Đồ án Phân lập, tuyển chọn và đánh giá một số đặc tính của một số chủng lactobacillus trên cá chim vây vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng 7 năm 2011 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và môi trường, trường Đại học Nha Trang đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên lớp 49SH, cùng toàn thể các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 6 năm 2011 Sinh viên Lê Thanh Huân MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC 45 Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 52 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Cá chim vây vàng 14 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC 45 Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC 46 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C 47 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X 47 Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 48 Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C 49 Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X 49 Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 50 Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 51 Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 51 Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 nm của chủng L1.2 53 Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 của chủng L1.3 53 Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 55 Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD600 nm. 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 57 Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3 58 KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, nghành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang phát triển nhanh chóng. Theo công bố của FAO năm 2006, tổng sản lượng nuôi trồng thủy sản của Việt Nam là 1,67 triệu tấn, xếp vị trí thứ 6 Châu Á. Hiện nay đối tượng nuôi trồng chủ yếu là các loài thủy hải sản nước mặn như: cá mú (Epinephelus spp), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcariper), cá cam (Seriola spp), cá hồng (Lutijanus erythropterus), cá chim (Trachinotus blochii), ốc hương (Babylonia areolata), vẹm xanh (Perna viridis), tôm sú (Penaeus monodon),... trong đó đối tượng nuôi mới là cá chim vây vàng đang được chú ý phát triển nuôi bởi vì thịt cá thơm ngon hấp dẫn, hàm lượng dinh dưỡng cao, rất được ưa chuộng. Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) là loài phân bố tương đối rộng ở vùng biển nhiệt đới, Tây Thái Bình Dương, Nhật Bản, Đài Loan, Indonesia, miền Nam Trung Quốc. Nước ta cá phân bố chủ yếu ở vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ. Cá có kích cỡ thương mại 0,8 -1 kg/con, giá trị kinh tế cao với giá bán 100.000 VNĐ/kg, thị trường xuất khẩu: Nhật Bản, Đài Loan, Trung Quốc, Hồng Kông, Mỹ, Singapore. Đây là một đối tượng nuôi mới ở Việt Nam, chưa được nghiên cứu nhiều nên người nuôi vẫn gặp khó khăn do tỷ lệ cá chết cao, sức chống chọi trước các điều kiện bất lợi của môi trường và các vi khuẩn gây bệnh còn thấp đặc biệt là các bệnh do Vibrio gây ra. Để khắc phục tình trạng này, người nuôi đã dùng các loại hóa chất khử trùng, các chất kháng sinh phòng bệnh. Tuy nhiên hiệu quả của các phương pháp này không cao, ngược lại còn gây ảnh hưởng đến môi trường, nguy hiểm hơn nếu lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây ra tồn dư kháng sinh và hiện tượng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản. Vì vậy, việc tìm ra một giải pháp thích hợp để giải quyết vấn đề này là rất quan trọng. Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học có chứa những vi sinh vật mang những đặc tính: đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, sinh các enzyme tiêu hóa, phân hủy các chất hữu cơ thừa …đã được áp dụng. Các chế phẩm sinh học không những tăng khả năng sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho vật nuôi mà còn hạn chế được tối đa khả năng sử dụng kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh thủy sản. Nhiều nhóm vi sinh vật mang các đặc tính probioic đã được áp dụng, trong đó có nhóm vi khuẩn Lactobacillus. Với lí do như vậy nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và đánh giá tiềm năng probiotic của các chủng Lactobacillus phân lập trên Cá Chim vây vàng” Mục tiêu của đề tài là phân lập, tuyển chọn một số chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio để bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi cá chim vây vàng nhằm mục đích tăng tốc độ tăng trưởng, khả năng kháng bệnh, đảm bảo sự phát triển bền vững của nghề nuôi cá chim vây vàng. Các nội dung nghiên cứu của đề tài: Phân lập các chủng Lactobacillus và Vibrio trong ruột cá chim vây vàng. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng Lactobacillus. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hơp cho các chủng Lactobacillus.Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan về probiotic 1.1.1. Giới thiệu vê Probiotics Theo Tổ chức nông nghiệp và lương thực của Liên hợp quốc (FAO) “Probiotic là những vi sinh vật sống, nếu được bổ sung với liều lượng hợp lý sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ”. Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908). Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ con người. Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phòng bệnh cho người và vật nuôi. Chế phẩm probiotic đang được sử dụng như một loại thuốc để phòng và điều trị bệnh cho người và vật nuôi. Các nghiên cứu cho thấy chế phẩm này mang lại nhiều lợi ích cho đường ruột như: cân bằng hệ vi sinh vật khu trú trong đường ruột, kích thích tiêu hóa, tăng khả năng miễn dịch và phòng ngừa nhiễm trùng cho cơ thể. Ngoài ra, chế phẩm probiotic sử dụng trong y học còn có khả năng giảm viêm, giảm cholesteron, tăng quá trình hấp thu khoáng, ngăn ngừa sự phát triển vi khuẩn gây bệnh viêm ruột, điều hoà trường hợp không dung nạp lactose và đề phòng được ung thư kết tràng…. Một số chủng vi sinh vật đã được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho người như: Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus johnsonii, Bacillus subtilis… Nhiều chủng vi khuẩn cũng được sử dụng để sản xuất ra các chế phẩm ứng dụng rất hiệu quả nhằm kiểm soát côn trùng gây hại cho cây trồng như vi khuẩn Bacillus thuringiensis, nấm Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae, virus NPV.v.v. Ngoài ra các chế phẩm vi sinh còn được sử dụng để làm phân bón vi sinh nhằm phân giải các chất hữu cơ làm giàu cho đất, phân giải lân khó tiêu thành lân dễ tiêu để cây trồng hấp thu được. Các chế phẩm vi sinh sử dụng trong các hệ thống xử lý rác thải và nước thải, làm sạch dầu mỏ trong các vụ tràn dầu. Mặc dù vậy, việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) vẫn còn khá mới mẻ, mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây. Đối với mỗi loài thủy sản khác nhau cần có chế phẩm probiotic với những chủng vi sinh vật thích hợp riêng. Phương thức sử dụng chủ yếu là bổ sung trực tiếp vào thức ăn hoặc thêm vào môi trường nước nuôi. Nhiều nhà nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấy chế phẩm Probiotic đã tạo ra những thay đổi đáng kể về khu hệ vi sinh trong đường ruột theo hướng cân bằng có lợi trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số lượng các vi sinh vật có khả năng gây bệnh như E.coli, Samomella, Listeria…giảm mạnh. Những phát hiện mới về khả năng tăng cường miễn dịch, điều chỉnh những sai lệch bất lợi ở hệ vi sinh vật đường ruột do bênh nhiễm khuẩn, virus, dị ứng thức ăn đang mở ra triển vọng áp dụng chế phẩm này trong nuôi trồng thủy sản, cân bằng sinh thái và bảo vệ môi trường. * Thành phần chế phẩm probiotic Vi sinh vật trong chế phẩm Probiotic thường gồm 4 nhóm sau: - Nhóm vi khuẩn lactic: Thường chọn các chủng vi khuẩn lactic điển hình thuộc giống Lactobacillus (Lactobacillus acidophillus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei …). Trong hoạt động sống vi khuẩn lactic chuyển đường thành axit lactic, ngoài ra nó có thể sinh ra Baterioxin – một loại hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn và có phổ ức chế vi sinh vật khá rộng. Loại chất kháng sinh này không gây ra tính kháng kháng sinh ở các vi khuẩn gây bệnh. Axit lactic và Bacterioxin có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh, giải độc cho đường ruột. - Nhóm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: Chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính α amylase và protease. Các chủng này không gây độc, gây bệnh cho người và vật nuôi. Nhóm vi khuẩn này có tác dụng phân giải các hợp chất hữu cơ bị ô nhiễm trong môi trường. Thường chọn các chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus (Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus lichenifomis,… ). Ngoài khả năng sinh α amylase và protease chúng còn sinh ra Bacterioxin. Các vi khuẩn này chủ yếu tham gia vào quá trình làm sạch môi trường và tham gia vào quá trình đấu tranh sinh học, ức chế vi khuẩn gây bệnh, hạn chế dịch bệnh cho vật nuôi. - Nhóm vi khuẩn quang tự dưỡng ( Photoautotrop): Gồm các vi khuẩn tía và vi khuẩn không tía có khả năng đồng hóa H2S và CO2 để xây dựng tế bào và không sinh ra O2. Trong khi phân hủy H2S hoặc muối sulfua kim loại gây ra, làm giảm tính độc cho môi trường. Khi cho thêm vi khuẩn quang tự dưỡng vào thức ăn hoặc môi trường nước nuôi có thể loại bỏ nhanh chóng NH3, H2S, axit hữu cơ, những chất có hại, cân bằng pH, cải thiện chất lượng nước. - Nhóm nấm men: Gồm một số loài thuộc giống Sacaromyces, sử dụng nấm men sẽ có tác dụng tận dụng lượng đường được tạo thành trong môi trường nước để lên men rượu nhẹ, hạn chế dinh dưỡng của các loại vi sinh vật gây bệnh khác, cải thiện mùi và màu của nước. 1.1.2. Cơ chế tác động của probiotic 1.1.2.1. Sản sinh ra các chất ức chế Các vi khuẩn probiotic sinh các chất ức chế: bacteriocin, siderophores, lysozym, protease, H2O2, các axit hữu cơ, amoni, diaxetyl…các chất này được sinh ra bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi sẽ có tác dụng ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hại khác. (Saurabh S, Choudhary AK và Sushma GS, 2005).Ví dụ: Lactobacillus sp sản sinh ra bacteriocin là chất ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn gây bệnh. Alteromonas sp dòng B-10-31 sản sinh monostatin làm ức chế hoạt tính protease của Aermonas hydrophyla và Vibrio anguillarum. 1.1.2.2. Cạnh tranh cơ chất, năng lượng với những vi khuẩn khác Cạnh tranh dinh dưỡng của các vi sinh vật probiotic có vai trò quan trọng trong việc đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật bên trong đường ruột và bên ngoài môi trường nuôi. Probiotic có khả năng cạnh tranh về mặt dinh dưỡng đối với các vi khuẩn lây bệnh và sẽ hạn chế được sự phát triển, lây lan của các chủng vi sinh vật đó. Vi khuẩn có hại bị loại bỏ có nghĩa là loại bỏ được đối thủ cạnh tranh chất dinh dưỡng và năng lượng dùng cho vi khuẩn probiotic và cho vật chủ. Ví dụ: sự hấp thụ các monosaccarit của các vi sinh vật probiotic có thể làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile gây ra bệnh tiêu chảy trên vật nuôi bởi vì sự phát triển của Clostridium difficile phụ thuộc vào các monosaccarit (Kenneth, H.Wilson và Fulvio Periniz, 1998). Ngoài ra các vi khuẩn sinh siderophore được sử dụng làm probiotic để cạnh tranh Fe với các vi khuẩn gây hại. Vì siderophore là chất có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng gắn với các ion Fe. Siderophore có thể hoà tan Fe kết tủa thành dạng dễ sử dụng cho vi sinh vật, do đó nó là công cụ thu lượm Fe trong môi trường. 