31 2.1 Collagen bột .................................................................................................. 32 2.1.1 Nguyên liệu ..................................................................................................32 2.1.2 Quy trình công nghệ sản xuất collagen bột .................................................32 2.1.3 Sản phẩm collagen bột tinh sạch .................................................................36 2.2 Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm thức uống ........................ 37 2.2.1 Ứng dụng collagen vào các sản phẩm thức uống (trà, cà phê) nhằm bổ sung thêm lượng protein cho cơ thể .....................................................................37 2.2.2 Ứng dụng collagen làm trong các sản phẩm thức uống có cồn ...................39 2.3 Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa .............................. 43 2.4 Ứng dụng collagen trong chế biến thịt và thủy sản ...................................... 49 2.4.1 Những ứng dụng phổ biến của collagen trong ngành chế biến thịt – thủy sản ................................................................................................................49 2.4.2 Ứng dụng collagen trong sản xuất vỏ bọc sản phẩm thịt chế biến ..............51 Mục lục Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm vi 2.4.3 Ứng dụng collagen trong ức chế sự oxy hóa chất béo trong sản phẩm thịt chế biến ........................................................................................................54 2.4.4 Tăng hiệu suất nấu và chống mất nước cho sản phẩm nhờ collagen ..........62 2.4.5 Collagen thay thế một phần nguyên liệu trong sản phẩm thịt chế biến ......66 2.5 Collagen được ứng dụng trong nhiều sản phẩm khác nhau có tác dụng tốt cho xương ..................................................................................................... 78 KẾT LUẬN ................................................................................................................... 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................... Error! Bookmark not defined. Danh mục bảng Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2.1- Phân loại protein theo chức năng của chúng trong cơ thể ...........................4 Bảng 1.2.2 – So sánh thành phần amino acid của một số loại protein (gam amino acid/100 gam protein) [7, 12, 28] ....................................................................................6 Bảng 1.2.3 - Thành phần amino acid của collagen vảy cá Rohu và cá Catla (số gốc amino acid trên tổng số 1000 gốc amino acid) [23] ........................................................7 Bảng 1.2.4 – Sự khác nhau về hàm lượng hydroxyproline và nhiệt độ biến tính của collagen từ các nguồn thu nhận khác nhau [23] ..............................................................8 Bảng 1.3.1 – Phân loại collagen [27] ...............................................................................9 Bảng 1.4.1 - Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu da, xương cá chỉ vàng và collagen trích chiết được [24] ........................................................................................11 Bảng 1.4.2 - Thành phần amino acid của dung dịch collagen da cá nóc [18] ...............17 Bảng 1.4.3 -Thành phần amino acid của dung dịch collagen da và xương cá chỉ vàng chiết bằng pepsin [24] ....................................................................................................17 Bảng 2.1.1 – Các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của collagen thu nhận từ lợn [11] .............36 Bảng 2.3.1 – Kết quả đánh giá tính tính ổn định khi bảo quản của sản phẩm trong thí nghiệm 1 [21] .................................................................................................................46 Bảng 2.3.2 - Kết quả đánh giá hương vị sản phẩm trong thí nghiệm 1 [21] .................46 Bảng 2.4.1 - Thông tin kỹ thuật c ủa Code 10 [17] ........................................................53 Bảng 2.4.2 - Thông tin kỹ thu ật của Code V [17] .........................................................53 Bảng 2.4.3 - Thành phần hóa học của xúc xích Wiener và xúc xích gan trong nghiên cứu [14] ..........................................................................................................................58 Bảng 2.4.4 – Kết quả phân tích sản phẩm [14] .............................................................59 Bảng 2.4.5 - Kết quả phân tích thành ph ần xúc xích với những hàm lượng collagen khác nhau [9] .................................................................................................................64 Bảng 2.4.6 - Kết quả phân tích gần đúng thành phần jambon với những hàm lượng collagen khác nhau [9] ...................................................................................................64 Bảng 2.4.7 – Thành phần công thúc xúc xích Bologna dạng thô [1] ............................68 Bảng 2.4.8 - Thành phần công thúc xúc xích Bologna dạng mịn [1] ............................68 Bảng 2.4.11 - Tính chất sản phẩm xúc xích Bologna dạng thô đã được bổ sung collagen với các hàm lượng khác nhau [1] ....................................................................68 Bảng 2.4.10 –Các thông số bị ảnh hưở ng bởi hàm lượng collagen bổ sung trên sản phẩm xúc xích Bologna dạng nhũ tương mịn [1] ..........................................................70 Bảng 2.4.11 - Các thông số bị ảnh hưởng bởi hàm lượng collagen bổ sung trên nguyên liệu xúc xích Bologna dạng nhũ tương mịn [1] .............................................................70 Bảng 2.4.14 - Công thức chế biến xúc xích [10] ...........................................................71 Bảng 2.4.15 –Phân tích thành phần hóa học của xúc xích và collagen [10] .................72 Bảng 2.4.16 – Các thông số bị ảnh hưởng bởi hàm lượng collagen bổ sung và thời gian lưu trữ sản phẩm [10] ....................................................................................................73 Danh mục bảng Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm viii Bảng 2.4.17 – Kết quả phân tích màu sắc nguyên liệu và sản phẩm theo hàm lượng collagen bổ sung [10] ....................................................................................................75 Bảng 2.4.18 - Kết quả phân tích màu sắc nguyên liệu và sản phẩm .............................76 Bảng 2.4.19 - Kết quả phân tích cảm quan sản phẩm [10] ............................................77 Bảng 2.5.1 – Kết quả so sánh hoạt tính chống tái hấp thu xương của các phân đoạn collagen [30] ..................................................................................................................81 Bảng 2.5.2 – Thành phần viên nén collagen kết hợp canxi và vitamin D 3 [30] ...........81 Bảng 2.5.3 - Thành phần sản phẩm thức uống có bổ sung collagen [30] .....................82 Bảng 2.5.4 - Thành phần sản phẩm bánh cracker có bổ sung collagen [30] .................82 Bảng 2.5.5 - Thành phần sản phẩm jelly có bổ sung collagen [30] ..............................82 Bảng 2.5.6 - Thành phần sản phẩm phô mai chế biến có bổ sung collagen [30] ..........83 Bảng 2.5.7 - Thành phần sản phẩm yaourt có bổ sung collagen [30] ...........................83 Bảng 2.5.8 - Thành phần sản phẩm sữa bột có bổ sung collagen [30] ..........................83 Bảng 2.5.9 - Thành phần sản phẩm thức ăn cho chó có bổ sung collagen [30] ............83 Danh mục hình Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.2.1 – Chuỗi xoắn collagen gồm 3 dây xoắn chặt .................................................4 Hình 1.2.2 – Từng bậc cấu tạo trong phân tử collagen [8] ..............................................5 Hình 1.2.3 – Cấu trúc sợi collagen [22] ..........................................................................5 Hình 1.4.1 - Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích peak và hàm lượng acid amin [31] ......................................................................................................12 Hình 1.4.2 – Phân tích điện di SDS–PAGE collagen từ da (S) và xương (B) của cá chỉ vàng dưới điều kiện khử và không khứ .........................................................................13 Hình 1.4.3 - Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá ..14 Hình 1.4.4 – Đường cong biến tính nhiệt của collagen, gelatin và collagen thủy phân [34] .................................................................................................................................15 Hình 1.4.5 -Biểu đồ sự phụ thuộc độ nhớt theo nhiệt độ [20] .......................................16 Hình 1.4.6 – Sự thay đổi độ nhớt của dung dịch collagen (trong acid acetic) từ da và xương cá chỉ vàng theo nhiệt độ [24] ............................................................................16 Hình 1.4.7 – Sự thay đổi độ nhớt tương đối (%) của collagen da và xương cá chỉ vàng theo pH [24] ...................................................................................................................19 Hình 1.4.8 - Sự thay đổi độ nhớt tương đối (%) của collagen da và xương cá chỉ vàng theo nồng độ NaCl [24] .................................................................................................19 Hình 1.5.1 - Quy trình tách chiết collagen ....................................................................20 Hình 1.5.2 – Giản đồ pha của CO 2 ................................................................................24 Hình 1.5.3 – Sơ đồ quy trình tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn ....................................25 Hình 1.6.1 - Sản phẩm phomat có chứa collagen hydrolysate làm giảm hàm