Đồ án Thao tác kỹ thuật trên saccharomyces cerevisiae ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒCHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP. HCM KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN SACCHAROMYCES CEREVISIAE ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU GVHD: Th.S HOÀNG MỸ DUNG SVTH: TRẦN TRƯỜNG LUÂN MSSV: 60601418 LỚP: HC06BSH TP. HCM, 07/2010 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự chân thành, tơi xin gởi lời cảm ơn đến: Thạc sĩ Hồng Mỹ Dung - Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học-Khoa Kỹ Thuật Hĩa Học - Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã tận tình hướng dẫn và chia sẽ kinh nghiệm qúy báu, luơn động viên và giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đồ án chuyên ngành. Các thầy cơ trong bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã truyền đạt những kiến thức bổ ích giúp tơi cĩ những bước đi rõ ràng để hồn thành đề tài. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Trường Đại Học Bách Khoa TpHCM – đã cùng chia sẽ, trao đổi kinh nghiệm và giúp đỡ tơi trong suốt quá trình làm việc. MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ TCA: TriCarboxylic Acid cycle (chu trình acid citric). EMP:  Embden-Meyerhof Pathway (chu trình chuyển hĩa Glucose thành pyruvate). Chaperone: khả năng gấp cuộn của protein trước điều kiện tác động nhiệt. sHSPs: small Heat Shock Proteins : Nhĩm gen chịu điều kiện shock nhiệt. Marker: gen hoặc 1 đoạn DNA với 1 điểm nhận biết trên Nhiễm sắc thể dùng để định danh các tế bào. Episomal plasmid: Chứa điểm khởi đầu sao chép, cần thiết cho quá trình phiên mã của gen nằm trong plasmid. Centromeric plasmid: Chứa centromere đĩng vai trị trong quá trình nhân đơi, phân chia của gen trong plasmid. DANH MỤC HÌNH Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang trắng và vang đỏ[8]. 6 Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31] 9 Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi [31]. 11 Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử)[26]. 11 Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [8]. 15 Hình 2.3.4: Quá trình sinh trưởng của tế bào chồi con nấm men[8]. 16 Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998) 17 Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (Sharma, 1998) 18 Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hĩa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [1]. 21 Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hĩa glucose thành ethanol [31]. 22 Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào[28]. 24 Hình 2.5.2: Sự sinh trưởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong mơi trường YPD [19]. 27 Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa [10]. 28 Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men[10]. 30 Hình 2.5.5: Một số acid cĩ mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC [10]. 30 Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau [10]. 31 Hình 2.5.7: Ảnh hưởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde [9]. 32 Hình 2.5.8: Ảnh hưởng của SO2 lên acid malic và acid lactic [9]. 33 Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng như là sự phát triển của nấm men dưới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose [12]. 38 Hình 3.1.1: Cấu trúc của HSP26 [23]. 42 Hình 3.1.3: Mơ hình cấu trúc khơng gian của gen HSP26 [24]. 42 Hình 3.1.4: Vị trí, kích thước của YHR087W trên Nhiễm sắc thể VIII của nấm men S.cerevisiae[30,31]. 44 Hình 3.1.5: Cấu trúc khơng gian của YHR087W [30]. 45 Hình 3.1.6: Mẫu thể hiện cơ chế của chaperone dưới sự kiểm sốt nhiệt độ của sHsp. [25]. 46 Hình 3.1.7: Cơ chế nhân số lượng bản sao của gen HSP26 [22]. 47 Hình 3.1.8: Sơ đồ sự hình thành các chủng ICV16 (ICV27)-PPGK1-YHR087W. [22]. 48 Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trước và sau khi sốc nhiệt [17]. 49 Hình 3.2.2: Ảnh hưởng của việc gắn gen HSP26 và YHR087W vào plasmid YEp352 trên gen biểu hiện và kháng stress. [22]. 51 Hình 3.2.3 : Tác động của việc gắn HSP26 và YHR087W vào centromeric plasmid pRS316 lên chung ICV27 biểu hiện gen, stress thẩm thấu và khả năng lên men [22]. 52 Hình 3.2.4: Sự thay thế thích hợp promoter của gen HSP26 và YHR087W trên chủng ICV16 và ICV27 bằng promoter SPI1 [22]. 53 Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22]. 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần các chất cĩ trong cấu trúc của nấm men được lạnh đơng khơ[8]. 12 Bảng 2.2: Các thành phần hĩa học trong nấm men đơng khơ[8]. 12 Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]. 19 Bảng 2.4: Tác động điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28]. 25 Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rượu trên chủng Saccharomyces cerevisiae. 26 Bảng 2.6: Thơng số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong mơi trường cĩ sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric. 29 Bảng 2.7: Ảnh hưởng của một số acid lên sự sự sinh trưởng của nấm men. 30 Bảng 2.8: Các thơng số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần mơi trường lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20]. 35 Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12]. 37 Bảng 3.1: Vị trí , thành phần nucleotide và acid amin cấu tạo của HSP26 [29] 41 Bảng 3.2: Vị trí, thành phần nucleotide, acid amin cấu tạo YHR087W [30]. 44 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề chọn đề tài. Các cuộc cách mạng sinh học phân tử đã mang lại những ý nghĩa mới lạ, tiến bộ với các ứng dụng vào lên men và lưu trữ rượu. Những nghiên cứu trên một số chủng nấm men đã cung cấp những thơng tin về mơi trường nuơi cấy và mật độ vi sinh vật cĩ trong rượu. Đồng thời cho thấy mơi trường nuơi cấy phụ thuộc vào phương pháp sinh học phân tử điều này trở thành những thơng tin cĩ giá trị trong cơng nghệ sản xuất rượu. Những đoạn gen cĩ giá trị cung cấp những cơ hội hiểu biết và khai thác ứng dụng vi sinh trong sản xuất rượu cũng như là tìm ra chìa khĩa của các nhân tố gen đây là cơ sở phát triển giá trị thương phẩm hoặc hạ giá thành của rượu[8]. Những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã thay đổi quan điểm của các nhà khoa học về việc đánh giá hệ vi sinh cĩ trong rượu.Tạo nên cái nhìn mới về tính phức tạp trong các phản ứng chuyển đổi từ các loại trái cây đến rượu vang mang đậm mùi vị đặc trưng [8]. Cơng nghệ sản xuất rượu đã và đang là một cơng nghệ chuyên nghiệp lâu đời ở nhiều nước trên thế giới. Phương pháp truyền thống là dựa vào kinh nghiệm và kỹ thuật thủ cơng. Nhưng ngày nay, những thiết bị tự động hố đang dần thay thế và đồng thời kiểm sốt được chất lượng cũng như cải thiện được vấn đề vệ sinh trong quá trình sản xuất. Rượu đại diện cho lịch sử ,nền văn hĩa của một dân tộc. Ngày này người dùng khơng chỉ quan tâm đến sự đa dạng của các loại rượu mà cịn về chất lượng của sản phẩm.Do đĩ việc cải thiện những kỹ thuật lên men trong quá trình sản xuất là yếu tố quan mà nhà sản xuất hướng đến [1]. Việc cải thiện chất lượng,khả năng sinh tổng hợp lượng,loại bỏ chất độc hại,bổ sung tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong rượu là những yêu cầu cấp thiết đối với cơng nghệ sản xuất rượu hiện nay[1]. 1.2.Mục đích nghiên cứu. Việc tối ưu quá trình lên men tạo ra hàm lượng ethanol cao trở thành một yếu tố quan trọng trong kỹ thuật hiện đại. Đã cĩ rất nhiều nghiên cứu về những thay đổi kỹ thuật trong quá trình lên men như pH, nhiệt độ, nồng độ đường…Hiện nay với những kỹ thuật tiên tiến về sinh học phân tử các nhà nghiên cứu đã khơng chỉ thay đổi những yếu tố kỹ thuật truyền thống như trên mà cịn tác động đến bộ gen của chủng vi sinh sử dụng lên men rượu thơng qua những kỹ thuật di truyền. Nghiên cứu này chỉ ra hướng đi quan trong trong cơng nghiệp sản xuất rượu hiện nay. Đầu tiên là sự tối ưu hĩa các điều kiện ảnh hưởng lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae đã giúp chất lượng rượu ngày càng trở nên hồn hảo, khơng những về chất lượng rượu mà cịn tận dụng tối đa được nguồn nguyên liệu, tăng khả năng đáp ứng của nấm men dưới các điều kiện stress nhằm tạo ra lượng ethanol là lớn nhất trong quá trình lên men rượu. Bên cạnh đĩ, nghiên cứu này mở ra một hướng đi mới trong cơng nghệ sản xuất rượu.Thay đổi xu hướng tác động kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men, thay vào đĩ là tác động lên hệ gen của chủng vi sinh. Những tác động kỹ thuật ảnh hưởng tới giá trị cảm quan, chất lượng của rượu vang thành phẩm và thao tác kỹ thuật gen trên 2 gen HSP26 và YHR087W nằm trong hệ gen của Saccharomyces cerevisiae đã tăng lượng ethanol lên đến 10% so với thơng thường. Điều này đã chứng minh tầm quan trọng của những thao tác kỹ thuật gen lên quá trình tối ưu lượng ethanol sinh ra cũng như là chất lượng rượu thành phẩm. 1.3.Nhiệm vụ của đề tài. Tổng quan về chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae giống nấm men được ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp lên men rượu hiện nay. Làm rõ những đặc điểm sinh lý,di truyền,hệ gen các yếu tố tác động Nghiên cứu các ảnh hưởng kỹ thuật truyền thống lên quá trình lên men rượu bao gồm:pH ,nhiệt độ, hàm lượng đường,độ thẩm thấu, lượng ethanol sinh ra…Từ đĩ cĩ thể ứng dụng sản xuất để cĩ chất lượng rượu phù hợp. Nghiên cứu kỹ thuật gen thao tác trên gen HSP26 và YHR087W của Saccharomyces cerevisiae. Cơ chế hoạt động sinh tổng hợp trong quá trình lên men. Thao tác kỹ thuật nâng cao hàm lượng ethanol. Đánh giá kết quả mang lại qua các nghiên cứu trên thế giới. 1.4.Ý nghĩa thực tiễn. Những tác động kỹ thuật trong quá trình lên men rượu đã nâng cao chất lượng rượu thành phẩm. Đồng thời, giảm thiểu chi phí cho quá trình sản xuất, mang lại hiệu quả kinh tế và giá trị lợi nhuận cho nhà sản xuất. Ngồi những thay đổi về tác động kỹ thuật truyền thống thường dùng cĩ thể dùng những thao tác trên kỹ thuật di truyền để tạo ra những giống nấm men cĩ khả năng tạo ra lượng ethanol lớn hơn so với chủng thơng thường. Thơng qua những tác động lên chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae nhằm giúp tạo nên một cơ sở dữ liệu về những điều kiện tác động kỹ thuật, về hệ gen và khả năng thích ứng các yêu cầu trong cơng nghiệp sản xuất rượu của nấm men. Cũng như, tìm cách giải quyết những khĩ khăn trong việc loại bỏ các độc tố, hợp chất hữu cơ, acid hữu cơ cĩ thể gây hại hoặc ảnh hưởng đến chất lượng rượu trong quá trình sản xuất. CHƯƠNG 2: TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG KHÁI QUÁT CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT RƯỢU VÀ TÁC ĐỘNG CỦA CÁC YẾU TỐ TRUYỀN THỐNG ĐẾN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 2.1.Khái quát chung về cơng nghệ sản xuất rượu vang. 2.1.1.Lịch sử sản xuất rượu vang Lịch sự ra đời của rượu vang đã đồng hành cùng lịch sử nhân loại.Các nhà khảo cổ cho rằng,rượu vang cĩ xuất xứ từ khu vực Capcazo và Trung Đơng khoảng 8000 năm về trước. Các di khảo cổ tại Ai Cập cho thấy rằng rượu vang đã cĩ mặt ở đây từ 5000 trước cơng nguyên.Khoảng 2000 năm trước cơng nguyên sản xuất rượu vang du nhập tới Hy Lạp và sau đĩ được truyền đi khắp Địa Trung Hải. Vào thế kỷ XVI ,các nhà thám hiểm Châu Âu đã mang tới Châu Mỹ .Năm 1530 Người Tây Ban Nha xâm chiếm Trung và Nam Mỹ bắt đầu trồng nho ở Mexico,Argentina… Đến năm 1813 nghề trồng nho đã lớn mạnh ở tất cả những nơi mà thực dân Châu Âu đặt chân tới.Tại Bắc Mỹ ,khoảng giữa thế kỷ XIX nghề trồng nho và làm rượu thức sự mới phát triển[1,7]. Ngày nay trồng nho và sản xuất rượu vang đã trở thành một phần khơng thể thiếu trong văn hĩa và kinh tế nhân loại.Hằng năm cĩ 26 tỷ lít rượu vang được sản xuất ra[1]. Rượu vang được làm từ các loại nho nguyên chất và được lên men một cách tự nhiên. Vì nho vốn cĩ hai đặc tính tự nhiên là đường và men nên nước nho được ép ra, trải qua một quy chình chế biến sẽ trở thành rượu vang.Rượu vang là một sản phẩm của quy trình tinh xảo mà khởi đầu bằng việc quyết định thởi điểm thích hợp nhất để hái nho.Tất cả các quy trình để làm rượu vang cơ bản đều giống nhau từ lúc hái cho đến khi đĩng chai. Nguyên lý làm rượu vang cũng rất đơn giản ,tuy nhiên việc xủ lý nho, lên men rượu van để tạo hương vị mong muốn là cả một nghệ thuật.Trong quá trình sản xuất các nhà nấu rượu cần đối các yếu tố giữa những mùi hương dễ chịu với những mùi khĩ chịu. Nồng độ rượu và acid cũng cần được điều tiết ,nếu cid vượt quá rượu sẽ cĩ vị chua,nếu nhiều cồn quá rượu sẽ sốc. Tác nhân quan trọng nhất trong sản xuất rượu vạng là chủng vi sinh và chất lượng nho. Nguyên liệu chính sẽ quyết định hương vị , nồng độ cồn, độ chưa, màu sắc của thành phẩm. Vang trắng, nho được nghiền dịch quả và tách khỏi lớp vỏ trước khi lên men. Vang đỏ lên men cùng vỏ. Chất màu đỏ (anthocyanin)và một số chất khác từ vỏ quả được chiết tách trong quá trình lên men và tạo thành màu đỏ cùng hương vị đặc trưng của vang đỏ. Vang hồng cĩ màu sắc hồng nhạt được làm từ nho đỏ theo cơng thức của lên men vang trắng(khơng lên men cùng vỏ). Lượng chất màu được chiết ra trong quá trình ép quả tạo màu cho rượu[1,7]. 