1.1.2.3. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh Cạnh tranh vị trí bám dính trên đường ruột là một tiêu chí quan trọng để dánh giá hiệu quả của vi sinh vật probiotic (Ringo E và Gatesoupe FJ, 1998). Vi khuẩn probiotic cạnh tranh vị trí bám dính trên thành ruột hay trên các biểu mô khác có vai trò ngăn cản sự khu trú và phát triển của các vi khuẩn gây bệnh .Người ta đã chứng minh khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt ruột của Lactobacillus GG và Lactobacillus plantarum 299V để ngăn cản sự phát triển và lây lan của vi khuẩn Escherichia coli 0157H7 gây bệnh tiêu chảy ở người và động vật nuôi (Mack DR, Michail S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA, 1999). Ngoài ra một số vi khuẩn thuộc giống Lactobacillus cũng được biết có thể khóa chặt các thụ thể bề mặt trong đường ruột để hạn chế được sự bám dính của các vi sinh vật gây bệnh khác. (Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL, 1994 ). 1.1.2.4. Tăng cường đáp ứng miễn dịch Chế phẩm probiotic có tác động tích cực lên hệ thống miễn dịch của cơ thể. Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic có khả năng tăng cường quá trình sản xuất các kháng thể và giải phóng cytokin gây ra đáp ứng miễn dịch cho cơ thể. (Jon A. Vanderhoof, M.D., Series Editor, 2005). Probiotic còn tác động lên các tế bào tua, từ đó cảm ứng tế bào limpho T  để dung nạp/điều hòa và kích thích các đáp ứng miễn dịch. Ngoài ra, kháng nguyên của vi khuẩn probiotic kích thích tế bào niêm mạc ruột sản sinh kháng thể chống lại tác nhân gây bệnh, các chhất ức chế của probiotic tiếp tục nâng cao hiệu quả kháng thể của vật chủ. Người ta thấy rằng bổ sung vi khuẩn lactic làm tăng khả năng chống lại bệnh truyền nhiễm đường ruột. Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy probiotic có ảnh hưởng quan trọng đối với các đáp ứng miễn dịch thích ứng ở những bệnh như dị ứng sữa bò ở trẻ em, viêm khớp tự miễn ở người lớn. 1.1.2.5. Cải thiện chất lượng nước Chế phẩm probiotic giúp giảm nồng độ các chất hữu cơ trong nước, giảm hàm lượng BOD, giảm độc do amoni, nitrat và khí hydrosunfua, khống chế được vi khuẩn gây bệnh. Các vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có thể cải thiện chất lượng nước bởi chúng có thể sử dụng các chất hữu cơ dư thừa hoặc các chất khí như H2S để làm chất dinh dưỡng thông qua các enzyme ngoại bào. (Prieur và cộng sự,1990). 1.1.3. Ứng dụng của probiotic 1.1.3.1. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong y học, trong trồng trọt, trong bảo vệ môi trường. - Trong y học: các chế phẩm probiotic khi được bổ sung vào đường ruột sẽ giúp làm sạch đường ruột, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh vật trong đường ruột, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạt động tốt hơn, tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Ngoài ra, các hoạt chất sinh học từ chế phẩm probiotic như axit amin, các enzyme, các nucleotit, các axit nucleic, các vitamin, đặc biệt là biotin có tác dụng tăng các quá trình chuyển hóa của tế bào, kích thích và tăng cường khả năng miễn dịch, tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của các vi khuẩn có hại. - Trong trồng trọt: Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng (bao gồm cây lương thực, cây ăn quả, cây hoa màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2004). Những nghiên cứu về tác dụng của probiotic với cây trồng cho thấy chúng có thể: + kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả, + cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh, + tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng và kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống, làm cho hoa trái tươi lâu. Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ. Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005). - Trong bảo vệ môi trường: Do có tác dụng tiêu diệt các vi sinh vật gây thối (sinh ra các loại khí H2S, SO2, NH3…) nên khi phun chế phẩm probiotic vào rác thải, cống rãnh, chuồng trại chăn nuôi…sẽ khử mùi hôi một cách nhanh chóng. Đồng thời số lượng ruồi, muỗi, ve, các loại côn trùng bay khác giảm hẳn số lượng. Rác hữu cơ được xử lý EM chỉ sau một ngày có thể hết mùi và tốc độ mùn hoá diễn ra rất nhanh. Trong các kho bảo quản nông sản, sử dụng EM có tác dụng ngăn chặn được quá trình gây thối, mốc. Các nghiên cứu cho biết chế phẩm EM có thể giúp cho hệ vi sinh vật tiết ra các enzym phân huỷ như lignin peroxidase, enzyme amylase, protease, cellulase và đặc biệt là cellulase, hemicellulase. Các enzym này có khả năng phân huỷ các hoá chất nông nghiệp tồn dư, thậm chí cả dioxin. Ở Belarus, việc sử dụng EM liên tục có thể loại trừ ô nhiễm phóng xạ (Teruo Higa, 2002). 1.1.3.2. Ứng dụng của chế phẩm Probiotic trong nuôi trồng thủy sản Mặc dù chế phẩm probiotic mới được ứng dụng vào nuôi trồng thủy sản trong thời gian 10 năm trở lại đây nhưng hiệu quả của chế phẩm này là rất to lớn. Hiện nay các loài vi sinh vật: Bacillus, Lactobacilus, nhóm vi khuẩn quang dưỡng… được sử dụng chủ yếu để sản xuất các chế phẩm này. Những nghiên cứu cho thấy rằng các loài vi khuẩn này đều không độc hại, dễ nuôi cấy, dễ tồn tại trong môi trường nước. Cải thiện môi trường nước nuôi: Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước nuôi thủy sản có tác dụng cải thiện chất lượng nước. Trong nuôi trồng thủy sản, lượng thức ăn dư thừa do động vật thủy sản hấp thụ không hết chiếm số lượng rất lớn, đây là nguyên nhân chính gây ô nhiễm môi trường nước. Đặc biêt trong nuôi tôm, tôm chỉ hấp thụ được dưới 1/3 tổng lượng dinh dưỡng đầu tư vào ao nuôi (Briggs và Funge-Smith, 1994) và phần còn lại bị mất vào hệ thống ao nuôi (Wu, 1995 và Piedrahita, 2003). Hơn nữa, các chất bài tiết từ các loài thủy sinh vào môi trường nước chiếm khoảng 70 – 80% lượng protein chúng đã tiêu hóa, phần lớn trong số đó (80%) ở dưới dạng dễ hòa tan trong nước, đặc biệt là ammoniac (Porter và cộng sự, 1987). Các chất thải này, bao gồm thức ăn dư thừa và các sản phẩm bài tiết, có thể phì nhưỡng cho ao nuôi và kết quả là sự phát triển bùng nổ của tảo độc cũng như gây ra hiện tượng thiếu ô-xy trong nước. Chế phẩm probiotic được bổ sung vào môi trường nước có chưa các vi khuẩn có khả năng sinh ra các enzyme ngoại bào như protease, amylase có thể phân giải các chất hữu cơ và các chất bài tiết thành CO2 và nước, chuyển các chất độc hại như NH3, H2S, NO2 - thành các chất không độc như NO3-, NH4+, giúp giảm mùi hôi của môi trường nước, ổn định pH và màu nước ao (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005). Các chủng vi sinh thường được sử dụng để thực hiện chức năng này gồm Bacillus sp, Nitrosomonas, Nitrobacter.. như vậy các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic co tác dụng - Làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá. - Giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên. Nhiều loại chế phẩm vi sinh được sử dụng để cải thiện môi trường nước nuôi trồng thủy sản như: chế phẩm EM, BIOnAQUA 1-MV( công ty Mai Việt), BZT® Aquaculture (USA), BIO II (Võ Thị Hạnh và cộng sự, 2005).… Tăng tốc độ sinh trưởng, khả năng kháng bệnh cho đối tượng nuôi: Nghề nuôi trồng thủy sản đang đối mặt với các loại bệnh dịch, nguyên nhân chủ yếu là do các loại vi khuẩn Aeromonas.sp, Pseodomonas.sp, Vibrio sp. Tuy nhiên , chúng ta hạn chế sử dụng kháng sinh để phòng bênh nên chế phẩm probiotic có vai trò vô cùng quan trọng. Hiện nay trong nuôi trồng thủy sản cũng phân lập được nhiều loại probiotic như Carnobacterium piscicola (Hius, 1984), Lactobacillus plantarum (Schroder, 1984), Pediococcus acidilactici (Pucci, 1988 ). Các chủng vi sinh vật có thể cạnh tranh vị trí bám dính và dinh dưỡng bên trong đường ruột nhờ khả năng chịu mặn, chịu kiềm, chịu axit của đường ruột. Bên cạnh đó, các chủng probiotic này càng được chú ý hơn nhờ khả năng sinh ra các chất ức chế (bacteriocins, sideropheres, lysozymes, hydrogen peroxides..) và tổng hợp được các hợp chất kháng sinh tương ứng như: piscicolin, plantarin, pediococin (PA - 1) có tính sát khuẩn cao, đặc biệt đối với vi khuẩn gây bệnh như: Listeria monocytogenes (Pucci, 1988), Shigella spp. và Salmonella spp… Vì vậy khi bổ sung chế phẩm probiotic có chứa các vi sinh vật này vào thức ăn sẽ kìm hãm sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh, đảm bảo sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột tôm cá, giúp đối tượng nuôi tăng trưởng và phát triển tốt, chống chọi được với các loại bênh dịch. Sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản sẽ hạn chế dùng một lượng lớn chất kháng sinh và hóa chất vào ao nuôi thủy sản. Đặc biệt là hạn chế đáng kể khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn có hại trên đối tượng nuôi đây là biện pháp tăng hiệu quả sản xuất có ý nghĩa thực tiễn (Xiang-Hong và cộng sự, 1998). Bên cạnh đó chế phẩm probiotic sẽ giúp tôm cá sinh trưởng mạnh hơn do các vi khuẩn trong chế phẩm probiotic chính là nguồn cung cấp các enzyme tiêu hóa, một số vitamin và axit béo có tác động tích cực đến quá trình chuyển hóa của cá tôm. (Sakata, 1990). Nhờ đó tôm cá sẽ hấp thụ thức ăn tốt hơn, có sức chống chịu với các điều kiện môi trường, tăng sức đề kháng. Ngoài ra, chế phẩm probiotic còn được biết với khả năng kháng virus. Một số nghiên cứu cho thấy các chủng vi sinh vật trong chế phẩm probiotic có khả năng kháng một số tác nhân virus gây bệnh trên động vật thủy sản, trong đó khả năng kháng virus gây bệnh trên trên tôm sú như IHNV (Kamei và cộng sự, 1988) và OMV (Direkbusarakom và cộng sự, 1998). Như vậy, chế phẩm probiotic còn có thể giúp cho nuôi trồng thủy sản chống chọi với tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất là virus. Đây có thể là một ưu thế lớn cho việc sử dụng chế phẩm probiotic vào nuôi trồng thủy sản trong tương lại. 1.1.4. Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics. Quy trình tạo chế phẩm probiotic : Chủng giống Nguyên liệu Nhân giống Lên men Sinh khối Chế phẩm dạng dịch Chất phụ gia Chế phẩm dạng bột 1.1.4.1. Nguyên liệu Môi trường dùng để nuôi thu sinh khối vi khuẩn cần đảm bảo đủ thành phần chất dinh dưỡng, khoáng, chất kích thích sinh trưởng, VTM. Và một yêu cầu đối với nguyên liệu dùng để sản xuất công nghiệp là nguyên liệu phải rẻ tiền, dễ kiếm. Đối với chủng giống vi sinh vật, cần lựa chọn những chủng có đầy đủ các đặc tính mà ta cần để sản xuất chế phẩm mà ta mong muốn. 1.1.4.2. Nhân giống Chủng giống được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4oC. Vì vậy, khi sử dụng ta cần hoạt hóa giống, bằng cách cấy chuyền sang ống thạch nghiêng, đặt trong tủ ấm 320 sau 24-48h. Nhân giống cấp1: Chủng sau khi phát triển tốt trong ống thạch nghiêng được cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS, LB, EB đối với các chủng vi khuẩn lactic, bacillus, vi khuẩn quang dưỡng. Nuôi ở 370C trong 24h. Nhân giống cấp 2: Các chủng giống cấp 1 đã phát triển tốt được cấy chuyền sang môi trường lỏng với tỷ lệ 10% giống, trong bình tam giác. Nuôi ở 370C trong 24h. Nhân giống cấp 3: Giống cấp 2 được nhân tiếp sang thùng nhựa có thể tích lớn hơn với tỷ lệ giống 10%, nuôi ở 370C. Giống cấp 3 được dùng để lên men trong những thùng lên men lớn để thu sinh khối. 1.1.4.3. Thu sinh khối Sau lên men, dịch lên men được xử lý để thu sinh khối. Có các phương pháp thu sinh khối như: - Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút, nhiệt độ 40C trong 10 phút. Phương pháp này chỉ được áp dụng trong phòng thí nghiệm. - Dùng màng siêu lọc. Những màng này có thể lọc được vi khuẩn. Hiện nay phương pháp này được áp dụng nhiều trong công nghiệp. 