Đồ án Nghiên cứu môi trường nhân PLB (protocorm like body) và môi trường tạo chồi từ PLB trên giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan

GIỚI THIỆU Hoa lan hiện nay đang là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao cho nhiều quốc gia, đặc biệt ở một số nước Châu Á. Thái Lan là nước đứng đầu Thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa lan, với sản phẩm chủ lực là lan Dendro (Dendrobium), đã cho doanh thu mỗi năm từ xuất khẩu gần 600 triệu USD. Hoa lan là cây trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa đầy 500ha lan hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan đã thu về 35 triệu USD từ xuất khẩu sản phẩm hoa này. Nước ta bắt đầu chú ý thương mại hoa lan vào giữa những năm 1990. Hiện nay hoa lan đã được nhiều tỉnh, thành phố xem như là cây chiến lược phát triển kinh tế của tỉnh. Vì vậy tốc độ phát triển hoa lan đang phát triển nhanh cả về diện tích lẫn chủng loại, từ những khu vườn trồng lan nhỏ lẻ trước đây, trong vòng 10 năm (2000-2009) diện tích trồng lan đã tăng lên gần 80ha, với hàng trăm chủng loại có giá trị cao như: Hồ điệp, Dendro, Mokara, Vanda,... Tuy nhiên việc phát triển sản xuất hoa lan trong nước còn gặp nhiều khó khăn đặc biệt là cây giống. Các cơ sở sản xuất cây giống trong nước không đủ đáp ứng nhu cầu sản xuất, các nhà vườn phải nhập cây giống từ nước ngoài bằng nhiều hạn ngạch khác nhau. Điều này rất khó khăn cho việc kiểm soát dịch bệnh và gây thụ động trong sản xuất hoa thương phẩm. Bởi vậy việc tập trung phát triển sản xuất cây lan giống in vitro, khắc phục sự thiếu hụt cây giống trong sản xuất là cấp thiết ở nước ta hiện nay. Đề tài nghiên cứu môi trường nhân PLB (protocorm like body) và môi trường tạo chồi từ PLB trên giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan. Mục đích xác định môi trường thích hợp sử dụng nhân PLB và tạo chồi từ PLB, để làm cơ sở thiết lập và hoàn thiện qui trình sản xuất cây giống hoa lan hồ điệp trên qui mô rộng. Tuy nhiên do thời gian có hạn, đề tài chỉ nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy của giai đoạn nhân PLB và giai đoạn tạo chồi. Đây là hai giai đoạn quan trọng của quy trình sản xuất giống hoa lan. Nó không những ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng cây giống mà còn ảnh hưởng đến chất lượng hoa thương phẩm. Việc nhân PLB và tạo chồi lan hồ điệp chất lượng cao là tiền đề thúc đẩy phát triển sản xuất cây lan giống trong nước, góp phần khắc phục hiện tượng thiếu hụt cây giống trong sản xuất hiện nay, từng bước nâng cao trình độ kỹ thuật nhân giống và thu nhập cho người sản xuất, hạn chế sự lây lan nguồn bệnh từ nước ngoài qua con đường nhập cây giống. CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặt vấn đề Lan hồ điệp (Phalaenopsis spp.) là một trong những loài lan quý đang rất được ưa chuộng và đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành cũng như cây cảnh trên thế giới. Tuy nhiên, số lượng cây giống sản xuất hiện nay vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Nguyên nhân do lan hồ điệp là loài sinh trưởng chậm và là một loài lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, công nghệ lai tạo giống kết hợp gieo hạt trong ống nghiệm cho tỷ lệ nẩy mầm cao, tạo nên sự đa dạng về màu sắc, cấu trúc, kích thước hoa sau mỗi thế hệ. Tuy nhiên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt mang tính biến dị cao, tốn nhiều thời gian, không thể có được cây con cho hoa như cây mẹ. Để khắc phục điều này các nhà khoa học đã dùng nhiều phương pháp nuôi cấy mô để tạo ra cây con đồng loạt và ổn định về mặt di truyền. Phương pháp này có ưu điểm tạo nên được những quần thể cây con đồng tính trạnh, có sự tăng trưởng và chất lượng hoa đồng đều. Hiện nay phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đối với cây lan hồ điệp nhằm tạo cây giống sạch bệnh rất được quan tâm. Tuy nhiên phương pháp này thực hiện khó thành công hơn, đỉnh sinh trưởng quá nhỏ nên không thể tái sinh hoặc chết đi qua các lần khử trùng. Hồ điệp là loại lan đơn thân, thân ngắn và mỗi cây cho một đỉnh sinh trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí quá trình nuôi cấy. Vì vậy, hiện nay các nhà nuôi cấy mô trong nước cũng như trên thế giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa hồ điệp có chứa các mắt ngủ có thể tạo thành chồi. Do đó, phương pháp nuôi cấy phát hoa in vitro để tạo chồi được xem là đặc trưng ở lan hồ điệp, nhưng hệ số nhân giống từ phương pháp này cũng rất thấp. Gần đây, phương pháp nhân giống lan hồ điệp thông qua tái sinh protocorm like body (PLB) trực tiếp từ mô trưởng thành đang được quan tâm, phương pháp này giúp tạo cây con đồng nhất và hệ số nhân giống cao. Tuy nhiên, khó khăn lớn nhất của phương pháp này là tỷ lệ PLB tạo ra từ mô trưởng thành rất thấp nên mất nhiều thời gian để tăng sinh PLB. Mà thời gian tăng sinh dài sẽ dẫn đến nhiều biến dị hình thái không mong muốn trên cây giống. Như vậy, yêu cầu đặt ra là cần phải tạo được số lượng lớn PLB trong thời gian ngắn nhằm tránh những biến dị có thể xảy ra. Trong nội dung của đề tài “Nghiên cứu xác định môi trường thích hợp nhân PLB và tạo chồi từ PLB giống lan Phalaenopsis amabilis Yubidan phục vụ sản xuất cây giống”. Mục đích xác định được môi trường nhân PLB và môi trường tạo chồi từ PLB thích hợp là cho giống lan hồ điệp Phalaenopsis amabilis Yubidan, làm cơ sở để thiết lập quy trình sản xuất cây giống lan hồ điệp trên qui mô rộng. 1.2 LAN HỒ ĐIỆP (PHALAENOPSIS) 1.2.1 Nguồn gốc và phân bố Lan hồ điệp có tên khoa học là Phalaenopsis, là loài có hoa lớn, bền, đẹp. Tên gọi Phalaenopsis có nguồn gốc từ tiếng Hi Lạp, Grec Phalaina có nghĩa là "con bướm" và Opsis có nghĩa là "giống như". Hồ điệp là lan có hình dáng tựa như bươm bướm phất phơ rất đẹp. Hồ điệp được phát hiện vào năm 1750, lần đầu tiên được Rumphius đặt tên là Angraecum. Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum amabile. Chi Phalaenopsis (P) do C. L. Blume phát hiện vào năm 1825. Năm 1887, loài hồ điệp lai đầu tiên được J. Veitch đăng ký với tên Phalaenopsis. harriettiae, từ việc kết hợp giữa P. amabilis và P. violacea. Sau đó, có rất nhiều loài lai mới được tạo ra làm tăng thêm sự đa dạng và huyền bí của Phalaenopsis. Phalaenopsis gồm có 21 loài phát sinh, ưa nóng phân bố trải dài từ Ấn Độ qua Đông Nam Á, Philipin, và từ Bắc tới Nam Úc, chúng sống trên cây hoặc đá, nơi có khí hậu nóng ẩm, độ cao trên 2000 m. Ở Việt Nam có khoảng 5-6 loài hồ điệp rừng như: Hồ điệp dẹt: (Phalaenopsis Coenu) Cây sống phụ, rễ lớn, không có thân, lá thuôn dài hình bầu dục. Phát hoa dài 30cm, thẳng đứng, cánh hoa màu xanh vàng, 6-12 chiếc, nở rất lâu tàn và có hương thơm, cột nhuỵ màu vàng. Cây mọc ở miền Trung, có dáng đẹp, có thể gây trồng ở Đà Lạt. Hoa nở vào đầu mùa thu. Hồ điệp ấn: (Phalaenopsis Mannii) Cây mảnh, lá dạng bầu thuôn, hơi cong, màu xanh bóng. Phát hoa dài, thường buông thòng xuống, hoa tập trung ở đỉnh, cánh màu vàng nghệ với vân màu đỏ. Môi nhỏ màu trắng có vạch tím, hai thuỳ bên thuôn. Cây mọc ở Trung Bộ, Đà Lạt. Hoa nở vào mùa hè. Hồ điệp trung: (Phalaenopsis Parishii). Cây nhỏ lá hình trái xoan, màu xanh bóng, rụng vào mùa khô. Phát hoa mọc thẳng đứng, mang 3-9 hoa ở đỉnh, màu vàng nhạt, môi hồng tươi, giữa có hai vạch nâu. Cây mọc đẹp, hoa đứng, màu sắc sặc sở nên được gây trồng làm cảnh, trang trí trong phòng. Hoa nở vào mùa xuân. Lan tiểu hồ điệp hay hồ điệp nhài: (Phalaenopsis Pulcherrima) Cây nhỏ, sống trên đất cát trong các rừng chồi, rễ khoẻ mập, lá hình trái xoan. Phát hoa nhỏ dài mang từng chùm hoa ở đỉnh, nở dần, có nhiều loại như: màu trắng, màu hồng, tím… Hoa nhỏ, cánh bầu dục, lưỡi có màu đậm hơn, họng màu tím. Cây mọc ở miền Trung, Đồng Nai, Bình Châu…trồng rất tốt ở TP, Hồ Chí Minh. Ra hoa vào mùa mưa. 1.2.2 Phân loại thực vật Giới Plantae Thực vật Ngành Magnoliophyta Ngọc Lan Lớp Liliopsida Hành Phân lớp Liliidae Hành Bộ Orchidales Lan Họ Orchidaceae Lan Chi Phalaenopsis Lan hồ điệp Loài Phalaenopsis amabilis 1.2.3. Sự hình thành các nhóm Phalaenopsis Khoảng những năm 1945, trên thế giới có tới 3500 loài Odontoglossum, 4300 loài Cattleya và hơn 5000 loài lan hài lai nhưng chỉ có khoảng 140 loài Phalaenopsis lai. Sau đó hơn 100 loài Phalaenopsis và Doritaenopsis mới được lai tạo và đăng ký. Các giống lai Phalaenopsis mới hình thành góp phần tăng thêm tính đa dạng và huyền bí của thế giới hoa. Các loài lan hồ điệp được phân chia thành hai nhóm chính: Nhóm chuẩn “Moth orchids” có phát hoa dài phân nhánh (trên 1 m) và có hoa lớn (đường kính khoảng 12 cm) tròn, màu trắng, hồng hoặc sọc. Nhóm này chủ yếu được lai tạo từ P. amabilis (hoa trắng) và P. schilleriana (hoa hồng). Nhóm hoa nhỏ có phát hoa ngắn, hoa nhỏ (đường kính khoảng 3 cm), không tròn, dạng sáp và nhiều màu sắc. Nhóm này được lai từ nhiều loài Phalaenopsis hoa nhỏ như P. amboinensis, P. lueddemanniana, và P. violacea. Ban đầu, nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ không được ưa chuộng như lan hồ điệp chuẩn. Đầu thập niên 80, do thị hiếu của người chơi hoa thay đổi nên nhóm lan hồ điệp hoa nhỏ được ưa chuộng hơn, được sản xuất rộng rãi và lai tạo ra nhiều giống mới. Các cây lai mới này có màu sắc sặc sỡ và mang hương thơm do lai tạo từ P. violacea nhưng hoa vẫn nhỏ và mau tàn. Đến cuối thập niên 80, người ta đã chú trọng đến việc nâng cao chất lượng hoa bằng cách tuyển chọn các loài có phẩm chất tốt để lai tạo, do đó các cây thuộc nhóm hoa nhỏ dần đã được cân bằng hơn so với nhóm hồ điệp chuẩn. Trong khi đó, nhóm hồ điệp chuẩn (màu hồng và trắng) vẫn được lai tạo và sản xuất với chất lượng tốt đồng thời nhu cầu về các giống này luôn rất cao. Sau đó, giống lai Phalaenopsis màu vàng có kích thước hoa bằng với hoa trắng lớn xuất hiện. Hầu hết các cây hoa vàng này đã được lai từ hơn 20 năm trước nhưng đến nay chúng vẫn đạt chất lượng hoa tốt, lâu tàn. Hiện nay, người ta đã có thể tạo ra cây có hoa lớn hơn với đường kính hoa khoảng 10 cm bằng cách lai P. deventeriana với các cây lai màu vàng khác. Lan hồ điệp hoa vàng tiếp tục được tập trung lai tạo và sau một thời gian dài đã tạo ra được những cây có chất lượng cao nhất. Loài P. venosa rất được chú ý nhờ có hoa màu nâu nhạt và hương thơm ngào ngạt. Ngoài ra, một số giống mới lai tạo từ P. venosa như P. Mishima Charm và P. Hausermann’s Gold Cup cho hoa màu vàng ươm. Những cây hoa màu vàng, nhỏ như P. Orchid World và P. Michael Crocker cũng lai tạo được nhiều hoa lớn hơn và lâu tàn. Một nhóm Phalaenopsis lai mới được hình thành gọi là “Hoàng Hôn” hay “Màu sa mạc”. Nhóm này được tạo thành nhờ lai giữa P. venosa hoặc P. amboinensis với P. schilleriana. Hoa của các giống này (màu hồng nhạt đến hồng cam hoặc cam sẫm) có hình dạng và kích thước tương tự hoa của P. schilleriana. Một số giống đặc trưng cho nhóm này là P. Pago Pago (venosa x Lippegiut). Nhóm hồ điệp tạo nhiều phát hoa phổ biến ở Trung Mỹ gồm các loài P. equestris và P. stuartiana. Mặc dù kích thước hoa chỉ khoảng 4 – 5 cm nhưng do cây có rất nhiều phát hoa, mỗi phát hoa mang số lượng lớn hoa và hoa nở sớm hơn so với các loài hồ điệp khác nên các giống này rất được ưa chuộng trên thị trường. Hoa có màu từ trắng đến hồng sáng, sọc trắng và viền trắng. Nhiều giống lai mới được sử dụng trong ngành công nghiệp hoa cắt cành có thể tạo được hoa quanh năm trong thời gian ngắn với giá thành thấp. Mặc dù hoa cắt cành mau tàn hơn hoa trồng chậu nhưng chất lượng của hoa vẫn đạt tiêu chuẩn nhất định. Một số giống mới được tạo ra khi lai Phalaenopsis với các chi khác, đặc biệt là Doritis. Các giống Doritis có hoa màu sáng và số lượng hoa nhiều, khi lai với Phalaenopsis tạo ra các giống Doritaenopsis có hình dạng hoa tương tự như Phalaenopsis. Khi lai Phalaenopsis với Vanda alliance có thể tạo ra được một số giống mới như Asconopsis Irene Dobkin (P. Doris x Ascocentrum miniatum). 