2.1.2.Sơ đồ quy trình cơng nghệ sản suất rượu vang trắng và vang đỏ: Hình 2.1.1: Sơ đồ quy trình sản xuất rượu vang trắng và vang đỏ[8]. 2.1.3. Một số cơng đoạn quan trọng trong quá trình sản xuất rượu vang. 2.1.3.1.Thời điểm gặt hái nho: Khi nho chín thì độ acid sẽ giảm xuống và lượng đường sẽ tăng lên. Thời điểm thích hợp để gặt hái nho là vào tháng 8 đối với Vang nổ (Sparkling Wines) vào tháng 10 đối với rượu đỏ. Các nghệ nhân sẽ quyết định thời điểm gặt hái nho, nhằm đạt lượng acid và lượng đường như mong muốn để chế biến theo khẩu vị riêng của mình. Thời điểm các trang trại gặt hái nho cũng được thể hiện rõ trên nhãn của các loại rượu vang. Để làm rượu vang nổ thì nho sẽ được hái khi độ acid đạt khoảng 1% và 19o Brix (Brix là đơn vị đo lượng đường cịn lại trên nho, nhân đơn vị Brix với 0,55 thì sẽ được nồng độ cồn). Để làm rượu vang đỏ, nho sẽ đựơc hái khi đạt gần được khoảng 0,8% độ acid và 22o Brix (e cĩ biết tại sao o, vị của 2 loại rượu này khác nhau ntn?). Phần lớn các loại nho dùng để làm rượu vang trắng và đỏ khi được gặt hái thì sẽ đạt khoảng 0,65% độ acid và 23o Brix. Điều kiện trên là tiêu chuẩn cơ bản để quyết định thời điểm thích hợp nhất khi gặt hái nho. Phần lớn các nghệ nhân làm rượu vang quyết định thời điểm gặt hái nho bằng thơng qua việc đánh giá màu sắc nho và nếm quả nho [1]. 2.1.3.2.Quy trình chiết dịch nho: Bước đầu tiên là lấy nước từ những quả nho. Quy trình này được thực hiện qua hệ thống Vắt và Tước cuống. Hệ thống này sẽ tước các cuống từ những chùm nho và vắt nước ra khỏi vỏ nho. Nước này được gọi là nước chất lượng 1. Để làm ra vang trắng thì nước chất lượng 1 này sẽ được đưa qua hệ thống ép và sau đĩ được đưa vào bồn lên men. Để làm ra rượu đỏ thì nước chất lượng 1 sẽ được đưa trực tiếp đến bồn lên men rồi sau đĩ đưa qua hệ thống ép. 2.1.3.3.Quy trình lên men: Phần lớn hệ thống lên men rượu trên thế giới đều sử dụng phương pháp truyền thống. Phương pháp lên men truyền thống này đã chứng minh được hiệu quả cao và ổn định vì vậy rất ít nghệ nhân ứng dụng những phương pháp khác.Trong quy trình lên men, cĩ một yếu tố rất quan trọng mà các nghệ nhân chú tâm đạt tới đĩ là nhiệt độ. Khi lên men với nhiệt độ (7oC đến 12o C) thì hương thơm của nho được bảo quản tuyệt đối. Với nhiệt độ (25o đến 35o C) sẽ đạt được hương vị của hoa nhiều hơn là hương vị của quả. Trong quá trình lên men để làm rượu vang trắng và vang nổ thì nhiệt độ lý tưởng nhất là 10o C và cho vang đỏ là 30oC.Thời gian lên men keos dài từ 8-10 ngày[1,8,3]. 2.1.3.4.Quy trình ép: Hơn một nửa lượng nước ép ra từ quả nho một cách dễ dàng khơng cần đến áp lực cao. Phần cịn lại sẽ được ép ra từ hệ thống ép. Để làm rượu vang trắng nho sẽ được ép trước sau đĩ đưa lên hệ thống lên men. Cịn rượu vang đỏ thì ngược lại, được đưa lên hệ thống lên men trước khi đưa vào hệ thống ép.Phần bã sẽ được đêm ép để tận thu các chất chiết cịn sĩt lại trong quá trình lên men[1,3]. 2.1.3.5.Quy trình ủ: Để rượu đạt được sự hài hịa và ổn định của mùi vị và chất lượng thì rượu phải được ủ nhằm làm cho khí ơxi tác động thật chậm.Rượu vang ủ lạnh sẽ phải ủ lâu hơn rượu vang ủ ấm.Rượu vang ủ trong bồn thép lớn sẽ phải ủ lâu hơn rượu vang để trong các bồn hoặc trong các thùng bằng gỗ. Thời gian là yếu tố quan trọng trong quy trình ủ. Thơng thường rượu vang được ủ trong khoảng 3 đến 6 tháng hoặc 2 đến 3 năm. Nhiệt độ ủ rượu thường từ 8-18oC. Trong giai đoạn này rượu được tách bỏ cặn và châm thêm rượu vang định kỳ vào thiết bị ủ để giảm khoảng khơng gian ở bề mặt lên men[3] 2.1.3.6.Quy trình lọc và làm mịn: Để đạt được mầu tinh khiết cho rượu ở giai đoạn cuối cần đưa hệ thống lọc và làm mịn vào dây chuyền sản xuất.Hệ thống lọc sẽ làm cho nước nho trong hơn. Rượu sau khi được lọc sẽ được chuyển qua bồn chứa sạch khác và quy trình lọc sẽ được thực hiện vài ba lần trong 6 tháng cho đến 3 năm trong quy trình làm rượu vang. Hệ thống làm mịn sẽ lọc được các phần tử nhỏ nhất để rượu đạt được mầu trong suốt. 2.1.3.7.Phương pháp pha trộn: Pha trộn là một nghệ thuật tâm đắc nhất của cơng nghệ sản xuất rượu. Pha trộn cĩ thể mang đến những sản phẩm cĩ đặc thù riêng và chất lượng rất ổn định. Các nghệ nhân cĩ thể pha trộn theo các phương thức sau đây: - Hai hoặc nhiều giống nho chính trong cùng một nơng trại nho. - Cùng một giống nho chính từ nhiều nơng trại nho khác nhau. - Hai hoặc nhiều giống nho chính từ hai hoặc nhiều nơng trại nho khác nhau - Nho từ các năm gặt hái khác nhau. -Và những phương pháp khác pha trộn khác.Việc pha trộn được thực hiện vào thời điểm giữa hai quy trình lên men và vơ chai. 2.1.3.8.Quy trình vơ chai: Quy trình vơ chai khơng phức tạp nhưng địi hỏi sự thận trọng để tránh sự ơxy hố. Vệ sinh là yếu tố tất yếu để tránh nhiễm vi khuẩn chua và mọi vi khuẩn khác cĩ hại đến con người. 2.1.4. Nguyên liệu sản xuất rượu vang. Nguyên liệu trong cơng nghiệp sản xuất rượu vang thường cĩ khá nhiều chủng loại khác nhau như: nho, dâu tằm, các loại trái cây…Nhưng loại phổ biến và được sử dụng phổ biến nhất hiện nay là nho. Các loại nguyên liệu trong sản xuất cần đạt độ chín về sinh lý nhằm thu được dịch quả cĩ hàm lượng acid thấp,hàm lượng đường cao.Ngồi ra cịn cĩ một số chỉ tiêu về hình dáng,đặc điểm,các chỉ tiêu về an tồn chất lượng thực phẩm nhằm mang lại vang thương phẩm cĩ giá trị. Thành phần hĩa học của nguyên liệu: Nước: chiếm tỷ lệ rất cao trung bình 80-90% ,nước chủ yếu tồn tại ở dạng tự do ,trong dịch tế bào ,chất nguyên sinh và gian bào.Ở màng tế bào nước liên kết với hemicellulase và cellulase.Lượng nước phân bố khơng đồng đều giữa các mơ. Đường :tồn tại chủ yếu ở dạng D-glucose ,D-fructose và saccharose .Glucose cịn ở dạng liên kết trong phân tử của saccharose ,tinh bột ,cellulase... Ngồi hai thành phần trên, trong nho cịn chứa các thành phần khác như: các acid hữu cơ(bao gồm cĩ malic, tartaric, citric,cetonic…), hợp chất màu( anthocyanes và flavones), phenol, tanin, polyphenol ngưng tụ, hợp chất chứa nito… 2.2.Tổng quan nấm men. Nấm men thường cĩ hình dạng khác nhau. Thường chúng cĩ hình cầu, hình ellip, hình bầu dục và cả hình dài. Một số lồi nấm men cĩ tế bào hình dài nối với nhau thành những sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hay khuẩn ty giả (pserdomycelium). Hình dạng của nấm men hầu như khơng ổn định. Nĩ phụ thuộc vào tuổi của nấm men và phụ thuộc vào điều kiện nuơi cấy[2]. Kích thước tế bào nấm men: Tế bào nấm men thường cĩ kích thước lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình của tế bào nấm men như sau: chiều dài 9-10µ, chiều rộng 2-7µ. Kích thước của tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuơi cấy, theo tuổi sinh lý[2]. Hình 2.2.1: Một số loại nấm men: A: Lactobacillus-johnsonii, B: Candida, C: LactobacillusAcidophilus, D: Saccharomyces cerevisiae [31] Nấm men là sinh vật nhân chuẩn, cĩ khoảng 1500 lồi khác nhau đã được phát hiện trên thế giới. Hầu hết chúng sinh sản vơ tính bằng cách nảy chồi. Mặc dù cĩ một vài lồi sinh sản bằng cách phân đơi. Nấm men là sinh vật đơn bào, một số lồi cĩ thể tạo cơ thể đa bào,kích thước khác nhau tùy thuộc lồi thơng thường chúng cĩ kích thước từ 3-4µm.Cĩ những lồi cĩ kích thước đến 40µm. Saccharomyces cerevisiae là loại nấm men được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp sản xuất bánh mì và thức uống cĩ cồn. Saccharomyces cerevisiae được dùng trong phịng thí nghiệm và giữ vai trị quan trọng trong trong nghiên cứu vi sinh tế bào, tìm hiểu những thơng tin về tế bào để phục vụ cho những nghiên cứu của con người. Các lồi nấm men, như Candida albicans là tác nhân gây bệnh và cĩ thể gây nhiễm trùng ở người. Gần đây một số lồi nấm men đã được sử dụng trong các phản ứng sinh học tao ra nguồn nhiên liệu sinh học, sản xuất ethanol cho các ngành cơng nghiệp. 2.2.1. Tăng trưởng ,dinh dưỡng. Nấm men là sinh vật tự dưỡng chúng sử dụng các hợp chất hữu cơ như là nguồn năng lượng chính và khơng cần cĩ ánh sáng mặt trời. Nguồn carbon chính được nhận chủ yếu từ các từ hexose như glucose và frutose hoặc từ disaccharide như sucrose và maltose. Một vài lồi cĩ thể chuyển hĩa đường pentose, cồn và các acid hữu cơ. Nấm men phát triển tốt nhất trên mơi trường pH trung tính hoặc hơi chua. Nhiệt độ phát triển của nấm men cũng hồn tồn khác nhau. Leucosporidium frigidum phát triển ở -2đến 20°C(28-68°F). Saccharomyces telluris phát triển từ 5-35°C(41-95°F) và Candida slooffi ở 28-45 °C(82-113°F). Các tế bào cĩ thể sống trong điều kiện đĩng băng trong ở điều kiện nhất định, với khả năng sống sĩt giảm theo thời gian đĩng băng. 2.2.2. Sinh thái. Nấm men là rất phổ biến trong mơi trường. Ví dụ như nấm men xuất hiện trong tự nhiên trên vỏ của trái cây và quả (như nho, táo hay đào), và dịch tiết từ thực vật. Một số nấm men được tìm thấy ở trong đất và cơn trùng. Các chức năng sinh thái và đa dạng sinh học của nấm men là tương đối khơng rõ. So với các vi sinh vật khác. Nấm men bao gồm Candida albicans, Rubra rhodotorula, Torulopsis và Cutaneum trichosporon được tìm thấy ở mơi trường quanh con người hoặc trên vỏ thực vật. Nấm men cũng cĩ mặt trong các thực vật đường ruột của động vật cĩ vú và một số lồi cơn trùng. 2.2.3. Sinh sản: Nấm men sinh sản vơ tính hoặc hữu tính. Hình thức thường gặp là sinh sản vơ tính bằng phương pháp nảy chồi. Chúng gồm những chồi nhỏ,hoặc tế bào con được hình thành từ các tế bào mẹ. Tế bào mẹ tạo các nhân và truyền vật chất di truyền qua cho các tế bào con. Các chồi con tiếp tục phát triển cho đến khi tách khỏi tế bào mẹ, hình thành tế bào mới.Một số nấm men sinh sản theo cách tách đơi thay vì tạo chồi. 2.2.4. Ứng dụng: Nấm men được ứng dụng rộng rãi trong khá nhiều lĩnh vực. Trong đĩ, quá trình lên mên bằng phương pháp cơng nghệ sinh học tạo ra các sản phẩm đặc trưng,chi phí thấp được quan tâm nhiều nhất. Các loại nấm men được ứng dụng vào cơng nghiệp sản xuất đồ uống cĩ cồn như bia ,rượu…Cơng nghệ sản xuất thực phẩm:bánh mì với khá nhiều sản phẩm đa dạng phong phú. Cơng nghệ sản xuất nguồn nhiên liệu (bioethanol)…Ngày nay cịn hướng đến lĩnh vực đồ uống khơng cồn, probiotic, thực phẩm chức năng đem lại nguồn thực phẩm cĩ giá trị dinh dưỡng cao. 2.3. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae. 2.3.1 Đặc điểm sinh thái, thành phần cấu tạo, sinh trưởng và phát triển ở Saccharomyces cerevisiae. Hình 2.3.1: Tế bào nấm men S. cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi [31]. Hình 2.3.2: Tế bào nấm men S. cerevisiae cố định dưới kính hiển vi điện tử ( độ phĩng đại: A:500X, B:1000X, C: 2000X)[26]. Saccharomyces cerevisiae thuộc: Bộ: Endomycetales. Họ: Saccharomycetaceae. Saccharomyces cĩ khoảng 40 lồi (Van Der Walt, 1970) và các lồi trong giống này được biết nhiều do chúng được ứng dụng trong làm nổi bánh, bia, rượu....Chúng hiện diện nhiều trong sản phẩm cĩ đường, đất, trái cây chín, phấn hoa.... Nấm men cĩ hình bầu dục, gần trịn, kích thước khoảng 6 - 8 µm x 5 - 6 µm, vỏ tế bào cấu tạo bởi carbohydrat, lipid, protein dầy khoảng 0,5 µm, màng tế bào chất, tế bào chất và nhân đã được trình bày chung ở phần “Tế bào vi sinh vật chân hạch”. S. cerevisiae thường cĩ cấu tạo hình elip, đường kính lớn từ 5-10nm và đường kính nhỏ từ 1-7nm, tế bào gia tăng kích thước theo độ tuổi. thể tích tế bào đơn bội là 29 mm3 và tế bào lưỡng bội là 55 mm3. Các tế bào của nấm men mang cấu trúc và chức năng của eukaryote bậc cao, được sử dụng như là một mơ hình hữu ích đại diện cho các tế bào eukarylote. Các thành phần cấu trúc và hĩa học của tế bào được được minh họa theo bảng 2.1 và bảng 2.2. Bảng 2.1: Thành phần các chất cĩ trong cấu trúc của nấm men được lạnh đơng khơ[8]. Thành phần trong cấu trúc Phần trăm khối lương khơ Độ ẩm 2-5% Protein 42-46% Carbohydrate 30-37% Acid nucleic 6-8% Lipid 4-5% Chất khống 7-8% Bảng 2.2: Các thành phần hĩa học trong nấm men đơng khơ[8]. Thành phần % khối lượng khơ Carbon 48,2 Hydro 6,5 Oxy 33,8 Nitơ 6,0 Phospho 1,0 Magie 0,1 Canxi 0,04 Kali 2,1 Từ những thành phần trên Rosen đã cho rằng nấm men cĩ sự hình thành cấu trúc của C4.02H6.5O2.11N0.43P0.03. Các phân tử carbonhydrate là thành phần cấu trúc: thành tế bào và các hợp chất liên quan đến nguồn dinh dưỡng dự trữ, khả năng kháng stress, như là glycogen và trehalose. Khoảng 75-80% tế bào nấm men là nước. Vách ngăn bao phủ tế bào chất (plasmalemma) chiếm khoảng 15-25% trên tổng khối lượng tế vào. Thành tế bào nấm men cĩ cấu thay đổi tùy biến phù hợp với các điều kiện ngoại cảnh và ở các giai đoạn khác nhau của chu kì sống. Tùy theo cấu trúc và điều kiện tăng trưởng và quá trình trao đổi chất, thành tế bào chứa những enzyme cĩ khả năng tạo điều kiện thuận lợi cho việc vận chuyển các phân tử vào trong tế bào chất. Khoảng khơng gian giữa màng trong và màng ngồi (periplasme) của thành tế bào từ 25-45A. Các tế bào S. cerevisiae chứa 1 lượng chitin rất nhỏ ( khoảng 1% khối lượng khơ) tập trung nhiều nhất tại các điểm nảy chồi, nơi đĩng vai trị quan trọng trong sự phân bào( khi chồi vừa chớm nở). Trong nấm men. mạng lưới các sợi 1,3-β-glucan chiếm tới 40% khối lượng khơ của vách tế bào, cĩ ảnh hưởng chính đến cơ chế cân bằng của vách tế bào. 1,3-β-glucan được tổng hợp tại bề mặt của tế bào và chứa những chuỗi hẹp trung bình khoảng 1500 đơn vị glucose. 