1.1.4.4. Tạo chế phẩm Dịch sinh khối sau khi đã xử lý được trộn với chất mang. Chất mang giúp vi khuẩn có thể tồn tại lâu, nó như chất bảo quản chế phẩm. Chất mang thường là khô đậu tương, khô lạc, cám gạo, bột gạo, đường lactose, sucrose… Sau khi trộn chất mang ta tiến hành sấy khô chế phẩm đến độ ẩm 8-12% để bảo quản. Có thể dùng các phương pháp sấy: Sấy nhiệt: Cho chế phẩm vào thiết bị sấy bình thường ở nhiệt độ 40-500 C trong 4-5h. Ưu điểm: - Tốn ít chi phí cho thiết bị - Hao phí cho năng lượng thấp Nhược điểm: - Thời gian sấy kéo dài - Không thể tự động hóa được - Chất lượng sấy kém Sấy hút chân không + Nguyên lý làm việc: Dưới môi trường áp suất chân không, các khay chứa nguyên liệu được quay đảo bên trong buồng sấy nhằm tăng hiệu suất sóng cao tần. Hàm ẩm trong nguyên liệu được gia nhiệt nhanh và bay hơi thoát ra ngoài bề mặt. tăng tốc độ sấy so với kiểu gia nhiệt truyền dẫn. + Ưu điểm: Hiệu suất sấy cao, tiêu hao năng lượng ít, nhiệt độ sấy thấp nên thích hợp với sản phẩm nhạy nhiệt. + Nhược điểm: Thiết bị đắt tiền. Sấy chân không thăng hoa + Nguyên lý hoạt động: Giai đoạn 1: làm lạnh chế phẩm đến -180 C để kết tinh lượng nước trong và trên bề mặt nguyên liệu chuyển từ lỏng sang rắn. Giai đoạn 2: Tạo điều kiện chân không kết hợp với việc nâng nhiệt độ từ từ (lên đến 250 C) để nước trong nguyên liệu chuyển từ rắn sang hơi. + Ưu điểm: Nhiệt độ sấy thấp nên bảo toàn được giá trị của sản phẩm. + Nhược điểm: Chi phí cho thiết bị và năng lượng cao. . Tổng quan về cá chim vây vàng 1.2.1. Giới thiệu chung về cá chim vây vàng Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepède 1801) phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Tây Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, Đại Tây Dương. Vùng biển nhiệt đới và Á nhiệt đới, vùng biển Đông Nam Á và vùng biển Tây Châu Phi. Ở Trung Quốc chúng phân bố vùng biển Đông Hải, Nam Hải, Hoàng Hải, vùng biển Quảng Đông, Quảng Tây, Hải Nam, Phúc Kiến. Cá chim vây vàng cũng đã tìm thấy ở vùng biển nước ta. Ở Việt Nam, cá chim vây vàng được tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ. Hình 1.1 : Cá chim vây vàng Cá chim vây vàng có cơ thể hơi tròn và bề bên dẹp chính giữa lưng hình vòng cung, bề mặt da có màu trắng xám và vây lưng có màu ánh bạc vàng. Cá chim vây vàng có kích thước tương đối lớn, kích thước có thể đạt 45 - 60 cm. Cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi bình thường 1 năm đạt 0,5 - 1 kg/con. Từ năm thứ 2 trở đi mỗi năm khối lượng tăng tuyệt đối là 1 kg. Cá chim vây vàng là loài cá nước ấm, có tập tính di cư, sống ở tầng giữa và tầng mặt. Ở giai đoạn cá giống hàng năm sau mùa đông cá thường tập trung thành đàn sống ở vùng vịnh, cửa sông. Cá trưởng thành sinh trưởng tốt nhất ở điều kiện nhiệt độ 22 – 280C, là loài rộng muối 3 - 33 ppt. Dưới 20 ppt cá sinh trưởng nhanh, trong điều kiện độ mặn cao tốc độ sinh trưởng chậm lại. Nhu cầu hàm lượng oxy hòa tan lớn hơn 2,5 mg/L. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trưởng thành có thể bắt những động vật vỏ cứng như: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trưởng thành là các loại tôm cá nhỏ. Cá trưởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thương phẩm. Cá Chim vây vàng (Trachinotus bloochi) có thịt thơm ngon, có khả năng chống chịu dịch bệnh tốt. Cá chim vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, được nuôi nhiều ở vùng biển miền Nam Trung Quốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore. Nước ta có vùng biển ấm, nhiều vùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lượng nước tốt, độ mặn nước biển tương đối ổn định. Đây là điều kiện vô cùng thuận lợi để phát triển nghề nuôi cá chim vây vàng ở Việt Nam. 1.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới và trong nước 1.2.2.1. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng trên thế giới Năm 1986, ở Đài Loan, Lâm Liệt Đường đã thu gom 126 con cá chim vây vàng loại nhỏ, loại vừa và lớn nuôi chung với nhau. Năm 1989, Lâm Liệt Đường lần đầu tiên sinh sản nhân tạo cá chim vây vàng thành công. Năm 1991, Lâm Liệt Đường tăng thêm đàn bố mẹ cho tiến hành sinh sản nhân tạo. Năm 1993, Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại học Trung Sơn kết hợp với Trại Nghiên cứu giống Thủy sản Quảng Đông – Trung Quốc nghiên cứu sinh sản nhân tạo thành công giống cá chim vây vàng quy mô nhỏ (ương nuôi ấu trùng trong bể xi măng). Năm 1998, Trung tâm đã kết hợp với Công ty trách nhiệm hữu hạn giống thủy sản Thắng Lợi – Hải Nam – Trung Quốc nghiên cứu sản xuất nhân tạo thành công trên quy mô lớn (ương nuôi ấu trùng trong ao đất). Bên cạnh đó, Trung tâm phát triển nuôi biển ở Batam – Indonesia (Nur. Muflich Juniyanto, Syamsul Akbat và Zakimi) đã thành công trong việc sản xuất giống nhân tạo cá chim vây vàng, vì vậy con giống có thể được sản xuất ở địa phương vượt mức và làm giảm áp lực khai thác giống ngoài tự nhiên. Cá chim vây vàng đã và đang được nuôi nhiều ở vùng biển miền Nam Trung Quốc và một số quốc gia trên thế giới, cá đang được tiêu thụ mạnh ở Nhật Bản, Đài Loan, Hồng Kông, Trung Quốc, Mỹ, Singapore. 1.2.2.2. Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng ở Việt Nam Năm 2006, Trung tâm Khuyến nông Quốc gia đã phối hợp với Trường Cao đẳng Thủy sản, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I thực hiện dự án nhập công nghệ sản xuất nhân tạo cá chim vây vàng do Trung tâm chuyển giao công nghệ Trường Đại học Trung Sơn Trung Quốc chuyển giao. Năm 2009 Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang bắt đầu thử nghiệm cho đẻ nhân tạo cá chim vây vàng tại Bè Nghiên cứu Thực nghiệm - Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa, sau đó ấp trứng và ương giống thành công tại Trại Sản xuất Giống cá Biển – Khoa Nuôi trồng Thủy sản – Trường Đại học Nha Trang, tại Đường Đệ – Nha Trang. Với nguồn giống và kỹ thuật nuôi đã được chủ động sản xuất, một số vùng nuôi ở nước ta đã được chuyển giao công nghệ nuôi thương phẩm cá chim vây vàng. Đầu năm 2011, Trung tâm giống Hải sản tỉnh Nam Định đã nuôi thử nghiệm giống cá chim biển vây vàng trong ao đất và có hiệu quả cao. Bên cạnh đó, ở Quỳnh Lưu Nghệ An đang xây dựng mô hình nuôi thương phẩm cá chim vây vàng. Hiện nay cá chim vây vàng đang được nuôi thử nghiệm ở Phú Yên, Vũng Tàu, Nha Trang … và bước đầu đã mang lại hiệu quả. Trên thế giới và trong nước mới chỉ tập trung vào vấn đề sinh sản nhân tạo và kỹ thuật nuôi cá chim trắng vây vàng, trong khi đó cá chim trắng vây vàng nuôi lồng biển vẫn có thể đối diện với nguy cơ bệnh dịch và bị ảnh hưởng bởi các tác động từ môi trường tự nhiên. Tuy nhiên từ trước đến nay, vấn đề nghiên cứu về thức ăn và bệnh dịch trên cá chim trắng vây vàng vẩn còn bỏ ngỏ, chưa có một nghiên cứu nào về lĩnh vực này được công bố. Tình hình bệnh dịch trên cá nuôi nước mặn nói chung và cá chim vây vàng nói riêng Nuôi cá biển là nghề phát triển mạnh ở Việt Nam từ 30 năm nay và đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn nhưng trong thời gian gần đây đang có dấu hiệu dừng lại do dịch bệnh xảy ra nhiều, nguyên nhân gây bệnh bao gồm: 1.2.3.1. Bệnh do nấm, ký sinh trùng Nấm là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh ở cá như: Bệnh nấm thủy mi – gây ra do do 4 giống nấm Leptolegnia, Aphanomyces, Saprolegnia và Achlya; Bệnh nấm mang - gây ra bởi Branchiomyces. Các loại nấm gây hại nhiều đối với nhiều loại cá nuôi giai đoạn cá con, cá thịt và trứng cá. Nấm gây bệnh trên cá làm cho cá bị ngứa ngáy, lở loét, kém ăn. Biện pháp phòng và trị hiện nay thường dùng muối ăn ( NaCl) nồng độ 2-3% sulfate đồng ( CuSO4) nồng độ 0,5g/m3 nước để tắm cho cá nuôi. Ký sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên cá biển nuôi. Nguyễn Thị Muội và Đỗ Thị Hòa (1978-1980) đã phát hiện được 80 loài ký sinh trùng ký sinh trên cá biển. Nhiều loại ký sinh trùng như: ký sinh trùng đơn bào (Amyloodinium), ký sinh trùng bánh xe (Trichodiniosis), và các loại sán lá đơn chủ (Monogeneansis, Neobenedenia girellae, Benedenia epinepheli và Benedenia sp) cũng là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở cá nuôi. Mặc dù không gây tổn thất lớn nhưng nó làm cho cá chậm lớn, giảm chất lượng thịt cá, tạo cơ hội cho vi khuẩn và virus tấn công. Biện pháp phòng ngừa các bệnh do ký sinh trùng thường là giữ vệ sinh ao cá nhất là ao ương, cải tạo ao nuôi kỹ càng, thả cá với mật độ vừa phải và tẩy giun sán định kỳ cho cá nuôi bằng thuốc. 1.2.3.2. Bệnh do virus Virus là tác nhân gây bệnh nguy hiểm trên cá biển nuôi lồng bè. Tuy nhiên ở Việt Nam tình hình nhiễm bệnh do virus ở trên cá nuôi vẫn chưa nghiêm trọng, các tác nhân virus gây bệnh thường gặp chủ yếu ở tôm nuôi như bệnh đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại tử cơ quan tạo máu (IHHNV), hội chứng Taura (TSV)… Ở trên cá biển nuôi, tác nhân virus gây bệnh được ghi nhận nhiều là virus gây bệnh tử hoại thần kinh (VNN). Bệnh này gây ra trên nhiều loài cá biển và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau (Takana và cộng sự 2003, 2004; Curtis và ctv 2001...). Bệnh này đã được phát hiện trên các loại cá mú (Epinephelus spp.) cá chẽm (Lates calcarifer) và cá bớp (Rachycentron canadum) nuôi ở Khánh Hòa, Việt Nam (Trần Vĩ Hích và cộng sự, 2008). Một số bệnh do virus cũng gây thiệt hại đáng kể cho nghề nuôi cá biển trên thế giới như virus IHN gây hoại tử cơ quan tạo máu ở cá hồi vân, iridovirus gây ra hiện tượng hoại tử mang và da ở cá tầm trắng. Ngoài ra, một số bệnh khác do virus cũng đã được ghi nhận ở các loài cá khác như bệnh nhiễm trùng xuất huyết do vi rút do virus VHS gây nên ở cá hồi, cá trích, cá bơn; bệnh do RSIV ở cá vược, cá tráp và cá mú song. Hiện nay chưa có biện pháp chữa trị cho bệnh bởi virus trên cá nuôi nên để giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh virus thì phải đảm bảo nguồn giống sạch virus và hạn chế nhập, xuất khẩu các loại cá có nguy cơ nhiễm virus đã biết. 1.2.3.3. Bệnh do vi khuẩn Hiện nay, bệnh do vi khuẩn gây thiệt hại rất lớn cho nghề ương nuôi cá thương phẩm. Nhiều bệnh trên cá nuôi lồng bè trên biển do vi khuẩn đã được ghi nhận như: bệnh đốm trắng ở thận trên cá giò nuôi thương phẩm, bệnh Vibriosis, bệnh mòn vây cụt đuôi và bệnh xuất huyết nhiễm trùng máu ở cá mú, cá giò, cá chẽm ( Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2008). Theo thống kê Ở Khánh Hòa, có khoảng 30% hộ nuôi cá biển bị chịu tác hại của bệnh do vi khuẩn. Bệnh có thể xảy ra ở nhiều loài cá biển nuôi như cá mú, cá chẽm, cá hồng, đặc biệt giai đoạn cá nhỏ (5-20cm), cá nuôi lồng thường chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn với tỷ lệ chết có thể đạt 50-100%, đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng (Đỗ Thị Hòa, 2008). Các virus gây bệnh trên cá biển đã được biết như : Vibrio spp, Aeromonas spp, Flexibacter sp, Pseudomonas fluorescents, Pseudomonas putida , Photobacterium damsela, (Đỗ Thị Hòa, 2008). Trong đó, nhóm vi khuẩn Vibrio spp gây bệnh đang được chú ý hơn cả vì tốc độ lây lan và mức độ ảnh hưởng nghiêm trọng của chúng trong nghề nuôi trồng thủy sản hiện nay. Vibrio – nhóm vi khuẩn gây bệnh điển hình ở động vật thủy sản Bệnh vibriosis là tên gọi chung cho các bệnh khác nhau ở động vật thủy sản do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra. Trong bệnh vibriosis, vi khuẩn Vibrio có thể là tác nhân sơ cấp hoặc tác nhân thứ cấp (tác nhân cơ hội, ký sinh trùng ký sinh hay các tác động môi trường như cơ học, hóa học) có thể đóng các vai trò quan trọng trong các dịch bệnh vibriosis ở