1.2.4 Đặc điểm thực vật 1.2.4.1 Cơ quan dinh dưỡng a) Thân Lan hồ điệp thuộc loại lan đơn thân, thân rất ngắn không có giả hành, bao bọc bởi hai màng bẹ lá xếp dọc chiều dài thân. được tạo ra bởi 1 đỉnh sinh trưởng hoạt động liên tục, cũng không có thời kỳ nghỉ rõ ràng. Lan sinh trưởng chậm, thân chính của nó trong điều kiện thuận lợi lại mọc ra các lá mới theo phương thẳng đứng, còn cành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc nảy ra từ nách lá. Lá mọc xếp thành hai hàng xen kẽ với nhau. Theo sự sinh trưởng của cây, các lá già ở dưới gốc dần dần héo và rụng đi. Thân của lan hồ điệp ngoài tác dụng giữ cho cây đứng thẳng, còn có chức năng tích trữ chất dinh dưỡng và nước. b) Lá Lá của lan hồ điệp to, dầy, đầy đặn, lá mọc đối xứng không cuống có bẹ ôm lấy thân cây. Hình dạng lá đơn giản (elip thuôn hoặc hình lưỡi mác) với màu xanh đơn thuần hoặc mặt trên xanh mặt dưới rìa lá có màu tím. Một cây có từ 3-15 lá, nhưng chỉ có 4-5 lá trên cùng là còn tăng trưởng kích thướt. Căn cứ vào màu sắc lá có thể phân biệt được màu sắc hoa của chính nó, lá màu xanh thường ra hoa màu trắng hoặc hoa nhạt màu, còn các lá màu khác thường cho hoa màu đỏ. Trong nách lá có 2 chồi phụ, chồi phụ trên to hơn gọi là chồi hoa sơ cấp, bên dưới là chồi dinh dưỡng sơ cấp. Các chồi sơ cấp này sinh trưởng đến mức độ nhất định sẽ đi vào giai đoạn nghỉ. Thông thường bề mặt trên của lá không có khí khổng, chỉ có mặt dưới của lá mới có khí khổng. Lan hồ điệp là loài thực vật CAM, nên khí khổng mở ra vào ban đêm để thu nhận CO2 tạo ra axit Malic dự trữ trong cơ thể, vào ban ngày, CO2 được giải phóng tham gia vào quá trình quang hợp. Do đó ban ngày cây ít bị mất nước, thóat hơi nước. Điều kiện này đối với những cây không được cung cấp nước đầy đủ thường xuyên là rất có lợi. Khi cây đủ nước thì khí khổng cũng có thể mở ra vào ban ngày, hút khí CO2 để tiến hành quang hợp bình thường. Nếu gặp phải điều kiện khô hạn thì khí khổng sẽ đóng lại, quá trình quang hợp chỉ xảy ra vừa đủ cho lượng CO2 tạo ra trong chu trình hô hấp. Đây chính là nguyên nhân làm cho lan hồ điệp mặc dù không có giả hành nhưng lại có khả năng chịu hạn tốt. c) Rễ Hệ rễ của lan hồ điệp không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh, lông hút rõ ràng mà rễ lan hồ điệp thường có dạng hình tròn. Lan có rễ khí sinh phát triển mạnh, màu lục, mọc từ gốc thân xuyên qua bẹ lá, phía ngoài có một lớp mô xốp dày gọi là màng bao (velamen) có tác dụng dự trữ nước và bảo vệ rễ khỏi bị khô. Lớp mô xốp này dễ dàng hút nước, muối khoáng và dinh dưỡng cho cây, đồng thời đóng vai trò đặc biệt trong việc giữ nước cũng như ngăn chặn ánh sáng mặt trời gay gắt. Số lượng rễ khá nhiều, rễ to và hơi để dẹp tạo thành một vành đai tăng diện tích tiếp xúc với ánh sáng. 1.2.4.2 Cơ quan sinh sản a) Hoa Lan Hồ điệp Phát hoa hình thành ở nách lá thường từ 1-2 phát hoa. Hoa mọc thành cụm, lưỡng tính, đối xứng hai bên. Bao hoa dạng cánh, rời nhau, xếp thành hai vòng: ba mảnh vòng ngoài và hai mảnh vòng trong bé hơn, mảnh thứ ba có hình dạng và màu sắc khác hẳn gọi là cánh môi. Gốc cánh môi thường kéo dài ra, chứa tuyến mật. Nhị và nhụy dính liền thành cột nhị nhụy. Hạt phấn thường dính lại thành khối phấn, có chuôi và gót dính ở phía dưới. Hai khối phấn ngăn cách nhau bởi trung đới. Bộ nhụy gồm 3 lá noãn dính nhau thành bầu dưới, mang nhiều noãn, đính bên (Hoàng Thị Sản, 2003). Cả cành hoa nở liên tiếp hơn nửa năm. Trung bình một phát hoa cho 7-15 hoa. mỗi hoa bền khoảng 2 tháng. b) Quả Trái Lan Hồ điệp Quả của lan hồ điệp thuộc loại quả nang, mở bằng các khe nứt dọc theo hai bên đường của giá noãn. Quả lan chứa rất nhiều hạt, tùy vào giống, loài mà hạt có thể từ vài trăm đến vài ngàn hạt. Hạt cần trải qua 130 – 150 ngày để hạt trưởng thành, hạt mở sau 90 ngày. Hạt nhỏ được gió mang xa như hạt bụi, phần lớn hạt bị chết vì chứa phôi chưa phân hóa. Theo Bernard (1909), hạt lan muốn nảy mầm phải nhiễm nấm Rhizoctonia vì loại nấm này có tác dụng khởi phát sự tái lập phân bào. Trong thực nghiệm, người ta có thể đánh thức các “phôi sơ khai” (protocorm) khi sử dụng sốc thẩm thấu bằng cách nuôi cấy hạt trên môi trường chứa sucrose (Bùi Trang Việt, 2002). c) Keiki Keiki chỉ một cây con mọc từ một mấu trên cuống hoa. Một số loài có hoa nhỏ như P. lueddemanniana thường tạo keiki trên cuống hoa. Hiện tượng này được Williams mô tả lần đầu tiên vào năm 1894 (Williams và Williams, 1894). Keiki còn có thể được hình thành ở nhiều loài Phaleanopsis và một số loài thuộc các chi lai. Chẳng hạn trong The Genus Phaleanopsis (Sweet, 1980) có trình bày rõ khả năng phát triển cây con từ đốt phát hoa Phaleanopsis kunstleri ở Kew Gardens. Keiki còn có thể hình thành từ rễ ở các loài Philippine P. stuartiana (Williams và Williams, 1894) và Phaleanopsis schilleriana (Davis và Steiner, 1952). Các cây Phaleanopsis dưới điều kiện nuôi trồng không thuận lợi sẽ tạo ra keiki trên cuống hoa, đặc biệt khi đỉnh đã bị cắt bỏ. 1.2.4.3 Môi trường thích hợp cho cây lan hồ điệp a. Nhiệt độ và độ ẩm Hồ điệp là loại hoa phát triển tốt ở vùng nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của hồ điệp là 220C-250C ban ngày và 180C vào ban đêm. Cây có thể phát triển tốt ở nơi có nhiệt độ cao 350C ban ngày và 250C vào ban đêm. Nhiệt độ lý tưởng để phát triển tốt là 250C-270C. Điều lưu ý là biên độ nhiệt độ ngày đêm là giới hạn quan trọng của lan hồ Điệp. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro thì ta có thể điều chỉnh nhiệt độ phòng thí nghiệm sao cho phù hợp từ 22 đến 250C. Thực tế nhiệt độ thật của mô trong bình nuôi cấy có thể cao hơn từ 2-40C đối với nhiệt độ của phòng nuôi cấy. Theo Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng và phát triển cây in itro qua những tiến trình sinh lý như hô hấp hay hình thành tế bào và cơ quan. Việc xử lý cây mẹ trước khi đưa vào nuôi cấy in vitro là một phương pháp xử lý cơ bản để sản xuất cây sạch bệnh (Morel, 1952,1955). Xử lý nhiệt Dahlia trước khi nuôi cấy in vitro cho thấy đỉnh sinh trưởng sẽ được khử virus (Read, 1989). Đỉnh sinh trưởng có kích thước nhỏ, nhưng có thể nuôi cấy được, tạo ra stock mẹ sạch bệnh in vitro đầu tiên trước khi tiến hành nhân giống xa hơn. b. Ánh sáng Ánh sáng là nguồn năng lượng rất quan trọng đối với cây trồng, giúp cây quang hợp tốt. Nếu ta không cung cấp đủ ánh sáng thì cây sẽ phát triển yếu. Ngoài ra ánh sáng cũng có nhiều tác động khác như sinh ra nhiệt, ảnh hưởng đến sinh lý cây. Do đó mỗi cây sẽ sinh trưởng tốt trong một dãi nhiệt độ cụ thể. Nếu vựơt quá dải nhiệt độ này có thể làm chậm tốc độ biến dưỡng và sinh trưởng của cây. Thông thường ta sử dụng ánh sáng đèn quỳnh quang. Nhu cầu ánh sáng đuợc