lượng chất béo ..................................................................................................................................26 Hình 1.6.2 – Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng là collagen hydrolysate ...........................27 Hình 1.6.3 - Collagen hydrolysate làm chất kết dính trong thanh kẹo ..........................27 Hình 1.6.4 – Sản phẩm thịt nguội có chứa collagen hydrolysate ..................................27 Hình 1.6.5 – Collagen hydrolysate làm trong các loại thức uống .................................28 Hình 1.6.6 – Viên nang mềm có lớp vỏ ngoài làm từ collagen. ....................................28 Hình 1.6.7 – Viên nang cứng làm từ chất liệu collagen ................................................29 Hình 1.6.8 - Ứng dụng collagen hydrolysate trong kỹ thuật nội soi ............................30 Hình 1.6.9 – Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa .30 Hình 2.1.1 - Quy trình chiết collagen bằng cid acetic (acid-soluble collagen – ASC) .32 Hình 2.1.2 - Quy trình chiết collagen bằng pepsin (pepsin-soluble collagen – PSC) ...33 Hình 2.1.3 - Quy trình chiết collagen có mặt vi khuẩn Bacillus ...................................35 Hình 2.1.4 – Bột collagen tinh sạch ...............................................................................36 Hình 2.4.1 – Tiết diện cắt ngang của sản phẩm xúc xích Bologna (0: không bổ sung collagen; 10: bổ sung 10% collagen; 20: bổ sung 20% collagen; 30: bổ sung 30% collagen) [1] ...................................................................................................................69 Lời mở đầu Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm x LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam là quốc gia có tiềm năng xuất khẩu thủy sản rất lớn. Năm 2006, tổng sản lượng cá tra, cá basa của các tỉnh ĐBSCL 825.000 tấn. Đầu năm 2008, đạt 1 triệu tấn, chủ yếu là mặt hàng cá phi lê. Tại các nhà máy chế biến thủy sản, cá tươi được lóc hai miếng phi-lê để chế biến xuất khẩu. Phần còn lại chiếm khoảng 60% gồm da, xương, đầu, bụng, mỡ, ruột, kỳ vi... Như vậy, sẽ có khoảng 600.000 tấn phụ phẩm sau xuất khẩu cần được xử lý. Hiện nay, mỡ cá được nghiên cứu ứng dụng làm biodesel hoặc xuất thô sang Trung Quốc, các phần còn lại được sản xuất thành bột cá làm thức ăn gia súc . Ngoài ra , ngành giết mổ và chế biến gia súc gia cầm ở Việt Nam cũng thải ra một lượng phế phẩm khá lớn mà trong đó cũng chủ yếu là da và xương . Nếu như phế phẩm của các ngành công nghiệp này ch ỉ được chế biến thành bột thức ăn gia súc hay các dạng sản phẩm thô , giá trị thấp khác thì hiệ u quả kinh t ế mang lại không cao hoặc nếu như loại bỏ hẳn t hì phải tốn thêm chi phí cho việc xử lý chất thải . Trong khi, thành phần chính trong da, xương là collagen có rất nhiều ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm và gần đây được ứng dụng khá nhiều trong công nghiệp thực phẩm . Cho nên việc ứng dụng các phụ phẩm này vào nhiều ngành khác nhau , đặc biệt là trong ngành thực phẩm có ý nghĩa đặc biệt quan trọng . Vấn tách chi ết collagen trong da đã được nghiên cứu nhiều và cũng đạt nhiều thành công đáng kể . Vấn đề còn lại cấp bách hiện nay là cần tiếp tục nghiên cứu để ứng dụng sản phẩm collagen thu được vào chế biến các sản phẩm công nghiệp khác nhau nhằm nâng cao giá trị kinh tế của collagen, đồng thời giải quyết được vấn đề ô nhiễm môi trường. Nhiệm vụ của đồ án này là bước đầu tổng quan tài liệu về ứng dụng collagen trong ngành thực p hẩm, góp phần giải quyết vấn đề cấp thiết nêu trên . Nội dung chính của bài viết liên quan đến các phương pháp ứng dụng collagen trong các sản phẩm thực phẩm khác nhau như các sản phẩm thức uống , các sản phẩm chế biến từ sữa , các sản phẩm thịt và thủy sản , collagen dạng tổng hợp nhằm khai thác các tính chất công nghệ cũng như giá t rị y học của collagen , từ đó nâng cao giá trị và tính thương mại của collagen . Tổng quan về collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 1 Chương 1 TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN Giới thiệu sơ lược về collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 2 1.1 Giới thiệu sơ lược về collagen Collagen là thành phần protein chủ yếu của các mô liên kết. Collagen chiếm khoảng 25% protein tổng số trong cơ thể động vật và là thành phần chủ yếu của khung mạng ngoại bào.Collagen là protein dạng sợi xoắn. Collagen được tìm thấy trong tất cả các loài động vật đa bào. Nó có trong các mô liên kết của tim, mạch, da, giác mạc, sụn, sừng, dây chằng, xương, răng, … Collagen cũng đư ợc tìm thấy ở các mô bên trong của hầu hết các cơ quan. Collagen tạo nên độ bền của mô, cơ quan và duy trì d ạng cấu trúc của chúng. Collagen rất đa dạng về thành phần và cấu trúc. Ngày nay, người ta đã tìm ra khoảng 28 loại collagen khác nhau[2, 3, 26]. Do có cấu trúc và tính chất hóa học đặc biệt, collagen được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: ngành da, phim, mỹ phẩm, y học, dược phẩm, vật liệu sinh học và thực phẩm [2]. Nhìn chung, trong ngành công nghiệp collagen, các dạng collagen thương mại đều từ da và xương động vật có vú như trâu, bò, heo,…, phế thải của ngành chế biến gia cầm. Tuy nhiên, nguồn động vật ở cạn này không phù hợp với nhiều vùng tín ngưỡng, tôn giáo; khó điều khiển về chất lượng và có thể lây nhiễm các tác nhân sinh học và chất độc như: BSE (bệnh bò điên), FMD (b ệnh lở mồm long móng). Vì thế, hiện nay người ta tìm nguồn thu nhận collagen mới từ các loài cá và thủy sản khác[2]. Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 3 1.2 Thành phần và cấu trúc Trước khi tìm hiểu về collagen, chúng ta sơ lược đôi nét về protein. Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các acid amin (hình 2.1). Acid amin đư ợc cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của acid amin. Khoảng 20 acid amin đã đư ợc phát hiện trong thành phần của tất cả các loại protein khác nhau trong cơ thể sống. Protein có bốn bậc cấu trúc: Cấu trúc bậc một: Các acid amin nối với nhau bởi liên kết peptide hình thành nên chuỗi polypeptide. Đầu mạch polypeptide là nhóm amin của acid amin thứ nhất và cuối mạch là nhóm cacboxyl của acid amin cuối cùng. Cấu trúc bậc một của protein thực chất là trình tự sắp xếp của các acid amin trên chuỗi polypeptide. Cấu trúc bậc một của protein có vai trò tối quan trọng vì trình tự các acid amin trên chuỗi polypeptide sẽ thể hiện tương tác giữa các phần trong chuỗi polypeptide, từ đó tạo nên hình dạng lập thể của protein và do đó quyết định tính chất cũng như vai trò của protein. Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin có thể dẫn đến sự biến đổi cấu trúc và tính chất của protein. Cấu trúc bậc hai: là sự sắp xếp đều đặn các chuỗi polypeptide trong không gian. Chuỗi polypeptide thường không ở dạng thẳng mà xoắn lại tạo nên cấu trúc xoắn α và cấu trúc nếp gấp β, đư ợc cố định bởi các liên kết hyđro giữa những acid amin ở gần nhau. Các protein sợi như keratin, collagen... (có trong lông, tóc, móng, sừng) gồm nhiều xoắn α, trong khi các protein c ầu có nhiều nếp gấp β hơn. Cấu trúc bậc ba: Các xoắn α và phi ến gấp nếp β có thể cuộn lại với nhau thành từng búi có hình dạng lập thể đặc trưng cho từng loại protein. Cấu trúc không gian này có vai trò quyết định đối với hoạt tính và chức năng của protein. Cấu trúc này lại đặc biệt phụ thuộc vào tính chất của nhóm -R trong các mạch polypeptide.Chẳng hạn nhóm -R của cystein có khả năng tạo cầu đisulfur (-S-S-), nhóm -R của proline cản trở việc hình thành xoắn, từ đó vị trí của chúng sẽ xác định điểm gấp, hay những nhóm -R ưa nước thì nằm phía ngoài phân tử, còn các nhóm kị nước thì chui vào bên trong phân tử... Các liên kết yếu hơn như liên kết hydro hay liên kết điện hóa trị có ở giữa các nhóm -R có điện tích trái dấu. Cấu trúc bậc bốn: Khi protein có nhiều chuỗi polypeptide phối hợp với nhau thì tạo nên cấu trúc bậc bốn của protein. Các chuỗi polypeptide liên kết với nhau nhờ các liên kết yếu như liên kết hydro. Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 4 Phân loại protein: Có nhiều loại protein, mỗi loại đảm nhiệm một vai trò khác nhau trong cơ thể: Bảng 1.2.1- Phân loại protein theo chức năng của chúng trong cơ thể LOẠI PROTEIN CHỨC NĂNG Protein cấu trúc Cấu trúc, nâng đỡ Protein enzyme Xúc tác sinh học: tăng nhanh, chọn lọc các phản ứng sinh hóa Protein hormone Điều hòa các hoạt động sinh lý Protein vận chuyển Vận chuyển các chất Protein vận động Tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể Protein thụ quan Cảm nhận, đáp ứng các kích thích của môi trường Protein dự trữ Dự trữ chất dinh dưỡng Collagen là loại protein cấu trúc trong cơ thể động vật. Nó được phân bố trong các bộ phận như da, cơ, gân, sụn, dây chằng xương và răng... Trong thành phần của da, ở lớp bì chứa rất nhiều collagen tạo ra một hệ thống nâng đỡ, hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì đ ộ ẩm... Tùy theo từng độ tuổi, điều kiện sống, tác nhân môi trường, da có thể bị lão hóa hoặc tổn thương, sợi collagen mất dần tính đàn hồi và săn chắc do cấu trúc collagen bị phá vỡ. 1.2.1 Cấu trúc phân tử collagen Về cấu trúc của phân tử collagen, phân tử collagen hay còn gọi là tropocollagen là một cấu trúc dạng sợi hình ống chiều dài khoảng 300nm, đường kính 1,5 nm. Mỗi sợi collagen này được cấu tạo từ ba chuỗi polypeptide nối với nhau bằng các liên kết hydro và xoắn lại với nhau giống như sợi dây thừng (hình 1.2.1). Hình 1.2.1 – Chuỗi xoắn collagen gồm 3 dây xoắn chặt Mỗi một vòng xoắn có độ dài là 3,3 gốc amino acid, chiều cao là 2,9 Ao. Mỗi một chuỗi polypeptide trong collagen được cấu tạo từ các amino acid theo một trật tự, Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 5 thông thường là Gly - Pro - Y, hoặc Gly - X – Hyp (hình 1.2.2). Trong đó, X, Y là những đơn vị amino acid khác. Proline (Pro) và hydroxyproline (Hyp) chiếm khoảng 1/6 chuỗi, glycine chiếm khoảng 1/3 chuỗi. Tổng cộng chỉ riêng proline, hydroxyproline, và glycine chiếm 1/2 chuỗi collagen. Các amino acid còn lại chiếm 1/2 [25]. Hình 1.2.2 – Từng bậc cấu tạo trong phân tử collagen [8] (a) Chuỗi polypeptide bậc một. (b) Cấu trúc xoắn α bậc hai và bậc ba. (c) Cấu trúc so le bậc bốn Glycine đóng một vai trò hết sức quan trọng trong cấu trúc sợi siêu xoắn của collagen. Tropocollagen liên kết với nhau theo kiểu đầu nối đuôi hình thà nh collagen fibril. Các collagen fibril này bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber (hình 1.2.3). Vì thế collagen rất chắc, dai, và bền. Hình 1.2.3 – Cấu trúc sợi collagen [22] (a) Cấu trúc khái quát 3 chuỗi xoắn α của collagen. (b) Phân tử collagen. (c) Collagen fibril đường kính từ 10 đến 300nm. (d) Collagen fibril bó lại với nhau hình thành sợi collagen siêu cáp – collagen fiber, đường kính từ 0,5 đến 3 μm. Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 6 1.2.2 Thành phần hóa học của collagen Về thành phần các acid amin: trong collagen chứa rất ít hoặc không chứa cystein và tryptophan, nhưng chứa rất nhiều hydroxyproline. Hydroxyproline này là một acid amin đặc trưng của collagen mà các loại protein khác không có. Trong phân tử tất cả các loại collagen, luôn có sự lặp lại của cấu trúc X-Y-Gly, trong đó X, Y có thể là bất kỳ acid amin nào. Tuy nhiên, ở vị trí của X và Y thường là (2S)-Proline (Pro, 28%) và (2S,4R)-4-Hydroxyproline (Hyp, 38%). Chuỗi Pro-Hyp- Gly là chuỗi thường gặp nhất trong phân tử collagen (10,5%) [27]. Bảng 1.2.2 – So sánh thành phần amino acid của một số loại protein (gam amino acid/100 gam protein) [7, 12, 28] Protein Amino acid COLLAGEN (từ da cá phổi) CASEIN (từ sữa dê) ALBUMIN (từ trứng) Alanine 11,70 3,50 5,70 Glycine 24,00 2,80 6,30 Valine 2,56 6,70 10,30 Leucine 3,37 13,60 8,90 Isoleucine 1,64 4,20 4,90 Proline 14,8 9,30 3,80 Phenylalanine 2,60 4,40 3,77 Tyrosine 0,19 4,60 2,69 Serine 4,71 3,60 10,90 Threonine 3,18 4,90 10,70 Cystine - - - Methionine 0,59 2,70 1,11 Arginine 9,10 3,90 2,73 Histidine 0,80 - 1,16 Lysine 3,63 6,70 7,70 Aspartic acid 6,60 4,70 10,90 Glutamic acid 1,90 20,30 7,40 Hydroxyproline 9,80 - - Hydroxylysine 0,88 - - Arginin - 3,90 - Tryptophan - - - Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 7 Thành phần amino acid của collagen từ các nguồn thu nhận khác nhau (cơ quan, loài động vật, …) thì khác nhau. Bên dư ới là thành phần amino acid của một số loại collagen từ một số loài động vật khác nhau. Bảng 1.2.3 - Thành phần amino acid của collagen vảy cá Rohu và cá Catla (số gốc amino acid trên tổng số 1000 gốc amino acid) [23] Amino acid Rohu Catla Aspartate + asparagine 53 48 Glutamate + glutamine 87 83 Hydroxyproline 83 84 Serine 28 26 Glycine 361 353 Histidine 0 0 Arginine 38 38 Threonine 17 17 Alanine 80 83 Proline 118 130 Tyrosine 3 2 Valine 15 15 Methionine 9 9 Cysteine 0 0 Isoleucine 13 12 Leucine 28 26 Phenylalanine 54 55 Lysine 13 19 Thành phần và cấu trúc Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 8 Bảng 1.2.4 – Sự khác nhau về hàm lượng hydroxyproline và nhiệt độ biến tính của collagen từ các nguồn thu nhận khác nhau [23] Môi trường sống Sinh vật Nguồn thu nhận Hàm lượng Hydroxyproline (gốc/1000 gốc amino acid) Nhiệt độ biến tính (o Nguồn tham khảo C) Trên cạn Bê Da 94 40,8 Ikomaa và cộng sự. (2003) Lợn Da 93 37 Nước ngọt Cá Rohita và cá Catla Vảy 83 36,5 Pati Falguni và cộng sự (2010) Cá Oreochrom-is niloticas Vảy 83 35,7 Ikomaa và cộng sự. (2003) Cá chép bạc (Hypophth- almichthys molitrix) Da 84 34,5 Rodziewi cz- Motowidł o và cộng sự. (2008) Cá Cyprinus carpio Da 76 28,0 Duan và cộng sự. (2009) Vảy 77 28,0 Xương 80 28,0 Biển Cá Pragus Vảy 73 29,9 Ikomaa và cộng sự. (2003) Cá cóc lưng đen (Lagoceph- alus gloveri) Da 77 28,0 Senaratne và cộng sự. (2006) Cá nóc mắt đơn (Takifugu rubripes) Da 67 28,0 Nagai và cộng sự. (2002) Biển sâu Cá trống đỏ (Sebastes mentella) Da 64 16,1 Wang và cộng sự. (2008) Vảy 65 17,7 Xương 61 17,5 Cá hồi (Gadus sp.) Da 53 15,0 Sadowska và cộng sự. (2003) Phân loại Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 9 1.3 Phân loại Collagen là thuật ngữ chung cho nhóm protein có cấu túc xoắn anpha của ba sợi polypeptide, và tất cả các loại protein collagen đều có cấu trúc siêu phân tử mặc dù kích thước, chức năng và sự phân bố của chúng trong các mô khác nhau rất nhiều. Hiện nay, người ta đã tìm ra hơn 28 loại collagen khác nhau. Dựa vào cấu trúc và tổ chức siêu phân tử của collagen, chúng có thể được nhóm lại thành các nhóm: collagen dạng sợi (fibril-forming collagen), collagen tổ hợp sợi (fibril-associated collagen (FACIT)), collagen transmembrane, collagen trên nền membrane và các loại collagen khác với cấu trúc đặc biệt. Bảng 1.3.1 – Phân loại collagen [27] Loại Nhóm Thành phần Phân bố I Sợi α1[I]α2[I] Da, xương, gân, dây chằng II Sợi α1[II]3 Sụn III Sợi α1[III]3 Da, máu, mạch, ruột IV Mạng lưới α1[IV]2α2[IV] Màng membranes α3[IV]α4[IV]α5[IV] α5[IV]2α6[IV] V Sợi α1[V]3 Xương, gân, giác mạc, nhau thai α1[V]2α2[V] α1[V]α2[V]α3[V] VI Mạng lưới α1[VI]α2[VI]α3[VI] Xương, gân, sụn α1[VI]α2[VI]α4[VI] VII Sợi mỏ neo α1[VII]2α2[VII] Gân, bang quang VIII Mạng lưới α1[VIII]3 α2[VIII]3 α1[VIII]2α2[VIII] Gân, não, tim, thận IX Collagen dạng sợi kết hợp xoắn gián đoạn (Fibril- Associated Collagens with Interrupted Triple helices – FACIT) 1[IX]α2[IX]α3[IX] Sun, giác mạc X Mạng lưới α1[32]3 Sụn XI Sợi 1[XI]α2[XI]α3[XI] Sụn XII FACIT α1[XII]3 Gân, dây chằng XIII Collagen dạng màng kết hợp xoắn gián đoạn (Membrane - Associated Collagens — Màng tế bào, gân, sụn Phân loại Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 10 with Interrupted Triple helices – MACIT) XIV FACIT α1[XIV]3 Xương, sụn, dây chằng XV Dạng ghép kênh (multiplexins) — Mao mạch, tinh hoàn, thận, tim XVI FACIT — Hạ bì, thận XVII MACIT α1[XVII]3 Hemidesmosomes trong biểu mô XVIII MULTIPLEXIN — Tầng hầm màng, gan XIX FACIT — Tầng hầm màng XX FACIT — Giác mạc (gà) XXI FACIT — Dạ dày, thận XXII FACIT — Mô nút giao XXIII MACIT — Tim, võng mạc XXIV Sợi — Xương, giác mạc XXV MACIT — Não, tim, tinh hoàn XXVI FACIT Tinh hoàn, buồng trứng XXVII Sợi — Sụn XXVIII — — Hạ bì, dây thần kinh hông Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 11 1.4 Tính chất Để có thể được ứng dụng một cách hiệu quả thì collagen thành phẩm phải có độ tinh sạch phù hợp và đồng thời phải biết rõ các tính chất quan trọng của colllagen như: thành phần cấu trúc, khối lượng phân tử, thành phần amino acid và nhiệt độ biến tính và khả năng hòa tan, trương nở của collagen. Thành phần và tính chất của collagen tạo thành phụ thuộc nhiều vào nguồn nguyên liệu sản xuất và cũng như phương pháp tách chiết và tinh sạch. Thành phần và tính chất của collagen đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đề cập. 1.4.1 Độ tinh sạch của collagen Phanat Kittiphattanabawon và cộng sự (2005) đã ti ến hành nghiên cứu trích chiết collagen từ da và xương cá chỉ vàng. Kết quả phân tích nguyên liệu và sản phẩm thu được như bảng bên dưới. Bảng 1.4.1 - Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu da, xương cá chỉ vàng và collagen trích chiết được [24] Thành phần (% khối lượng) Hydroxyproline (mg/g) Mẫu Ẩm Tro Chất béo Protein Da 64,08 3,23 0,98 32,0 19,5 Xương 62,27 14,40 8,77 13,3 5,71 Collagen da 7,06 0,68 0,33 94,0 58,5 Collagen xương 11,57 0,88 0,48 84,2 42,5 Villanueva và cộng sự (2009) đã đưa ra phương pháp định lượng collagen bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao. Xác định hàm lượng collagen dựa vào diện tích peak và dựa vào đồ thị đường chuẩn mô tả mối tương quan giữa diện tích peak và hàm lượng hydroxyproline, glycine, proline trong collagen. Tác giả cho rằng collagen là một chuỗi polipeptide trong đó thành phần chủ yếu bao gồm 3 loại acid amin trên. Và hàm lượng collagen được tính như sau: µ µ + +∑ Pr ( / )­ ( / ) 0,55 Hyp Gly o g mg Hµml îng collagen g mg Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 12 Hình 1.4.1 - Đồ thị đường chuẩn biểu thị mối tương quan giữa diện tích peak và hàm lượng acid amin [31] Tuy nhiên, phương pháp đơn giản hơn cho việc định lượng collagen là theo phương pháp của Sadowska và cộng sự (2003). Thông qua xác định hàm lượng hydroxyproline tính được lượng collagen tổng bằng công thức: Hàm lượng collagen (μg/mg) = hydroxyproline (μg/mg) x 14,7 1.4.2 Thành phần cấu trúc và khối lượng phân tử Theo kết quả phân tích điện di, người ta xác định được khối lượng phân tử của collagen loại I vào khoảng 200-300 kDa cao hơn so với gelatin (dưới 200-300kDa) và cao hơn nhiều so với sản phẩm thủy phân collagen (dưới 50 kDa). Trong đó, cấu trúc chuỗi β có phân tử lượng khoảng 200 kDa còn cấu trúc chuỗi α có phân tử lượng khoảng 100 kDa [34]. Do khi thu nhận collagen ta chỉ sử dụng các tác nhân để tấn công vào những cấu trúc không phải chuỗi xoắn của collagen, điều kiện tiến hành ôn hòa, thời gian thích hợp nên mức độ thủy phân ít và collagen vẫn giữ được cấu trúc mạch dài, và do đó khối lượng phân tử của collagen lớn. Trong khi, để sản xuất gelatin và collagen thủy phân thì ngư ời ta phải sử dụng tác nhân và điều kiện tiến hành khác nghiệt hơn, tấn công vào cả các cấu trúc xoắn của sợi collagen nên sản phẩn tạo thành có khối lượng phân tử nhỏ và dao động nhiều [34]. Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 13 Trong nghiên cứu của Phanat Kittiphattanabawon và cộng sự (2005), sau khi phân tích điện di, các tác giả thu được kết quả về cấu trúc và khối lượng phân tử collagen như hình 1.4.2. Hình 1.4.2 – Phân tích điện di SDS–PAGE collagen từ da (S) và xương (B) của cá chỉ vàng dưới điều kiện khử và không khứ ( M, I, II, III và V là các collagen tương ứng làm mẫu chuẩn) [24] Kết quả trên cho thấy, không có sự khác nhau giữa collagen da và collagen xương. Cả hai loại collagen này đều có ít nhất hai chuỗi α khác nhau (α1 và α2). N ếu có thêm chuỗi α3 thì trong đi ều kiện phân tích này vẫn chưa xác định được. Kết quả này cũng phù h ợp collagen trích chiết từ nhiều loài cá khác (Ciarlo và cộng sự 1997; Kimura, 1985; Kimura & Ohno, 1987; Matsui và cộng sự, 1991; Nagai & Suzuki, 2000a, 2000b; Piez, 1965). Cấu trúc của collagen dưới điều kiện khử và không khử đêu như nhau đối với collagen từ da và xương, chứng tỏ trong da và xương đều không có các liên kết disulfur (-S-S-). Nhìn chung, cấu trúc collagen loại I chứa ít cystein (0,2%), methionine (1,24- 1,33%) %) (Owusu-Apenten, 2002). Mà đây là hai amino acid chủ yếu tạo nên các cầu nối disulfur nên số lượng các liên kết disulfur trong collagen loại I là rất ít. Tóm lại, kết luận của tác giả là collagen thu nhận được từ da và xương cá chỉ vàng chủ yếu là collagen loại I, cấu trúc gồm hai chuỗi α (α1 và α2). Trong nghiên cứu của Nagai và cộng sự (2000), các tác giả đã sử dụng phương pháp điện di SDS-PAGE theo phương pháp của Weber và Osborn (1969) để xác định các chuỗi collagen. Trong đó, mẫu collagen được hoà tan vào sodium phosphate 0,02M (pH 7,2) chứa 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) và 3,5M urea. Điện di được tiến hành trên 3,5% gel với đệm phosphate 0,1M (pH 7,2) chứa 1% SDS. Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 14 Hình 1.4.3 - Sắc kí điện di SDS-PAGE collagen loại I của da heo và collagen da cá (Điện di trên 3,5% gel chứa urea 3,5M: (A) Da heo; (B) Cá Pecca; (C) Cá mập; (D) Cá thu) [19] Bằng phương pháp điện di như đã nói trên, hình 2.23 cho th ấy collagen da của cá pecca và cá mập gồm 2 chuỗi α khác nhau, đó là α1 và α2. Trong đó, α2 có hàm lượng rất nhỏ. Nếu có α3 tồn tại thì cũng không thể tách khỏi α1 trong đi ều kiện điện di này. Còn đ ối với cá thu, collagen dạng α chỉ gồm chuỗi α1 mà hoàn toàn không có α2. Trong hình 1.4.3, có sự tồn tại của chuỗi β ở cá 3 loài cá. 1.4.3 Nhiệt độ biến tính Khi thực hiện quá trình biến tính collagen bằng nhiệt, các tính chất vật lý của collagen như độ nhớt, khả năng hòa tan, khả năng hấp thu quang học thay đổi. Độ nhớt của collagen thay đổi trong một khoảng rộng khi ta tăng nhiệt độ. Dựa vào sự thay đổi độ nhớt của collagen theo nhiệt độ, người ta xác định nhiệt độ biến tính của collagen. Độ nhớt của collagen giảm dần theo chiều tăng của nhiệt độ. Theo đồ thị hình 1.4.4, ta thấy độ nhớt của collagen bắt đầu giảm ở 30oC và đạt ổn định tại 42,5oC. Khi độ nhớt của collagen giảm xuống thấp hơn ½ giá trị ban đầu (tại nhiệt độ phòng tức là 25oC) thì collagen xem như bi ến tính. Như vậy, theo đồ thị bên dưới thì collagen biến tính tại 37,5o 34 C. Khi biến tính, cấu trúc xoắn ba sợi của collagen bị phá vỡ, collagen chuyển sang dạng lõi xoắn ngẫu nhiên do có sự phá vỡ liên kết hydro giữa các sợi collagen trong cấu tạo của nó. Các dạng trime (γ) chuyển thành dạng dime (β) hoặc sợi đơn (α) làm giảm độ nhớt [ ]. Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 15 Hình 1.4.4 – Đường cong biến tính nhiệt của collagen, gelatin và collagen thủy phân [34] Độ nhớt của dung dịch collagen giảm liên tục khi ta tăng nhiệt độ. Tốc độ giảm độ nhớt của dụng dịch collagen cũng gi ảm dần khi nhiệt độ tăng. Người ta xác định nhiệt độ biến tính cảu collagen dựa vào sự thay đổi độ nhớt của nó theo nhiệt độ. Nhiệt độ mà tại đó độ nhớt của dung dịch collagen giảm chỉ còn một nửa so với dung dịch collagen ở nhiệt độ phòng là nhiệt độ biến tính của collagen. Khi nhiệt độ nhỏ hơn nhiệt độ biến tính thì đ ộ nhớt của collagen giảm nhanh, còn khi nhiệt độ lớn hơn nhiệt độ biến tính thì dung dịch collagen có độ nhớt giảm rất chậm và dần đạt ổn định. Có thể giải thích sự giảm độ nhớt của collagen khi ta biến tính collagen bằng nhiệt là do sự đứt các liên kết hydro trong cấu tạo phân tử của collagen, đồng thời cấu trúc xoắn lò xo 3 sợi của collagen cũng b ị phá vỡ, collagen chuyển cấu trúc thành các dạng xoắn ngẫu nhiên, cấu trúc dạng γ chuyển thành β và α [24]. Nhiệt độ biến tính collagen da cá thấp, 26,5oC (cá pecca), 25,6oC (cá thu), 25,0oC (cá mập) thấp hơn khoảng 10oC so với collagen da heo (37o 19C) [ ]. Nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá vược Nhật Bản, cá thu, cá mập đầu bò, cá nóc mắt đơn trong khoảng 25-28oC; còn của collagen từ xương cá vược Nhật Bản, cá ngừ, cá thu ngựa khoảng 29,5-30o 24C [ ]. Lê Thị Hồng Nhan (2009) có nghiên cứu trên loài cá basa (Pangasius Bocourti) nuôi tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, Việt Nam. Tác giả cũng có một số phân tích trên sản phẩm collagen thu được. Trong đó, nhiệt độ biến tính collagen được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt, sử dụng thiết bị Brookfield viscometer HDBV- II. Phân tích độ nhớt được thực hiện trong một bể nước. Nhiệt độ bể được cài đặt từ 30oC Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 16 lên 50oC với tốc độ 5oC/phút và giữ ở 50oC trong 10 phút. Kết quả độ nhớt giảm khi ta tăng nhiệt độ (hình 1.4.5). Từ đó đã xác đ ịnh được nhiệt độ biến tính của collagen từ da cá basa là khoảng gần 40o C. Hình 1.4.5 -Biểu đồ sự phụ thuộc độ nhớt theo nhiệt độ [20] Hình 1.4.6 – Sự thay đổi độ nhớt của dung dịch collagen (trong acid acetic) từ da và xương cá chỉ vàng theo nhiệt độ [24] Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 17 1.4.4 Thành phần amino acid Về phân tích thành phần amino acid, mẫu collagen được thủy phân trong điều kiện giảm áp, trong dung dịch HCl đậm đặc (thường dùng HCl 6M), ở nhiệt độ cao (khoảng 111o Bảng 1.4.2 - Thành phần amino acid của dung dịch collagen da cá nóc [ C). Dịch thủy phân được phân tích trên máy phân tích amino acid. 18] Amino acid Số lượng ( số gốc/ 1000 gốc) Hydroxyproline 67 Aspartic acid 50 Threonine 25 Serine 48 Glutamic acid 87 Proline 103 Glycine 351 Alanine 106 Half-cystine 2 Valine 17 Methionine 14 Isoleucine 12 Leucine 23 Tyrosine 4 Phenylalanine 10 Tryptophan 0 Lysine 19 Histidine 8 Arginine 54 Tổng 1000 Bảng 1.4.3 -Thành phần amino acid của dung dịch collagen da và xương cá chỉ vàng chiết bằng pepsin [24] Amino acid Da ( số gốc/ 1000 gốc) Xương ( số gốc/ 1000 gốc) Asp 51 47 Hyp 77 68 Thr 29 25 Ser 36 34 Glu 78 74 Pro 116 95 Gly 286 361 Ala 136 129 Val 22 17 Met 12 8 Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 18 Ile 5 5 Leu 24 25 Tyr 4 2 Phe 15 12 Hyl 10 20 Lys 31 25 His 10 6 Arg 60 46 Tổng 1000 1000 Qua một số kết quả phân tích trên, ta thấy glycine là thành phần acid amin chủ yếu trong collagen (khoảng 30-35% tổng số acid amin). 1.4.5 Khả năng trương nở, hòa tan Khả năng hòa tan của collagen phụ thuộc nhiều vào pH và nồng độ muối trong dung dịch. Kittiphattanabawon và cộng sự (2005) đã khảo sát ảnh hưởng của pH và nồng độ NaCl lên khả năng hòa tan của collagen từ da và xương cá chỉ vàng. Độ hòa tan của collagen đạt cao nhất tại pH=2 đối với collagen từ da và tại pH=5 đối với collagen từ xương. Nói chung, cả hai dạng collagen đều tan tốt trong vùng pH acid và độ hòa tan giảm nhanh khi pH tiến về trung tính. Tuy nhiên, khi nồng độ acid trong dung dịch quá cao (pH<2) thì lại làm han chế khả năng hòa tan c ủa collagen. Khi pH lớn hơn pI thì protein tích đi ện âm, còn khi pH nhỏ hơn pI thì protein tích điện dương. Khi đó, protein tương tác và liên kết nhiều với nước hơn so với giữa các phân tử protein với nhau. Do đó, khi pH càng xa pI thì đ ộ hòa tan của nó càng tốt. Độ hòa tan của collagen trong dung dịch acid acetic 0,5M có mặt NaCl vẫn tốt khi nồng độ NaCl nhỏ hơn 3%. Khi nồng độ NaCl lớn hơn 3% thì có s ự giảm đột ngột độ hòa tan của collagen (từ trên 90% xuống dưới 40%). Nguyên nhân là do tại nồng độ này của NaCl làm gia tăng các tương kỵ nước, làm giảm liên kết giữa protein với nước và dẫn đến sự tủa protein. Từ đồ thị ta thấy collagen từ xương cá chỉ vàng chị muối tốt hơn collagen từ da cá chỉ vàng. Sự khác nhau về khả năng hòa tan c ủa các loại collagen là do sự khác nhau về đặc điểm cấu trúc phân tử của chúng. Tính chất Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 19 Hình 1.4.7 – Sự thay đổi độ nhớt tương đối (%) của collagen da và xương cá chỉ vàng theo pH [24] Hình 1.4.8 - Sự thay đổi độ nhớt tương đối (%) của collagen da và xương cá chỉ vàng theo nồng độ NaCl [24] 1.4.6 Điểm đẳng điện (pI) Điểm đẳng điện (isoelectric point – pI) là một thông số quan trọng của protein, liên quan nhiều đến tỉ lệ các gốc amino acid ngoài mạch chính thuộc về nhóm chức acid hay base. Thông thường pI của collagen có giá trị khoảng 8,4, cao hơn cả gelatin (khoảng 4,9) và collagen thủy phân (khoảng 4,6). pI của collagen nằm trong vùng pH kiềm vì trong quá trình trích chiết, các gốc acid trong mạch collagen bị trung hòa bởi các tác nhân có tính acid [34]. Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 20 1.5 Thu nhận collagen 1.5.1 Sự phá vỡ tế bào Các phân tử collagen không có khả năng đi qua màng tế bào, cho nên cần phá vỡ cấu trúc để chuyển collagen vào dung dịch. Người ta có thể phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị nghiền đồng thể (homogenizator). Thiết bị này có chày thủy tinh gắn với motor quay và có thể điều chỉnh tốc độ quay theo yêu cầu. Các tế bào giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị phá hủy. Để tiện cho phá vỡ màng tế bào có hiệu quả, các mô tế bào thường được cho trương nước. Ngoài ra còn có thể dùng sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, và các chất tẩy rửa. Các hóa chất này giúp cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào do trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Điều này có thể giải thích tại sao trước khi tách chiết collagen, da cá thường được tẩy rửa với các hóa chất trên, một mặt là để loại sạch các tạp chất, mặt khác là để cho da được trương nở hoặc thành tế bào bị phá vỡ, giúp collagen dễ dàng đi vào dung dịch tách chiết. Sự tách chiết protein collagen: Sau khi cấu trúc tế bào bị phá vỡ, việc chiết tách collagen dễ dàng hơn, có thể chiết bằng các dung dịch acid hoặc enzyme theo quy trình như sau (hình 1.5.1) Hình 1.5.1 - Quy trình tách chiết collagen Quá trình chiết collagen được thực hiện trong các thiết bị ở nhiệt độ lạnh, trong điều kiện vô trùng, khuấy trộn liên tục để đảm bảo chiết được collagen có chất lượng tốt. Cách thức hoạt động của emzyme pepsin : Điểm đẳng điện của pepsin khoảng pH 1, pepsin thuỷ phân mạnh các liên kết peptide nối mạch do các nhóm amin của các Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 21 acid amin thơm trong phân tử protein và peptide tạo thành, sản phẩm được tách ra là các peptide và các acid amin tự do. Hoạt động trong môi trường acid, pepsin hoạt động thích hợp nhất trong khoảng pH 1,5 - 2; ở điều kiện này pepsin không bền do có sự tiêu enzyme. Pepsin có độ bền tối đa ở pH 4 - 5; ở vùng pH này, hoạt lực của pepsin thấp; từ pH 5,6 hầu như không có hoạt tính protease. Dung dịch pepsin trong nước ở dạng pepsinogen và được hoạt hoá bởi H+ với pH = 1,5 – 2,0. Chúng phân giải gần 30% mạch peptide và biến protein thành polypeptide. 1.5.2 Phương pháp tinh sạch collagen Trong dịch chiết thô, ngoài collagen còn có các protein tạp, các lipid, muối khoáng, để loại chúng phải sử dụng nhiều biện pháp khác nhau. Để loại muối khoáng thường dùng phương pháp thẩm tích đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. Để loại bỏ các protein tạp có phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc kí trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel. 1.5.2.1 Phương pháp thẩm tích Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dung dịch các tinh thể (các muối, các hợp chất hữu cơ có trọng lượng phân tử thấp...). Các tinh thể có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick. Nước sẽ khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp hơn (thường là dung dịch rửa) vào dung dịch keo, trong khi đó các ion và các chất phân tử nhỏ sẽ chuyển từ dung dịch keo vào dung dịch có nồng độ thấp hơn. Trong quá trình tách chi ết vàtinh sạch protein, để loại muối ra khỏi dung dịch protein thì cho dung dịch protein vào cái túi đặc hiệu làm bằng nguyên liệu bán thấm. Thông thường người ta hay dùng túi cellophan. Sau đó đặt cả túi vào bình chứa lượng lớn nước hoặc lượng lớn dung dịch đệm được pha loãng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M). Vì màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ chỉ cho các chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua vào các dung dịch đệm loãng. Như vậy, muối sẽ khuếch tán vào nước hoặc dung dịch đệm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), còn nước hoặc đệm loãng sẽ di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein. Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Bằng cách thay thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein. Có thể làm giảm bớt hoặc loại trừ sự pha loãng như th ế khi tiến hành thẩm tích dưới áp suất, có nghĩa là khi dung d ịch được xử lý nằm dưới một áp suất thủy tĩnh H+ PEPSINOGEN PEPSIN Pepsin PROTEIN POLYPEPTIDE Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 22 đầy đủ, để dòng thủy động học của nước từ dung dịch sẽ cân bằng sự khuếch tán của các phân tử vào dung dịch. Phương pháp này thường đòi h ỏi có thiết bị đặc biệt. Phương pháp thẩm tích thông thường là cho dung dịch có kết tủa protein vào túi thẩm tích (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluen để bảo quản protein (vì thời gian thẩm tích lâu, protein có thể bị thối hỏng). Buộc túi vào một que thủy tinh, gác que thủy tinh lên miệng chậu nước để giữ túi ở giữa chậu. Cho vòi nước chảy nhẹ liên tục vào đáy chậu để thay đổi nước thường xuyên. Muối hòa tan trong nước và bị loại dần. Có thể tăng tốc độ thẩm tích bằng cách khuấy trộn dung dịch rửa. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh. 1.5.2.2 Sắc ký gel Trong sắc kí gel, pha tĩnh là mạng polymer có lỗ rỗng, các lỗ rỗng này được phủ đầy bởi dung môi làm pha động. Kích thước của lỗ rỗng phải đồng nhất, bởi vì kỹ thuật sắc kí gel dùng để tách các chất theo trọng lượng phân tử. Các phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ rỗng sẽ không lọt vào bên trong lỗ rỗng và sẽ bị dòng chảy của dung môi đuổi ra khỏi cột. Còn phân tử nào có kích thước nhỏ hơn kích thước lỗ rỗng sẽ chui vào nằm bên trong lỗ nên bị giải ly ra khỏi cột chậm hơn. Sắc kí gel được ứng dụng trong việc tách một hổn hợp thành cácnhóm chất riệng rẽ, ứng dụng trong việc xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất có trọng lượng phân tử lớn, và ứng dụng để loại muối ra khỏi một hợp chất. 1.5.3 Làm khô và bảo quản chế phẩm collagen Tính cố định cấu trúc của protein được bảo đảm nhờ khả năng liên kết nước của chúng. Nếu dung dịch protein bị khô ở độ nhiệt trong phòng thì đa s ố protein bị biến tính. Protein chỉ có thể được giữ ở dạng khô trong trường hợp nếu việc sấy khô được tiến hành vô cùng nhanh hoặc ở nhiệt độ thấp. Nhiều protein như chúng ta đã biết, ở độ nhiệt thấp có thể được kết tủa bằng rượu hoặc acetone. Nếu kết tủa thu được bằng cách đó đem xử lý bằng rượu tuyệt đối, bằng acetone hoặc bằng ether và sau đó làm khô thật nhanh thì protein sẽ không bị biến tính. Tuy nhiên, nhiều protein không chịu được cách xử lý như vậy. Vì vậy, người ta sử dụng phương pháp làm đông khô. Dung dịch protein đã đư ợc thẩm tích được làm đóng băng và làm thăng hoa băng ở áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo ra nhờ máy hút chân không mạnh). Hơi nước được tạo ra đều được đóng băng trong bầu dự trữ ở độ nhiệt thấp hơn. Sau một vài giờ chỉ còn lại bột protein. Sau đó bột này (trong chân không) có thể được giữ ở độ nhiệt cao hơn. 1.5.4 Sử dụng CO2 siêu tới hạn trong tinh sạch collagen Một chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid – SCF) là bất kì một hợp chất nào có giá trị nhiệt độ và áp suất trên điểm tới hạn trong giản đồ pha. Trên giá trị nhiệt độ tới hạn, thì phần tử khí không thể hóa lỏng ở bất kì áp suất nào. Áp suất tới hạn là áp suất hơi của khí tại nhiệt độ tới hạn. Trong môi trường siêu tới hạn, chỉ tồn tại một pha Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 23 duy nhất gọi là fluid. Pha fluid không phải là pha khí cũng không ph ải là pha lỏng. Nó là trung gian giữa hai pha. Pha fluid này có khả năng hòa tan tương t ự như chất lỏng, đồng thời cũng khuếch tán tốt như chất khí. Điểm tới hạn là điểm kết thúc của đường cong cân bằng pha giữa hai trạng thái khí – lỏng. Vùng lỏng siêu tới hạn cho biết bằng cách sử dụng sự kết hợp giữa đẳng áp và thay đổi nhiệt độ, giữa đẳng nhiệt và thay đổi áp suất, hoàn toàn có khả năng chuyển đổi các thành phần tinh khiết từ trạng thái lỏng sang trạng thái khí trong vùng và ngược lại mà không hề có sự chuyển pha. Chất lỏng siêu tới hạn có khả năng hòa tan như m ột chất lỏng, đồng thời cũng có khả năng vận chuyển như một chất khí. Điều này giúp cho nó dễ xâm nhập vào mẫu và chiết xuất được cạn kiệt các hoạt chất. Có thể coi SCF là một trạng thái chuyển tiếp, hay trạng thái trung gian giữa khí và lỏng. Kết quả là tốc độ trích ly và sự chuyển khối rất nhanh so với các quy trình tách chiết thông thường. Điều này giúp giảm bớt thời gian của quá trình. Hơn th ế nữa, điều kiện tiến hành có thể được kiểm soát để đạt hiệu quả cao trong quá trình tách chiết chọn lọc. Tách chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (supercritical fluid extraction – SFE) phụ thuộc vào khối lượng riêng của pha fluid và có thể được điều khiển thuận lợi thông qua việc kiểm soát hệ thống nhiệt độ và áp suất. Trong thực tế, SCF có thể được sử dụng để tách chiết các chất trong mẫu rắn cũng giống như tách chiết bằng dung môi lỏng theo phương pháp xưa nay. Tuy nhiên không giống như phương pháp truyền thống ở chỗ là lượng dung môi cặn bã mà phương pháp SFE thảy ra môi trường rất nhỏ. Chính vì thế phương pháp này được cho là thân thiện với môi trường. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp SFE là độ hòa tan của một chất trong một dung môi sẽ khác nhau trong những điều kiện nhiệt độ và áp suất khác nhau. Ở điều kiện môi trường (25o Mặc dù sự hòa tan của chất rắn dễ bay hơi trong dung môi siêu tới hạn cao hơn trong khí lí tưởng nhưng người ta vẫn mong muốn làm tăng độ hòa tan cao hơn n ữa nhằm làm giảm lượng dung môi cho quy trình tách chiết. Do đó, khả năng hòa tan của một chất trong SCF có thể được cải thiện bằng cách thêm vào một chất được gọi là chất trợ dung môi (cosolvent). Chất trợ dung môi có vai trò như m ột chất trung gian dễ bay hơi, giúp cho sự hòa tan một chất vào dung môi dễ dàng hơn. Tiềm năng thương mại của công nghệ SCF có thể được cải tiến đáng kể nhờ vào việc sử dụng chất trợ dung môi. Tuy nhiên, cũng c ần cân nhắc rằng dù thêm một lượng rất nhỏ chất trợ dung môi vào cũng s ẽ làm thay đổi đáng kể tính chất tới hạn của dung môi. Trong giản đồ pha của CO2 (hình 1.5.2), đường sôi phân chia miền khí và lỏng, kết thúc tại điểm tới C, áp suất 1 bar), độ hòa tan của một chất trong pha khí thườngcó quan hệ trực tiếp tới áp suất hơi của nó và nói chung là không đáng kể. Tuy nhiên trong dung môi siêu tới hạn, độ hòa tan của một chất tăng đến 10 lần. Sự hòa tan của một chất trong pha lỏng siêu tới hạn là do sự kết hợp giữa áp suất hơi và ảnh hưởng tương tác giữa chất tan và dung môi. Nghĩa là sự hòa tan của nó không chỉ đơn thuần phụ thuộc vào áp suất. Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 24 hạn. Tại đây, pha lỏng và pha khí biến mất để trở thành một pha siêu tới hạn duy nhất. Dưới nhiệt độ tới hạn, ví dụ ở 280K, khi áp suất tăng, khí bị nén lại, và cuối cùng đến khoảng trên 40 bar, ngưng tụ thành một chất lỏng đặc hơn nhiều, thể hiện trên đường đứt khúc. Hệ bao gồm hai pha cân bằng: pha lỏng có mật độ dày đặc và pha khí có mật độ thấp. Khi nhiệt độ tiến tới 300K, mật độ của pha khí tại trạng thái cân bằng trở nên dày đặc hơn và mật độ của pha lỏng thấp hơn. Tại điểm tới hạn (31,1o C hay 304,1K; 73,8 bar), không có sự khác biệt về mật độ và hai pha lỏng – khí gộp lại thành một pha duy nhất gọi là fluid phase. Vì vậy, trên nhiệt độ tới hạn, chất khí không thể hóa lỏng dưới một áp suất nào. Trên nhiệt độ tới hạn một chút, trong vùng lân cận của áp suất tới hạn, đường biểu hiện gần như là một đường thẳng đứng. Một sự gia tăng nhỏ áp suất làm cho mật độ của pha siêu tới hạn tăng lên rất lớn. Nhiều tính chất vật lý khác, ví dụ như độ nhớt và mối quan hệ giữa hằng số điện môi với nồng độ dung môi, tất cả đều có liên hệ chặt chẽ tới mật độ. Ở nhiệt độ cao hơn, fluid bắt đầu hoạt động như một chất khí. Ví dụ đối với CO2, 400K, mật độ tăng gần như tuyến tính với áp suất. Hình 1.5.2 – Giản đồ pha của CO 2 Thu nhận collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 25 Hình 1.5.3 – Sơ đồ quy trình tách chiết bằng CO2 siêu tới hạn Sơ đồ này có đường hoàn lưu dung môi, trong đó: 1. Thiết bị tồn trữ CO2 2. Thiết bị làm lạnh: CO2 đi vào thiết bị làm lạnh để duy trì trạng thái lỏng trước khi vào bơm cao áp. 3. Presurisation – thiết bị tạo áp suất: Tại đây, áp suất được giữ ở 300bar. 4. Reheating: Nhiệt độ được nâng lên đến 31oC bằng thiết bị trao đổi nhiệt. 5. Cột tách. 6. Thiết bị giảm áp: Áp suất được giảm xuống trả CO2 về trạng thái khí cho phép tách CO2 khỏi dịch chiết. 7. Reheating: Nhiệt độ được duy trì ở 30o C. 8. Separation: Phân riêng lần 1, tách CO2 khỏi dịch chiết bằng trọng lực. 9. Under pulling: Dịch chiết được giảm sức nén một cách từ từ để cho an toàn. 10. Cyclonic separation: Phân riêng lần 2, tách CO2 khỏi dịch chiết bằng lực ly tâm. 11. Liquefaction – thiết bị hóa lỏng: Vẫn trong trạng thái khí, CO2 được làm lạnh để hóa lỏng). Ứng dụng của collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 26 1.6 Ứng dụng của collagen 1.6.1 Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có các ứng dụng khác nhau. Collagen hydrolysate (collagen thủy phân ) được sử dụng trong thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, và công nghiệp nhiếp ảnh. Chúng được sử dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm. Chúng được dùng như chất thay thế cao su, keo dán, xi măng, mực in lụa nhân tạo, là chất tạo kết dính trong diêm quẹt. Chúng được dùng trong bộ lọc sáng cho đèn thủy ngân. Trong sản xuất thực phẩm : Collagen được dùng để làm vỏ bao xúc xích, màng bọc kẹo, làm nguyên liệu sản xuất một số loại thực phẩm dinh dưỡng, thực phẩm chức năng. Tất nhiên chúng phải trải qua một quá trình chế biến để đạt được những tính chất ứng dụng mong muốn. Trong các sản phẩm phô mai, người ta thêm vào một hàm lượng collagen hydrolysate nhằm ngăn chặn sự mất nước. Ngoài ra, trong sản phẩm bơ sữa, collagen đóng vai trò quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho sản phẩm, cũng như thay thế hàm lượng chất béo trong các loại thực phẩm này. Hình 1.6.1 - Sản phẩm phomat có chứa collagen hydrolysate làm giảm hàm lượng chất béo Trong sản phẩm kẹo dẻo, sự có mặt của collagen hydrolysate cung cấp cho sản phẩm độ dẻo, dai và mềm do chúng ngăn chặn sự kết tinh của đường. Các sản phẩm như vỏ kẹo có chứa 0,5-1% hàm lượng collagen hydrolysate với vai trò làm giảm sự tan chảy. Ứng dụng của collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 27 Hình 1.6.2 – Sản phẩm kẹo dẻo có vỏ màng là collagen hydrolysate Trong công nghiệp sản xuất kẹo mứt, collagen hydrolysate được sử dụng làm chất tạo gel, chất kết dính, tạo xốp, làm chậm quá trình tan kẹo trong miệng. Hình 1.6.3 - Collagen hydrolysate làm chất kết dính trong thanh kẹo Trong các sản phẩm như thịt hộp, thịt nguội…, collagen hydrolysate chiếm từ 1-5% giúp giữ hương vị tự nhiên của sản phẩm, đồng thời cũng là một chất kết dính giúp cho việc tạo hình sản phẩm dễ dàng hơn. Hình 1.6.4 – Sản phẩm thịt nguội có chứa collagen hydrolysate Ứng dụng của collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 28 Trong công nghiệp sản xuất rượu bia và nước hoa quả, collagen hydrolysate sử dụng như chất làm trong sản phẩm . Nhờ vậy, sản phẩm khi làm ra có màu sắc trong suốt và óng ánh. Hình 1.6.5 – Collagen hydrolysate làm trong các loại thức uống 1.6.2 Ứng dụng trong y học và dược phẩm Trong y học và dược phẩm, collagen được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng và mềm. Nó có tác dụng bảo vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi. Thành phần chính của vỏ bao là collagen và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, những chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu. Viên nang mềm có thể có hình viên bi, hình trứng, hình trụ, hình giọt, hình hạt đậu, dung lượng 0,1-0,5g chứa dịch lỏng sánh. Viên nang cứng gồm hai mảnh lồng khít vào nhau, hình con nhộng, thành mỏng, kích cỡ 1/40mm, chế tạo bằng máy với quy mô lớn, đựng chất thuốc đã nghiền thành bột. Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho bệnh nhân có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng. Hình 1.6.6 – Viên nang mềm có lớp vỏ ngoài làm từ collagen. Ứng dụng của collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 29 Viên nang cứng gồm hai mảnh lồng khít vào nhau, hình con nhộng, thành mỏng, kích cỡ 1/40mm, chế tạo bằng máy với quy mô lớn, đựng chất thuốc đã nghiền thành bột. Viên thuốc với vỏ bao collagen đảm bảo cho bệnh nhân có thể nuốt viên thuốc một cách dễ dàng. . Hình 1.6.7 – Viên nang cứng làm từ chất liệu collagen Collagen còn đư ợc sử dụng để làm ra các gạc vô trùng sử dụng trong giải phẩu… Nhóm các nhà nghiên cứu trường Đại học Wisconsin-Madison đã t ạo ra dạng collagen bền nhất được khoa học biết đến hiện nay. Đây là giải pháp thay thế ổn định collagen ở người và một ngày nào đó có thể được dùng để điều trị chứng viêm khớp và các tình trạng thiếu collagen. Collagen là dạng protein có nhiều nhất trong cơ thể người, tạo ra các khối và bó dây chắc chắn, có tác dụng hỗ trợ cấu trúc của da, các cơ quan, sụn và xương, đồng thời là tế bào liên kết giữa các bộ phận này. Nhiều thập kỷ qua, các bác sĩ s ử dụng collagen từ bò để điều trị các vết bỏng nghiêm trọng và các vết thương khác. Collagen nhân tạo là liệu pháp chữa trị nhiều bệnh như viêm khớp do thoái hóa collagen tự nhiên trong cơ thể. Để tạo ra loại collagen mới này, các nhà khoa học đã thay thế 2/3 lượng axit amin thông thường của protein bằng các dạng ít dẻo, giúp cấu trúc chung của protein cứng hơn và duy trì được hình dạng của chúng. Tính đột phá của cách tiếp cận này là sử dụng các vật liệu cứng hơn có hình dạng tương tự với các hình dạng protein chức năng sau khi gấp nếp. Dạng collagen mới gắn kết với nhau ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ collagen tự nhiên phân rã. Mặc dù được tạo thành chủ yếu từ các acid amin không có trong tự nhiên, nhưng hình ảnh chụp tia X tinh thể cấu trúc 3 chiều của collagen tạo ra trong phòng thí nghiệm cho thấy, không có sự khác biệt với collagen tự nhiên. Sản phẩm collagen bền vững thực sự là một bằng chứng về khả năng của hóa học protein hiện đại. Collagen đã được sử dụng rộng rãi trong phẫu thuật thẩm mỹ, hỗ trợ chữa bệnh cho bệnh nhân bỏng, làm tái tạo xương và rất nhiều trong nha khoa, phẫu thuật chỉnh hình. Khi khớp xương bị thoái hóa, lượng chất nhầy giữa hai khớp mất đi, không còn có tác dụng làm trơn và vì th ế cử động co duỗi khớp gối khó khăn và đau nhức. Để tái tạo khớp, người ta tiến hành bó collagen hydrolysate xung quanh khớp, dần dần chúng thấm sâu vào trong, làm trơn, và cải thiện tình hình khớp xương. Dĩ nhiên là k ỹ thuật này đòi hỏi chất lượng collagen rất cao và chuyên biệt cho khớp. Ứng dụng của collagen Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 30 Trong phẩu thuật nội soi, collagen hydrolysate được ứng dụng để bôi vào các ống nội soi, có tác dụng bôi trơn, vì th ế các bác sĩ dễ dàng đưa các ống này vào cơ thể bệnh nhân mà không gây đau. Sau thời gian từ 40 – 60 phút, collagen sẽ tan hủy trong cơ thể bệnh nhân mà không gây hại gì. Hình 1.6.8 - Ứng dụng collagen hydrolysate trong kỹ thuật nội soi Trong nha khoa, collagen được chế tạo thành các mảnh bọt biển (sponges), chúng là một tác nhân cầm máu. Những mảnh bọt biển này có khả năng hấp thụ một lượng chất lỏng gấp 50 lần khối lượng của chúng, vì thế chúng có khả năng cầm máu nhanh chóng. Một ứng dụng khá hay trong nha khoa là các bác sĩ tạo ra một lớp men răng nhân tạo bằng collagen hysrlysate có chứa các ion calcium, phosphate, fluoride áp lên bề mặt răng thật , vì thế răng được bảo vệ khỏi các tác nhân gây sâu răng. Hình 1.6.9 – Collagen hydrolysate trong các mảnh bọt biển sử dụng trong nha khoa 1.6.3 Ứng dụng trong công nghiệp mỹ phẩm Colagen chứa các tác nhân làm ẩm tự nhiên đối với cơ thể, có vai trò chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng; hơn nữa colagen còn dùng làm nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem dưỡng da cao cấp, dầu gội, các sản phẩm dưỡng tóc cũng như các loại sữa tắm… Collagen hydrolysate là thành phần trong các sản phẩm mặt nạ dưỡng da chúng kết hợp với các tinh chất trong mật ong, dầu oliu, tinh dầu hoa hồng… có tác dụng dưỡng ẩm cho da, tái tạo làn da mệt mỏi, bảo vệ da khỏi các tác nhân tia tử ngoại , khói bụi, hóa chất… Vì thế da được trẻ hóa, tươi tắn. Dưới tác dụng của các tác nhân tia tử ngoại, thuốc nhuộm tóc, thuốc duỗi tóc… tóc dễ bị tổn thương, chẻ ngọn, mất đi vẻ bong mượt. trong các sản phẩm chăm sóc tóc thường có bổ sung một