1,3-β-glucan cĩ cấu trúc sợi và vơ định hình. Sự hình thành này chỉ ra khả năng giữ vững hình dạng và cấu trúc vững chắc của vách tế bào cũng như tính đàn hồi. Các sợi glucan khơng tan trong nước, kiềm và acid acetic trong khi đĩ phần vơ định hình hịa tan trong nước và acid những khơng hịa tan trong kiềm. Hai polysacharide khác nhau,1,6-β-glucan và chitin đã được liên kết với 1,3-β-glucan và cĩ những chức năng khác vượt trội hơn là chỉ ổn định hình dạng và tính bền vững cho vách tế bào. Một lượng nhỏ lipid và phophate vơ cơ là thành phần trong mạng lưới vách tế bào. Lượng lipid chứa trong S. cerevisiae chứa khoảng 2-15%. Đối với tế bào khỏe mạnh bề mặt tế bào mang lưới cĩ điện tích âm, được cho rằng các chuỗi phosphate nằm trên lớp mannoprotein ngồi. Bề mặt tế bào cĩ cấu trúc kị nước , các liên kết trên lớp màng chủ yếu là lipid, nằm trên lớp vách ngồi phức tạp. Những tác động của pH thấp, hàm lượng đường cao và khả năng chịu áp suất thẩm thấu của tế bào là những yếu tố đánh giá cho màng tế bào. Khi nấm men làm quen với mơi trường chứa áp suất thẩm thấu cao thì kết quả mang lại sau quá trình lên men là nơng độ ethanol từ 12-15% khi đĩ lại trở thành tác nhân cĩ hại cho nấm men. Ngồi ra sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng cũng gây ra những biến động đáng kể cho sự sinh trưởng của nấm men. Do đĩ phải cân nhắc trong các phương pháp và kỹ thuật lên men. Lipid màng gồm phopholipid và sterol, và mang tính kỵ nước. Các phospholipid chính là phosphotidylinositol, phosphotidylserine, phosphotidylcholine và phosphotidylethanolamine, cịn các sterol là ergosterol. Zymosterol cũng là một sterol khá phổ biến ở màng tế bào nấm men. Các sterol được gắn trong màng tế bào, giữa các chuỗi lipid khác nhau và tự điều chỉnh trong cấu trúc lỏng của chúng. Tế bào chất là hệ keo lỏng cĩ pH acid khoảng 5,25 chủ yếu chứa các ion hoặc các phân tử hữu cơ cĩ trọng lượng thấp hoặc trung bình hoặc các hợp chất hịa tan( protein enzyme và glycogen). Những enzyme chính trong tế bào chất chủ yếu liên quan đến quá trình thủy phân glycogen,sinh tổng hợp acid béo, tổng hợp protein. Sự cân bằng bên trong và tổ chức cấu trúc được đảm nhận bởi cytosketeton, trong đĩ bao gồm vi ống (tubulin) và vi sợi ( actin). Đây là cấu trúc động trong việc thực hiện chức năng của chúng là nhận và loại bỏ các tiểu đơn vị protein. Vi ống (tubulin) và vi sợi ( actin) cĩ tầm quan trọng trong cả nguyên phân, giảm phân, hình thành vách ngăn và nhu động. Các sợi actin sắp xếp tạo thành cấu trúc cũng chắc để đáp ứng lại những kích thích của sự thẩm thấu. đồng thời tái hiện cấu trúc sau khi sự cân bằng với áp suất thẩm thấu được phục hồi. Ty thể được chú trọng trong cấu trúc và chức năng của bào quan này. Cũng như các sinh vật nhân chuẩn khác chúng cĩ ribosome riêng, cĩ sự khác nhau với ribosome của tế bào chất. Một số được phân bố tự do trong tế bào chất, hoặc được phân bố trong mạng lưới nội chất. Ở giai đoạn phát triển nhất định ty thể chiếm 12% khối lượng tế bào, cấu trúc bao gồm sự tự sao chép DNA và hệ thống tổng hợp protein. DNA ty thể (mtDNA) khơng bao gồm hệ thống gen của nấm men, nhưng vật liệu cho các chủng đơn bội được sử dụng trong quá trình được thiết lập một trình tự. Khối lượng 86kb, mtDNA kém quan trọng hơn so với nhiễm sắc thể nhỏ nhất của nấm men. Và chỉ đại diện khoảng 0,5% trong hệ gen của nấm men. Các ty thể mã hĩa bộ gen chỉ khoảng 5% trong tất cả các protein ty thể. Các hệ gen của ty thể được nhân lên khoảng 10 lần bởi cĩ sự phiên mã thành RNA. Ty thể được xem là nơi sản sinh năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, quá trình sinh tổng hợp ATP, gĩp mặt trong chuỗi vận chuyển điện tử bên trong màng tế bào, quá trình sinh tổng hợp phospholipid, hoặc trong quá trình β-oxy hĩa. Khơng bào hiện diện là một bào quan lớn, cĩ cấu trúc thay đổi theo các điều kiện khác nhau. Khơng bào cĩ 2 chức năng chính: đầu tiên là nguồn dự trữ cung cấp chất dinh dưỡng, thứ hai là cung cấp những vị trí quan trọng cho các đại phân tử, protein, trở thành con đường trung gian trao đổi các chất trong tế bào. Khơng bào cũng được xem như kho dự trữ nguồn phospho hoặc các polyphosphate chứa liên kết cĩ năng lượng cao. Cĩ cấu trúc lớn thứ 2 sau khơng bào là nhân, đượcc bao bọc với lớp màng kép, và rải rác các lỗ nhân ( hiện nay được gọi là khu phức hợp của nhân, NPC), kiểm sốt quá trình trao đổi các phân tử trong và ngồi nhân.Nhân cĩ đường kính từ 0,1-2µm, các lỗ trên về mặt cĩ kích thước thay đổi được phù hợp với việc trao đổi chất, các protein cĩ khối lượng thấp giữa nhân và tế bào chất. Quá trình sinh sản của nấm men thường thơng qua sinh sản vơ tính, phân chia tế bào bất đối xứng ( nảy chồi) tế bào con được hình thành giống hệt tế bào mẹ. dưới điều kiện thích hợp tế bào con sẽ phát triển khỏe mạnh như tế bào mẹ. Quá trình này kéo dài đến khi các tế bào bị lão hĩa và chất dinh dưỡng bị cạn kiệt, sau đĩ tế bào chết. Chu trình sinh trưởng của nấm men được nghiên cứu đĩng một vai trị quan trọng trong cơng nghiệp cũng như là đại diện cho tế bào eukaryote. Trên thực tế nấm men cĩ một hệ gen nhỏ tuân theo những kĩ thuật di truyền và chu kì tế bào được xảy ra nhanh chĩng cho thấy khả năng ứng dụng trong phịng thí nghiệm. Hình 2.3.3: Chu kỳ sinh sản của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [8]. Một chu kì tế bào được chia làm 4 pha G1, S, G2, và M. Pha S và M là giai đoạn DNA tự phân và phân chia nhân xảy ra tương ứng với sự kiểm sốt của tế bào. Xen giữa quá trình tự nhân đơi và phân chia nhân là các pha G1 và G2, trong đĩ cĩ sự thay đổi trong đĩ quá trình trao đổi chất diễn ra bình thường như quá trinh tăng trưởng và phát triển của tế bào. G1 đại diện cho quá trình tế bào con tách khỏi mẹ và phát triển đến cuối quá trình tế bào bắt đầu sinh chồi. Ngay sau khi DNA được tạo thành các tế bào bước vào giai đoạn 2. Sự kiểm sốt thực sự bắt đầu khi quá trình đến cuối giai đoạn G1, buộc tế bào phải phân chia. Sau khi sự phân chia bắt đầu thì các yếu tố ngoại cảnh, chất dinh dưỡng cạn kiệt thì ngăn chặn quá trình phân chia tế bào. Yêu cầu của quá trình này là tế bào phải phát triển vượt qua mức tối thiểu về kích thước và chắc chắn rằng tế bào đã phân chia tạo vịng ở 2 tế bào con. Sau đĩ tế bào thực hiện các con đường cần thiết cho sinh tổng hợp DNA và chuyển vào giai đoạn phase S. Sau khi quá trình tổng hợp DNA được hồn thành, tế bào tiến vào giai đoạn G2, với sự phát triển các chồi được nhân lên, nhân tham gia vào quá trình nguyên phân( pha M). Bước cuối cùng của chu kì tế bào là phân tách tế bào chất của tế bào mẹ và tế bào con. Sự phân tách tế bào con khơng được thực hiên tồn vẹn cĩ thể tạo nên kiểu hình đặc trưng cho các tế bào con. Hình 2.3.4: Quá trình sinh trưởng của tế bào chồi con nấm men[8]. Nguồn gốc của sự hình thành chồi trên cơ thể tế bào mẹ được bắt đầu với sự lựa chọn một vị trí thích hợp trên cơ thể mẹ, nơi cĩ sự phát triển mạnh. Vị trí điểm chồi được xác định dưới sự điều khiển của kiểu gen. Sự tạo nên một chồi mới bao gồm sự hình thành vịng chitin,một đoạn vịng ngắn khoảng 10nm và một vài protein được gắn trên vịng chitin. Sự sinh trưởng và phát triển của chồi phụ thuộc vào lớp vách tế bào polysaccharide bao quanh bề mặt chỉ cho phép tế bào phát triển tới mức giới hạn về kích thước. Và sau đĩ quá trình tách chồi khỏi tế bào mẹ được thực hiện. Việc tạo nên vách là quá trình cịn khá bí ẩn, những liên kết ở màng, cĩ nguồn gốc từ bộ máy golgi đĩng vai trị nổi bật. Chứa các túi tiền chất và các enzyme (chitin synthase và β-glucan synthase). Tạo nên những lối đi giúp các chất xây dựng tế bào con di chuyển từ tế bào mẹ sang tế bào chồi con. Sau đĩ quá trình phân chia nhân được xảy ra tạo nên nhân phù hợp cho chồi con, hướng tế bào chất và các bào quan sang chồi con. Sau khi hồn thành quá trình nguyên phân, các chồi con trưởng thành tách khỏi tế bào mẹ[8]. Hình 2.3.5: Sinh sản bằng cách nẩy chồi ở nấm men (Sharma,1998) Sinh sản hữu tính ở nấm men: Nấm men khơng sinh ra các cơ quan sinh dục mà chúng sinh ra hai tế bào dinh dưỡng cĩ nhiệm vụ giống như các giao tử. Quá trình tích hợp tế bào chất (plasmogamy) và hợp nhân (karyogamy) xảy ra và thành lập tế bào nhị bội, nang và cuối cùng là bào tử nang thành lập trong nang. Hình 2.3.6: Giai đoạn sinh sản hữu tính ở nấm men Saccharomyces cerevisiae (Sharma, 1998) Số bào tử nang tùy thuộc vào số lần phân chia nhân nhưng thường là 8, bào tử nang được giải phĩng, nẩy mầm để hình thành tế bào dinh dưỡng mới từ đây chúng sinh sản vơ tính bằng sự nẩy chồi hay phân đơi. Tuy nhiên, sinh sản hữu tính khơng phải đơn giản như mơ tả ở phần trên; theo Guilliermond (1949), nấm men cĩ 3 loại chu kỳ sinh trưởng hay vịng đời khác nhau được mơ tả ở 3 loại nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ludwigii và Schizosaccharomyces octosporus. 2.3.2. Một số chủng Saccharomyces: Rosini và al (1982), phân loại lại mơi trường của các chủng nấm men của viện vi sinh học của trường Đại học Perouse, đã quan sát, trên 591 chủng S.cerevisiae bảo quản malt thạch, 23 trường hợp mất khả năng lên men galactose, điều đĩ cĩ nghĩa là 23 chủng này trở nên bayanus theo sự phân loại của Lodder (1970). Sử dụng các phương pháp di truyền đồng nhất nấm men trong lên men rượu vang, nhanh và thường được sử dụng, sự khuếch đại thành các đoạn của gen đơn bội bởi phản ứng poly hĩa mạch (PCR), gần đây đã chỉ ra rằng một dụng cụ tuyệt vời của sự phân biệt của lồi lên men vang. Dưới đây là một số lồi được phân loại theo nghiên cứu trên. Bảng 2.3: Một số chủng nấm men saccharomyces cerevisiae[1]. Chủng nấm men Đặc điểm Khả năng ứng dụng trong lên men Chủng 12. Tế bào trịn hình trứng với kích thước 5-8m. Nhiệt độ 250C chỉ trong vịng một ngày cụ thể tạo thành bào tử (1 – 4 bào tử).tế bào già thường chứa nhiều glycogen và metaxromatin. Sinh sản mạnh trong 12 giờ đầu nuơi cấy sau đĩ chậm dần Khả năng lên men rất mạnh glucose, matose, fructose, galactose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose. Khi lên men cĩ khẳ năng tích lũy trong mơi trường 13% đường. Chủng số 2 (do Linder tách ra từ 1889 trong nhà máy rượu). Tế bào dài, hình đứng, lớn và sinh sản bằng cách nảy chồi. Ở 25oC trong 30 giờ nuơi cấy cĩ thể tạo thành bào tử (thường trong tế bào cĩ 3 bào tử) Chủng đầu tiên được ứng dụng trong sản xuất rượu Lên men được các loại đường như chủng 12 nhưng khả năng sinh sản kém hơn. Chủng M.10 (được tách từ năm1916). Tế bào chủng này cĩ hình trịn hay hình oval với kích thước 5-6 x 6-7µ. Chúng cĩ khả năng sản sinh rất nhanh. Sản xuất các loại nguyên liệu chứa đường. Lên men được ở nồng độ rất cao. Bền vững với acid sulfuric và tồn tại được ở pH =2. Chủng B. Tế bào hình trụ, hình oval với kích thước tế bào 3,9-9,7 x 39-8,9 m. Sử dụng rộng rãi trong sản xuất rượu từ mật rỉ. Cĩ khả năng lên men rượu rất tốt, đồng thời cĩ đặc tính lên men bánh mì cao. Chủng M (thu được vào 1905) do Ghenebec. Bền và ổn định, thích nghi được những điều kiện khơng bình thường trong thực tế sản xuất. Sinh