phân tích ở những thông số khác nhau: độ sáng trên đơn vị diện tích thể hiện bởi w/m2, thời gian chiếu sáng biểu hiện bằng giờ/ngày và chất lượng phổ sáng của ánh sáng nhận được. Đối với mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết, vì năng lượng được cung cấp dưới dạng glucid (đường) có trong môi trường môi cấy. Ánh sáng thì cần thiết để điều hoà vài quá trình về hình dạng cây. Nhiều nghiên cứu khác nhau chứng minh ánh sáng ảnh hướng đến sự phát sinh hình thái của phôi, tái sinh cây con lan hồ điệp. Cường độ sáng: một vài thất bại trong lúc nuôi cấy do việc sử dụng cường độ ánh sáng quá cao hoặc không có ánh sáng trong thời gian dài (mất điện), Thông thường người ta dùng phytotron: 50 w/m2 hoặc khoảng 10.000 lux. Bình thường trong các phòng nuôi cấy, cường độ ánh sáng thay đổi từ 5 đến 25 w/m2 (100-5000 lux), nhưng người ta sử dụng thường xuyên nhất là từ 10 đến 15 w/m2.. Werckeister (1971) ghi nhận ánh sáng ảnh hưởng quan trọng đến chồi nhưng tối cần thiết cho tạo rễ ở cây Cymbidium bằng cách dùng than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy. Pennazio & redolfi (1973) chứng minh cường độ ánh sáng (4000lux) quan trọng trong nuôi cấy khoai lang. Ảnh hưởng của ánh sáng dường như có liên hệ với các loài, có loài chịu ánh sáng cao, ánh sáng trung bình và ánh sáng thấp hay tối (Papachatzi et al., 1970; Miller & Murashige, 1976). Thời gian chiếu sáng: thời gian chiếu sáng có thể không ảnh hưởng nhiều trong việc sinh tạo hình dạng của mô, mà phần lớn trường hợp, chính số lượng của năng lượng sáng nhận được là quan trọng. Nó ảnh hưởng đến những đáp ứng sinh lý ở cây trồng. Trong thực tế, nhiều phòng nuôi cấy mô chọn thời gian chiếu sáng từ 16-18 giờ/ngày và được điều chỉnh theo chế độ nhất định. Chất lượng ánh sáng: các công trình nghiên cứu đáng lưu ý của Seibert (1975), chứng tỏ trên mô sẹo thuốc lá thì ánh sáng xanh lơ (giải phổ giữa khoảng 467nm) hoặc tím (giải phổ giữa khoảng 419nm) kích thích việc tạo chồi và áng sáng đỏ (giải phổ giữa khoảng 660nm) cảm ứng việc sinh tạo rễ. Các kết quả này, cũng như các nghiên cứu khác cho thấy, quá trình tạo hình thể thực vật dường như được điều chỉnh bởi các sắc tố nhận ánh sáng: phytochroom, và các chất khác. Như vậy ta sẽ có lợi nếu trộn 2 loại đèn huỳnh quang: một loại có nhiều tia xanh hơn, còn loại có nhiều tia đỏ. Thông thường bóng đèn ghi ‘ánh sáng ngày’ thì có nhiều tia xanh, nếu ‘chiếu sáng trắng’ sẽ có nhiều tia đỏ hơn. Các ống huỳnh quang trắng trong thương mại có thể sử dụng đủ. Ánh sáng cao hơn ánh sáng đỏ có ảnh hưởng hưởng đến những biến đổi sinh lý trên cây như: ra hoa, chế độ dinh dưỡng và những hiện tượng khác như tăng sinh chồi in vitro bằng cách xử lý cây mẹ với ánh sáng đỏ (Read ẹt al.,1978). Ánh sáng xanh cho thấy có khả năng kích thích (Ward & Vance, 1967) và ức chế (Seibert et,al., 1975). Bước sóng của ánh sáng cũng có ảnh hưởng đến phản ứng cây in vitro (Kadkade & Jopson, 1978; Economou, 1982) và mối tương tác giữa bước sóng ánh sáng và môi trường dinh dưỡng (Villalobos et al., 1984; Husemann & Reinert, 1976). Điều này cho thấy chấy lượng ánh sáng ảnh hưởng đến nhiều thay đổi ở cây in vitro. c. Dinh dưỡng Lan hồ điệp trong tự nhiên phát triển quanh năm không có mùa nghỉ, do đó nhu cầu về dinh dưỡng là không thể thiếu vì cây không có giả hành nên không dự trữ dinh dưỡng được, cần phải được bổ sung thường xuyên. Phân dùng cho lan hồ điệp nói chung gồm nhiều loại: vô cơ, hữu cơ... Khi được nuôi trồng trong điều kiện in vitro mặc dù chỉ cần một lượng rất ít nhưng nếu không cung cấp đủ cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Thông thường được cung cấp dưới dạng muối khoáng bổ sung trong môi trường nuôi cấy. 1.3. Giống hồ điệp Phal. amabilis Yubidan Hồ điệp Phal. amabilis Yubidan thuộc nhóm hồ điệp chuẩn, hoa màu trắng, đường kính hoa khoảng 12 cm, hình tròn, môi có vết vàng nhạt. Hiện nay rất được ưa chuộng, thị trường tiêu thụ cả trong nước và xuất khẩu. Chính vì vậy việc nghiên cứu và nuôi trồng giống lan này là rất cấn thiết, đem lại hiệu quả kinh tế cao. Hình 1.1 Hoa (x) và môi (y) của Phalaenopsis amabilis. Yubidan. 1.4 Môi trường nuôi cấy mô thực vật 1.4.1 Môi trường Sự lựa chọn môi trường thích hợp là một yếu tố quan trọng quyết định sự thành công trong nuôi cấy mô. Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy, có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây. Trong 20-30 năm qua có nhiều báo cáo cho thấy có khoảng 24 môi trường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật (Street và Shiflito,1977; Pierik,1987; torres,1989). Tuỳ theo từng giai đoạn phát triển của mẫu cấy và mục đích của nghiên cứu mà ta chọn lựa môi trường thích hợp. Không có môi trường nào là chuẩn tuyệt đối cho sự phát triển của tế bào, do đó sự thay đổi môi trường là rất cần thiết. Một môi trường nuôi cấy bao gồm: khoáng vô cơ, ngồn carbon, vitamin và các chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Những chất được bổ sung vào môi trường phụ thuộc vào từng đối tượng và mục tiêu nghiên cứu. Bao gồm những phân tử nitrogen hữu cơ, acid hữu cơ và dịch chiết (Gamborg,1986). Môi trường Murashige và Skoog (MS-1962) hay Linsmaier và Skoog (LS -1965) được dùng phổ biến, đặc biệt ở những môi trường tái sinh. Môi trường B5 (Gamborg et al.,1968), N6 (Chu,1978) Nitsch và Nitsch (NN-1969) được sử dụng cho nhiều mục tiêu khác nhau. Môi trường Drive- Kuniyuki Wainut (DKW-1984) và Lloyd và McCown (WPM-1980) được sử dụng nuôi cấy cây thân gỗ. 1.4.2 Thành phần các chất khoáng Trong môi trường nuôi cấy mô thực vật người ta chia ra thành các nhóm khác nhau Nhóm đa lượng: Đạm (N): Giữ vai trò tạo lập protein cho cây giúp cây hình thành cơ quan. Đạm giúp thân, lá, phát triển, đủ đạm cây phát triển mạnh, lá lớn, màu xanh đậm. Thiếu đạm cây màu vàng nhạt, thân lá nhỏ yếu, cây sinh trưởng kém, cằn cỗi, ra hoa sớm, hoa nhỏ, ít hoa. Các chất cung cấp đạm dùng trong các môi trường nuôi cấy: CO(NH2)2 : Urê (46% N). (NH4)2SO4 : Sunfat ammonium tức SA (22% N). KNO3 : Kali nitrat (14%N). NH4NO3 : Nitrat amonium (34 % N). NaNO3 : Natri nitrat Ca(NO3)2 : Calci nitrat (15,5% N) Lân (P): Cùng với Nitơ, đạm giúp tạo lập