động vật thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Vibrio là tác nhân gây bệnh quan trọng đối với động vật nuôi thủy sản. V. anguillarum, V. salmonicida, và V. vulnificus là ba trong số những tác nhân gây bệnh chính cho vài loài cá ( Bùi Quang Tề , Phan Thị Vân và cộng sự, 1998). Số lượng chết gây ra bởi Vibrio trên cá và các loài sò hến là rất phổ biến trong giai đoạn ấu trùng sớm và có thể xuất hiện đột ngột, đôi khi dẫn đến chết toàn bộ (Thompson và cộng sự, 2004). Trong những năm gần đây, nghề nuôi cá lồng trên biển phát triển mạnh, bệnh vibiosis đã trở thành các bệnh thường gặp và gây nhiều tác hại cho nghề nuôi thủy sản (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Bệnh do Vibrio gây ra có thể quan sát được ở khắp mọi nơi có nghề nuôi động vật thủy sản nước lợ và nước mặn, sự phân bố của bệnh này rộng khắp thế giới, tập trung ở châu Á, Phi và Mỹ. Nhiều loài cá biển có giá trị kinh tế cao đang được nuôi phổ biến ở nhiều quốc gia châu Á, như cá mú (Epinephelus spp.), cá chẽm (Lates calcarifer) thường bị bệnh này, đặc biệt là hình thức nuôi lồng bè trên biển (Liopo và cộng sự, 2001). Bệnh thường thể hiện các dấu hiệu: trên thân xuất hiện các đốm đỏ nhỏ, tại đó vẩy cá bị tróc và rụng đi, sau một thời gian tạo nên các vết loét nhỏ, sâu. Giải phẫu bên trong cho thấy hiện tượng xuất huyết nội tạng, và xuất huyết trong cơ của cá. Cá bị bệnh có thể gây chết hàng loạt khi bị cấp tính, gây chết rải rác khi ở các thể thứ cấp tính (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Từ cá bệnh ở Việt Nam người ta đã phân lập được một số loài vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus, V. alginolyticus, và V. anguillarum (Phan Thị Vân và cộng sự, 2000). Ngoài ra có những thông báo khác về bệnh do Vibrio ở cá như vi khuẩn V. anguillarum, V. vulnificus gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá trình, V. salmonicida gây bệnh ở cá vùng nước lạnh (Đỗ Thị Hòa và cộng sự, 2004). Tình hình bệnh dịch và nguyên nhân gây bệnh ở trên các loài cá nuôi thương phẩm như cá mú, cá chẽm, cá giò đã được nhiều nghiên cứu công bố. Tuy nhiên do cá chim vây vàng mới được đưa vào nuôi thương phẩm trong thời gian gần đây nên chưa có nghiên cứu cụ thể về dịch bệnh được công bố, nhưng qua thực tiễn nuôi cá chim trắng vây vàng ở lồng bè trên biển, chúng tôi quan sát thấy số lượng cá bị hao hụt do bệnh tật là tương đối lớn. Chúng tôi cũng đã tiến hành thu mẫu cá chim trắng vây vàng bị bệnh đem về phân lập các chủng gây bệnh, kết quả là có rất nhiều vi khuẩn thuộc Vibrio spp đã được phân lập, đây là một cơ sở để kiểm tra và xem xét các tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên loài cá này trong tương lai. Để làm sáng tỏ vấn đề này thì cần các nghiên cứu cụ thể để đánh giá cũng như đưa ra các biện pháp khắc phục để nghề nuôi thương phẩm cá chim trắng vây vàng được phát triển mạnh. . Tổng quan về vi khuẩn lactic Giới thiệu về vi khuẩn lactic 1.3.1.1. Giới thiệu chung Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà, …), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản xuất axit lactic và các loại muối của axit lactic. Ngay từ năm 1780 nhà hóa học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875, L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau (1878) Lister đã phân lập được vi khuẩn lactic và đăt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococus lactic ) và ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã hình thành từ năm 1881. Những vi khuẩn gây lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic, chúng có thể lên men được các loại đường monosacarit, disacarit nhưng không lên men được tinh bột. Vi khuẩn lactic thường có dạng hình cầu ( hoặc oval) và hình que, đường kính của các dạng lactic thường từ 0.5 – 1.5 µm, các tế bào hình cầu xếp thành cặp hoặc chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn lactic khoảng 1 – 8 µm, trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Tất cả các vi khuẩn lactic đều không chuyển động, không sinh bào tử, G+, kỵ khí tùy tiện vi hiếu khí. Trực khuẩn thường nhạy cảm hơn so với liên cầu khuẩn. Vi khuẩn lactic lên men được monosaccarit và disaccarit nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên men được bất kỳ loại disaccarit nào, một số không lên men được saccaroza, một số không sử dụng được latose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột ( trừ chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccarit khác. Khả năng tạo thành axit lactic của các loài vi khuẩn lactic khác nhau thi rất khác nhau và như vậy độ bền với axit này cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo được axit lactic cao, các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH = 3,8 – 4 còn cầu khuẩn không thể phát triển trên môi trường này, hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn là ở pH = 5 – 6. Đa số vi khuẩn lactic đặc biệt là trực khuẩn lactic đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong môi trường và chỉ phát triển được trong môi trường có tương đối đầy đủ các axit amin hoặc các hợp chất Nitơ phức tạp hơn. Ngoài ra chúng còn có nhu cầu về vitamin ( B1, B6 , PP, các axit pantotenic, axit folic …). Vì vậy môi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic khá phức tạp. Chính các đặc điểm dinh dưỡng về axit amin và vitamin cho nên nhiều chủng vi khuẩn lactic được dùng trong phân tích hai dạng hợp chất này ở các cơ chất khác nhau. Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptit, axit amin, hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn. Vi khuẩn lactic chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vận sống được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl, có thể sống trong môi trường từ 7 – 10 % NaCl. Vi khuẩn lactic ưa ấm có nhiệt độ sinh trưởng tối thích trong khoảng 25 – 350C, nhóm ưa nhiệt có nhiệt độ tối thích 40 – 450C, nhóm ưa lạnh phát triển tốt ở nhiệt độ tương đối thấp ( <= 50C). Khi gia nhiệt đến 60 – 800C thì hầu hết bị chết sau 10 – 30 phút. Một số vi khuẩn lactic có khẳ năng tạo thành màng nhầy, một số khác có khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rữa thực phẩm. Như vậy ngoài khẳ năng tạo ra axit lactic, các loài này còn sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng sinh ( Bacterioxin). Trong tự nhiên, vi khuẩn lactic thường gặp trong không khí, đất, nước nhưng chủ yếu là ở thực vật và các sản phẩm thực phẩm thực phẩm (rau quả, sữa, thịt,…) một số tìm thấy trong đường tiêu hóa của người và động vật. 1.3.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic Người ta dựa vào quá trình lên men chia vi khuẩn lactic thành hai loại: vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị hình. 1.3.1.2.1. Lên men đồng hình - Lactobacterium casei: đây là những trực khuẩn rất ngắn gây chua sữa tự nhiên. Yếm khí tuỳ tiện, lên men tốt glucose, maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8 ÷ 1% axit lactic. Ở điều kiện bình thường gây chua sữa trong vòng 10 đến 12 giờ. Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 100C, tối ưu là 350C và tối đa là 450C, chúng thuỷ phân cazein và gelatin rất yếu. - Streptococcus cremoris: Thường tạo thành chuỗi dài, thường phát triển ở nhiệt độ thấp hơn Lactobacterium casei, tối ưu từ 250C ÷ 300C, lên men glucose, galactose. - Lactobacterium bulgaricus: đây là trực khuẩn rất dài, nhiệt độ phát triển tối ưu là 200C, có khả năng lên men glucose, lactose. Có khả năng tạo độ axit cao (3,7% axit lactic). - Lactobacterium delbruckii: thường gặp trên hạt đại mạch, đây là trực khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển của mình chúng có khả năng tạo thành sợi. Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 500C, khác với các loài khác chúng không có khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng không được dùng trong chế biến sữa. - Lactobacterium cueumeris fermenti: thường tìm thấy chúng trong sữa ủ chua. Là trực khuẩn không chuyển động, thường tạo thành tế bào đơn và có khi tạo thành chuỗi. Thường chúng tạo thành chuỗi trong quá trình lên men. Khả năng tạo axit tối đa trong môi trường từ 0,9 ÷ 1,2%. 1.3.1.2.1. Lên men dị hình - Streptobacterium hassice fermentatae: thường thấy chúng trong các dịch lên men chua rau cải. Chúng tồn tại từng tế bào riêng biệt hoặc ghép thành từng đôi, hoặc chuỗi ngắn có khi ghép thành từng chuỗi dài hình sợi. Khi lên men rau cải chua tạo thành axit lactic, axit axetic, rượu etylic và CO2. Lên men đường saccarose tốt hơn lên men đường lactose. - Lactobacterium lycopersici: là trực khuẩn gram dương, sinh hơi, tế bào tạo thành chuỗi hay đơn, có khi ghép thành đôi một. Khi lên men chúng tạo thành axit lactic, rượu êtylic, axit axetic và CO2. Chúng có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng thường chết ở nhiệt độ 800C. 1.3.2. Giới thiệu về giống Lactobacillus Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, kích thước lớn (0,5 - 0,7 × 2 - 8 μm), đại bộ phận các loài không di động, không sinh bào tử, có dạng hình que hay hình cầu. Chúng có những nhu cầu về dinh dưỡng phức tạp và làm lên men hoàn toàn, hiếu khí hay kị khí, ưa axit.( De Man và cộng sự, 1960). Nhiệt độ phát triển tối thích thường là 30 – 350 C. Khuẩn lạc của Lactobacillus thường có hình tròn, màu trắng hay đục sữa. Lactobacillus được đặc trưng bởi khả năng sản xuất axit lactic là một sản phẩm phụ của quá trình chuyển hóa glucose. -Lactobacillus được tìm thấy trong các môi trường sống có chứa nhiều cacbohydrat và phân bố rộng khắp trong thức ăn, thức ăn ủ chua, phân bón, sữa và các sản phẩm sữa và trong đường ruột người, động vật, thủy sản…. -Nhiều loài Lactobacillus được sử dụng thương mại trong việc sản xuất các loại sữa chua, pho mát và sữa chua, và họ có một vai trò quan trọng trong sản xuất rau quả lên men (dưa chua và dưa cải bắp), đồ uống (rượu vang và nước trái cây), bánh mì bột chua, và một số xúc xích . Ngày nay Lactobacillus được sử dụng trong chế phẩm probiotic cho cả con người và vật nuôi. Đặc biệt, trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản chế phẩm probiotic đang được phát triển và ứng dụng ngày càng rộng rãi. 1.3.2.1 Giống Lactobacillus – các đặc tính của vi khuẩn probiotic 1.3.2.2.1 Khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh Lactobacillus có khả năng sinh ra các chất kháng khuẩn và đối kháng với nhiều vi khuẩn Gram (+), Gram (-) và kể cả nấm. Lactobacillus có khẳ năng sinh ra các chất kháng khuẩn bao gồm: các axit hữu cơ (axit lactic và axetic axit), hydrogen peroxit, cacbondioxit, và diaxetyl cũng như bacterioxin và các hợp chất giống bacterioxin ( Mishra và Lambert, 1996; Ouwehand và cộng sự, 1999). Cả axit lactic và axit axetic đều có khẳ năng hạn chế sự phát triển của các vi sinh vật khác bởi chúng làm giảm pH bên trong đường ruột và chính điều này đã ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của các vi sinh vật khác (Mishra và Lambert, 1996). Hydrogen peroxit ức chế được sự phát triển của cả vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) (Hollang, Knapp, và Shoesmith, 1987; Mishra và Lambert, 1996). Diacetyl tác động ức chế lên sự tăng trưởng bằng cách can thiệp sử dụng arginine (Jay, 1986) Ngoài ra Lactobacillus còn có khả năng sinh ra bacterioxin, một loại protein có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacterioxin còn có khả năng phân giải ADN, ARN và tấn công vào peptidoglycan để làm suy yếu thành tế bào. Bacterioxin sẽ tấn công các vi khuẩn gây bệnh và ức chế sự phát triển của chúng, trong đó có các vi khuẩn gây bệnh như: E.coli; Samonella; Vibrio; Campylobacter, Shigella, Vibrio, Clostridium, Candida albicans, và một số virus khác nữa (O’Sullivan và Kullen, 1998). 