sản nhanh và hiệu suất lên men tương đối tốt Lên men trong mơi trường chứa các hỗn hợp đường khác nhau. 2.4.Cơ sở khoa học của quá trình lên men rượu. Quá trình lên men là quá trình phức tạp trong đĩ cĩ sự biến đổi quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của nấm men. Quá trình chuyển hĩa nguồn nguyên liệu thành sản phẩm chính trong lên men rượu là ethanol và CO2, ngồi ra trong quá trình lên men cịn tạo ra nhiều sản phẩm hữu cơ khác cĩ khả năng ảnh hưởng tới chất lượng của rượu vang. Do đĩ hiểu rõ những cơ sở khoa học trong quá trình lên men sẽ giúp cho việc điều khiển quá trình lên men xảy ra theo chiều hướng cĩ lợi. Hình 2.4.1: Quá trình chuyển hĩa glucose trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [6]. Quá trình lên men rượu thực chất là một quá trình chuyển hĩa đường thành rượu etylic, CO2 và các sản phẩm phụ khác.Quá trình chuyển hĩa từ đường hexose đến rượu etylic và CO2 cĩ thể biểu diễn theo phương trình tổng quát của Gay-Lussac [5]. Hình 2.4.2: Quá trình chuyển hĩa glucose thành ethanol [31]. C6H12O6 2 C2H5OH + 2CO2 + Q Theo phương trình thì khi lên men sẽ tạo ra 2 phân tử rượu etylic và 2 phân tử CO2. Theo lý thuyết thì hiệu suất thu hồi rượu là 51,1% so với hexose và 53,8% đối với maltose hoặc saccharose[5]. Năm 1857, Louis Pasteur đã cơng bố kết quả nghiên cứu của mình và kết luận: Sự phân giải đường thành rượu và CO2 trong điều kiện yếm khí, cứ 100% glucose sẽ tạo thành 51,1% C2H5OH và 49,4% CO2, 3,2 acid succinic và khoảng 1% các sản phẩm khác[39]. Quá trình lên men được thực hiện qua một chuỗi phản ứng rất phức tạp và liên quan đến quá trình phosphoryl hĩa các hợp chất hữu cơ. Tồn bộ quá trình này được thơng qua chu trình Embden-Meyerhof. Trong đĩ, đáng chú ý là sự tham gia của ATP trong quá trình chuyển hĩa glucose thành rượu etylic: C6H12O6 + 2ATP + 2H3PO4 + 4ADP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ADP + 4ATP Năng lượng tích lũy trong liên kết ATP chính là nguồn năng lượng cung cấp cho hoạt động của nấm men. Và đây cũng là nguồn năng lượng làm tăng nhiệt độ của dịch lên men trong quá trình lên men.Xét về mặt hĩa học, sự lên men rượu cĩ thể chia thành 2 thời kì: thời kì cảm ứng và thời kì tĩnh. Thời kì cảm ứng: Ở giai đoạn này, chất nhận H của enzyme alcohol-dehydrgenase là acetaldehyde được tạo chưa đầy đủ. Do đĩ, enzyme sẽ chuyển H đến cho andehyde phophateglycerinic. Dưới tác dụng của enzyme phosphatase, phosphateglycerin bị thủy phân để tạo thành glycerin. Như vậy trong mơi trường sẽ hình thành glycerin và CO2. Thời kì tĩnh: Đến lúc này, lượng acetaldehit là cơ chất bình thường của enzyme alcohol-dehydrogenase được tạo thành đã cĩ nhiều, nên enzyme sẽ chuyển H đến cho cơ chât của nĩ, rượu etylic và CO2 được hình thành từ đây. Trong mơi trường acid, glycerin là sản phẩm phụ chỉ được tạo ra trong thời kì cảm ứng.Thực tế cho thấy rằng, sự lên men chỉ xảy ra một cách bình thường cho sản phẩm chủ yếu là rượu và một số sản phẩm phụ khác như glycerin, acid hữu cơ, chỉ trong điều kiện pH của mơi trường từ 4-5 và mơi trường yếm khí, sự lên men xảy ra mới mạnh mẽ nhưng khi đĩ sự phát triển của nấm men cĩ thể bị kìm hãm, do điều kiện yếm khí nên lượng Oxy khơng cung cấp đủ cho quá trình gia tăng sinh khối. Khi cĩ khơng khí thì sự lên men sẽ yếu dần đi và nấm men thu nhận năng lượng của cần thiết để phát triển theo con đường hơ hấp hiếu khí bằng cách oxy hĩa glucose để chuyển thành CO2 và H2O. hiện tượng kìm hãm sư lên men rượu dưới ảnh hưởng của oxy được gọi là hiệu ứng pasteur[5]. Con đường chuyển hĩa từ đường glucose đến sản phẩm ethanol theo chuỗi phản ứng của chu trình EMP(Embden-Meyerhof pathway) và chi phối bởi các enzyme pyruvate decarboylase và enzyme alcohol dehydrogenase: 2.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nấm men Saccharomyces cerevisiae trong quá trình lên men rượu. 2.5.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ : Trong cơng nghiệp lên men yếu tố nhiệt độ được đánh giá là nhân tố quan trọng từ khi bắt đầu đến khi kết thúc quá trình lên men. Ngày nay đã cĩ rất nhiều nghiên cứu xem xét tác động của nhiệt độ đối với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra nhiệt độ tối ưu trong quá trình lên men của nấm men saccharomyces là khoảng 28 – 320C. Tuy nhiên nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao và kéo dài hơn. Ở nhiệt độ 300C nấm men thuần phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2 – 3 lần, cịn ở nhiệt độ 35 -380C chúng phát triển nhanh gấp 6 đến 8 lần. Khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester, aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng. Hình 2.5.1: Tác động của nhiệt độ lên mật độ tế bào: (□) 15oC, (◊)20oC,(●) 25oC, (∆) 30oC, (▼) 35oC [28]. Nhiệt độ cĩ tác động đến những quá trình trao đổi chất của tế bào và đặc tính của nấm men trong quá trình tạo ra lượng ethanol( Bảng: 2.4 ). Điều này yêu cầu sự hiểu biết trong việc tìm hiểu những chủng nấm men đáp ứng yêu cầu và sự kiểm sốt nhiệt độ phụ thuộc những quá trình sinh lý học khác nhau, và chiều hướng thay đổi sự trao đổi chất của nấm men. Việc lên men ở nhiệt độ thấp trở thành một ứng dụng quan trọng trong cơng nghiệp sản xuất rượu vang, một mặt nào đĩ nĩ cĩ tác dụng đến quá trình sinh trưởng của tế bào, bởi vì chúng làm tăng khả năng chịu stress của nấm men trong suốt quá trình lên men. Bảng 2.4: Tác động của điều kiện nhiệt độ lên các sản phẩm của quá trình lên men [28]. Nồng độ(g/l) 15oC 20oC 25oC 30oC 35oC Ethanol 93.60±0.56 93.04±0.88 90.00±0.00 89.60±0.00 79.52±0.08 Glycerol 6.05±0.11 6.59±0.07 6.91±0.11 7.18±0.02 7.38±0.08 Acetaldehyde 0.05±0.00 0.09±0.01 0.04±0.00 0.04±0.00 0.02±0.00 Acid Succinic 0.74±0.06 0.89±0.04 0.77±0.06 0.92±0.08 0.70±0.03 Acid Acetic 0.08±0.01 0.13±0.01 0.14±0.00 0.13±0.01 0.22±0.04 Tổng sản phẩm 100.52 100.74 97.86 97.87 87.84 CO2 89.53 88.99 86.08 85.70 76.06 Tổng sản phẩm+ CO2 190.05 189.73 183.94 183.57 163.90 Ethanol nấm menα 47.51 47.23 45.68 45.48 40.36 α : ethanol tạo thành(g/l) x 100/ nồng độ đường ban đầu(g/l). Sự ảnh hưởng trong quá trình lên men ở chế độ nhiệt độ thấp chính là sự kéo dài trong pha lag và điều này thúc đẩy nhiều nghiên cứu nhằm rút ngắn quá trình này đĩ là sử dụng những chủng nấm men khơ qua quá trình làm ướt. Những phân tích ở cấp độ phân tử đã cho thấy những minh chứng về khả năng tế bào nấm men thích ứng với những điều kiện stress sau khi cĩ sự biến đổi đột ngột về nhiệt độ[11]. Việc lên men tại những điều kiện nhiệt độ khác nhau dẫn đến sự sinh trưởng của nấm men cũng hồn tồn khác nhau.Việc sử dụng chửng Saccharomyces cerevisiae EC1118 ở diều kiện nhiệt độ là 15oC và 30oC đã cho thấy những thay đổi đáng kể của nấm men với các điều kiện stress về nhiệt độ. Một trong những tác động cĩ ảnh hưởng lớn nhất tới quá trình lên men ở nhiệt độ thấp là là sự ảnh hưởng của quá trình trao đổi Nitơ. Mặc dù trong suốt quá trình đã được cung cấp 1 hàm lương amoniac là như nhau nhưng kết quả cho thất lượng sinh khối tạo ra ở 15oC ít hơn lượng sinh khối tạo ra ở 30oC và các chủng nấm men cơng nghiệp biểu hiện tốt hơn so với chủng nấm men trong phịng thí nghiệm. Bảng 2.5 : Sự tác động của yếu tố nhiệt độ lên quá trình lên men rượu trên chủng Saccharomyces cerevisiae. Nhiệt độ Tác động cĩ lợi trong lên men Tác động cĩ hại trong lên men 28-32oC Khoảng nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men rượu[5,11]. Tổn thất do tạo men khá cao. Ở 29,5oC là 7,37%[2]. 32-35oC Thời gian lên men nhanh, hàm lượng sản phẩm phụ cao tăng giá trị tạo hương vị cho sản phẩm[5]. Lượng tế bào chết tăng, mất cân bằng. Hoạt tính nấm men giảm theo thời gian[5]. 20-22oC Hạn chế tạp khuẩn trong mơi trường lên men. Tổn thất trong quá trình lên men vẫn cịn ở mức cao. 10-18oC Ổn định chất lượng sản phẩm, tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm[3,11,7]. Tổn thất do tạo men giảm dần khi giảm nhiệt độ lên men ở 17,5oC là 5,32%, ở 10oC là 4,42%[2].Yếu tố nguy hại cĩ thể tồn tại ở mức độ cao[11]. 4oC Ổn định chất lượng sản phẩm. Giữ được hương vị đặc trưng cho sản phẩm trong khi bảo quản[19]. Nấm men hầu như khơng phát triển trong điều kiện nhiệt độ lạnh. Nấm men chỉ được phát hiện sau 50 giờ lên men[19]. Hình 2.5.2: Sự sinh trưởng của nấm men S. cerevisiea S228C trong mơi trường YPD ( độ hấp thụ) theo ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau: (♦), 35oC; (○), 25oC; (■), 15oC; (▲), 4oC [19]. 2.5.2. Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men và tác động của các acid lên sự thay đổi pH. 2.5.2.1 Ảnh hưởng của pH lên quá trình lên men. Nồng độ ion H+ trong canh trường cĩ ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng cĩ khả năng làm thay đổi diện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hay giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật hoạt động tốt ở một pH nhất định. Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo rượu ethylic là 4,5 – 5,0. Đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột thường khống chế ở pH = 4,8 – 5,2; nhằm giữ cho amylase tiếp tục chuyển hĩa tinh bột và dextrin thành đường lên men được. Tăng pH sẽ dễ bị nhiễm khuẩn; glycerin tạo nhiều hơn và giảm hiệu suất lên men. Vì vậy, khi tạo men giống trong điều kiện sản xuất, cần điều chỉnh pH tới 3,8 – 4,0 để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lactic và nấm men cĩ hại. Ở pH 4,2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH = 4,5 – 5,0 nhưng tạp khuẩn hầu như khơng phát triển. Tới lúc nào đĩ nấm men phát triển nhiều và đủ mạnh tăng pH đến tối ưu cho nấm men phát triển nhanh hơn. Lúc này điều kiện cũng tốt cho các tạp khuẩn nhưng vì nấm men đã nhiều và đủ mạnh để lấn át nên tạp khuẩn cũng khĩ gây tác hại cho lên men. Phương pháp này được áp dụng để gây men trong điều kiện sản xuất và gọi là nuơi cấy nấm men thuần khiết tự nhiên.Khi cho acid sulfuric vào đường dịch, chúng sẽ khơng ở dạng tự do mà liên kết hĩa học với các muối và giải phĩng acid hữu cơ, phosphoric tự do, chủ yếu ở dạng KH2SO4 và NaH2PO4. Giữa ion H + và lượng acid cĩ tương quan nhất định đối với mỗi dung dịch nào đĩ, ví dụ cùng một pH nhưng độ chua của dịch đường hĩa từ ngơ bao giờ cũng lớn hơn từ sắn . Trong thực tế sản xuất khơng phải cơ sở nào cũng cĩ điều kiện đo pH, mà thường chỉ xác định độ chua. Đối với mỗi dung dịch nào đĩ thì pH cĩ thể xem như gần ổn định cịn độ chua lại thay đổi nhiều phụ thuộc vào mức độ nhiễm khuẩn của nguyên liệu và dịch lên men. Khi nhiễm khuẩn sẽ tạo acid hữu cơ cĩ độ phân ly thấp nên ít làm thay đổi pH. Vì vậy trong sản xuất rượu khơng chỉ xác định pH mà cịn xác định độ chua. Độ chua cĩ thể biểu diễn theo độ hay theo gam acid / lít. Một độ chua được biểu diễn bằng 1ml dung dịch NaOH 2M vừa đủ để trung hịa acid tự do chứa trong 20 ml dịch hoặc biểu diễn độ chua bằng gam H2SO4/lít dịch, 10 chua = 2,45 g /l. 2.5.2.2 Tác động của một số acid lên pH trong suốt quá trình lên men. Tác động của acid tartaric trong quá trình lên men và thay đổi pH.Tartaric ở nồng độ 5-10g/l là nồng độ thích hợp cho quá trình lên men xảy ra ở mức độ cao và rút ngắn thời gian lên men của quá trình. Hình 2.5.3: Những sự thay đổi trong mức độ lên men tối đa (♦), ngày lên men kết thúc(▲), pH cuối của quá trình lên men(●) do ảnh hưởng của acid tartaric[10]. Khi sử dụng nồng độ tartaric ở 0g/l thì thời gian lên men là dài nhất, đến 18 ngày. pH cũng cĩ sự thay đổi trong quá trình, trong quá trình lên men khơng cĩ sự bổ sung tartaric thì pH giữ khá ổn định trong quá trình lên men pH=2,4 Trong khi đĩ với sự bổ sung acid tartaric với nồng độ 20g/l pH sau quá trình lên men là 3,5. Sự tác động ở các khác nhau đã ảnh hưởng tới mức độ hồn thành quá trình lên men.