protein cho cây, giúp cây hô hấp và quang hợp, tạo sự hấp thu đạm được dễ dàng, giúp cây nảy mầm, ra hoa, ra rễ, kích thích ra hoa, làm hoa bền và ít rụng. Các chất có thể bổ sung lân cho cây gồm có: Ca(H2PO4)2 : Super phosphate (22% P2O5) (NH4)2HPO4 : Diamonium Phosphate (46% P2O5). (NH4)3HPO4.3H2O : Triamnium Phosphat. KH2PO4 : Phosphat Kali. Kali (K): Giúp cây hấp thụ đạm dễ dàng, tạo các bó mạch trong cây giúp cây cứng chắc, đứng thẳng, cùng với P thúc đẩy sự ra hoa. Các chất cung ứng K như: KCl : Clorua kali (60% K2O). K2SO4 : Sunphat kali (48% K2O). KNO3 : Kali nitrat (44% K2O). KH2PO4 : Phosphat kali (40% K2O). Nhóm trung lượng: gồm những nguyên tố Ca, Mg, S. Calcium (Ca): tạo vách tế bào, giúp cây cứng chắc, lá dầy, giúp cây hấp thụ đạm tốt. Các chất cung cấp Ca như: CaCl2 : Calci clorua. Ca(NO3)2 : Calci nitrat. Đối với những chất chứa Ca ta không nên hoà tan chung với các hoá chất khác vì dễ gây kết tủa, cây không hấp thu hiệu quả. Magiê (Mg): là thành phần tạo nên diệp lục tố cho cây, làm lá xanh. Nếu cây dư Mg lá sẽ có màu xanh đậm bất thường. Khi cây thiếu có thể dùng MgSO4 hoặc MgHPO4 để cung cấp Mg cho cây. Sunfua (S): là thành phần của tế bào chất, giúp cây tăng trưởng. Thiếu S cây cằn cỗi, lá nhỏ. Thường S đã chứa sẵn trong nhóm chất có chứa gốc SO4 như: K2SO4, MgSO4, FeSO4, CuSO4, (NH4)2SO4.. Nhóm vi lượng: nhóm này cũng rất cần thiết cho lan dù cho nó chỉ cần một lượng rất nhỏ (không quá 5mg/lít). Người ta thường dùng những nguyên tố sau để cung cấp cho cây: Sắt (Fe), Đồng (Cu), Kẽm (Zn), Mangan (Mn), Bore (B), Molypden (Mo). Sắt (Fe): đóng vai trò tạo diệp lục tố giúp cây quang tổng hợp tốt. Thiếu Fe làm lá cây có màu xanh lợt, đầu rễ kém phát triển, có thể dùng FeDTA cung cấp Fe cho cây. Đồng (Cu): thiếu Cu dễ làm cho ngọn lá khô, cây không phát triển, ra chồi nhiều nhưng yếu. Dùng CuSO4 để cung cấp cho cây (đôi khi dùng dạng CuEDTA để cung cấp Cu). Kẽm (Zn): thiếu kẽm làm thân ngắn lại, lá mọc chụm ở đầu. Dùng ZnSO4 cung cấp Zn cho cây (có khi dùng ZnEDTA). Mangan (Mn): thiếu Mn lá vàng nhạt, ở là già thường có chấm vàng. Dùng MnSO4 cung cấp Mn cho cây. Bor (B): thiếu B rễ mọc kém, lá quăn ở đầu, đọt non dễ bị hư. Dùng H3BO3 (axit Boric để cung cấp B cho cây. Molypden (Mo): điều hoà sụ tăng trửơng của cây. Có thể dùng Na2MoO4 (molypdat Natri) để cung cấp Mo cho cây. Bảng 1.1: Thành phần các chất khoáng trong một số môi trường nuôi cấy mô thông dụng(mg/l) Hoá chất White B5 N6 WP MS VW KNC NH4NO3 400 1650 500 (NH4)2SO4 134 463 500 500 Mg2SO4.7H2O 720 246 185 370 370 122 122,15 KCl 65 250 KNO3 80 2528 2830 1900 525 KH2PO4 400 170 170 250 250 K2SO4 990 NaH2PO4.H2O 19 150 Na2SO4 200 CaCl2.2H2O 150 166 96 440 Ca(NO3)2.4H2O 300 556 241,3 Ca3(PO4)2 200 Na2EDTA.2H2O 37,2 37,2 37,2 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 27,8 25,0 Fe2(SO4)3 2,5 Fe2(C4N4O6)3 23,13 H3BO3 1,5 3 1,6 6,2 6,2 CoCl2.6H2O 0,025 0,025 CuSO4.5H2O 0,001 0,025 0,25 0,025 MnSO4.H2O 10 5,68 5,68 MnSO4.4H2O 7 4,4 22,3 22,3 MoO3 0,0001 Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 KI 0,75 0,75 0,8 0,83 ZnSO4.7H2O 3 2 1,5 8,6 8,6 White. (1963) B5 : Gamborg et al. (1968) N6 : Nitsch và Nitsch (1969) WP : Lloyd and McCown (1980) MS : Murashige and Skoog (1962) VW : Vacin and Went (1949) KNC : Knudson C (1946) 1.4.3. Carbohydrate Hầu hết môi trường nuôi cấy mô thực vật đều cần bổ sung thêm nguồn carbohydrate bên ngoài. Carbohydrate cần cho việc nuôi cấy tạo mô sẹo (White, 1934; Gautheret, 1955). Sucrose được sử dụng làm nguồn carbohydrate đầu tiên White (1940) và sau đó nhiều nhà nghiên cứu khác cũng sử dụng hiệu quả. Có nhiều nghiên cứu về nhu cầu carbohydrate đối với phôi non và phôi trưởng thành của thực vật, đặc biệt là ở họ lan. Nhiều bằng chứng cụ thể đã chỉ rõ rằng phôi lan có khả năng sử dụng được nhiều nguồn carbon hơn phôi của các loài thực vật hạt kín khác. Đối với phôi của Odontoglossum và Miltonia, sucrose và maltose đều thích hợp, trong khi với Cattleya, Vanda và Phalaenopsis thì glucose và sucrose đều tốt (Breddy, 1953). Ito (1951) quan sát thấy rằng phôi của Dendrobium, Cattleya, Vanda, Phalaenopsis và Epidendrum có khả năng sử dụng được tinh bột trong dịch chiết cà chua bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Ernst (1967b) khảo sát ảnh hưởng của các nguồn carbon khác nhau như mono, di, trisaccharides và đường rượu lên sự tăng trưởng của phôi Phalaenopsis (‘Elinor Shaffer’ x ‘Doris’) mới nảy mầm và Dendrobium để so sánh ảnh hưởng của các dạng D và L môi trường có chứa fructose, D-xylose, D-glucose, trong khi đó ribitol, D-ribose ngược nhau ở các hợp chất khác nhau. Sự tăng trưởng của phôi Phalaenopsis là cực đại và D-arabinitol không giúp ích cho sự tăng trưởng. Verma và Dougall (1977) cho rằng các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự tăng trưởng và phát sinh phôi ở cà rốt hoang dại. Các nguồn carbohydrate khác nhau có ảnh hưởng khác nhau lên sự biến dưỡng ở thực vật. Theo Gleddie và cộng sự (1983) sucrose là nguồn carbon tốt nhất cho sự phát sinh phôi. Ngoài vai trò là nguồn carbon, các carbohydrate còn có tác dụng như một yếu tố điều hòa sự phát sinh hình thái. Carbohydrate có tác dụng lên sự hình thành diệp lục. Diệp lục trong mô sẹo nuôi cấy có ảnh hưởng lên khả năng phát sinh phôi. Các gen biểu hiện nhanh trong sự biệt hóa của các diệp lục cảm ứng ánh sáng xanh cũng có biểu hiện trong sự phát sinh phôi vô tính ở Chenopodium rubrum và cà rốt (Aleith và Richter, 1991). Sự hình thành và biểu hiện của các protein trong giai đoạn đầu của quá trình phát sinh phôi vô tính được tìm thấy trong lục lạp của đậu Hà Lan (Koonen và Jacobson, 1991). Sự kích thích quá trình phát sinh phôi vô tính trong nuôi cấy mô sẹo tế bào trứng ở Citrus trên môi trường chứa lactose có liên quan đến sự hình thành diệp lục trong mô sẹo (Button, 1978). Quá trình tổng hợp diệp lục ở mô sẹo cà rốt bị ức chế bởi sucrose, trong khi đó glucose không gây ức chế quá trình này. Sucrose ức chế sự hình thành màu xanh và khi giảm đường trong môi trường cần thiết cho quá trình tổng hợp diệp lục (Edelman và Hanson, 1971a). 