lượng collagen hydrolysate có tác dụng bảo vệ cho tóc, phục hồi hư tổn. Ứng dụng collagen trong thực phẩm Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 31 Chương 2 ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG THỰC PHẨM Collagen bột Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 32 2.1 Collagen bột 2.1.1 Nguyên liệu Nhìn chung, trong ngành công nghiệp collagen, các dạng collagen thương mại đều từ da và xương động vật có vú như trâu, bò, heo,…, phế thải của ngành chế biến gia cầm. Tuy nhiên, nguồn động vật ở cạn này không phù hợp với nhiều vùng tín ngưỡng, tôn giáo; khó điều khiển về chất lượng và có thể lây nhiễm các tác nhân sinh học và chất độc như: BSE (bệnh bò điên), FMD (b ệnh lở mồm long móng). Vì thế, hiện nay người ta tìm nguồn thu nhận collagen mới từ da, xương, vây của cá và các loài thủy sản khác. 2.1.2 Quy trình công nghệ sản xuất collagen bột Nagai, Suzuki (2000) đã nghiên cứu quá trình tách chiết collagen từ phụ phẩm da, xương, vây của các loài cá ngừ (Katsuwonus pelamis), cá pecca nhật bản (Lateolabrax japonicus), cá thu (Scomber japonicus), cá tráp vàng (Dentex tumifrons), cá mập (Heterodontus japonicus). Da, xương và vây được bảo quản ở 25oC đến khi sử dụng. Tất cả các quá trình từ bước tiền xử lí đến tách chiết đều tiến hành ở 4o C (hình 2.2.1). Hình 2.1.1 - Quy trình chiết collagen bằng cid acetic (acid-soluble collagen – ASC) Collagen bột Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 33 Chỉ nói về phần da cá, trước tiên là bước tiền xử lý bằng NaOH 1% để loại các chất non-collagen (chất béo, chất màu, chất gây mùi tanh). Da tiếp tục được xử lý với butyl alcohol 10% để loại tiếp tạp chất. Sau đó là quá trình tách chi ết collagen bằng acid acetic 0,5M trong 3 ngày. Ly tâm lấy phần dịch, còn phần bã đem chiết lần 2 cũng với acid acetic 0,5M trong 2 ngày nữa. Ly tâm lấy phần dịch. Cả hai phần dịch chiết thu được là dịch lỏng, hơi sánh, gọi là acid-soluble collagen (ASC). Để thu nhận collagen, cho NaCl rắn vào phần dịch chiết này đến nồng độ 0,9M. Đến đây collagen thô đã được kết tủa. Để thu được collagen sạch, tiến hành ly tâm, lấy phần tủa hoà tan vào acid acetic 0,5M. Thẩm tách thu được collagen sạch. Collagen sạch được làm lạnh khô và cất trữ ở nhiệt độ lạnh. Hiệu suất tách chiết đạt được tương đối cao 51,4% (cá pecca Nhật Bản), 49,8% (cá thu), 50,1% (cá mập) (tính trên trọng lượng khô). Nagai và cộng sự (2002) tiếp tục phát triển các phương pháp tách chiết collagen trên da của loài cá nóc (Takifugu rubripes) bằng enzyme pepsin (hình 2.1.2): Hình 2.1.2 - Quy trình chiết collagen bằng pepsin (pepsin-soluble collagen – PSC) Ở bước tiền xử lý loại tạp chất vẫn sử dụng NaOH và butyl alcohol. Nhưng đến giai đoạn tách chiết, ngoài việc chiết bằng acid acetic, tác giả còn sử dụng chiết bằng Collagen bột Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 34 enzyme pepsin. Da cá sau khi rửa sạch tạp chất, được chiết với acid acetic 0,5M, trong 3 ngày. Ly tâm lấy phần dịch cho kết tủa với NaCl bổ sung đệm tris-HCl (pH 7,5), được collagen thô. Còn phần bã đư ợc chiết tiếp bằng hổn hợp acid acetic 0,5M và pepsin 10% (w/v), trong 2 ngày, ở 4oC. Công đoạn tinh sạch collagen cũng ti ến hành như bài báo năm 2000 của tác giả. Sau khi kết tủa collagen thô bằng NaCl, ly tâm lấy phần tủa hòa tan vào acid acetic 0,5M, để loại bỏ các tạp chất không tan trong acid. Thẩm tách loại bỏ acid acetic. Làm khô lạnh tạo sản phẩm collagen sạch có thể sử dụng trong một số lĩnh vực. Trong bài báo này, tác giả đã phát triển thêm một cách tách chiết collagen đó là phương pháp sử dụng enzyme. Da cá không tan hoàn toàn trong acid acetic nhưng tan hoàn toàn trong enzyme pepsin proteolysis. Hiệu suất chiết bằng enzyme (44,7%) cao hơn chiết bằng acid acetic (10,7%). Có thể cho rằng việc bổ sung enzyme giúp cho sự phá vỡ các màng tế bào nhanh hơn và mạnh hơn. Vì th ế collagen càng dễ dàng được tách ra và cho hiệu suất tách chiết cao. Chin Ying Hiao (2004) đã đưa ra quy trình chi ết collagen trong đó có sử dụng quá trình lên men vi khuẩn Bacillus (hình 2.1.3): Collagen bột Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 35 Hình 2.1.3 - Quy trình chiết collagen có mặt vi khuẩn Bacillus - Xử lý nguyên liệu đầu vào: Nguyên liệu có thể là phế phẩm của ngành chế biến gia cầm, da heo, da trâu bò, phế liệu cá, … Tùy theo nguồn nguyên liệu đầu vào mà tác giả có phương án xử lý khác nhau. Chẳng hạn, đối với nguyên liệu là da heo thì cách xử lý như sau: Đầu tiên, da heo được rửa hai lần với nước cất để làm sạch da nguyên liệu và giảm thiểu sự lây nhiễm. Quá trình rửa sử dụng kết hợp dung dịch NaOH 0 ,2N và dung dịch hypoclorua trong nước 0,01 -0,2% trong thời gian từ 15 đến 40 phút. Sau đó, da heo sẽ được cắt thành mẫu nhỏ kích thước 0,5x0,5cm, rửa lại bằng nước nóng và để ráo. - Chuẩn bị giống cấy: Vi khuẩn Gram (+) thuộc giống Bacillus được sử dụng trong quá trình lên men tách chiết collagen. Vi khuẩn được nhân giống cấp 1 trong 25ml môi trường dinh Bột collagen Pepsin+HAc Dung dịch Dung dịch thải Nguyên liệu Xử lý Phối trộn Lên men Rửa Chiết Lọc Kết tủa Thẩm tích Ly tâm Sấy thăng hoa Nghiền Rây Vi khuẩn Bacillus Nhân giống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Nước Nước thải Membrane 0,3µm Nước thải Nước thải Than hoạt tính Bã Collagen bột Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 36 dưỡng ở 37o - Da sau khi lên men sẽ được rửa sạch rồi cho vào dung dịch nồng độ 3%(w/v) chứa acid acetic (HAc) 0,5M (pH 3,0) và pepsin 0,4-2%(w/v), khuấy trộn nhẹ trong khoảng thời gian không quá 48 giờ, thường là 36 giờ. Sau đó, collagen sẽ tan hoàn toàn trong dung dịch này và dụng dịch sẽ cho qua than hoạt tính rồi sau đó ly tâm tốc độ 5000xg trong 50 phút. Các quá trình tiếp theo tương tự như các quy trình tách chiết collagen trên. C trong 24 giờ, tốc độ lắ đảo là 150 vòng/phút. Sau đó, nhân giống cấp 2 với thể tích 100ml trong thiết bị lên men trong 24 giờ, tốc độ lắc đảo là 450 vòng/phút. Tiếp theo, phần da đã xử lý được phối trộn với vi khuẩn đã nhân giống, lượng da sử dụng 10-40%(w/v). Tốc độ lắc đảo khi l ên men là 350 vòng/phút, thời gian từ 18 -48 giờ. Quy trình này khá phức tạp do phải qua quá trình nuôi cấy vi khuẩn. Tuy nhiên, chính nhờ quá trình lên (sự hoạt động của vi khuẩn), màng tế bào trong mô da được phân giải và sự lôi kéo collagen đi vào dung dịch tách chiết xảy ra dễ dàng hơn. 2.1.3 Sản phẩm collagen bột tinh sạch Sản phẩm collagen tinh sạch tốt đạt độ tinh khiết lên đến trên 99%. Hình 2.1.4 – Bột collagen tinh sạch Tuy nhiên tùy thuộc vào mỗi ứng dụng cụ thể (tính chất sản phẩm , tính công nghệ yêu cầu ở collagen ) mà ta sẽ lựa chọn collagen có độ tinh sạch phù hợp . Chẳng hạn, khi ứng dụng collagen như là tác nhân làm trong cho các sản phẩm thức uống thì đòi hỏi collagen phải có độ tinh sạch rất cao (trên 99%), rất ít hoặc hầu như không có chất béo; nhưng khi sử dụng collagen vào chế biến các sản phẩm từ thịt thì yêu cầu về hàm lượng chất béo trong col lagen không quá quan trọng . Collagen từ thu nhận từ lợn (pork collagen) có các yêu cầu về chỉ tiêu hóa lý và vi sinh như bảng Bảng 2.1.1 – Các chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của collagen thu n hận từ lợn [11] Thành phần Hàm lượng Độ ẩm (% khối lượng sản phẩm ) ≤5 Protein tổng (kể cả collagen) (% khối lượng sản phẩm ) ≥85 Collagen (% khối lượng sản phẩm ) ≥40 Hàm lượng chất béo (% khối lượng sản phẩm ) ≤14 Tro tổng (% khối lượng sản phẩm ) ≤3 Chì (mg/kg sản phẩm ) ≤1 Salmonella âm tính Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 37 2.2 Ứng dụng collagen trong ch ế biến các sản phẩm thức uống 2.2.1 Ứng dụng collagen vào các sản phẩm thức uống (trà, cà phê) nhằm bổ sung thêm lượng protein cho cơ thể [5] Trước đây, người ta đã c ố gắng nâng cao chất lượng cà phê bằng các ngu ồn protein thương mại. Nguồn protein này có thể là casein , sữa và đậu nành . Nhìn chung , tất cả nh ững nỗ lực đều không thành công . Độ pH của cà phê mạnh là ở độ pH thấp gần với điểm đẳng điện (pH 4,6) của casein. Khi dạng hòa tan trong nư ớc của casein được thêm vào cà phê nóng , casein đông tụ ngay l ập tức và kết tủa. Điều kiện như vậy là hoàn toàn không thể chấp nhận được. Whey protein không có điểm đẳng điện tại pH đó. Do đó, các nhà nghiên cứu đã thử thêm whey protein vào cà phê. Tuy nhiên, nhiệt độ cao của cà phê cũng làm whey protein biến tính và vón cục. Rõ ràng, giá trị cảm quan của sản phẩm cũng không thể chấp nhận. Các acid trong cà phê tăng đáng kể sự đông tụ whey protein, tương tự như khi phô mai Ricotta được sản xuất từ sữa phô mai bằng cách làm nóng sữa tới 87-88o 5 C, và thêm một lượng acid acetic vào s ữa này. Việc sử dụng whey protein để nâng cao chất lượng cho cà phê không t ốt hơn mấy so với casein. Protein đậu nành cũng bị k ết tủa trong cà phê nóng do nhiệt độ cao và độ pH acid [ ]. Một sáng chế năm 2010 của Connolly và cộng sự liên quan đến sản phẩm th ức uống cà phê có b ổ sung protein. Sản phẩm có thể được sản xuất một cách hiệu quả bằng cách bổ sung thêm protein mà không làm xuất hiện bất kỳ tính chất nào không thể chấp nhận được đối với thức uống pha chế. Ý tưởng của phát minh này là để sản xuất một loại đồ uống cà phê có chứa một lượng đáng kể các loại protein b ổ sung, nhưng vẫn đảm bảo hương v ị và các tính chất cảm quan như cà phê bình thường . Cách bổ sung này cũng có thể áp dung cho các sản phẩm đồ uống pha chế khác , chẳng hạn như trà . Những người đã nghiên cứu thì biết rõ là rất khó đ ể bổ sung thêm một lượng protein cho m ột loại đồ uống nóng. Cà phê là một thức uống được chuẩn bị và sử dụng ở nhiệt độ cao, thường là nhiệt độ trên 87- 88o Collagen thủy phân được biết không có mùi vị gì đặc trưng , hòa tan được trong nước, và ổn định trong cả điều kiện pH acid và nhi ệt độ cao. Do không có mùi vị đặc trưng nên collagen thủy phân đư ợc thêm vào cà phê ho ặc thêm vào các thành phần của cà phê trước khi pha trong quá trình sản xuất mà không có b ất kỳ ảnh hưởng nào lên hương vị của đặc trưng của sản phẩm . Collagen thủy phân cũng ổn định trong điều kiện môi trường cà phê nóng nên không bị tách pha trong sản phẩm . Tuy nhiên, C, và ngoài ra, cà phê có hàm lượng axit cao (độ pH của một tách cà phê mạnh có pH khoảng 4,5 đến pH 4,8). Cho nên, thật khó để tìm thấy một loại protein ổn định theo các điều kiện nhiệt độ cao, và hàm lượng a cid cao, chẳng hạn như tìm th ấy trong một cốc cà phê. Một loại protein đã được phát hiện sử dụng trong đồ uống, có tính bền acid, là collagen thủy phân. Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 38 collagen không phải là một protein chứa đầy đủ các thành phần acid amin . Nó thiếu đáng kể các acid amin cần thiết như tryptophan, tyrosine. Con người không thể sống được nếu chỉ sử dụng collagen như là nguồn protein duy nhất vì collagen là một loại protein dinh dưỡng nhưng không đầy đủ. Collagen thủy phân có thể được sử dụng để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của cà phê, nhưng không thể cho rằng cà phê có chứa một lượng protein hoàn hảo . Trong những năm gần đây, đã có những tiến bộ công nghệ trong chế biến whey protein. Bởi vì whey protein biến tính nhiệt một cách dễ dàng và thậm chí s ẽ kết tủa trong sản phẩm thức uống pha sẵn thanh trùng (ready-to-drink beverage – RTD beverage), nước giải khát, nên chỉ sử dụng tối thiểu trong các đồ uống RTD. Các nhà sản xuất whey protein thấy rằng sự ổn định nhiệt của whey protein cải thiện đáng kể nếu họ thủy phân whey protein bằng enzyme ở mức độ nhẹ (thường là 2% đến 5% thủy phân liên kết peptide). Các sản phẩm th ủy phân đạt được các mức độ đủ để ngăn chặn sự không hòa tan trong nước của protein, nhưng ở mức độ thủy phân đủ thấp này hương vị của protein không được giữ nguyên như cũ . Sản phẩm t hủy phân protein thường có mùi khó chịu và vị đắng. Sự ra đời của whey protein thủy phân đã d ẫn đến việc sử dụng rộng rãi của whey protein trong sản phẩm RTD. Các nhà nghiên cứu đã cố gắng nâng cao chất lượng cà phê với các protein này. Chúng làm việc tốt trong cà phê ở mức độ sử dụng thấp, nhưng vấn đề trở nên phức tạp ở mức độ sử dụng cao hơn. Ví dụ, nếu thêm 5 gam whey protein (5,8 gam whey protein isolate hoặc 6,5 g whey protein concentrate 80%) vào 113,4 gam cà phê đậm và nóng, cà phê này sẽ chuyển thành màu trắng và có mùi lưu huỳnh. Khi thêm một chút whey protein thủy phân, cà phê chuyển dần sang màu kem, và vẫn có mùi lưu huỳnh (mặc dù không mạnh). Rõ ràng sự thay đổi màu sắc trắng và mùi vị cà phê khi bổ sung whey protein thủy phân là điều chưa được chấp nhận . Đối với sáng chế này, tác giả thử sử dụng whey protein thủy phân sâu hơn (8% đến 12%). Việc thêm whey protein th ủy phân ở mức độ sâu hơn này cho cà phê là m ột sự cải tiến, các màu cà phê vẫn tương tự như của cà phê đối chứng , không có mùi lưu huỳnh. Tuy nhiên, hương vị và mùi thay đổi đáng kể vì những mùi mạnh mẽ của sản phẩm thủy phân. Thí nghiệm cho thấy rằng loại whey protein thủy phân ở mứ c độ cao không chấp nhận để tăng cường chất lượng cà phê . Chất lượng dinh dưỡng của một protein không đầy đủ có thể được tăng cường đáng kể bằng cách pha trộn các protein không đầy đủ với một protein chất lượng dinh dưỡng cao. Hai loại protein được cho là bổ sung cho nhau, một nguồn cung cấp acid amin với số lượng đủ để bù đắp cho những thiếu hụt của các protein khác. Whey protein là một protein bổ sung cho collagen. Người ta pha trộn whey protein và collagen với tỉ lệ 50% : 50% để sản xuất sản phẩm chứa protein đầy đủ các acid amin. Họ đã thử trộn một hỗn hợp của whey protein thủy phân và collagen thủy phân vào cà Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 39 phê. Tổng lượng protein bổ sung là 5 gram protein/4 ounce cà phê uống. Điều này sẽ mang lại một ly cà phê 8 ounce tiêu chuẩn, với 10 gram protein (bằng 20% giá trị tiêu thụ protein hằng ngày theo thiết lập của chính phủ Hoa Kỳ) [5]. Collagen thủy phân tan trong nước, ổn định nhiệt được sử dụng có thể có nguồn gốc từ bò, lợn, hoặc cá. Các whey protein có thể có ngu ồn gốc từ whey protein isolate hay concentrate, với mức độ th ủy phân phù hợp cho sản phẩm , đảm bảo tính chất cả m quan tốt . Whey protein isolate hay concentrate được thủy phân tốt nhất là 8% đến 12%. Bất kỳ loại hương cà phê tự nhiên, tự nhiên và nhân tạo, hoặc nhân tạo đều có thể được sử dụng để bổ sung hương vị của thức uống. Việc thêm hương v ị là không bắt buộc, nhưng thường người ta sừ dụng để đảm bảo sự chấp nhận của ngư ời tiêu dùng. Lấy ví như trong sáng ch ế này, bổ sung vào 115 gram cà phê nóng, 2,75 gam collagen thủy phân, và 3,3 gram whey protein thủy phân. Khối lượng sản phẩm cuối là 113,4 gam và chứa 5 gram protein. Kết quả, cà phê giữ lại màu tối của nó và không phát hiện bất kỳ mùi lưu huỳnh hoặc hương vị nào khác lạ . Tuy nhiên, hầu hết người thử cho rằng sản phẩm có sự khác biệt giữa mẫu đối chứng và mẫu đã bổ sung protein . Cà phê đối chứng có m ột mùi cà phê và hương vị mạnh hơn. Khi thêm một lượng 0,5 gam hương cà phê tự nhiên thì t ất cả người thử đồng ý rằng cà phê có bổ sung protein rất gần với hương v ị và mùi cà phê đối chứng . Do đó, việc bổ sung một lượng collagen thủy phân và whey protein thủy phân và m ột số lượng rất nhỏ của hương cà phê tự nhiên, sẽ cung c ấp một loại sản phẩm cà phê b ổ sung protein, với giá trị dinh dưỡng protein được nâng cao , nhưng mà vẫn giữ lại tất cả các thuộc tính của cà phê như mong muốn của người tiêu dung [5]. Tóm lại , trong phát minh này , một loại th ức uống cà phê đã được b ổ sung protein bao gồm collagen thủy phân, whey protein thủy phân. Ngoài ra , một lượng rất nhỏ của hương cà phê tự nhiên cũng được bổ sung đ ể tăng mùi vị của thức uống. Loại sản phẩm này được bổ sung thêm khoảng 2%(w/w) collagen thủy phân, 3%(w/w) whey protein thủy phân, và ít hơn ½ %(w/w) hương cà phê tự nhiên. Phương pháp bổ sung protein này cũng được áp dụng cho cả sản phẩm trà [5]. 2.2.2 Ứng dụng collagen làm trong các sản phẩm thức uống có cồn [4] Đồ uống có cồn không chưng cất từ nho, táo, lê, mạch nha, hoa bia, và các vật liệu lên men khác đều gây đục sau khi lên men chính. Thành phần gây đục này là do các hạt nhỏ đường kính 1,0 µm đến 0,001 µm. Chúng thường là bã nho , nấm men, peptide, pectins, dextrans, tannin, nhựa hop, polyphenol và các loại tương tự. Để có được một sản phẩm ngon miệng, trong suốt, cần thiết phải loại bỏ các vật liệu gây đục bằng một quá trình được gọi là làm trong . Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 40 Theo quy định tại Hoa Kỳ và các nước khác, yêu cầu các tác nhân làm trong đối với rượu không làm thay đổi tính cách cơ bản của rượu vang, và trong trường hợp của đồ uống có cồn không chưng cất , nhiều nước yêu cầu không được giữ lại tác nhân làm trong trong sản phâm cuối cùng . Thông thường, việc làm trong đư ợc thực hiện bằng cách tạo phức giữa tác nhân làm trong với tác nhân gây đục và lọc bỏ phức chất tạo thành . Các tác nhân làm trong tiêu biểu là bentonit, carbon, gelatin, casein, polyvinylpyrrolidone và thạch (từ bóng cá, bản chất là collagen ). Phức chất được sử dụng ở đây có nghĩa và đ ề cập đến sự kết hợp hóa học và/hoặc kết hợp vật lý. Trong quá trình làm trong thông thường, các tác nhân làm trong được được bổ sung và các đồ uống có cồn lên men và ủ cho đến khi đạt độ trong theo yêu cầu . Quá trình này được thực hiện trong nhiều ngày và trong trường hợp của bia là khoảng năm ngày. Các phức hợp của các tác nhân làm trong và tác nhân gây đục thường có kích thước hạt rất nhỏ, có xu hướng gây tắc nghẽn các bộ lọc và yêu cầu thay các phương tiện lọc thường xuyên. Một trong những tác nhân thường được áp dụ ng vì tủa được hầu hết các tác nhân gây đục trong rư ợu và bia là thạch. Tuy nhiên , thạch thì đ ắt tiền. Thạch là m ột dạng tương đối tinh khiết của collagen, có nguồn gốc từ các bong bóng của những con cá l ớn, ví dụ Beluga Sturgeon và các loài tương tự. Theo sáng chế năm 1984 của Cioca và cộng sự , một phương pháp làm trong các sản phẩm đ ồ uống có cồn được nghiên cứu . Phương pháp bao gồm việc phối trộn các hạt collagen tự nhiên với một loại th ức uống có cồn và đem ủ . Hỗn hợp đượ c ủ trong một khoảng thời gian đủ để các hạt collagen tạo ph ức chất với các thành phần gây đục trong sản phẩm , sau đó các phức chất tạo thành đư ợc tách bằng cách lọc hoặc phương pháp tương tự để sản xuất sản phẩm lo ại đồ uống có cồn đạt độ trong yêu cầu . Sáng chế này đã cung cấp tác nhân làm trong luôn s ẵn có và hiệu quả cho các sản phẩm đ ồ uống lên men có cồn. Hơn nữa theo phát minh này , phức chất tạo thành giữa tác nhân làm trong và vật gây đục cho sản phẩm c ó thể dễ dàng loại bỏ bằng cách lọc do kích thước của vật liệu được lọc lớn; đồng thời phức chất khóa hòa tan trở lại trong sản phẩm nên việc tách loại cũng dễ dàng hơn . Đó là collagen . Collagen tự nhiên đư ợc sử dụng ở đây muốn nói đế n collagen tinh khiết được trích chiết từ l ớp chân bì trong da và đã qua tách béo . Các collagen được sử dụng ở đây tốt nhất từ động vật già để cung cấp một số lượng đáng kể các liên kết ngang và cấu trúc dạng sợi . Collagen tồn tại trong một chuỗi xoắn ba cùng với các chu kỳ liên tục giữa các chuỗi ba. Các chuỗi xoắn ba của collagen tự nhiên đôi khi được gọi là một sợi nhỏ và các sợi kết với một chu kỳ trục của khoảng 640Å. Collagen được sử dụng ở dạng hạt , kích thước hạt cần nh ỏ hơn 1 mm và tốt nhất là nhỏ hơn 0,5 mm. Kích thước hạt của collagen là quan trọng, kích thước hạt Ứng dụng collagen trong chế biến các sản phẩm từ sữa Tổng quan ứng dụng collagen trong thực phẩm 41 càng nhỏ diện tích bề mặt tiếp xúc để tạo phức càng lớn