1.3.2.2.3 Khả năng chịu mặn Khả năng chịu mặn của Lactobacillus có vai trò quan trọng vì đây là yếu tố đầu tiên quyết định sự tồn tại của probiotic trong môi trường nước biển. Khả năng chịu mặn là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau. Một số chủng Lactobacillus đã được biết với khả năng chịu độ mặn cao, cao hơn rất nhiều so với độ mặn trung bình từ 3,1‰ tới 3,8‰ của nước biển như: L. amylovorus DCE 471có thể tồn tại và sinh ra bacterioxin trong môi trường 3 % (w/v) NaCl (Patricia Neysens và cộng sự, 2003) Lactobacillus sakei có thể sống trong môi trường có độ mặn rất cao 9% NaCl (Chaillou và cộng sự, 2005). 1.3.2.2.4 Khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa Trong các điều kiện invitro, nhiều chủng Lactobacillus đã được tuyển chọn với khả năng tồn tại ở trong điều kiện bất lợi của đường ruột động vật thủy sản như môi trường axit HCl ở dạ dày, môi trường kiềm của ruột, lyzozyme, dịch tụy, dịch mật. (Srikanjana Klayraung và cộng sự, 2008 ). Khả năng tồn tại trong các điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa giúp cho các vi sinh vật probiotic có thể cạnh tranh được vị trí bám dính và các nguồn dinh dưỡng, năng lượng với các vi khuẩn gây hại. Một số chủng Lactobacillus có khả năng tồn tại tốt trong đường tiêu hóa đã được phân lập như: L. curvatus, L. reuteri, L.plantarum, L. parapentarum, L. pentosus, L. keferi, L. fermentum, L. animalis, L.mucosae, L. aviaries ssp. aviaries, L.salivarius ssp. salicinus, L. salivarius ssp.L.salivarius, L. hilgardii, and L. panis (Srikanjana Klayraung và cộng sự, 2008 ). 1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển của vi khuẩn lactic nói chung và Lactobacillus nói riêng. 1.3.2.1.1. Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phát triển cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệu suất thu hồi là lớn nhất và giá thành rẻ (Lương Đức Phẩm, 2004). Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Cacbon là thành tố chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơ thể của mọi loài sinh vật. Vì vậy sự chuyển hoá nguồn dinh dưỡng cacbon thành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật. Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose (glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin). + Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất. Chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoá hơn. Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho vi sinh vật dễ sử dụng. + Lactose là disaccarit, nó là đường có trong sữa người và động vật. Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vì chúng có khả năng sinh enzym β-galactosidase. Enzym này thuỷ phân lactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn được dễ dàng hơn. + Sucrose cũng là một disaccarit. Trong quá trình lên men dưới tác dụng của enzym sucrose hydrolase bị thuỷ phân thành glucose và fructose. Vài loài lactococci, saccarose được vận chuyển bởi hệ enzym sucrose phosphotransferase và một enzym đặc hiệu sucrose-6-phosphate hydrolase phân cắt sucrose-6-phosphate thành glucose-6-phosphate và fructose. Những enzym này chỉ được tiết ra khi xuất hiện sucrose trong môi trường (Thompson và Chassy, 1981). + Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thuỷ phân tinh bột thành đường, có 3-20 chuỗi. Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextroza liên kết với nhau bởi liên kết hidro yếu. Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩm thực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Một số loài vi khuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột (William và Wilkins, 1986). Sự phát triển của vi khuẩn lactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái và sinh lý khác nhau và vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những áp lực của các quá trình xử lý sau này. Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng sống sót của L. bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm, nếu lên men từ manose thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructose và lactose (Carvalho và cộng sư, 2004). Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường nào cũng cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của tất cả sinh vật. Vật chất cơ bản của tế bào (protein, axit nucleic…) đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều axit amin khác nhau do đó chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo sự phát triển của mình. Axit amin có thể được đồng hoá dưới dạng peptit nhờ vào tác dụng của enzym protease ngoại bào hay nội bào. Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau. Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ như L. helveticus, chúng có thể bị kích thích bởi sự có mặt của muối amoni trong môi trường (Chopin, 1993). Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịch chiết thịt, trypton…Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiên cứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao được hiệu quả sản xuất. Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sử dụng khá nhiều (Lars Axelsson, 2004). Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chẳng hạn đối với Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzym protease thuỷ phân một số protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào. Nhìn chung mangan và magie là những chất đóng các vai trò chủ yếu sau: + Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym. + Giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy. + Ổn định cấu trúc tế bào. Mg2+ là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp vi khuẩn lactic sử dụng tốt hơn các loại đường. Carvalho và cộng sự đã nhận thấy là khi bổ sung NaCl và saccarose vào môi trường MRS khi nuôi cấy L. bulgaricus đem lại những kết quả khác nhau trong quá trình tạo sinh khối và tỷ lệ sống sót của tế bào trong khi sấy và bảo quản sau này (Carvalho và cộng sự, 2004). Các chất chứa axit béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Chúng không những kích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này. Ví dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặn của vi khuẩn lactic (Ho Phu Ha và Michelle Cartherine Adams, 2007). 13.2.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn. Tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp. Tỷ lệ tiếp giống quá cao, mặc dù thời gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn làm thức ăn nhanh chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng. Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men. Ảnh hưởng của pH Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sinh axit làm pH môi trường giảm, khi pH môi trường giảm đến một mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy trong quá trình nuôi người ta phải luôn điều chỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn phát triển. Mỗi một loài vi khuẩn lactic có một khoảng pH tối thích khác nhau, dao động trong khoảng 4,5-6,5, nhưng cũng có một số chủng có thể phát triển ở pH=9,6 và một số hoạt động ở pH=3,2 như Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH=3. Theo Giraud và cộng sự đối với vi khuẩn L. plantarum A6, sự giảm pH sẽ làm giảm sự chuyển hoá cơ chất. Ngoài ra Silva và cộng sự đã tìm ra mối liên hệ giữa pH cuối cùng của môi trường nuôi cấy chủng L. bulgaricus liên quan đến quá trình sấy phun và bảo quản khô sau này. Họ nhận định được tế bào sẽ chịu được quá trình xử lý nhiệt độ tốt hơn nếu trong quá trình nuôi cấy không điều chỉnh pH (Lars Axelsson, 2004). Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Nhiệt độ ảnh hưởng đến các phản ứng enzym của tế bài vi sinh vật. Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Ví dụ: vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ cơ thể người 37oC. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic trong nuôi trồng thủy sản Những nghiên cứu ở nước ngoài: Ở một số nước Châu Âu, nhiều chủng Lactobacillus đã được lựa chọn để làm chế phẩm vi sinh trong nuôi cá. Trong một nghiên cứu của Nikoskelainen và cộng sự (2001) đã cho thấy khả năng giảm tỷ lệ chết của cá hồi của hai chủng Lactobacillus rhamnosus và Lactobacillus bulgaricus với liều lượng bổ sung vào thức ăn của cá là 1012 CFU/g . Bên cạnh đó, Carnevali và cộng sự (2004) đã cho thấy khả năng cải thiện sức khỏe của cá tráp biển khi bổ sung Lactobacillus plantarum với nồng độ 104 CFU/g (Carnevali và cs, 2004). Ở Ấn Độ, theo nghiên cứu của Mohanty và cộng sự (1996) cho thấy chế phẩm vi sinh sử dụng Lactobacillus và nấm men Saccharomyces cerevisiae có khả năng kích thích sự tăng trưởng của cá chép. Ở Thái Lan, Jiravanichpaisal và cộng sự (1997) đã sử dụng Lactobacillus trong nuôi tôm sú (P.momodon Fabrius) và giảm được tỷ lệ tôm chết do dịch bệnh gây ra bởi nhóm vibrio và bệnh đốm trắng. Ngoài ra có rất nhiều chế phẩm sử dụng Lactobacillus như BZT® AQUA, BZT® DIGESTER (Bio-Form,L.L.C.,Tulsa,Oklahoma,USA); Aqua Ron (International Biologicals, Ấn Độ); EPICIN-Pond (Epicore BioNetworks Inc - USA )…. Các chế phẩm này có tác dụng làm ổn định chất lượng nước và nền đáy trong ao nuôi tôm cá; nâng cao sức khoẻ và sức đề kháng tôm cá nuôi; giảm thiểu ô nhiễm môi trường ao nuôi và xung quanh do nuôi trồng thuỷ sản gây nên; nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn của thủy sản. Những nghiên cứu trong nước: Ở Việt Nam, những nghiên cứu về việc sử dụng các chế phẩm vi sinh và Lactobacillus . spp vào chế phẩm để cải thiện môi trường nuôi thủy sản nói chung và nuôi tôm nói riêng còn tương đối ít (Nguyễn Hữu Phúc và Nguyễn Văn Hảo, 1998)Theo Vũ Thị Thứ và cộng sự, (2004) thử nghiệm men vi sinh Biochie để xử lý nước nuôi tôm sú giống và tôm thịt tại Đồ Sơn, Hải Phòng và Hà Nội cho kết quả khá tốt thông qua môi trường được cải thiện, đặc biệt rất có hiệu quả đối với nuôi tôm giống như giảm chu kỳ thay nước và giảm mùi hôi, tăng tỷ lệ sống và tăng trưởng của tôm. Mô hình nuôi tôm sú bằng chế phẩm vi sinh (ES-01 và BS-01 của Trung tâm nghiên cứu ứng dụng sinh học phục vụ nuôi trồng thủy sản Sóc Trăng) góp phần đưa năng suất tôm nuôi nhiều trang trại đạt tới 12 tấn/ha/vụ. Nhiều hộ nuôi tôm có xử lý chế phẩm vi sinh cho thấy môi trường nước luôn ổn định, tôm phát triển nhanh khắc phục được nhiều khó khăn về thời tiết, môi trường, chi phí đầu tư, dịch bệnh. Ở Cà Mau, việc áp dụng mô hình nuôi tôm bằng chế phẩm EM.ZEO bước đầu mang lại hiệu quả khả quan, giữ cho môi trường của ao luôn sạch, tôm khoẻ mạnh mà hoàn toàn không sử dụng các loại hoá chất độc hại, kháng sinh. Trong suốt quá trình nuôi, tôm phát triển tốt và không bị nhiễm bệnh ( Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự, (2000) tìm hiểu tác dụng của men vi sinh Bio-dream lên các yếu tố vô sinh và hữu sinh trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh với liều lượng 1g/m3 và cho thấy hiệu quả tích cực trong việc giảm mật độ Vibrio tổng số và ổn định được môi trường nước. Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Phương (2007) sử dụng 3 loại men vi sinh Ecomarine, Bio-dream, BZT trong ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình nước xanh cải tiến, cho thấy các yếu tố môi trường phù hợp cho sự phát triển của ấu trùng, men vi sinh góp phần hạn chế số lượng vi khuẩn Vibrio spp trong môi trường bể ương, với tỷ lệ sống của ương ấu trùng tôm càng xanh khá cao, dao động từ 59,1-76,6%. Các chế phẩm vi sinh như Biochie ES-01 và BS-01 EM.ZEO Bio-dream Ecomarine, BZT đều chưa hai chủng vi sinh chủ yếu là Bacillus .spp và Lactobacillus spp. Ngoài ra ở nước ta còn nhiều chế phẩm vi sinh khác sử dụng Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus prorogenes, Lactobacillus plantarum như TP- 05- Super; ZeoBac BIO- ZEOGREEN EMUNIV.S Biosure… Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Mẫu cá Chúng tôi sử dụng các mẫu cá vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) khỏe, đã trải qua một số dịch bệnh. Cá chim được lấy về từ trại cá Trường Đại học Nha Trang (Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa). Mẫu để phân lập là toàn bộ ruột cá. 2.1.2. Môi trường nghiên cứu + Alkaline Peptone Water (APW): Peptone NaCl Nước cất 10g 10g 1 lít Điều chỉnh pH môi trường đạt 8,5 ± 0,2. Hấp ở 1210C trong 10 phút. + MRS: Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, cao nấm men - 5, glucose -20. Tween 80, K2HPO4 - 2, Na-acetate - 5, (NH4)2 citrate - 2.00, MgSO4 . 7 H2O - 0.20, MnSO4 . H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH to 6.2 - 6.8. Khử trùng 1210C trong 15 phút. Điều chỉnh pH môi trường đạt 7,5, sau đó thêm agar vào. Hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút. + Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS): Cao nấm men Peptone Sucrose= Sodium thiosulfate.75H2O Sodium citrate.72H2O Sodium cholate Oxgall NaCl Ferric citrate Bromothymol blue Thymol blue Agar Nước cất 5g 10g 20g 10g 10g 3g 5g 10g 1g 0,04g 0,04g 15g 1 lít Cho các chất vào nước cất đã làm ấm và đun nóng để hòa tan. Chỉ để vừa sôi rồi nhấc ra ngay. Không hấp khử trùng. Để nguội đến 50oC rồi đổ đĩa. 2. 2. Nội dung nghiên cứu Khả năng chịu mặn Khả năng sinh axit lactic Phân lập Lactobacillus Mẫu nội tạng cá chim vây vàng Khả năng di động, phản ứng catalase Khả năng lên men đường Tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio spp. Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa Xác định các đặc tính probiotic và điều kiện nuôi cấy thích hợp Kết luận Hình thái khuẩn lạc Soi tươi Nhuộm Gram Nhiệt độ pH Thời gian Khả năng sinh enzyme amylase, protease Quy trình nghiên cứu được sơ đồ hóa trong hình 2.1 Hình 2.1:Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 2. 3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn 2.3.1.1. Phân lập Lactobacillus Phân lập các chủng Lactobacillus trên nội tạng của cá chim vây vàng trên môi trường MRS. Cân 5g mẫu nội tạng của cá chim vây vàng cho vào túi nilon, bổ sung 45 ml canh thang tăng sinh để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher trong 1 phút. Sau đó cho vào bình tam giác và ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng. Sau 24h đem pha loãng thành các nồng độ 10-2 đến 10-7. Hút 0,1 ml mẫu (Trần Linh Thước, 2008) từ ba nồng độ 10-5, 10-6, 10-7 cho vào môi trường thạch dinh dưỡng đã chuẩn bị trong các đĩa petri vô trùng và dùng que cấy trang đều lên bề mặt đĩa thạch. Các thao tác pha loãng, đổ đĩa thạch và cấy mẫu được làm trong tủ cấy vô trùng. Sau đó để các đĩa petri đã cấy mẫu vào tủ ấm 370C trong 1 – 2 ngày. Quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc để lựa chọn sơ bộ các loài thuộc chi Lactobacillus . Chúng được tách ra cấy ria nhiều lần để chọn các dòng thuần chủng, sau đó cấy chuyển vào môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm để giữ giống (Lương Đức Phẩm, 1998). 2.3.1.2. Nuôi cấy và bảo quản các chủng Lactobacillus Trong sản suất, nghiên cứu, việc hoạt hoá giống và thường xuyên kiểm tra chất lượng của giống là hết sức cần thiết. Để hoạt hóa giống người ta thường sử dụng môi trường nuôi cấy giàu các chất kích thích sinh trưởng như: cao nấm men, nước chiết cà chua, hỗn hợp vitamin, axit béo,… Vì vậy việc chon phương pháp giữ giống có vai trò quan trọng trong duy trì được những hoạt tính ưu việt của chúng, chống thoái hoá giống và không làm mất hoạt tính. Quá trình tiến hành giữ giống: - Sau khi phân lập được nhiều chủng Lactobacillus chúng tôi sẽ tiến hành giữ giống trên môi trường thạch nghiêng: chọn các đĩa petri có chứa khuẩn lạc thuần chủng, dùng que cấy ria chọn lấy các khuẩn lạc và cấy ria trên môi trường agar MRS trong các ống thạch nghiêng đã được chuẩn bị trước. Các ống được bảo quản ở nhiệt độ 4 – 6oC. Định kỳ cấy truyền giống, 2 – 3 tháng cấy truyền lại một lần. - Sau khi xác định được các đặc tính probiotic của các chủng vừa phân lập được, chúng ta sẽ tiến hành giữ giống trong môi trường MRS lỏng có chứa từ 30 – 50 % glycerol về thể tích: Các chủng Lactobacillus sau khi đã tuyển chọn sẽ được nuôi cấy ở môi trường MRS lỏng, ở 28 -300C, lắc 180 vòng/phút cho đến khi đạt đến thời gian ở giữa pha Logarit của đường cong sinh trưởng . Hút dịch nuôi cấy cho vào ống eppendoff có chứa glycerol với tỷ lệ từ 30 – 50 % thể tích của ống, votex các ống đã hút, cho vào tủ lạnh ở 4 -6 0C khoảng 30 phút trước khi đem bảo quản ở tủ đông sâu – 700C. Phương pháp bảo quản trong glycerol này cho phép chúng ta có thể giữ giống trong thời gian dài từ 6 tháng đến 1 năm. 2.3.1.3. Tuyển chọn các chủng Lactobacillus kháng Vibrio Các chủng Vibrio được sử dụng được lấy từ bộ sưu tập của phòng thí nghiệm và phân lập từ trên đối tượng cá chim vây vàng. Từ môi trường giữ giống, các chủng Lactobacillus và Vibrio được đưa vào môi trường lỏng tương ứng (Lactobacillus nuôi trên môi trường MRS, Vibrio nuôi trên môi trường APW) và nuôi hoạt hóa qua đêm ở 370C. Khi mật độ tế bào của Vibrio đạt khoảng 104 CFU ml-1 và mật độ tế bào Lactobacillus đạt khoảng 105 CFU ml-1 thì Vibrio được trang đều trên bề mặt đĩa thạch chứa môi trường LB đã chuẩn bị sẵn (Ravi và cs, 2007). Sau đó đục các lỗ thạch đường kính khoảng 5 mm, hút 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus cho vào các lỗ khoan (Sarker và cs, 2008). Đem các đĩa đã cấy vào tủ ấm 370C, sau 1 – 2 ngày quan sát các vòng kháng khuẩn và xác định đường kính của nó. Để chọn lựa được các chủng Lactobacillus kháng lại Vibrio có độ tin cây cao thì chúng ta tiến hành qua 2 – 3 vòng thử đối kháng. Vòng 1 tiến hành thử đối kháng tất cả các chủng Lactobacillus với 2 -3 chủng vibrio để tuyển chọn sơ bộ được các chủng có khẳ năng kháng. Tiếp theo sử dụng các chủng đã tuyển chọn lần 1 để thử khả năng đối kháng với 3-4 chủng vibrio, từ đó chọn ra các chủng có hoạt tính kháng mạnh để làm các bước tiếp theo. 2.3.2. Quan sát đặc điểm hình thái và đặc tính sinh hóa 2.3.2.1. Quan sát đặc điểm hình thái 2.3.2.1.1. Quan sát tế bào vi khuẩn bằng kính hiển vi - Chuẩn bị mẫu tế bào vi khuẩn. Các chủng Lactobacillus lựa chọn được nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc với tốc độ 200 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 – 30 0C. Sau 24h nuôi cấy, canh trường được thu nhận để làm tiêu bản quan sát tế bào vi khuẩn (ở trạng thái sống và nhuộm Gram). - Chuẩn bị tiêu bản Phiến kính (lame) và lá kính (lamelle) được rửa sạch với xà bông, làm khô và ngâm trong cồn 950. Tạo tiêu bản giọt ép - quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống: nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật lên phiến kính. Đặt lá kính lên giọt nước (cẩn thận để không tạo bọt nước bằng cách nghiêng lá kính một góc 450 và từ từ hạ xuống). - Soi kính hiển vi Trường hợp quan sát vi sinh vật ở trạng thái sống (sử dụng vật kính 10X và 40X): đặt tiêu bản lên bàn mẫu. Hạ tụ quang, đóng bớt chắn sáng. Chọn vật kính 10X, dùng nút chỉnh thô nâng bàn mẫu sao cho vật kính tiếp xúc với phiến kính. Chỉnh từ từ theo chiều ngược lại cho đến khi thấy ảnh vi sinh vật trong thị trường. Dùng bộ phận di chuyển bàn mẫu sao cho vùng muốn quan sát nằm giữa thị trường. Chuyển sang vật kính 40X, điều chỉnh nút chỉnh tinh để tìm ảnh. 2.3.2.1.2. Nhuộm Gram Vi khuẩn Lactic Gram (+), có hình trực khuẩn ngắn hoặc dài, dạng đơn, đôi hoặc xếp thành chuỗi. Ngoài ra vi khuẩn Lactic còn có hình cầu hoặc cầu trực khuẩn, dạng đơn, đôi, đám hoặc xếp thành chuỗi. Tiến hành: Bước 1: Cho một giọt canh trường chứa vi khuẩn lên phiến kính sạch, dàn đều và để khô tự nhiên hoặc hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn (tránh không cho ngọn lửa trực tiếp trên vết mẫu). Bước 2: Nhỏ một giọt chất nhuộm Violet lên vết mẫu đã được cố định trong vòng 1 phút, rồi rửa lại bằng nước cất. Bước 3: Nhỏ một giọt dịch cắm màu lugol lên vết mẫu trong vòng 30 giây đến 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất. Bước 4: Dùng cồn 950 tia qua lại trên vết mẫu và phiến kính đến khi hết màu (khoảng 15 giây), sau đó rửa ngay bằng nước cất. Bước 5: Nhỏ một giọt chất màu fucshin lên vết mẫu trong khoảng 1 phút, sau đó rửa bằng nước cất. Dùng giấy thấm khô và đem mẫu đi quan sát dưới kính hiển vi vật kính dầu. Sử dụng vật kính 100X, đặt tiêu bản đã nhuộm Gram lên bàn mẫu và nhỏ một giọt dầu lên vết nhuộm. Nâng tụ quang, mở chắn sáng. Nhìn vào mẫu (từ ngoài) và hạ từ từ vật kính 100X sao cho đầu vật kính chìm trong giọt dầu. Nhìn vào thị kính, dùng nút chỉnh thô điều chỉnh đến khi thoáng nhìn thấy ảnh thì dừng lại. Sau đó, dùng nút chỉnh tinh cho đến khi nhìn thấy ảnh rõ nét. 2.3.2.2. Quan sát đặc tính sinh hóa 2.3.2.2.1. Khả năng sinh acid lactic Phương pháp định tính: có 2 cách Nuôi vi khuẩn trong hộp petri trên môi trường MRS có bổ sung CaCO3 với lượng 10 g/l. Khi khuẩn lạc mọc, nếu chủng có sinh axit lactic thì xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải. Ngược lại là chủng không sinh axit lactic. Cho vào mỗi ống nghiệm 0,5 ml phenol, thêm từ từ từng giọt FeCl3 1% cho đến khi dung dịch có màu tím của phức phenol-sắt. Sau đó, cho vào dịch nghiên cứu. Nếu màu tím chuyển thành màu vàng thì trong dịch nuôi có mặt axit lactic. 2.3.2.2.2. Phản ứng catalase - Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của men catalase. - Cơ sở sinh hóa: Do oxy có thể tạo ra hàng loạt những dẫn xuất mang tính độc đối với vi sinh vật, không có gì ngạc nhiên là vi sinh vật cũng có thể tự “giải độc” bằng cách tạo ra những men có khả năng phá hủy một số sản phẩm chứa oxy như vậy. Điển hình của loại men này là catalase. Men catalase có ở hầu hết các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa cytochrome. - Phương pháp thử: Thử trên lam: Dùng que cấy lấy tâm khuẩn lạc thuần đã nuôi trên môi trường MRS đặc đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khuẩn lạc nằm trên lam kính. Nếu thấy các bọt khí xuất hiện chứng tỏ có enzym catalase trong tế bào. - Lưu ý: + Khi thử nghiệm trên lam không được đảo trộn trình tự tiến hành ( không đưa H2O2 lên lam kính trước vi sinh vật) bởi cả sắt lẫn platinum co trong que cấy đều có thể gây phản ứng dương tính giả. + Nên dùng các khuẩn lạc đã nuôi trong thời gian 18 – 24 giờ vì những khuẩn lạc già hơn có thể gây mất hoạt tính catalase và gây phản ứng âm tính giả. + H2O2 30% rất không bền và dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng nên cần giữ lạnh dung dịch và cần kiểm tra hoạt tính trước khi dùng. 2.3.2.2.3. Khả năng di động Chủng Lactobacillus được cấy đâm sâu trong môi trường thạch đứng. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa môi trường MRS đặc, cao 5 - 6cm. Dùng que cấy đầu nhọn chấm vào dịch nuôi rồi đâm sâu thẳng xuống ống thạch đứng chứa môi trường MRS rắn. Nuôi ở 30 – 350C trong 2 ngày đem ra quan sát. Nếu vi khuẩn mọc dọc theo vết cấy và mọc lan ra xung quanh, chứng tỏ chủng có khả năng di động. Vi khuẩn chỉ mọc dọc theo vết cấy chứng tỏ chủng không có khả năng di động và hô hấp tuỳ tiện. Vi khuẩn mọc trên bề mặt ống thạch chứng tỏ chủng hô hấp hiếu khí. 2.3.2.2.4. Khả năng sử dụng các loại đường: Sử dụng môi trường cơ bản gồm có:Cao thịt- 3 g; Pepton- 10 g; NaCl- 5 g; phenol đỏ – 0,03g; thêm nước cất đến 1000 ml. Bổ sung đường với nồng độ 0,5% và chỉnh pH đến 7,2 ± 0,2. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 5ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong 10 phút ở 121 0C. Đường arabinose, xylose, và các đường kép cần khử trùng riêng bằng màng lọc rồi mới bổ sung vào môi trường. Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0C, theo dõi hiện tượng sinh axit sau 1-3 ngày. Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh axit) chất chỉ thị sẽ chuyển màu vàng lục. Các loại đường được kiểm tra là: glucose, lactose, mantose, manitol, saccarose, sucrose. 2.3.3. Xác định các điều kiện nuôi cấy 2.3.3.1. Xác định khả năng sinh trưởng Chủng Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở 20 -300C, lắc 180 vòng/phút. Tiến hành lấy mẫu lúc đầu và sau 3h nuôi cấy để xây dụng đường cong sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục (∆OD600). Nguyên tắc: Khi pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan thì sẽ hình thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trường lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm môi trường trở nên đục. Giá trị OD (optical density, mật độ quang) càng cao thì độ đục càng cao, chứng tỏ vi khuẩn sinh trưởng càng mạnh. Vì vậy có thể xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 500 – 610 nm. Cách tiến hành: Đo độ đục của dịch nuôi cấy Lactobacillus bằng máy quang phổ. Cho môi trường vào cuvet số 1 làm đối chứng, cho vào máy đo OD ở 600 nm, đưa về giá trị bằng 0. Lấy dịch nuôi cấy Lactobacillus cho vào cuvet số 2 và cho vào máy đo, đọc kết quả hiện trên màn hình. 2.3.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm 2/3 thể tích bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10 %. Tiến hành nuôi cấy hai chủng Lactobacillus ở các mức nhiệt độ 300, 330, 370, 400. Cứ sau 12 giờ và 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đo pH và OD600 nm. 2.3.3.3. Xác định thời gian nuôi cấy Sau khi chọn được nhiệt độ thích hợp cho từng chủng Lactobacillus ta tiến hành thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy thu sinh khối tối ưu cho từng chủng. Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MRS lỏng. Lượng môi trường chiếm khoảng 2/3 bình nuôi cấy, tỷ lệ tiếp giống 10%. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 8, 12, 16, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 giờ nuôi cấy. 2.3.3.4. Xác định pH thích hợp Chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường MRS lỏng với lượng môi trường khoảng 2/3 thể tích bình nuôi cấy. Chỉnh pH môi trường về ở các mức pH = 4, 5, 6, 7, 8 và cho 10 % giống vào nuôi cấy ở nhiệt độ và pH thích hợp đã được chọn. Tiến hành đo pH và OD600 sau 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32h nuôi cấy. 2.3.4. Xác định các đặc tính probiotic 2.3.4.1. Xác định khả năng sinh enzyme tiêu hóa Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng, lắc 180 vòng/phút, sau 16 – 24 h tiến hành thu dich lọc bằng phương pháp ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút và xác định hoạt tính các enzyme theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch chứa cơ chất đặc trưng (casein với enzyme protease và tinh bột với enzyme amylase. Chuẩn bị môi trường trong nước cất rồi phân phối vào đĩa peptri. Sau khi thạch đông, khoét những lỗ nhỏ đường kính 0,5 cm trên mặt thạch, cho vào 0,1 ml dung dịch lọc, giữ trong tủ ấm. Sau 24 h đổ lugol và đo đường kính phần môi trường trong suốt không bắt màu với lugol. Biểu diễn hoạt tính tương đối của enzyme bằng số mm đường kính vòng thủy phân. Hoạt tính tương đối enzyme (H) xác định theo công thức: H = D – d (cm) D: Đường kính vòng phân giải cộng đường kính lỗ khoan. d: Đường kính lỗ khoan. 2.3.4.2. Xác định khả năng chịu mặn Lactobacillus được nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng ở các nồng độ muối NaCl khác nhau, lắc ở 180 vòng/phút, 370C trong 24h. kiểm tra khả năng sống sót của hai chủng Lactobacillus bằng giá trị OD600 nm. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân lập tuyển chọn 3.1.1. Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng Các mẫu cá chim vây vàng được từ trại cá Trường Đại học Nha Trang tại Vũng Ngán (Nha Trang – Khánh Hòa), chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 11 chủng Lactobacillus. Phân lập và thuần khiết Lactobacillus đã được tiến hành trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC. Các chủng Lactobacillus được đặt tên theo thứ tự L1.1, L1.2, L1.3, L1.4, L1.5, L2.1, L2.2, L2.3, L2.4, L2.5, L2.6. 3.1.2. Kết quả tuyển chọn các chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio Các chủng Lactobacillus được nuôi trên môi trường lỏng MRS, lắc với tốc độ 180 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Các chủng Vibrio được tiến hành đồng thời, nuôi trên môi trường APW, lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28-30oC). Tiến hành thử hoạt tính kháng Vibrio của Lactobacillus sau khi các chủng Lactobacillus và Vibrio đã được nuôi khoảng 18 – 22 giờ. Trang đều 0,1ml chủng Vibrio lên bề mặt đĩa thạch MRS, đục các lỗ có đường kính 5 mm lên môi trường đã cấy Vibrio và cho 50 µl dịch nuôi cấy các chủng Lactobacillus vào lỗ thạch. Các đĩa petri được ủ ở nhiệt độ 37oC trong tủ ấm. Tính đối kháng của các chủng Lactobacillus được đánh giá thông qua kích thước vòng kháng khuẩn (D – d, mm), trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn, d là đường kính lỗ thạch. Sau 1 – 2 ngày nuôi cấy, các đĩa nuôi cấy được đem ra đọc kết quả. Kết quả được thể hiện ở từ bảng 3.1 và hình 3.1: Bảng 3.1: Hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio của 5 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, ở nhiệt độ 37oC D – d (mm) V 2.1 V 2.2 V 2.3 V 2.4 C 1 C 7 C 23 L 1.2 15 14 20 18 15 22 20 L 1.3 18 16 14 22 10 24 21 L 1.4 11.5 16 13 12 10 13.5 17 L 1.5 10 14.5 16.5 10 12 11 18.5 L 2.2 13 14 16 12.5 13 10 10.5 Hình 3.1: Khả năng đối kháng 7 chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 và C23) của 6 chủng Lactobacillus trên môi trường MRS, được xác định bằng đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi ở 37oC Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio của 2 chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy trên môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, ở nhiệt độ 28 - 30oC . Kết quả từ bảng 3 cho thấy có 5 chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio, chiếm 45,45%. Qua bảng 3, hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy chủng Lactobacillus L1.2 và L1.3 có khả năng kháng Vibrio mạnh nhất, thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi chọn hai chủng L1.2 và L1.3 để làm các nghiên cứu tiếp theo. 3.2. Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hóa 3.2.1. Đặc điểm hình thái 3.2.1.1. Đặc điểm hình thái của chủng L1.2 Chủng L1.2 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc. L1.2 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C L1.2 Hình 3.4: Hình thái tế bào của chủng L1.2 khi soi tươi ở vật kính 100X Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram của chủng L1.2 Kết quả cho thấy: Chủng L1.2 có khuẩn lạc tròn, có đỉnh nhọn, màu trắng nhạt, khuẩn lạc sau 24 h nuôi cấy có kích thước khoảng 2mm. Khi làm tiêu bản soi tươi và nhuộm gram quan sát hình thái tế bào của chủng L1.2, kết quả trên hình 3.4 và hình 3.5: tế bào có dạng hình cầu, đứng đơn, xếp chuỗi, tụ thành đám. Tế bào bắt màu tím của thuốc nhuộm gram, điều đó chứng tỏ chủng LP2 là vi khuẩn gram dương. 3.2.1.2. Đặc điểm hình thái của chủng L1.3 Chủng L1.3 được cấy trang trên môi trường MRS bổ sung agar 2%, để trong tủ ấm 370C. Sau 24h nuôi, lấy đĩa petri ra quan sát hình thái khuẩn lạc. L1.3 Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 trên sau 24h trên môi trường MRS nuôi ở 340C L1.3 Hình 3.7: Hình thái tế bào của chủng L1.3 khi soi tươi ở vật kính 100X Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 Kết quả nuôi cho thấy: Chủng L1.3 có khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục sữa, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy khoảng 2,2 mm. Chủng L1.3 Tế bào có dạng hình que dài 1-2mm, đứng đơn, xếp đôi, tạo chuỗi, bắt màu tím của thuốc nhuộm gram. Kết luận chủng L1.3 là trực khuẩn, gram dương. 3.2.2. Đặc điểm sinh hóa Song song với các thí nghiệm xác định đặc điểm hình thái của 2 chủng, chúng tôi đồng thời tiến hành kiểm tra khả năng sinh axit lactic, khả năng tạo catalase, khả năng di động của 2 chủng L1.2 và L1.3. Thử catalase bằng cách nhỏ H2O2 vào khuẩn lạc, không thấy sủi bọt là catalase âm tính. Thử khả năng sinh axit lactic bằng phương pháp cho tạo phức với phenol. Kiểm tra khả năng di động bằng phương pháp cấy đâm sâu trên môi trường thạch đứng. Kết quả thử nghiệm khả năng di động được thể hiện trên hình 3.9; hình 3.10 và khả năng lên men các lọai đường ở bảng 3.2: L1.3 L1.2 Hình 3.9: Khả năng di động của chủng L1.2 và L1.3 L1.3 L1.2 Hình 3.10: Khả năng lên men các loại đường của chủng L1.2 và L1.3 Bảng 3.2: Kết quả thử các đặc tính của hai chủng L1.2 và L1.3 Chủng L1.2 L1.3 Khả năng sinh axit lactic + + Gram + + Khả năng di động - - Hoạt tính catalase - - Khả năng sử dụng các đường + + Tinh bột 0 0 Kết quả thí nghiệm cho thấy L1.2 và L1.3: là những vi khuẩn có sinh axit lactic, gram dương, catalase âm tính, không di động, không tạo bào tử. Theo khóa phân loại Bergey có thể kết luận 2 chủng L1.2 và L1.3 đều là những vi khuẩn lactic. Hai chủng L1.2 và L1.3 được lựa chọn này sẽ đem đi là các thí nghiệm tiếp theo. 3.3. Đặc tính nuôi cấy và đặc tính probiotic 3.3.1. Đường cong sinh trưởng của chủng L1.2 và L1.3 Xác định đường cong sinh trưởng của các chủng giúp ta kiểm soát quá trình nuôi cấy và xác định thời gian thích hợp nhất cho quá trình thu sinh khối. Chúng tôi tiến hành xác định đường cong sinh trưởng ở môi trường MRS lỏng, pH 6,5 và nhiệt độ nuôi cấy là 370C ± 2. Được xác định đến 30h, cứ 3h lấy mẫu một lần đo OD. a)Chủng L1.2 Hình 3.11: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 nm của chủng L1.2 Nhìn vào hình 3.11 có thể thấy chủng L1.2 đạt đến pha cân bằng ở 18h. Mật độ tế bào đạt giá trị lớn nhất ở 21 – 24h. Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già và chết dần. Nhự vậy ta có thể thu sinh khối ở 21 – 24h. b)Chủng L1.3 Hình 3.12: Mối tương quan giữa thời gian và OD600 của chủng L1.3 Nhìn vào hình 3.12 có thể thấy chủng L1.3 đạt đến pha cân bằng ở 15h. Mật độ tế bào đạt giá trị lớn nhất ở 18h – 21h. Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già và chết dần. Như vậy ta có thể thu sinh khối ở 18 – 21h. Qua kết quả trên chúng ta thấy cả 2 chủng đều bỏ qua giai đoạn thích ứng. Điều này dễ giải thích bởi môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều với môi trường lên men. Giai đoạn phát triển logarit ngắn, điều này có lợi cho quá trình sản xuất thu sinh khối, rút ngắn được thời gian lên men. Giai đoạn cân bằng dài chứng tỏ chủng có khả năng duy trì phát triển tốt. Điều này thuận lợi cho quá trình sản xuất xử lý thu sinh khối. 3.