1.4.4 Các vitamin Việc sử dụng các vitamin rất cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của mẫu cấy. Cây cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Các vitaimin này thuộc nhóm B và hiệu quả nhất là: Vitamin B1 tồn tại ở dạng thiamin – HCl: Các vitamin thường bị phân huỷ ở nhiệt độ cao khi hấp khử trùng. Tuy nhiên các chất bị phân huỷ này cũng có tác động lên sự tăng trưởng của mô như chưa phân huỷ. Một số vitamin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thực vật như: Vitamin B6 tồn tại ở dạng pyridoxin. Biotine Pantothenate de Calcium Myoinositol Các vitamin này được bổ sung vào môi trường với nồng độ rất thấp 10-100mg/l. Các dung dịch mẹ có thể được pha đậm đặc 1.000 lần và được bảo quản trong tủ lạnh từ 2-4 tuần. 1.4.5 Chất điều hoà sinh trưởng thực vật Chất điều hoà sinh trưởng thực vật hay còn gọi là: phytohormone đóng vai trò điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật bao gồm tái sinh các thực vật từ những tế bào và mô tách rời. Phytohormone gồm các chất như: auxin, abscisin, ethylene, gibberelline, cytokinine. Trong đó 2 loại hormone quan trọng nhất là auxin và cytokinine quyết định sự kích thích phân chia và biệt hóa tế bào của các mô được nuôi cấy in vitro. a. Auxin Auxin là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid (IAA). Các chất có cấu trúc gần giống IAA là dẫn xuất hay tiền chất của IAA, và có cùng vai trò với IAA trong vài cơ quan đều được gọi là auxin theo nghĩa rộng. Auxin tự nhiên được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng) và lá non, nơi có sự phân chia tế bào nhanh (trừ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh sáng). Sau đó, auxin di chuyển tới rễ và tích tụ trong rễ. Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Đặc tính chủ yếu của auxin là kích thích sự tăng trưởng và kéo dài của tế bào. Ở một số loài, auxin làm tăng sự tổng hợp enzym (peroxydase ở lõi thuốc lá, cellulose synthegtase ở kiều mạch), auxin có khả năng khởi đầu sự phân chia tế bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật, auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, NAA và IBA được sử dụng phổ biến thay thế cho 2,4-D vì hạn chế được hiện tượng đột biến. Auxin còn là yếu tố ngăn cản sự tổng hợp diệp lục tố (Nguyễn Đức Lượng, 2002). Phôi lan có đáp ứng đáng kể đối với auxin. Theo Curtis và Nichol (1948), IAA có khả năng ức chế sự tăng trưởng của phôi trong các giai đoạn đầu sau khi nảy mầm. Nhiều tác giả sau đó đã nhận thấy auxin có tác động lên sự tăng trưởng và nảy mầm của phôi lan ở nhiều giống lan lai khác nhau (Withner, 1953, 1955; Mariat, 1952). Ở một số giống lan biểu sinh, auxin (a-naphthalene acetamide) không ảnh hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng có tác động lên sự tăng trưởng của chồi và rễ (Yates và Curtis, 1949). Một số báo cáo khác cho rằng auxin có hoạt tính khi được sử dụng cùng với các dịch chiết kích thích tăng trưởng như nước dừa (Hegarty, 1955), nước cà chua (Meyer, 1945) và rất khó có thể quan sát thấy được ảnh hưởng riêng lẻ của auxin. Trong quá trình nghiên cứu người ta cũng nhận thấy một số ảnh hưởng của auxin đối với thực vật: Kích thích cho tế bào nở lớn và sinh trưởng thân. Kích thích phân bào ở tượng tầng phát sinh gỗ và kết hợp vớo cytokinin trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Kích thích phát sinh rễ trên đoạn thân, phát triển rễ nhánh và biệt hóa phát sinh rễ trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Ức chế sinh trưởng chồi bên Biệt hoá nhu mô libe và nhu mô gỗ Ức chế hay thúc đẩy sự rụng lá và trái phụ thuộc va2otho72i gian và vị trí lá và trái Sinh trưởng hoa – được kích thích bởi auxin Tạo môi trường phản ứng về dinh dưỡng của chồi và rễ với ánh sáng và lực hấp dẫn b. Cytokinin Các cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin…) được khám phá do những cố gắng tìm kiếm yếu tố kích thích sự phân chia tế bào thực vật. Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau đã được cô lập. Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giống nước dừa hay kinetin. Cytokinin được tổng hợp từ adenine, xuất hiện ở chóp rễ và hạt đang phát triển. Cytokinin cần cho sự phân chia tế bào, khi nuôi cấy mô cây đơn tử diệp cần bổ sung thêm nước dừa vào môi trường để tăng sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi (Miller và Skoog,1953; Miller, 1961) Tidiazuron (TDZ; N- phenyl-N1-1,2,3-thiadizol-5-ylurea) cũng có hoạt tính của một cytokinin. TDZ với một liều lượng thấp có tác dụng kích thích sự hình thành chồi non (Sankhala et al.,1996;Biazel et al., 1996;Murthy et al.,1998). Cytokinin cần trong phản ứng phosphoryl hóa, tác dụng trên sự di chuyển Ca2+ vào diệp lạp, giữ màu xanh cho lá, cũng như tính bán thấm cho tế bào, làm rộng tế bào, kích thích quá trình sinh tổng hợp protein. Như vậy, ảnh hưởng của cytokinin được chia làm 2 giai đoạn: nhân đôi nhiễm sắc thể và thêm chất tạo phân bào (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002). Các cytokinin như kinetin và zeatin có thể bền với nhiệt, không bị phân hủy sau 1 giờ đun nóng ở 1200C (Dekhuijzen,1971), trong khi BA chỉ ổn định ở 1000C trong 20 phút. Ảnh hưởng của cytokinin đến thực vật: Phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và khối u, thúc đẩy phát sinh chồi Tác động sự nở lớn tế bào Tác động trực tiếp đến phân bào của trái và chồi đỉnh Làm chậm lão hóa lá Kích thích sự mở khí khổng ở vài loài thực vật Kích thích phát sinh chồi bên trong điều kiện có ưu thế ngọn Tích tụ diệp lục và chuyển hóa etioplast vào diệp lục c. Gibberelline (GA) Chỉ có acid gibberellinic A3 (GA3) được sử dụng. Nó không có bán ở dạng nguyên chất. Đây là một chất tự nhiên, phân huỷ nhanh trong dung dịch nhày và ưu tiên bảo quản trong alcool 96 độ và để trong tủ lạnh. Chúng ta cần lưu ý là các chất điều hoà tăng trưởng bị phân huỷ hoặc trong lúc bảo quản chúng hoặc trong lúc hấp khử trùng ở autoclave. Các GA quan trọng ở thực vật là GA1, là GA đầu tiên tác động đến sự vươn thân, kích thích kéo dài tế bào. Các GA được tổng hợp từ mevalonic aicd ở mô non của chồi và hạt đang phát triển. Một số ảnh hưởng của GA được bíêt đến như: GA1 kích thích vươn thân qua kích thích phân bào và kéo dài tế bào. Tạo ra thân