Ở pH 3.5, 4.5 và 5.5 thời gian lên men là tương đương nhau. Riêng ở pH 2.5 thời gian lên men diễn ra lâu hơn và mức độ lên men cũng diễn ra khá chậm. Bảng 2.6: Thơng số động lực học và pH kết thúc quá trình lên men với những pH ban đầu khác nhau trong mơi trường cĩ sự thiếu hụt hoặc hiện diện của acid tartaric. Hình 2.5.4: Những minh chứng của cho sự thay đổi pH trong quá trình lên men: (A)pH bắt đầu lên men tại các giá trị khác nhau( đường nét đứt và kí hiệu mở) và khơng sử dụng acid tataric( nét liền và kí hiệu đậm)[ pH ban đầu:2,5 (◊), 3,5(∆), 4,5 (○) và 5,5()]; (B) pH trong quá trình lên men với sự hiện diện (●) và thiếu (▲) acid tataric trong những giờ đầu của quá trình lên men[10]. Bảng 2.7: Ảnh hưởng của một số acid lên sự sự sinh trưởng của nấm men. Acid Nồng độ Thời gian tiêu diệt nấm men ( giờ) Làm ngừng sinh trưởng Tiêu diệt men % mol/l % mol/l HCl 0,14 0,038 0,72 0,195 0,46 H2SO4 0,39 0,039 1,30 0,123 2,04 H3PO4 0,30 0,031 2,00 0,204 1,28 CH3COOH 0,75 0,125 3,00 0,500 1,25 Acid lactic 0,90 0,100 3,00 0,333 1,27 Hình 2.5.5: Một số acid cĩ mặt trong nội bào trong suốt quá trình lên men của hèm nho ở 25oC: (gạch sọc) nấm men khơ; (màu đen) giữa quá trình lên men; ( trắng) kết thúc quá trình lên men[10]. Hình 2.5.6: Sự thay đổi pH tại các nồng độ acid hữu cơ khác nhau, (A) tại nồng độ 0g/l acid, (B) tại nồng độ 5g/l acid: (♦)nồng độ kiểm sốt; (■) acid tartaric;(▲) acid malic; (×) acid citric; (●) acid succinic[10]. Việc sủ dụng những acid hữu cơ ở những nồng độ khác nhau đã cho thấy sự khác biệt rõ rệt trước và sau khi sử dụng các acid hữu cơ vào quá trình lên men. Bên cạnh đĩ, hồn tồn nhận thấy sự biểu hiện của các acid trong những thay đổi này ở các mức độ khác nhau( hình B) làm ảnh hưởng tới quá trình lên men. 2.5.3. Ảnh hưởng của SO2: So với các loại vi sinh vật khác nấm men rất bền với các điều kiện tác động của SO2. Việc sử dụng SO2 trong sản xuất rượu vang được dùng để ức chế và tiêu diệt một phần các vi sinh vật cĩ hại đến quá trình lên men.Sự cĩ mặt của SO2 sẽ kéo dài quá trình lên men.[39]. SO2 được xem như là chất chống oxy hĩa quan trọng trong lĩnh vực sản xuất rượu. Các nghiên cứu gần đây cho thấy nồng độ giới hạn của SO2 trong rượu được giới hạn ở mức tối đa là 200ppm. Được những tổ chức quốc tế khuyến cáo là tốt cho sức khỏe của người dùng. SO2 tác động đến quá trình lên men đặc biệt là trong quá trình lên men malolactic và tác động lên sự giảm hàm hàm lượng acid malic cĩ trong rượu vang. SO2 được biết đến như một tác nhân chống lại các vi sinh vật gây hại trong rượu . nguồn SO2 được lấy từ 3 nguồn chính: trong các hợp chất của trái cây( glucose và arabinose), trong quá trình trao đỏi chất tạo sản phẩm của vi sinh vật (Gluconobacter và Acetobacter), và trong quá trình lên men cĩ thể tạo ra aetaldehyde, pyruvic và acid 2-oxoglutamic. SO2 hạn chế nguồn dinh dưỡng đối với ví sinh vật ,ức chế sự cạnh tranh quá trình oxy hĩa polyphenol, trong mơi trường hèm nho nĩ cạnh tranh trực tiếp với sự làm giảm hàm lượng oxy , làm oxy trở nên cĩ tính cấp thiết đối với Saccharomyces [9]. Hình 2.5.7: Ảnh hưởng của SO2 lên ethanol và acetaldehyde .(♦) mơi trường cĩ bổ sung SO2, (◊) mơi trường khơng bổ sung SO2[9]. Việc sử dụng SO2 trong quá trình sản xuất rượu vang là điều kiện cần thiết cho sự ổn định về chất lượng vang và giảm lượng vi sinh cĩ hại đến mức tối thiểu, cũng như là phịng tránh, ngăn chặn sự hình thành các loại độc tố từ các chủng nấm men thuần gây ra. SO2 ảnh hưởng trên sự hình thành acetandehyde. Việc hình thành Acetandehyde nĩi chung phụ thuộc trên lồi hoặc chủng nấm men sử dụng nhưng các nhân tố như là nhiệt độ,oxy , và SO2 tác động lên quá trình hình thành acetandeyde một cách tốt nhất. Tác động lên sự lên men malolactic: Sự ức chế của những chủng thuần lên quá trình lên men và các chủng lên men axit lactic.Trong trường họp này sự thêm vào SO2 khơng cịn cĩ sự tác dụng tương tự, nhưng cũng đã cĩ sự thay đổi chiều hướng phần nào. Nồng độ của acetandehyde phần nào tác động đến sự lên men malolactic,khi nồng độ vượt quá 100mg/l thì trở thành nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men lactic,trong khi ở mức độ thấp hơn (<100mg/l). Hình 2.5.8: Ảnh hưởng của SO2 lên acid malic và acid lactic .(♦) mơi trường cĩ bổ sung SO2, (◊) mơi trường khơng bổ sung SO2[9]. 2.5.4. Ảnh hưởng nguồn Carbon Nguồn sinh khối thu được chiếm tới 50% carbon trên tổng khối lượng khơ điều này biểu thị tầm quan trọng như thế nào. Nguồn Carobn trở thành một nguồn nguyên liệu chính cho quá trình trao đổi chất quan trọng để tỏng hợp năng lượng cho tế bào. Nhiều loại vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng một hợp chất hữu cơ cĩ cấu trúc đơn cung cấp cả Carbon và nguồn năng lượng cho tế bào. Cĩ nhiều sự khác biệt trong việc bổ sung các hợp chất hữu cơ so với các chất dinh dưỡng cần thiết. Việc bổ sung các chất dinh dưỡng hữu cơ được gọi là cơ chất cho sự phát triển và cĩ một chức năng rõ ràng trong sự sinh tổng hợp, được cho biết trước bởi những hoạt động sinh tổng hợp của tế bào bị ngưng lại. Hầu hết các loại vi sinh vật đều sử dụng nguồn Carbon chủ yếu từ các nguồn carbon hữu cơ cũng như CO2 được biết đến là một chất dinh dưỡng với hàm lượng nhỏ[7]. Carbonhydrate là nguồn cung cấp tốt nhất nguồn carbon, Oxy, Hydro, và quá trình trao đổi năng lượng. thường xuất hiện với một ham lượng lớn trong mơi trường cao hơn hản các chất dinh dưỡng khác thơng thường được sử dụng từ 0.2-25%. Khả năng sử dụng nguồn carbonhydrate phụ thuộc vào sự phức tạp trong cấu trức của phân tử.Thơng thường theo chiều hướng ưu tiên sau: Hexose > disaccharides > Pentoses > polysaccharides Carbonhydrate cĩ cấu trúc hĩa học gần giống với polyhydroxyaldehyde cũng như là polyhydroxyketone. Thơng thường chúng cĩ thể được chia thành 3 nhĩm : các monosaccharide, các disaccharide và các polysaccharide. Carbonhydrate cĩ một quy luật trọng tâm trong quá sinh tổng hợp năng lượng, sản xuất ra ATP. Tiến trình bẽ gãy các polysaccharide và các disaccharide thành các loại đường đơn giản hơn là nguồn nguyên liệu chính của hợp chất giàu năng lượng. Trong suốt quá trình trao đổi chất, glucose, sẽ chuyển hĩa thành CO2, nước và năng lượng.Ba con đường chuyển hĩa cĩ quan hệ mật thiết kiểm sốt quá trình trao đổi carbonhydrate[7]. Glucose qua quá trình biến đổi kỵ khí sẽ chuyển thành pyruvic và từ đĩ hình thành ethanol hoặc acid lactic. Từ pyruvic acid nĩ cĩ vào quá trình oxy hĩa theo con đường TCA(TriCarboxylic Acid cycle). Cứ mỗi phân tử glucose sẽ tạo thành 2 phân tử ATP được diễn ra trong EMP. Trong quá trình lên men sự hình thành acid pyruvic cĩ thể tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau, như ethanol, acid lactic, acid butyric, acetone và isopropanol. Chu trình TCA: chức năng của chu trình TCA là chuyển hĩa pyruvic và acid lactic,tạo thành những sản phẩm cuối cùng CO2 và H2O. Nĩ cũng là kênh chuyển hĩa cuối cùng sự oxy hĩa các acid béo và bộ khung Carbon của nhiều acid amin.Phản ứng : EMP và chu trình TCA là những chu trình cung cấp nguồn năng lượng ATP chính, trong khi chúng cũng cung cấp năng lượng cho quá trình tổng hợp các acid amin và lipit. Chu trình pentose phosphate điều khiển hàm lượng pentose quan trọng cho nucleotide (ribose-5-phosphate) và sinh tổng hợp acid béo (NADPH2). Nấm men Saccharomyces cerevisiae sử dụng nguồn glucose, fructose và sucrose mà khơng cĩ bất cứ khĩ khăn nào. Đơi khi nấm men cịn sử dụng được galactose và maltose nhưng hiếm khi xảy tra.Quá trình trao đổi chất của Saccharomyces cerevisiae tuân theo EMP và tạo ra sản phẩm là ethanol, 2 phân tử ATP từ một phân tủ đường glucose. 2.5.5. Ảnh hưởng của nguồn nitơ: Nguồn Nito bổ sung trong quá trình lên men được đánh giá là nhân tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng và hiệu suất của quá trình lên men. Trong nhiều tình huống nghiên cứu khác nhau, nito được khảo sát theo 3 hướng: Cung cấp lượng nito vừa đủ cho quá trình lên men, giới hạn lượng nito của quá trình lên men và thiếu hụt lượng nito theo bảng 2.7 [20]. Trong cơng nghiệp lên men rượu sử dụng amoniac là nguồn nito chính. Nhưng các amino acid cũng được xem là nguồn cung cấp nguồn nito vơ cùng giá trị trong cơng nghiêp sản xuất rượu vang. Amoniac và các amino acid được đề cập đến như là những nguồn Nito chính đối với nấm men. Khi acid tataric khơng hiện diện trong mơi trừơng, sự thay đổi trong nồng độ của amoni đã khơng đủ để tránh khỏi những tác động làm chậm quá trình lên men[10]. Ngồi ra việc bổ sung nguồn nito cịn được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau: các muốn amoni sunphate, Urea…Bổ sung nitơ với số lượng 30 mg/100ml sẽ rút ngắn thời gian từ 84 giờ xuống 60 giờ, đồng thời lên men cũng tốt và đạt hiệu quả cao hơn mẫu đối chứng. Trong đĩ nguồn nitơ từ ure cho kết quả tốt hơn. Bảng 2.8: Các thơng số đánh giá trong quá trình lên men với thành phần mơi trường lên men chứa 20% glucose và các nguồn Nito ban đầu khác nhau[20]. CF: Kiểm sốt quá trình lên men(267mg N/l); LN : lượng Nito thấp trong quá trình lên men(66mg N/l); RF: ưu tiên cho quá trình lên men(66 + 200mg N/l cung cấp trong vịng 72 giờ và muối Diamoni sunfate). 2.5.6. Ảnh hưởng của nồng độ đường ( ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu). Dưới điều kiện nồng độ glucose cao S. cerevisiae vẫn biểu hiện khả năng lên men[12].Nồng độ dịch đường cao làm tăng áp suất, mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là cồn nhiều sẽ ức chế khơng những tạp khuẩn mà cả nấm men, dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men.Nồng độ dịch đường thấp làm giảm năng suất thiết bị lên men. Những tác động của nồng độ glucose cao ảnh hưởng trực tiếp lên sự trao đổi chất và sự biểu hiện của tồn bộ hệ gen. Áp suất thẩm thấu lớn (300mg/l glucose) đã tác động lên sự thay đổi lên hệ gen của nấm men. Kết quả đã tạo ra nguồn năng lượng lớn trong tế bào, sự hình thành các sản phẩm bậc 1 và bậc 2. Ở các nồng độ dịch đường khác nhau tương ứng với thời gian tiến vào pha log cũng khác nhau. Điều này cho thấy rằng nồng độ glucose cĩ tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men từ khi bắt đầu quá trình lên men cho đến khi kết thúc quá trình[12]. Bảng 2.9: Tác động của glucose lên một số yếu tố trong quá trình lên men[12]. Nồng độ glucose Thời gian tiến vào pha log(giờ) Thời gian hồn thành pha log(giờ) Ethanol tạo sau khi hồn thành pha log(g/l) pH của mơi trường Glycogen thu được sau 68h lên men(g/l) 120g/l 4 68 54,3 3,1 3,8 210g/l 6 88 72,4 2,8 5,2 300g/l 8 96 89,3 2,3 8,6 Thơng thường khống chế nồng độ chất khơ của dịch đường từ 16 – 18 % ( tùy theo mức độ thuần khiết), tương đương 13 – 15% đường, để sau khi lên men sẽ nhận được nồng độ rượu trong giấm chín là 8,5 – 9,5 % V. Hình2.5.9 thể hiện sự giảm nồng độ glucose trong quá trình lên men đồng thịi cho thấy sư tác động của glucose lên sự phát triển của nấm men. 2.5.7 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol lên quá trình lên men của Saccharomyces cerevisiae. Những tác động của ethanol đã ảnh hưởng tới 6138 gen,và trên các gen này ethanol cĩ những tác động thuận lợi cũng như cĩ như cĩ những tác động khơng thuận lợi cho sự biểu hiện của gen. Những biểu hiện của các gen này đã cho thấy một bức tranh tồn cảnh trong cơ chế các phản ứng trong quá trình sản xuất rượu dưới điều kiện tác động của ethanol ở nồng độ cao[18]. Điều đáng quan tâm trong cơ chế ảnh hưởng của ethanol cho thấy hầu hết tất cả các gen đều cĩ liên quan đến cơ chế tổng hợp trahalose được biểu hiện mạnh. Tương tự đĩ các biểu hiện của các gen sHSPs cũng cho thấy sự thay đổi trong biểu hiện, hầu hết các gen đều bị cảm ứng trước tác động của ethanol, ngồi ra một minh chứng cụ thể cũng đã cho thấy những sự tác động lên cơ chế chống oxy-hĩa. Trong quá trình lên men ở nồng độ ethanol 7% đã cho thấy: cĩ 3,2% gen cĩ biểu hiện ở mức độ giảm.63,6% gen cĩ biểu hiện tăng so với trước trong đĩ cĩ 49,4% phụ thuộc vào điều kiện stress của mơi trường. 14,2% phụ thuộc vào chủng nấm men kháng stress[18]. Hình 2.5.9: Sự giảm glucose, ethanol, và nồng độ glycerol cũng như là sự phát triển của nấm men dưới những điều kiện khác nhau về nồng độ glucose: 120g/l(∆), 210g/l(), và 300g/l (○). Kí hiệu các ơ được tơ đen biểu diễn cho (A) OD650, hoặc (B) glycerol; kí hiệu khơng tơ đen biểu diễn cho (A) glucose, hoặc (B) ethanol. Thí nghiệm được thực hiện 3 lần[12]. Sự cảm ứng dưới các điều kiện khác nhau liên quan đến nhiều yếu tố như khả năng bảo vệ tế bào dưới tác động nhiệt ,sự sinh tổng hợp trahalose,cơ chế chống oxyhoa cũng như là khả năng đáp ứng stress[18]. Khả năng ức chế hoạt động của ethanol bắt đầu tại nồng độ 5% và phụ thuộc vào điều kiện nuơi cấy và chủng nấm men sử dụng. Khi tăng nồng độ của ethanol thì tác động hưởng và phụ thuộc hồn tồn vào khả năng lên men và khả năng của chủng nấm men. Cơ chế dưới tác động của ảnh hưởng của ethanol là rất phức tạp[22,2]. 