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đối với hoạt động sống của vi sinh vật. Ở nhiệt độ thấp sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng do đó kéo dài thời gian thu sinh khối. Còn ở nhiệt độ quá cao chủng sẽ bị ức chế. Với mục đích thu sinh khối lớn trong thời gian ngắn ta cần tìm nhiệt độ tối thích nhất cho chủng phát triển đạt yêu cầu mong muốn của nhà sản xuất. Để tìm khoảng nhiệt độ tối thích chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường MRS lỏng tại các khoảng nhiệt độ được khảo sát là: 300C; 340C; 370C và 400C. Với pH là 6,5. Kết quả được đo sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang OD ở bước sóng l = 600nm.. Kết quả được trình bày ở hình 3.13: Hình 3.13 : Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của hai chủng L1.2 và L1.3, hai chủng đều là các vi khuẩn ưa ấm Đối với chủng L1.2 nhiệt độ tối thích cho sự phát triển của chủng là ở 35 -370C mạnh nhất ở 370C , ở nhiệt độ từ 37 – 40oC chủng đã bị ức chế bởi nhiệt độ. Do vậy để đáp ứng mục tiêu của sản xuất là sinh khối chúng tôi chọn nhiệt độ 370C làm nhiệt độ thích hợp cho chủng L1.2 phát triển. Chủng L1.3 phát triển tốt ở 33 - 350C và mạnh nhất ở 340C, sau 350C thì chủng L1.3 phát triển kém dần. Chúng tôi chọn nhiệt độ 340C cho mục tiêu sản xuất thu sinh khối của chủng L1.3. 3.3.3. Thời gian nuôi cấy Trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm việc xác định thời điểm thu nhận sinh khối có vai trò rất quan trọng, nó không chỉ có ý nghĩa trong việc rút ngắn thời gian sản xuất mà còn ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm sau này. Việc nghiên cứu thời gian nuôi cấy được thực hiện trên môi trường MRS với tỷ lệ tiếp giống là 10%. Thực hiện quá trình nuôi cấy tĩnh trong tủ ấm, chủng L1.2 nuôi ở 370C và chủng L1.3 nuôi ở 340C , theo dõi kết quả đo OD600nm sau thời gian từ 8h đến 40h. Hình 3.14: Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy và mật độ tế bào sống của hai chủng L1.2 và L1.3 ở OD600 nm. Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng L1.2 phát triển và cho sinh khối lớn nhất trong khoảng từ 24 - 28 h nuôi cấy, chủng L1.3 cho sinh khối lớn nhất trong khoảng thời gian từ 20 – 24h nuôi cấy. Thời gian này chậm so với đường cong sinh trưởng khoảng 3h nuôi. Nguyên nhân dẫn đến sự chênh lệch này là do quá trình nuôi để lấy sinh khối này được thực hiện trên thể tích lớn hơn rất nhiều ,so với thể tích nuôi để xác định đường cong sinh trưởng là 200 ml thì thể tích nuôi sinh khối là 1 L. khi thể tích nuôi cấy lớn thì sự ảnh hưởng của các chất ức chế như axit lên vi sinh vật sẽ yếu hơn vì vậy thời gian phát triển để thu được sinh khối lớn nhất sẽ kéo dài hơn. Từ kết quả trên, chúng ta sẽ xác định thời gian nuôi cấy thu nhận sinh khối trên quy mô lớn hơn trên quy mô công nghiệp. 3.3.4. pH nuôi cấy Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của 2 chủng L1.2 và L1.3 trong môi trường MRS lỏng. Dải pH được khảo sát từ 4 – 8, chủng L1.2 được nuôi cấy ở nhiệt độ 370C và chủng L1.3 nuôi ở 340C trong 48h. Cứ 3h lấy mẫu đo OD một lần. Kết quả được biểu diễn trên hình 16, ở 24h. Hình 3.15: Ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và phát triển của chủng L1.2 và L1.3 Từ hình 3.15 ta thấy rằng pH ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của cả 2 chủng. Chủng L1.2 phát triển tối thích ở pH = 6 – 7 , tốt nhất ở pH = 7. Ở pH = 8 chủng bắt đầu có dấu hiệu phát triển kém hơn Khoảng pH từ 5 – 6 chủng vẫn phát triển được nhưng ở pH từ 4 – 4,5 sự phát triển của chủng đã bị ức chế. Chủng L1.3 thì phát triển tốt ở pH = 6 – 7.5 và tối thích ở pH = 6.5. Ở pH = 8 chủng vẫn phát triển nhưng kém hơn, ở pH = 4 – 6 chủng phát triển yếu dần. Qua khảo sát ta thấy rằng hai chủng phát triển tốt ở pH trung tính và hơi kiềm. Điều đó chứng tỏ chủng rất thích hợp phát triển trong môi trường nước biển. Dựa vào sự khảo sát pH chúng tôi chọn pH = 6,5-7 làm pH môi trường cho quá trình lên men thu sinh khối 2 chủng L1.2 và L1.3. 3.3.5. Khả năng chịu mặn của hai chủng L1.2 và L1.3 Với mục đích ứng dụng các chủng vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotic cho nuôi trồng thuỷ sản. Do vậy, ta cần kiểm tra khả năng chịu mặn của các chủng L1.2 và L1.3. Thí nghiệm được kiểm tra trong môi trường MRS với độ mặn khác nhau. Kết quả cho trên hình 3.16. Hình 3.16: Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến sự phát triển của chủng L1.2 và L1.3 Chủng L1.2 có khả năng phát triển ở nồng độ muối 5%. Sự phát triển của chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn của môi trường. Chủng L1.3 có khả năng chịu mặn yếu hơn, mật độ tế bào giảm dần ở các nồng độ muối cao hơn và đến 5% muối thì sự phát triển của chủng L1.3 rất yếu ( OD600 = 0.95). Tuy nhiên ở nồng độ muối 1% thì chủng phát triển yếu hơn ở nồng độ muối 2%, điều này chứng tỏ nồng độ muối NaCl có ảnh hưởng đến sự phát triển của L1.3. Chúng ta nhận thấy 2 chủng đều có khả năng chịu mặn khá tốt, đặc biệt chủng L1.2 có khả năng chịu mặn tương đối cao 5%( so với độ mặn trung bình của nước biển là khoảng 3%). Đây là đặc tính quý khi sử dụng các chủng này làm chế phẩm cho NTTS ở các vùng khác nhau. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ các mẫu cá chim vây vàng được lấy từ Trại cá Trường đại học thủy sản Nha Trang (tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa) phân lập được 5 chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng 7 chủng Vibrio spp. Trong năm chủng có hoạt tính kháng Vibrio spp , hai chủng L1.2 và L1.3 có hoạt tính kháng mạnh nhất sau 24h nuôi cấy. Các điều kiện thích hợp cho 2 chủng phát triển: Chủng L1.2: nhiệt độ 370C, pH= 6.5 - 7 , thời gian thu sinh khối 24 - 28h, khả năng chiu mặn đến 5%. Chủng L1.3: nhiệt độ thích hợp 340C, pH= 6 - 7, thời gian thu sinh khối 20 – 24h, khả năng chịu mặn đến 5%. Hai chủng L1.2 và L1.3 được nghiên cứu có các đặc điểm sinh học của chi vi khuẩn Lactobacillus gồm: hình que, không di động, sinh axit lactic, lên men các loại đường (glucose, saccharose, sucrose, mantose, manitol, sorbitol). Kiến nghị Hướng nghiên cứu tiếp theo: Sử dụng hai chủng L1.2 và L1.3 vào chế phẩm probiotic để thử nghiệm invivo trên cá chim vây vàng. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế kháng khuẩn của các chủng Lactobacillus Giải trình tự gene hai chủng Lactobacillus nói trên TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Bộ thủy sản (2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải thiện chất lượng và xuất khẩu thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, 296 tr. Bùi Trọng Khiêm, (2008) “Tìm hiểu kỹ thuật ương giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) tại Trại Thực nghiệm sản xuất Hải sản - Vĩnh Hòa - Nha Trang”. 41 tr Nguyễn Văn Sơn, (2008) “Kỹ thuật nhân tạo sản xuất giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) tại trại thực nghiệm Trường Cao Đẳng Thủy Sản – Yên Hưng – Quảng Ninh”. tr 6 – 9. Trần Duy Thiết, (2004) “ Nghiên cứu ứng dụng chủng Lactobacillus acidopillus trong sản xuất chế phẩm sinh học (BIOF) dùng trong phòng và trị bệnh cho tôm cá”. 54 tr Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội (2004), “Bệnh học thủy sản”, NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh, Tp. Hồ Chí Minh, tr. 224 – 231. Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ “Các loại bệnh thường gặp trên cá biển nuôi Khánh Hòa” Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản số 02/2008 – Đại học Nha Trang, tr. 16 – 24. Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên “Bệnh tử hoại thần kinh trên cá biển nuôi tại Khánh Hòa” Tạp chí Khoa học –Công nghệ Thủy Sản số 01/2008 – Đại học Nha Trang, tr 19 – 24. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội, 358 tr. Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, Nhà xuất bản giáo dục, 232 tr Tài liệu nước ngoài: Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL, (1994) “Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria” Gut 35, pp 483-489. Briggs, M. R. P. & Funge-Smith, S. J.,(1994) “A nutrient budget of some intensive marine shrimp ponds in Thailand” Aquaculture and Fisheries Management. 25, pp 789-811. Carvalho, A.S. Silva. J, Ho. P. Teixeia, F. X. Gibbs, (2004). Relevant factor for the preparation of freeze-died lactic acid bacteria. International Dairy Journal, 14, 835-847, Elsrier Science B.V. De Man. J.C., Rogosa, M and Sharpe, M.E. (1960) “A medium for the cultivation of Lactobacilli”. Journal of applied bacteriology. 23: pp 130-135. Direkbusarakom, S., Yoshimizu, M., Ezura, Y., Ruangpan, L., Danayadol Y., (1998) “Vibrio spp. the dominant flora in shrimp hatchery against some fish pathogenic viruses” J. Mar. Biotechnol. 6, pp 266–267. Ho Phu Ha and Michelle Cartherine Adams, (2007). “Selection and identifinication of a novel probiotic strans of Lactobacillus fermentum isolated from Vietnamese fermented food”. School of Enviromental and Life Science, Faculty of Science and Information Technology, The University of Newcastle, Australia. Hollang, K. T., J. S. Knapp, and J. G. Shoesmith. (1987) “Anaerobic Bacteria” 1st ed. Blackie and Son, Ltd., London. Kamei, Y., Yoshimizu, M., Ezura Y., Kimura, T., (1988) ” Screening of bacteria with antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries” Microbiol Immunol. 32, pp 67–73. Kenneth H. Wilson and Fulvio Perin2, (1998) “Role of Competition for Nutrients in Suppression of Clostridium dijficile by the Colonic Microflora”. INFECTION AND IMMUNITY, Oct. 1988, p 2610-2614. LARS AXELSSON, (2004), “Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology”. MATFORSK, Norwegian Food Research Institute, As, Norway. Mack DR, Michail S, Wei S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA, (1999) “Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression” Am J Physiol 39, pp 941-950. Mishra, C. and J. Lambert. (1996) “Production of anti-microbial substances by probiotics” Asia Pacific J Clin Nutr 5, pp 20–24. Nikoskelainen S, Ouwehand AC, Salminen S, Bylund G, (2001) “Protection of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) from furunculosis by Lactobacillus rhamnosus” Aquaculture 2001b;198:pp 229-236. O’Sullivan, D. J. and M. J. Kullen. (1998) “Tracking of probiotic bifidobacteria in the intestine” Intl Dairy J 8: pp 513–525. Patricia Neysens, Winy Messens, Luc De Vuyst, (2003) “Effect of sodium chloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471” International Journal of Food Microbiology 88, pp 29– 39. Porter, C. B., Krom, M. D., Robbins, M. G., Brickel, L. & Davidson, A, (1987) “Ammonia excretion and total N budget for Gilthead Seabream (Sparus aurata) and its effect of water quality conditions” Aquaculture. 66, pp 287-297. Prieur, G., Nicolas, J.L., Plusquellec, A., Vigneulle M., (1990) “Interactions between bivalves molluscs and bacteria in the marine environment”. Oceanogr. Mar. Biol. Annu. Rev. 28, pp 227–352. Sakata, T., (1990) “Microflora in the digestive tract of fish and shellfish” In: Lesel, R. (Ed.), Microbiology in Poecilotherms. Elsevier, Amsterdam, pp 171–176. Saurabh S, Choudhary AK and Sushma GS (2005) “Concept of probiotics in aquaculture”. Fishing Chimes 25, pp 19–22. Srikanjana Klayraung, Helmut Viernstein, Jakkapan Sirithunyslug, Siriporn Okonogi(2008) “Probiotic Properties of Lactobacilli Isolated from Thai Traditional” Sci Pharm 76: pp 485–503. Tanaka S, I Kuriyama, T Nakai and Miyazaki (2003) “Susceptibility of cultured juveniles of several marine fish to the sevenband grouper nervous necrosis virus”. Journal of fish diseases 26, pp 109-115. Teruo Higa, (2002). “Technology of Effective Microorganisms”. Concept and Phisiology. Royal Agricultural College, Cirencester, UK. Thompson, J.; Chassy, B.M.(1981) “Uptake and metabolism of sucrose by Streptococcus lactis”. J. Bacteriol. 1981, 147, pp 543–551 Wu, R.,(1995) “The environmental impact of marine fish culture: toward a sustainable future” Mar Pollut Bull. 31, pp 159-166.