2.5.8 Ảnh hưởng của một số hĩa chất và chất sát trùng. Trong điều kiện sản xuất, dù cĩ vệ sinh sạch đến mấy cũng khĩ đảm bảo vơ trùng tuyệt đối, vì vậy cần phải dùng chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế tạp khuẩn. Cĩ thể dùng hĩa chất khác nhau như clorua vơi, formalin, fluosilicat natri. Tùy theo chất lượng của hĩa chất mà dùng nhiều hay ít, cốt sao hạn chế được phát triển của tạp khuẩn nhưng khơng làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của nấm men.Khi dùng formalin hay fluosilicat natri, nồng độ khơng vượt quá 0,02% so với dịch lên men. Tùy theo tính chất và mức độ phân ly của mỗi acid mà tác hại của chúng lên nấm men sẽ khơng giống nhau.Ngồi ra, trong dịch đường lên men luơn chứa một lượng furfurol, melanoidin, cũng gây ảnh hưởng tới nấm men. Furfurol hạn chế khả năng nảy chồi và kích thước tế bào, tạo ra các hạt trong khơng bào. Furfurol chứa nhiều trong mật rỉ cĩ thể làm giảm khả năng tạo rượu và tăng các tạp chất, giảm hoạt độ của maltase và zymase của nấm men. Khi dịch chứa 4 – 6 triệu tế bào/ml thì 0,002% furfurol sẽ ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và sinh lý của dịch lên men; khi dịch lên men chứa 90 triệu / ml thì 0,006% furfurol mới ảnh hưởng tới sinh lý nấm men. Hàm lượng furfurol trong mật rỉ thường vào khoảng 6 đến 8 g / 100 g chất khơ. Nếu mật rỉ pha lỗng tới 20 – 22% thì nồng độ sẽ khoảng 1,5 – 2,0 mg / 100ml (0,0015 – 0,002%). Trong điều kiện lên men với tỉ lệ men giống lớm hơn 10%, ảnh hưởng của furfurol xem như khơng đáng kể. Melanoidin cĩ ảnh hưởng khơng giống nhau đối với các chủng men. Nĩ ảnh hưởng xấu đến sinh sản của chủng B và IA, chỉ trong 12 giờ đầu đối với chủng r-176 và r-202, melanoidin ảnh hưởng suốt trong thời gian 24 giờ, số tế bào ít hơn 1,3 – 2 lần so với mơi trường chứa 0,005 – 0,3g/100 ml. Caramela khơng bị hấp thụ trên bề mặt nấm men nhưng với nồng độ 0,005% sẽ làm nhiều tế bào bị chết đi. 2.5.9. Ảnh hưởng của sục khí. Sục khí để hịa tan oxy vào dịch đường, giúp cho nấm men phát triển nhanh hơn. Tuy nhiên, sục khí khơng cần thiết đối với dịch đường từ nguyên liệu tinh bột. Sục khí sẽ làm tăng lượng đường bay hơi. Mặt khác nếu dư dẫn đến tạo nhiều sinh khối và aldehyde, do đĩ làm giảm hiệu suất lên men rượu. Thực tế thì khơng cần sục khí vào dịch đường. Một lượng nhỏ oxy sẽ được hịa tan trong thời gian khuấy và làm lạnh, đủ đảm bảo cho sinh trưởng phát triển và lên men. Với tỉ lệ men giống 10%, sau 50 giờ lên men nồng độ biểu kiến của dịch đã giảm tới số lượng khơng đổi với hầu hết thùng lên men. Sau 70 – 72 giờ nồng độ rượu trong giấm chín đạt trung bình 9% V, đường sĩt chỉ vào khoảng 0,3 – 0,5 %. Qua những ảnh hưởng của các yếu tố truyền thống đến quá trình lên men rượu đã cho thấy tầm quan trọng của việc kiểm sốt các yếu tố liên quan. Ngồi quá trình kiểm sốt trên, cơng nghệ sản xuất rượu ngày nay hướng đến những thay đổi trên hệ gen để tạo ra những chủng nấm men đáp ứng được yêu cầu, cải thiện chất lượng, hạ giá thành sản phẩm. Đĩ là việc ứng dụng cơng nghệ sinh học phân tử để cải tiến hệ gen nâm men sẽ được trình bày trong chương tiếp theo. CHƯƠNG 3: TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TÁC ĐỘNG CỦA THAO TÁC KỸ THUẬT TRÊN GEN HSP26 VÀ YHR087W LÊN QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU 3.1. Tổng quan về HSP26 và YHR087W và giá trị thực tiễn đối với quá trình lên men rượu. 3.1.1. Tổng quan và chức năng HSP26,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu. sHSPs( small Heat Shock proteins) là những phân tử chapperone cĩ khối lượng phân tử vào khoảng 12-43 kDa đa số cĩ kích thước từ 14-27kDa được tìm thấy hầu hết trongcấu trúc của vi sinh vật, với số lượng của các loại khác nhau tùy từng chủng ( Narberhaus, 2002). Mặc dù chúng cĩ kích thước nhỏ nhưng các thực thể đang hoạt động trong sHSPs thường là các oligomer bao gồm nhiều tiểu đơn vị, gồm trình tự chuỗi đầu N cĩ thể thay đổi độ dài, một đoạn trình tự khơng thay đổi độ dài gồm khoảng 80 acid amin chứa α-acrytallin và đầu C ngắn ( Caspers et al., 1995). sHSPs cĩ khả năng ngăn chăn sự kết lắng protein và sự hình thành hiện tượng đục thủy tinh thể ở động vật cĩ xương sống. Thơng thường các tế bào phức tạp được hình thành từ các mono oligomer, dimer hoặc tetramer. Các cấu trúc phức tạp của sHSPs chịu nhiệt cĩ liên quan đến mơi trường của tế bào và các protein được tiết ra từ thành tế bào trong suốt quá trình trong thiết bị phản ứng được gia nhiệt ở trong khoảng thời gian dài Cấu tạo của Hsp26: Hsp26 hình thành chuỗi protein cĩ tổng số 214 acid amin [29]. Được qui định bởi 645 nucleotide. Hps26 nằm trên nhiễm sắc thể II hình thành từ 24 tiểu đơn vị cĩ tác động qua lại cĩ cấu trúc nhị trùng hợp theo khối bền vững ( bảng 3.1). Cấu trúc của hsp26 : Hsp26 được hình thành từ tế bào chất trong tế bào S. cerevisiae. Hsp26 cĩ cấu trúc bao gồm 2 yếu tố chính(Hình 3.1.1): phần đầu N cĩ cấu trúc khối đồng nhất về kích thước và đoạn và đầu C-α-crystallin, bao gồm một đoạn ngắn bên ngồi. Hps26 mang đầu N sẽ bắt đầu tại acid amin 95. N và C ưu tiên nằm ở vị trí cuối của hsp26 ở các đầu tương ứng[23]. Bảng 3.1: Vị trí , thành phần nucleotide và acid amin cấu tạo của HSP26 [29]. Tên gọi YBR072W trên chủng S.cerevisiae                            Tên gen HSP26 Định danh Hsp26p Vị trí Nhiễm sắc thể số II:382027..382671  Chuỗi Acid Amin 214 acid amin MSFNSPFFDFFDNINNEVDAFNRLLGEGGLRGYAPRRQLANTPAKDSTGKEVARPNNYAGALYDPRDETLDDWFDNDLSLFPSGFGFPRSVAVPVDILDHDNNYELKVVVPGVKSKKDIDIEYHQNKNQILVSGEIPSTLNEESKDKVKVKESSSGKFKRVITLPDYPGVDADNIKADYANGVLTLTVPKLKPQKDGKNHVKKIEVSSQESWGN Đoạn Nucleotide 645 nucleotide  atgtcatttaacagtccattttttgatttctttgacaacatcaacaacgaagttgatgcctttaacagattgctgggtgaaggcggcttaagaggctacgcaccaagacgtcagttagcaaacacacccgcaaaggattctactggcaaggaagttgctagaccaaataactatgctggcgctctttatgatcccagagatgaaaccttagatgattggttcgacaatgacttgtccctgttcccatctggtttcggtttccctagaagtgtcgcagttccagttgatattttggaccatgacaacaactacgagttgaaagtcgtggttcctggtgtcaaaagcaagaaggacattgatattgagtaccatcaaaacaagaaccaaattttggtttctggtgaaattccatctaccttgaatgaagagagtaaagacaaggtcaaggtcaaggagagcagctctggtaagttcaagagagtcatcactttgccagactacccaggtgtggatgcagacaacattaaagcagactacgcaaatggtgttttgacattaacagttccaaaattgaagcctcagaaggatggtaagaaccacgtcaagaagattgaggtttcttctcaagaatcgtggggtaactaa Hình 3.1.1: Cấu trúc của HSP26 [23]. Hình 3.1.2: Vị trí của HSP26 trên Nhiễm sắc thể II [31]. Hình 3.1.3: Mơ hình cấu trúc khơng gian của gen HSP26 [24]. Ý nghĩa thực tế của nhĩm gen sHSPs, HSP26 và đối với quá trình lên men rượu: Khi tế bào gặp mơi trường stress hoặc bất cứ điều kiện nào cĩ thể gây kích thích mạnh mẽ đến tế bào, thì một quá trình tổng hợp protein mới xảy ra như là một đoạn lớn của các protein gấp nếp sẽ bị đột biến một phần hoặc hồn tồn. Những protein bị biến tính sau đĩ được nhập qua hệ thống kiểm tra chất lượng để xác định khả năng biểu hiện chaperone. 2 yếu tố được xem xét là DnaK-DnaJ-DnaE và GroEL-GroES được cho là quan trọng hơn so với các sHSPs ( small Heat shock proteins) gấp nếp protein. Tuy nhiên khi xét đến chaperone cĩ sự thay đổi với những cơ chất làm tăng tính kích thích , thì sHSPs cĩ thể sẽ phục hồi những hư hỏng của proterin và bảo vệ protein khỏi những mối nguy hiểm.Điều này được thơng qua những protein cĩ tính chất tái gấp nếp, qua những cơ chế biểu hiện chaperone khi mà các gen khơng chịu tác động lâu dài dưới điều kiện stress. Do đĩ chúng cĩ khả năng bảo vệ những protein thành tế bào và cân bằng khả năng sống của thành tế bào dưới các điều kiện stress như là shock nhiệt và hĩa chất[27]. Chức năng của HSPs :những chức năng cụ thể của sHSPs vẫn chưa được đưa ra cụ thể.Một trong những chức năng cụ thể nhất là khả năng chống lại các ức chế về điều kiện nhiệt độ tác động.Mặc dù trong S. cerevisiae mà hsp26 là sHSP ,hsp 26 khơng cĩ sự đột biến nào mà cĩ thể tạo nên sự phân biệt rõ ràng trong kiểu hình so với các chủng thuần khác. Hsp26 cĩ khả năng điều chỉnh thích hợp với các điều kiện cảm ứng ,cĩ cấu trúc nhỏ và bị tác động bởi yếu tố nhiệt độ, cĩ thể hình thành những phân tử cĩ kích thước lớn[41,43]. Hsp26 của Saccharomyces cerevisiae là một trong những họ của những protein shock nhiệt cĩ kích thước nhỏ.Tất cả những đáp ứng với nhiệt độ và các điều kiện stress khác bởi sự hình thành những protein được gọi là protein shock nhiệt, những protein này được chia thành các nhĩm và cĩ một chức năng rõ ràng.Những protein này cĩ kích thước từ 15-40 kDa.Những protein này cĩ những khả năng đặc biêt : cĩ khả năng chịu được các điều kiện kích thích cao, khơng chỉ cĩ khả năng đáp ứng các điệu kiện stress mà cịn trong suốt quá trình phát triển.Sự tác động của các yếu tố cảm ứng lên hsp 26 khơng tuân theo quy luật thơng thường tác động lên các protein shock nhiệt khác. Hsp26 khơng cĩ sự biểu hiện khi khơng cĩ các điều kiên stress xảy ra : nhiệt độ, quá trình tạo bào tử. 3.1.2. Tổng quan và chức năng YHR087W,ý nghĩa đối với quá trình lên men rượu. YHR087W( hay được gọi là RTC3) được biết đến là gen chưa cĩ chức năng rõ ràng, hình thành protein cĩ tổng số 111 acid amin và được cấu tạo từ 336 nucleotide[30]. Bảng 3.2: Vị trí, thành phần nucleotide, acid amin cấu tạo YHR087W [33]. Tên gọi YHR087W trên chủng S.cerevisiae                            Tên gen RTC3 Định nghĩa Protein khơng rõ chức năng liên quan đến quá trình trao đổi của RNA, cĩ cấu trúc tương tự như SBDS Vị trí Nhiễm sắc thể VIII:280822..281157  Chuỗi Acid Amin 111aa  MSTVTKYFYKGENTDLIVFAASEELVDEYLKNPSIGKLSEVVELFEVFTPQDGRGAEGELGAASKAQVENEFGKGKKIEEVIDLILRNGKPNSTTSSLKTKGGNAGTKAN Đoạn Nucleotide 336 nt    atgtctactgtaaccaaatacttttacaagggtgaaaatacagatttgattgtcttcgctgcatccgaagagcttgtagacgaatatttgaaaaatccatcaattggtaagctatctgaagttgtcgaactcttcgaagttttcactcctcaggacggtaggggtgccgagggtgagttgggcgctgcctccaaggcccaagtggaaaatgagttcggtaagggcaagaagatcgaagaagttatcgatttgatattgagaaatggtaagccaaactctaccacctctagtctcaaaaccaaagggggtaacgccggaaccaaagcctacaattga Hình3.1.4: Vị trí, kích thước của YHR087W trên Nhiễm sắc thể VIII của nấm men S.cerevisiae[30,31]. YHR087W là gen khơng rõ chức năng, liên quan đến quá chình chuyển hĩa RNA, cĩ cấu trúc tương tự với SBDS và khơng cĩ khả năng ngăn chặn những đột biến xảy ra trên cdc13-1 đột biến xảy ra do sự nhạy cảm về nhiệt độ.Chịu tác động bởi một vài yếu kích thích ở nồng độ đường cao, ảnh hưởng đến quá trình phiên mã của nĩ, quá trình phiên mã được nhận định là tăng lên dưới các điều kiện gây stress: như shock nhiệt, stress thẩm thấu, stress dưới điều kiện nồng độ sorbitol ở mức cao ở pha cân bằng của chu kỳ phát triển của tế bào[19]. Hình 3.1.5: Cấu trúc khơng gian của YHR087W [30]. 3.1.3. Cơ chế biểu hiện của HSP26 và phương pháp nghiên cứu trên HSP26 và YHR087W. Cơ chế hoạt động của HSP26: Hsp26 được cho là che đậy bởi một protein khác trong quá trình xảy ra những biến đổi đối với hsp26. Thuộc tính của hsp26 cĩ được là khả năng gấp nếp của protein, giúp protein cĩ một cấu trúc phức tạo cĩ khả năng ngăn chặn các điều kiện ngoại cảnh tác động, đặc biệt là nhiệt độ( Hình 3.1.4). Điều này hồn tồn cĩ thể chấp nhận khi mà khơng cĩ sự biểu hiện của sự chống lại ức chế nhiệt độ khi khơng cĩ mặt của hsp26[16]. Hình 3.1.6: Mẫu thể hiện cơ chế của chaperone dưới sự kiểm sốt nhiệt độ của sHSP. Hsp26 được cấu thành từ 12 dimer trong phức hợp gồm 24 tiểu đơn vị. Ở trạng thái ái lực thấp thì Hsp26 khơng cĩ sự tương tác với các protein khơng gấp nếp. tăng nhiệt độ đến khi cĩ sự thay đổi nhỏ trong cấu trúc của oligomer, với sự chuyển đổi ái lực từ thấp lên cao. Oligemer Hsp26 được kích hoạt và cấu thành hợp chất khơng gồm các protein nguyên bản trong một cơ chất phức tạp[25]. 3.1.4. Phương pháp nghiên cứu trên gen HSP26 và YHR087W. Gen HSP26 và YHR087W trong nấm men rượu cĩ tính kháng với một số dạng stress và khả năng lên men. Sự tăng cấp độ biểu hiện của gen thơng qua 2 phương pháp được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền: Tăng số lượng bản sao của gen biểu hiện: bằng cách nhân số lượng lớn bản sao của gen HSP26 và YHR087W cùng với các centromeric plasmid của chúng. Thay thế promoter điều khiển sự biểu hiện của gen bằng cách sử dụng một promoter mạnh hơn promoter của chủng bản đầu: Thay thế promoter 2 gen HSP26 và YHR087W bằng SPI1 và PGK1. PGK1 mã hĩa quá trình tạo enzyme glycolytic phophoglycerate 3-kinase. Trong khi SPI1 cĩ biểu hiện điều hịa stress trong suốt quá trình lên men, các gen PGK1 biểu hiện mức độ tối đa của mRNA ở giai đoạn pha log, và giảm dần trong pha cân bằng, phù hợp với tỷ lệ lên men (Puig và Pérez-Ortín , 2000; Rossignol et al 2003.,) [19]. Phương pháp tăng số lượng bản sao của gen biểu hiện: bằng cách nhân số lượng lớn bản sao của gen HSP26 và YHR087W cùng với các centromeric plasmid của chúng. Hình 3.1.6 trình bày phương pháp nhân số lượng bản sao. Thực tế số lượng bản sao của HSP26 hoặc YHR087W cĩ thể nhiều hơn 2 bản sao trên DNA. Hình 3.1.7: Cơ chế nhân số lượng bản sao của gen HSP26 [22]. Phương pháp thay thế promoter điều khiển sự biểu hiện của gen bằng cách sử dụng một promoter mạnh hơn promoter của chủng bản đầu: Thay thế promoter 2 gen HSP26 và YHR087W bằng SPI1 và PGK1( Hình 3.1.8). Hình 3.1.8: Sơ đồ sự hình thành các chủng ICV16 (ICV27)-PPGK1-YHR087W. YHR087f và YHR087g là oligonucleotides được sử dụng để khuếch đại đoạn gen sau khi gắn promoter PGK1 vào vị trí SalI của plasmid pUG6. Các đầu 3’ của một nửa các oligonucleotide bắt cặp với trình tự của pUG6 nằm ở vị trí nucleotide thứ 10 ở đầu 5’ hay đầu 3’(tùy theo các oligonucleotide) của vị trí nối loxP[22]. 3.2. Kết quả của thao tác gen tác động lên mức độ biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W 3.2.1.Minh chứng sự biểu hiện của HSP26 dưới các điều kiện tác động nhiệt. Những qui luật biểu hiện của protein dẫn đến phương thức để chọn lọc một protein thiết lập rõ ràng điều kiện tăng trưởng và pha tăng trưởng để thu nhận tối đa lượng sinh khối.Trong những thí nghiệm trên chủng W303-1A, mang plasmid pL19, phát triển trong mơi trường YNB tại 28oC và xác định OD ở 570nm, sau đĩ được tăng lên 39oC trong 90 phút. Hình.3.2.1: Hsp26 biểu hiện trong các chủng khác nhau trước và sau khi sốc nhiệt. (A) nhuộm Coomassie blue- SDS-PAGE của protein tổng số biểu hiện từ các chủng nấm men trong quá trình tăng trưởng và sau khi nhiệt sốc. cột, L13 (hsp26) chủng phát triển ở 28°C; cột 2, L13 gia nhiệt đến 39°C trong 90 phút; ngõ 3, Oli H1 (HSP26) chủng phát triển ở 28°C; cột 4, Oli H1 gia nhiệt đến 39°C trong 90 phút; cột 5, W303-1A cĩ chứa một chủng bản sao nhiễm sắc thể của gen HSP26 và mang theo một plasmid bản sao pL19 với đoạn mã hĩa HSP26 phát triển ở 28°C; cột 6, W303-1A gia nhiệt lên 39°C trong 90 phút; P, đại diện cho trọng lượng marker phân tử: galactosidase (116 kDa), phosphorylase B (97,4 kDa), albumin từ huyết thanh trâu bị (66 kDa); ovoalbumin (45 kDa) và carbonic anhydrase(29 kDa). (B) phân tích Western-Blot sử dụng một kháng thể bắt nguồn từ tế bào khác chuyên biệt chống lại tác động của Hsp26 [17]. Dưới các điều kiện kiểm sốt, chủng L13, mang đoạn thiếu hụt trên bản sao nhiễm sắc thể của HSP26 và OliH1, chứa một nhiễm sắc thể của HSP26, và được biểu hiện trên mơi trường YNB. Một so sánh trên SDS-PAGE đã cung cấp tồn bộ protein của thành tế bào bao gồm các tế bào trước và sau khi tác động nhiệt( Hình 3.2.1A). Chủng W303-1A mang nhiều bản sao của plasmid đã thể hiện một protein lớn của khối lượng phân tử 26kDa khơng phụ thuộc vào pha phát triển ( Hình 3.2.1A cột 5 ,6). Dải polypeptide khơng được biểu hiện trên L13( hinh 1A,cột 1 và 2) cũng như là chủng Oli H1 ( hinh 3.2.1A, cột 3 và 4). Điều này chứng tỏ rằng mức độ biểu hiện của hsp26 dựa trên sự tác động của nhiệt độ. Để xác định mức độ biểu hiện của protein đoạn polypeptide, sau khi điện di protein được chuyển sang màng lọc nitrocellulose và biểu hiện bởi một kháng thể HSP26 chuyên biệt. Ngồi ra phân tích Western Blot cũng chỉ ra rằng HSP26 khơng được biểu hiện trên chủng L13 trước và sau khi shock nhiệt. Cũng như là các tế bào của Oli H1(Hình. 3.2.1B, cột 3),nhưng nĩ bị tác động tác động nhiệt (hình. 3.2.1B, cột 4),và nĩ được biểu hiện bởi các tế bào chứa các bản sao của plasmid (Hình. 3.2.1B, cột 5và 6). Những kết quả rõ ràng sự biểu hiện của protein như HSP26 và chỉ ra rằng sự gắn Hsp26 trong những bản sao của plasmid hướng đến sự điều chỉnh phiên mã của gen này [17]. 3.2.2 Ảnh hưởng của việc đưa gen HSP26 và YHR087W thành một plasmid multicopy dưới sự kiểm sốt của promoter của chúng. Hình 3.2.2: Ảnh hưởng của việc gắn gen HSP26 và YHR087W vào plasmid YEp352 trên gen biểu hiện và kháng stress.* chỉ ra rằng sự khác biệt giữa biến đổi gen và các chủng thuần được thống kê ý nghĩa theo phân tích ANOVA (P ≤ 0,05)[22]. Chủng nấm men ICV16 ura3-và ICV27 ura3- đã được thay plasmid YEp352, YEpHSP26 và YEpYHR087W. Xác định mức độ tác động trên cấp độ mRNA của những gen này, RNA được phân lập sau 2h phản ứng trong ethanol 10% hoặc glucose 25%. Các RNA được phân tích bởi Northern blot trong trường hợp của HSP26. Vì mức độ biểu hiện của YHR087W thấp nên sử dụng Real Time PCR để phát hiện và định lượng. Bảng A của hình. 2 trình bày các kết quả thu được trong các phân tích này. Ở nồng độ glucose 25% một sự biểu hiện quan trọng của gen HSP26 đã được tìm thấy trong cả hai chủng (gấp 5 đến 6 lần). Trong trường hợp stress ethanol, tăng gấp 4-5 lần so với các chủng cĩ chứa các vector trống đã được phát hiện cho HSP26 trong chủng ICV27 và cho YHR087W trong chủng ICV16. Xác định mức độ tác động trên cấp độ mRNA của những gen này, RNA được phân lập sau 2h phản ứng trong ethanol 10% hoặc glucose 25%. Các RNA được phân tích bởi Northern blot trong trường hợp của HSP26. Vì mức độ biểu hiện của YHR087W thấp nên sử dụng Real Time PCR để phát hiện và định lượng. Bảng A của hình.3.2.2 trình bày các kết quả thu được trong các phân tích này. Ở nồng độ glucose 25% một sự biểu hiện quan trọng của gen HSP26 đã được tìm thấy trong cả hai chủng (gấp 5 đến 6 lần). Trong trường hợp stress ethanol, tăng gấp 4-5 lần so với các chủng cĩ chứa các vector trống đã được phát hiện cho HSP26 trong chủng ICV27 và cho YHR087W trong chủng ICV16. Khả năng phản ứng với các điều kiện stress, khả năng tồn tại của các chủng theo các điều kiện đã được sử dụng cho việc phân tích RNA. Các dữ liệu được cung cấp trong hình.3.2.2 bảng B. Kết quả chỉ ra rằng đối với ICV16, YHR087W tăng khả năng kháng ethanol, trong khi đĩ HSP26 khơng ảnh hưởng đến khả năng sống. Đối với ICV27, khả năng tồn tại là cao trong hai biến đổi dưới các điều kiện stress. Tất cả những dữ liệu này chứng minh rằng một trong những thao tác nâng cao sức đề kháng stress, chủ yếu ở ICV27, các chủng cho thấy thiếu hụt trong quá trình lên men rượu và sức đề kháng kém đối với một số các điều kiện stress đặc thù (Zuzuarregui và del Olmo, 2004a)[22]. Những thao tác kỹ thuật này đã cung cấp một số thuận lợi trong phản ứng của các chủng trong điều lên men rượu. Kết quả thu được sau 27 ngày kể từ khi bắt đầu lên men rượu, và chỉ ra rằng chủng ICV27 khơng cĩ khả năng duy trì số lượng plasmid. Theo đĩ, chỉ những phương pháp lên men rượu tiến hành trên chủng ICV16 dưới một số nhiệt độ (16, 22, 30 ° C) và nồng độ đường (chứa 200-250g/l đường được bổ sung với 50 g / l của glucose ). Các kết quả thu được cho thấy mức độ tiêu thụ đường trong những phương pháp lên men rượu thực hiện tại 22°C trong hèm Sauvignon blanc (Requena, 2004) đã cao hơn trong nửa đầu của tiến trình trên chủng mang biểu hiện của YHR087W. 3.2.3 Hiệu quả của việc đưa gen HSP26 và YHR087W vào một centromeric plasmid dưới sự kiểm sốt của promoter nĩ. Để tăng tính ổn định plasmid trong chủng ICV27, các gen HSP26 và YHR087W đã được đưa vào centromeric plasmid pRS316, chứa URA3 marker. Chủng ICV27 ura3- biến đổi với các plasmid tương ứng, bao gồm vecto, để tạo nên các chủng ICV27/pRS316, ICV27/pRSHSP26 và ICV27 /pRSYHR087W. Hình 3.2.3 : Tác động của việc gắn HSP26 và YHR087W vào centromeric plasmid pRS316 lên chung ICV27 biểu hiện gen, stress thẩm thấu và khả năng lên men [22]. Phân tích Northern blot và RT-PCR cho thấy chỉ những thay đổi nhỏ hoặc khơng cĩ sự thay đổi trong cấp độ mRNA của những gen này trong các chủng biến đổi dưới điều kiện stress thẩm thấu gây ra bởi stress glucose 25% (Hình 3.2.3A). Mặc dù vậy, sức kháng của các chủng này với các điều kiện stress được tăng lên (Hình 3.2.3B). Việc cải tiến tính kháng stress với những thao tác này cĩ thể dẫn đến một thuận lợi thế trong khả năng lên men. Trong điều kiện lên men, plasmid mất đi khơng cao hơn 25%, dẫn tới plasmid này duy trì trạng thái cân bằng tốt hơn ở chủng này dưới điều kiện phát triển khơng chọn lọc tốt hơn so với các phiên bản bản sao. Khả năng lên men được phân tích bằng cách sử dụng hèm Macabeo (Requena, 2007 ) và theo các điều kiện giống như trong trường hợp của các chủng ICV16 với centromeric plasmid(plasmid mạch đơi DNA được tách từ nhiễm sắc thể của DNA). Theo bảng C trong Hình 3.2.3 cho thấy, sự biểu hiện của YHR087W trong các centromeric plasmid dẫn đến thời gian lên men giảm 37 ngày trong quá trình lên men thực hiện tại 22°C mà khơng bổ sung đường. Khi nồng độ glucose 50mg/l, quá trình lên men trong chủng đĩ cũng tiến hành nhanh hơn so với ban đầu. 3.2.4 Ảnh hưởng của sự thay thế promoter HSP26 hoặc YHR087W bằng promoter của gen SPI1. Hình 3.2.4: Sự thay thế thích hợp promoter của gen HSP26 và YHR087W trên chủng ICV16 và ICV27 bằng promoter SPI1 [22]. Những thay đổi các biểu hiện của gen HSP26 và YHR087W bao gồm sự thay thế một bản sao di truyền của promoter của một trong những gen này bằng promoter của gen SPI1, mà mã hĩa cho một protein thành tế bào chưa biết chức năng. Theo kết quả trước đây việc sử dụng các promoter này cho phép biểu hiện điều hịa stress của gen tiến tới đầu 3’. Hình 3.2.4A cho thấy rằng thao tác này với các gen HSP26, dẫn đến tăng biểu hiện của nĩ trong cả hai chủng trong khoảng 2-3 lần dưới điều kiện stress ethanol và thẩm thấu. Kết quả này tăng ổn định (khoảng 120%) trong khả năng tồn tại của các chủng biến đổi (Hình 3.2.4B). Với YHR087W, thao tác này cĩ tác dụng tích cực đáng kể đến sự biểu hiện gen theo điều kiện stress ethanol (đặc biệt là trong chủng ICV27), tăng ở một mức độ vừa phải dưới các điều kiện này. Đối với quá trình lên men (Hình 3.2.4C) trong chủng ICV16, thay thế các promoter của YHR087W, trong một bản sao di truyền của chúng bằng promoter của SPI1 đưa đến kết quả trong việc tiêu thụ lượng đường cao hơn trong suốt 8 ngày đầu tiên trong phương pháp lên men rượu thực hiện trong hèm Macabeo (Requena , 2007) cĩ chứa 200g/l đường[22]. 3.2.5 Ảnh hưởng của thay thế các promoter YHR087W bởi promoter của gen PPGK1 bởi một trong những bản sao di truyền của nĩ Cải thiện tập tính lên men , ảnh hưởng của việc thay thế promoter của gen YHR087W bởi một trong những bản sao di truyền của nĩ cho promoter của gen PGK1.Theo các điều kiện stress thử nghiệm (Hình 3.2.5A), sự biểu hiện của gen này tăng từ 10 đến 40 lần trong trường hợp của chủng ICV16 và 3-7 lần cho ICV27, mặc dù chỉ cĩ khả năng chống stress ethanol gia tăng trong cả hai chủng (với sự khác biệt ý nghĩa thống kê trong ICV16) với thao tác này (Hình 3.2.5B)[22]. Hình 3.2.5: Sự thay thế thích hợp promoter của HSP26 và YHR087W bằng PGK1 trên cả hai chủng ICV16 và ICV27 [22]. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN 4.1.Bàn luận Trong tất cả các bước sản xuất rượu vang, tế bào liên tục bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện stress như stress thẩm thấu, sự oxy hĩa, điều kiện pH thấp,thiếu chất dinh dưỡng, và stress ethanol. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các tế bào nấm men cĩ thể đáp ứng với những điều kiện bất lợi thơng qua những thay đổi trong biểu hiện của nhiều gen trong suốt tồn bộ quá trình lên men (Marks et al.., 2008; Mendes-Ferreira et al., 2007; Rossignol et al, 2003;). Bên cạnh đĩ, một số điểm tương quan giữa kháng stress, biểu hiện gen và phản ứng lên men đã cho thấy khả năng thích ứng với các điều kiện stress là một tiêu chí cho việc lựa chọn của nấm men rượu vang (Zuzuarregui và del Olmo, 2004a, b; Zuzuarregui et al., 2006)[19]. Sự biểu hện của gen chịu nhiều tác động của các yếu, các gen cĩ những chức năng riêng biệt và chịu trách nhiệm đảm nhận những qui luât quan trọng trong cơ chế đáp ứng các điều kiện stress của tế bào[18]. Sự hiểu biết tốt hơn về cơ chế phản ứng stress và một số kỹ thuật di truyền đã được thực hiện ở nấm men rượu vang với sức kháng được cải thiện đối với các điều kiện bất lợi xảy ra trong quá trình sản xuất rượu vang. Làm tăng tốc độ trong giai đoạn lên men tĩnh, nâng cao khả năng tồn tại trong điều kiện thiếu glucose[19]. Những biểu hiện của các nhân tố phiên mã Msn2p, tham gia vào phản ứng stress, cĩ thể được điều chỉnh để tạo sự cải tiến trong tính kháng stress và khả năng lên men (Cardona et al., 2007). Ảnh hưởng của các thao tác di truyền với một tác động nhỏ trong phiên mã nấm men, tập trung vào hai gen stress đặc biệt: HSP26 và YHR087W. Sử dụng kết hợp bốn phương thức khác nhau: sự biểu hiện trong espisomal plasmid hoặc centromeric plasmid dưới sự đối chứng của promoter của chúng và thay thế của các promoter của các gen này ở bản sao di truyền của chúng cho promoter của gen SPI1 hoặc PGK1. Những thác tác di truyền trên chủng ICV27 cĩ nhiều khĩ khăn, khơng thể duy trì được sự ổn định trong espisomal plasmid (khơng phải trên vector). Tuy nhiên, nĩ đã cĩ thể gắn và duy trì ổn định centromeric plasmid hoặc hiệu chỉnh trong bộ gen. Các thao tác di truyền dẫn đến tăng biểu hiện của các gen. Bên cạnh đĩ, các chủng biến đổi trong một số trường hợp cĩ nhiều khả năng chống lại các điều kiện bất lợi: stress thẩm thấu gây ra bởi nồng độ đường cao và stress ethanol. Một số chủng cĩ thể cải thiện khả năng lên men, và những tác động này phụ thuộc vào loại hèm tự nhiên được sử dụng, nhiệt độ tăng trưởng và nồng độ đường ban đầu. Vai trị quan trọng của gen YHR087W là cĩ khả năng chịu được nồng độ glucose cao và các điều kiện stress khác, và sự đột biến của nĩ cho thấy sự tăng trưởng bị bất hoạt trong mơi trường YPD chứa glucose 25%. Sự điều tiết phản ứng stress trong nấm men rượu vang ảnh hưởng đến khả năng lên men, nhưng rất khĩ để dự đốn tác động cụ thể vào từng trường hợp nên các nghiên cứu cần được thử nghiệm cẩn thận. Trong một số trường hợp các thao tác di truyền thực hiện dường như khơng mang lại kết quả ở điều kiện nồng độ đường cao hoặc khơng kể sức kháng với điều kiện stress này và khả năng lên men cải thiện được nhận thấy. Các kết quả này cĩ thể được giải thích bởi thời điểm phản ứng được quyết định của cảm ứng trong các điều kiện stress; như dưới điều kiện sốc nhiệt hoặc nồng độ glucose cao cảm ứng xảy ra rất nhanh chĩng và cấp độ sự biểu hiện ở cấp độ mRNA khoảng 2-6 lần giữa 30 phút và 2h sau khi tác động những điều kiện bất lợi (Gasch et al., 2000; Kaeberlein et al, 2002.), đây là thời gian được xem xét trong các thí nghiệm. Việc cải tiến được tìm thấy trong phương pháp lên men rượu cĩ thể được giải thích bởi rất nhiều điều kiện stress diễn ra đồng thời hoặc theo một trình tự. Mặt khác, khi promoter YHR087W được thay thế bằng promoter của SPI1 và thí nghiệm trong mơi trường chứa 25% glucose, khơng cĩ sự gia tăng cấp độ mRNA nào được tìm thấy trong bất kỳ chủng nào. Cuối cùng, trong các thao tác khác (ví dụ, trong biểu hiện của HSP26 ở espisomal plasmid trong chủng ICV16 hoặc trong centromeric plasmid trong chủng ICV27), các cấp độ mRNA tăng nhưng khả năng tồn tại trong điều kiện stress đặc biệt là khơng được cải thiện, cho thấy rằng các thao tác của một gen cụ thể là khơng đủ để cĩ được một hiệu ứng tích cực trong tính năng này. Điều thú vị, khi các promoter PGK1 được xem xét, sự biểu hiện của YHR087W tăng lên, nhưng điều này đã khơng mang lại bất cứ cải tiến trong khả năng lên men, cĩ lẽ vì sự thiếu kiểm sốt thời gian chính xác trong biểu hiện trong suốt quá trình lên men. Theo đĩ, việc sử dụng điều hịa của một promoter mạnh với các biểu hiện thấp hơn ở những giai đoạn thuận lợi của quá trình, như PGK1, khơng thích hợp để thay đổi các cấp độ mRNA của gen stress với mục đích cải thiện khả năng lên men. Mặc dù cĩ nhiều thí nghiệm đạt được một sự hiểu biết tốt hơn về cách cải thiện khả năng lên men trên cơ sở biểu hiện các thao tác trên gen kháng stress. Bên cạnh đĩ, cũng đã cung cấp một số hướng đi thú vị, trong đĩ cĩ sự liên quan của việc sử dụng các promoter SPI1 cho việc kiểm sốt sự biểu hiện của gen stress . 4.2 Hướng phát triển. 4.2.1 Phát triển dựa trên các phương pháp kiểm sốt tối ưu điều kiện lên men. Quá trình lên men rượu là một quá trình phức tạp địi hỏi, yêu cầu kỹ thuật của người sản xuất cao. Trong bài báo cáo này đã đề cấp tới những yếu tố thiết yếu ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình lên men đặc biệt là : theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của nấm men saccharomyces cerevisiea qua từng giai đoạn của quá trình lên men, những tác động ảnh hưởng đến chất lượng rượu và khả năng lên men của nấm men dưới các điều kiện ảnh hưởng. Những kết quả thu được phần nào đánh giá được tầm quan trọng của việc kiểm sốt các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình lên men. Đồng thời bên cạnh đĩ cịn mở ra hướng phát triển để cải thiện kỹ thuật lên men rượu. Kiểm sốt quá trình sản xuất để tạo ra hàm lượng ethanol là tối ưu, bên cạnh đĩ là chất lượng của rượu thành phẩm. Do đĩ phương pháp kiểm sốt tối ưu các điều kiện lên men trở nên hữu hiệu vì cĩ nhiều ưu điểm như : khơng sử dụng máy mĩc trang thiết bị đắt tiền,dễ dàng thực hiện, việc tiến hành các thí nghiệm để tối ưu điều kiện lên men nhanh. 4.2.2 Phát triển dựa trên việc cải tiến hệ gen của chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae. Sự cải tiến hệ gen của nấm men là một quá trình nghiên cứu lâu dài, liên quan tới nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng lên men của chủng nấm men. Những kết quả thu được trên 2 gen HSP26 và YHR087W đã cho thấy một bước tiến quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử. Việc cải thiện khả năng lên men, khả năng kháng các điều kiện bất lợi đối với nấm men đã chỉ ra rằng kỹ thuật di truyền trên các đoạn gen qui định những tính chất trên đã mang lại hiệu quả. Bên cạnh đĩ nguồn gen được di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, vì vậy trở thành một điểm lợi thế mà kỹ thuật kiểm sốt tối ưu các điều kiện lên men khơng cĩ được. Phương pháp này cĩ nhiều ưu điểm vượt trội: Tạo được chủng nấm men saccharomyces cerevisiae cĩ khả năng lên men tạo ethanol ở nồng độ cao, cải thiện khả năng lên men, chịu được các điều kiện cực đoan của mơi trường( áp thẩm thấu, các acid hữu cơ, nhiệt độ…). Mặc dù, phương pháp này địi hỏi kỹ thuật cao, người kỹ sư phải cĩ kiến thức chuyên mơn về lĩnh vực sinh học phân. Trên đây là hai hướng phát triển, tùy theo yêu cầu và mục đích mà người kỹ sư cĩ lựa chọn hợp lý. Hiện nay trên thế giới việc cải tiến hệ gen ngày càng được phát triển vì nĩ mang lại lợi ích lâu dài cho cơng nghệ sản xuất rượu vang, tế bào nấm men cĩ khả năng chịu được các điều kiện bất lợi mà vẫn tạo ra những sản phẩm rượu vang chất lượng. Vì vậy ở Việt Nam việc cải tiến hệ gen của nấm men là một bước tiến quan trọng và cấp thiết để tạo ra những giống nấm men đạt được yêu cầu trong sản xuất rượu vang, bên cạnh đĩ phát triển được ngành cơng nghệ sinh học nước nhà đặc biệt là lĩnh vực sinh học phân tử. Tài liệu tham khảo: Tài liệu trong nước: [1] Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành.,2009. Cơng nghệ sinh học tập 5: Cơng nghệ vi sinh và mơi trường. Nhà xuất bản Giáo Dục.176 trang. [2] Bùi Ái.2002. Cơng nghệ lên men ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM. trang. [3] Lê Văn Việt Mẫn, Nguyễn Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tơn Nữ Minh Nguyệt, Trần Thị Thu Trà.,2010. Cơng nghệ chế biến thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.1019 trang. [4] Ngơ Thị Phương Dung,2009. Khảo sát khả năng lên men và tính chịu cồn của nấm men. Tạp chí Khoa học, 11:374-382. [5] Nguyễn Quang Vinh., 2005. Nghiên cứu chế biến rượu vang từ nếp than. Luận văn Thạc sĩ, Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. Tài liệu nước ngồi: [6] Ian Hornsey., 2007. The Chemistry and Biology of Winemaking. The Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 0WF, UK. 472. [7] Henry C. Vogel, Celeste L. Todaro., 1997. Fermentation and Biochemical Engineering Handbook(1st Edition). Noyes Publications, Park Ridge, New Jeesy,USA. 439. [8] L. Cocolin and D. Ercolini.,2008. Molecular Techniques in the Microbial Ecology of Fermented Foods. Springer Science and Business Media, 233 Spring Street,NY, USA. 280. [9] Mĩnica Herrero, Luis A. García, and Mario díaz., 2005. The Effect of SO2 on the Production of Ethanol, Acetaldehyde,Organic Acids, and Flavor Volatiles during Industrial Cider Fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemitry, 51: 3455-3459. [10] María Jesus Torija, Gemma Beltran, Maite Novo, Montse Poblet, Nicolas Rozès, Albert Mas, and José Manuel Guillamĩn., 2003. Effect of Organic Acids and Nitrogen Source on Alcoholic Fermentation: Study of Their Buffering Capacity. Journal of Agricultural and Food Chemitry, 51:916-922. [11] Josep M. Llauradoa, Nicolas Rozés, Magda Constantia, and Alberto Mas., 2005. Study of Some Saccharomyces cerevisiae Strains for Winemaking after Preadaptation at Low Temperatures. Journal of Agricultural and Food Chemitry, 53:1003-1011. [12] Trong Khoa Pham, Poh Kuan Chong, Chee Sian Gan, and Phillip C. Wright., 2006. Proteomic Analysis of Saccharomyces cerevisiae under High Gravity Fermentation Conditions. Journal of Proteome Research,5 : 3411-3419. [13] Jaime Aguilera, Thomas Petit, Johannes H. de Winde, Jack T. Pronk., 2005. Physiological and genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae to high carbon dioxide concentrations. FEMS Yeast Research, 5:579-593. [14] Leilah E. Backhus, Joseph DeRisi, Patrick O. Brown, Linda F. Bisson.,2001. Functional genomic analysis of a commercial wine strain of Saccharomyces cerevisiae under differing nitrogen conditions. FEMS Yeast Research, 1:111-125. [15] Francisco J. Pizarro, Michael C. Jewett, Jens Nielsen,and Eduardo Agosin., 2008. Growth Temperature Exerts Differential Physiological and Transcriptional Responses in Laboratory and Wine Strains of Saccharomyces cerevisiae. Applied and Environmental Microbiology, 74:6358–6368. [16] Ronald E. Susek and Susan L. Lindquist.,1989. hsp26 of Saccharomyces cerevisiae Is Related to the Superfamily of Small Heat Shock Proteins but Is without a Demonstrable Function. Molecular And Cellular Biology,9:5265-5271 [17] Renato Marins Ferreira, Leonardo Rodrigues de Andrade, Márcio Barros Dutra, Marcos Farina de Souza, Vânia Margaret Flosi Paschoalin, Joab Trajano Silva.,2006. Purification and characterization of the chaperone-like Hsp26 from Saccharomyces cerevisiae. Protein Expression and Purification, 47:384-392. [18] H. Alexandre, V. Ansanay-Galeote, S. Dequin, B. Blondin., 2001. Global gene expression during short-term ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters, 498:98-103. [19] Takayuki Homma, Hitoshi Iwahashi, and Yasuhiko Komatsu.,2003. Yeast gene expression during growth at low temperature. Cryobiology, 46:230–237. [20] A. Mendes-Ferreira, M. del Olmo,J. García-Martínez, E. Jiménez-Martí,C. Lễo, A. Mendes-Faia, and J. E. Pérez-Ortín., 2007. Saccharomyces cerevisiae Signature Genes for Predicting Nitrogen Deficiency during Alcoholic Fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 73:5363-5369. [21] Elke Nevoigt.,2008. Progress in Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews,72:379–412. [22] E. Jiménez-Martí, A. Zuzuarregui, I. Ridaura, N. Lozano, M. del Olmo., 2009. Genetic manipulation of HSP26 and YHR087W stress genes may improve fermentative behaviour in wine yeasts under vinification conditions. International Journal of Food Microbiology, 130:122–130. [23] Thusnelda Stromer, Elke Fischer, Klaus Richter, Martin Haslbeck, and Johannes Buchner., 2004. Analysis of the regulation of the molecular chaperone hsp26 by temperature-induced dissociation: the n-terminal domain is important for oligomer assembly and the binding of unfolding proteins. The Journal Of Biological Chemistry. 279:11222–11228. [24] Jin Chen., 2010.Regions Outside the α-Crystallin Domain of the Small Heat Shock Protein Hsp26 Are Required for Its Dimerization. J. Mol. Biol, 398:122–131. [25] Titus M. Franzmann et al, 2005. The Activation Mechanism of Hsp26 does not Require Dissociation of the Oligomer. J. Mol. Biol, 350:1083–1093. [26]S. Rahaie, Z. Emam-Djomeh, S. H. Razavi, M. Mazaheri., 2010. Immobilized Saccharomyces Cerevisiae as a potential aflatoxin decontaminating agent in pistachio nuts. Brazilian Journal of Microbiology, 41:82-90. [27] Mee-Jung Han et al, 2008. Microbial small heat shock proteins and their use in biotechnology. Biotechnology Advances, 26:591–609 [28] Ma. Jesús Torija, Nicolas Rozès, Montse Poblet,José Manuel Guillamĩn, Albert Mas., 2003. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 80: 47– 53. Tài liệu Internet: [29] [30] [31] www.yeastgenome.org PHỤ LỤC MƠI TRƯỜNG SỬ DỤNG TRONG CÁC NGHIÊN CỨU Mơi trường YPD [19]: -1% (w/v) dịch chiết nấm men ( Yeast extract). -2% (w/v) Polypeptone. -2% (w/v) Dextrose. Mơi trường YNB [17]: Yeast Nitrogen Base: -0,67% (w/v) Nguồn Nito nấm men khơng chứacác amino acid( Hãng Difco cung cấp). -2% (w/v) glucose. - Các chất dinh dưỡng cần thiết.