cao ngược với tính lùn cây. Kích thích hạt nảy mầm ở hạt cần xử lý lạnh hay ánh sáng để phát sinh nảy mầm. Kích thích sản xuất nhiều loại enzyme. Kích thích sự hình thành và phát triển trái như nho d. Abscisic acid (ABA) ABA là một phân tử đơn, được tổng hợp từ mevalonic acid ở lá thuần thục để thích ứng với tress nước. Vì qui luật tác động của ABA trên sự rụng và lão hoá, nên ABA được nghĩ như một chất ức chế. Ảnh hưởng của ABA: Trong nuớc có nhiều ABA sẽ làm đóng khí khổng. ABA gây nên sự vận chuyển sản phẩm quang hợp để phát triển hạt và được hấp thu bởi phôi đang sinh trưởng. ABA phát sinh tổng hợp protein dự trữ trong hạt. ABA tác động ngược lại ảnh hưởng của gibberellin đến tổng hợp enzyme amylase ở hạt ngủ cốc đang nảy mầm. ABA phát sinh và duy trì sự nảy mầm ở hạt và chồi. 1.4.6 Hexitol Các hexitol như myo inositol được xem là có vai trò quan trọng trong nuôi cấy mô (Pollar et al., 1961) và Steinhard et al., 1962). Myo inositol là một hexitol được chú ý trong quá trình sinh tổng hợp cyclitol, sự nảy mầm của hạt, sự chuyên chở đường, dinh dưỡng khoáng, sự trao đổi chất đường, sự thành lập cấu trúc nhân và vách tế bào, sự cân bằng hormon (Loewus & Loewus, 1983). Myo-inositol cũng là một chất kích thích tăng trưởng in vitro và là nguồn carbohydrate nhưng nó lại hoạt động như vitamin. Manitol và sorbitol là những hexitol có khả năng thẩm thấu tốt cho các tế bào trần đã được cô lập. 1.4.7 Yếu tố làm đặc môi trường (Agar). Trong nuôi cấy mô thức vật người ta thường dùng một số vật liệu làm giá thể để nâng đỡ mô và chồi, giữ cho cây đứng vững trong môi trường. Nguyên liệu phổ biến nhất trong nuôi cấy mô là agar. người ta hoà agar vào trong môi trường, làm tan ở nhiệt độ cao (trên 600C) và làm đặc lại ở nhiệt độ phòng. Ngoài ra tuỳ thuộc từng vật liệu nuôi cấy mà người ta sử dụng các vật liệu khác làm giá thể như: giấy lọc, vải, một số màng nhân tạo. Agar là một polyosid có trọng lượng phân tử cao, được chiết ra từ rong biển loại gelidum. Bởi vì agar là sản phẩm lấy từ tảo biển, nên nó có những tác động sinh lý trên mô thực vật. Loại agar sử dụng để làm đông môi trường có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991; Debergh, 1983; Halquist et al., 1983). Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dạng gel và tan ra ở nhiệt độ 60-100oC, đặc lại khi nhiệt độ còn 35oC vì vậy agar ổn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân huỷ bởi enzym thực vật. Hơn nữa agar không phản ứng với các chất trong môi trường. Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ agar sử dụng và pH của môi trường. 1.4.8 Amino Acid Các amino acid và amin rất quan trọng trong sự tạo hình tế bào. Tất cả các dạng L-aminoacid đều là những dạng tự nhiên được tìm thấy trong thực vật: L-tyrosine góp phần vào sự phát sinh chồi (Skoog & Miller, 1957); L-arginine giúp cho tạo rễ; L-serine có thể được sử dụng trong nuôi cấy hạt phấn để tạo các phôi đơn bội. L-asparagin đôi khi cũng được dùng để làm tăng các phôi soma. Dịch thuỷ phân casein, dùng enzyme để phân giải protein của sữa cũng là thành phần rất hay dùng trong các môi trường vì nó cung cấp một hỗn hợp các amino acid tăng cường khả năng phản ứng của tế bào. Khi sử dụng phương pháp thuỷ phân bằng enzyme, ta có thể xác định chính xác thành phần ác amino acid có trong dung dịch, do đó ngày nay người ta thường sử dụng nó phổ biến hơn để khảo sát các amino acid riêng lẻ ảnh hưởng đến sự phản ứng của các tế bào như thế nào. 1.4.9 Các hợp chất tự nhiên. Nước dừa được sử dụng rộng rãi như là chất kích thích tăng trưởng trong nuôi cấy phôi. Nước dừa ngoài cung cấp chất béo, acid amin, acid hữu cơ, nó còn chứa nhiều trypton, carbohydrate như sucrose, glucose và fructose. Môi trường chứa auxin và 10 – 20% nước dừa giúp sự phân chia của các tế bào thân đã phân hóa (sự tạo mô sẹo). Người ta tìm cách xác định bản chất hóa học của chất có hoạt tính trong nước dừa nhưng phải sau khi khám phá ra cytokinin vài năm, nước dừa mới được chứng minh chứa zeatin (Letham, 1974). Khi nuôi cấy phôi lan, nước dừa thường được sử dụng để giúp phôi tăng trưởng và nảy mầm (Hegarty, 1955; Niimoto và Sagawa, 1961). Với Dendrobium, nước dừa không ảnh hưởng lên sự nảy mầm của phôi nhưng ức chế sự tăng trưởng của phôi ở các giai đoạn đầu nảy mầm (Kotomori và Murashige, 1965). Một số trường hợp khác, phôi Phalaenopsis lai tăng sinh mô sẹo và chậm phát sinh cơ quan khi bổ sung nước dừa vào môi trường (Ernst, 1967b). Nhiều loại nước chiết khác được sử dụng cho môi trường nuôi cấy phôi lan. Chẳng hạn nước chiết cà chua là một nguồn dinh dưỡng tốt cho phôi lan nảy mầm và tăng trưởng (Meyer, 1945c; Vacin và Went, 1949; Griffith và Link, 1957). Tác dụng kích thích tăng trưởng của nước cà chua được thấy rõ ở phôi Cattleya Sudan x C. percivaliana, các phôi tăng trưởng giới hạn và biệt hóa thành cơ quan, tạo cụm mô phân sinh và tăng sinh bình thường. Các nhà trồng lan chuyên nghiệp còn sử dụng nhiều loại dịch chiết khác như dịch chiết gỗ bulô (Zimmer và Pieper, 1974, 1976), dịch chiết bò, dịch chiết lúa mì, lúa mạch, cà rốt, nấm men, khoai tây, nấm đảm, peptone và nhiều loại nước trái cây khác (Knudson, 1922; Lami, 1927; Curtis, 1947b; Mariat, 1952; Withner, 1953). Nhưng đáng tiếc là hiệu quả tác dụng của các loại dịch chiết dinh dưỡng này lên sự tăng trưởng của phôi vẫn chưa được biết rõ, có thể trong thành phần các dịch chiết này chứa một số hợp chất kích thích tăng trưởng giúp cho sự phát triển bình thường của phôi. Vì phôi lan có nhu cầu đặc biệt về nguồn đạm, do vậy có thể các thành phần đạm trong dịch chiết có tác dụng kích thích sự tăng trưởng của phôi. 1.4.10 Các chất hấp thụ phenol. Khi phát triển phương pháp nuôi cấy mô để nhân giống Phalaenopsis, vấn đề thường gặp nhất là lượng phenol tiết ra từ mô nuôi cấy quá cao, phenol sẽ khuếch tán vào môi trường, làm oxy hóa các chất trong môi trường, gây độc cho mô nuôi cấy, kết quả là mẫu cấy sẽ bị hóa nâu và chết (Morel, 1974; Flamee và Boesman, 1977; Fast, 1979). Nhiều phương pháp loại trừ chất tiết này và đặc biệt là các sản phẩm oxy hóa của chúng được thực hiện, chẳng hạn như dùng chất chống oxy hóa, enzym ức chế phenol, polyvinylpyrrolidone, than hoạt tính, và nhiều loại chất hấp thụ khác. Hầu hết các phương pháp này đều kèm với việc cấy chuyền mẫu sau 2 – 3 tuần sang môi trường mới. Sử dụng than hoạt tính là biện pháp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô thương mại. Khi bổ sung than hoạt tính ở nồng độ xác định vào môi trường nuôi cấy mô Phalaenopsis, các hợp chất phenol trong môi trường sẽ được loại bỏ, giúp mô sinh trưởng tốt (Arditti và Ernst, 1993; Park và cộng sự, 2000). Việc bổ sung than hoạt tính vào môi nuôi cấy có tác dụng khử độc. Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hòa sinh trưởng và làm đen môi trường. Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BA, IAA. Khả năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất tạo phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy. 1.4.11 Ảnh hưởng của pH Arditti (1967a) đã tóm tắt ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của một số phôi lan. Đối với phần lớn các môi trường thì pH khoảng 5 đến 6 là phù hợp. pH dưới 5 thì agar không đông thành dạng gel hoàn toàn và trên 6 thì gel lại quá cứng (Murashige, 1973). pH của môi trường thường giảm từ 0.6-1.3 đơn vị sau khi hấp khử trùng (Sarma et al .,1990). Nếu trong thành phần môi trường có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị pH trong phạm vi nói trên. Vì ở pH kiềm hoặc quá axit, GA3 sẽ chuyển sang dạng không có hoạt tính (Van Braft & Pierk, 1971). Có một số trường hợp, sau một thời gian nuôi cấy, pH của môi trường giảm dần do sự hình thành một số amino acid hữu cơ trong môi trường. Mặt khác, nhiệt độ cao sẽ làm tăng tính axit của môi trường nuôi cấy (Mann et al., 1982). Nồng độ H+ trong môi trường có ảnh hưởng quyết định thời điểm nảy mầm của phôi, vì sau khi nảy mầm pH môi trường thấp hơn vẫn không gây độc cho sự tăng trưởng (Knudson, 1951). Tuy nhiên nhiều môi trường khác nhau được sử dụng để nuôi cấy phôi, do vậy ảnh hưởng của pH lên môi trường tăng trưởng của phôi lan vẫn chưa được khẳng định rõ ràng. 1.5 ĐIỀU KIỆN VÔ TRÙNG 1.5.1 Ý nghĩa vô trùng Môi trường để nuôi cấy mô thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin… Đó cũng là môi trường thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc độ phân bào của nấm, vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn, thì sau vài ngày đến một tuần toàn bộ bề mặt môi trường và mô cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm, vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì trong điều kiện này mô cấy không thể tiếp tục phát triển và chết dần. Thông thường một chu kỳ nuôi cấy mô thực vật dài từ 1 đến 5 tháng, khác với thí nghiệm vi sinh vật, có thể kết thúc trong vài ngày. Nói cách khác mức độ vô trùng trong thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi rất nghiêm khắc. Điều này đặc biệt quan trọng trong nuôi cấy tế bào đơn thực vật, điều kiện vô trùng phải rất cao mới có thể thành công được. 1.5.2 Nguồn tạp nhiễm Có ba nguồn tạp nhiễm chính là: Các dụng cụ và môi trường không được vô trùng tuyệt đối. Trên bề mặt hoặc bên trong mô cấy tồn tại các sợi nấm, bào tử nấm hoặc vi khuẩn. Trong khi thao tác làm lây nhiễm nấm hoặc vi khuẩn vào môi trường. 1.5.2.1 Vô trùng dụng cụ và nắp đậy môi trường a. Dụng cụ Các thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật thông thường đòi hỏi một lượng lớn các dụng cụ, thông dụng nhất là: Ống nghiệm các loại. Kích thước dễ thao tác là 25x200mm hoặc 25x100mm. Bình tam giác, lọ thuỷ tinh. Thường dùng loại có dung tích từ 125ml đến 250ml. Trường hợp sản xuất cây giống hoa lan thường dùng bình có dung tích từ 500-600ml. Cốc chịu nhiệt để pha môi trường, ống đong, đũa thuỷ tinh, pipet các loại, lọ đựng hoá chất. Ngoài ra còn có một số dụng cụ khác như: kẹp lớn, nhỏ, dao, giấy… Đối với các dụng cụ bằng thuỷ tinh đều cần phải chịu được nhiệt độ từ 160oC đến 180oC khi vô trùng khô và 120oC khi vô trùng ướt. Về chất lượng, đòi hỏi dùng loại thuỷ tinh trung tính, trong suốt để ánh sáng qua được ở mức độ tối đa. b. Nút đậy. Thường dùng nhất là các loại nút đậy bằng cao su, giấy bạc, bông không thấm nước… Nút đậy phải chặt, kín để bụi không đi qua được, đồng thời nuớc từ môi không bị bốc hơi quá dễ dàng trong quá trình nuôi cấy. Bông không thấm nước là loại nút đơn giản nhất, dễ tìm và dễ sử dụng nhưng có một số nhược điểm như: Nếu khi hấp nút bông bị ướt hoặc dính môi trường thì về sau sẽ dễ bị nhiễm nấm nhất là các thí nghiệm nuôi cấy trong thời gian dài. Thao tác làm nút bông chậm, không thuận tiện trong nuôi cấy mô trên quy mô lớn. Chỉ tái sử dụng được một vài lần. Gần đây người ta sử dụng nhiều loại nắp đậy thay thế nút bông. Các hãng sản xuất dụng cụ nuôi cấy mô cung cấp các loại nút đậy ống nghiệm và bình tam giác bằng nhựa chịu nhiệt có thể hấp ở 121oC mà không bị biến dạng. Một số phòng thí nghiệm dùng nắp cao su hay giấy bạc rất thuận tiện cho việc hấp vô trùng đồng thời cũng giảm được chi phí. c. Môi trường Môi trường được pha chế và đem hấp vô trùng khi đã phân phối vào các dụng cụ thuỷ tinh và đã đậy nút hoặc nắp. Thời gian vô trùng từ 15 đến 25 phút tuỳ theo thể tích của môi trường. Sau khi vô trùng cần để nguội cho agar đông lại và theo dõi 2 ngày xem môi trường có bị nhiễm hay không. Nếu môi trường không bị nhiễm là tốt, có thể sử dụng ngay hoặc cấy dần nhưng không quá 3 tháng. Các dung dịch mẹ dùng để pha môi trường (dung dịch muối khoáng, vitamin, chất điều hoà sinh trưởng) cần được giữ trong tủ lạnh. Dung dịch mẹ của hỗn hợp vitamin nên chia thành nhiều lọ nhỏ và bảo quản trong tủ mát, nhiệt độ 40C. Không nên pha một lượng quá lớn dung dịch mẹ các chất điều hoà sinh trưởng. Một số chất thường bị phân hủy ở nhiệt độ cao khi hấp khử trùng, muốn bổ sung vào môi trường phải sử dụng màng lọc 0.12 -0.2µm, qua hệ thống phễu lọc và máy hút chân không d. Nồi hấp vô trùng Ở nhiệt độ 121oC, toàn bộ vi sinh vật có trong môi trường đều bị tiêu diệt kể cả bào tử của vi sinh vật. Áp suất tương ứng với 121oC là 1kg/cm2, vì vậy các nồi hấp đều có thành dày chịu áp súât, có van bảo hiểm và đồng hồ đo áp suất. Thời gian hấp thường 15-25 phút sau khi đồng hồ đã chỉ 121oC. 1.5.2.2 Vô trùng mô cấy Mô cấy có thể là hầu hết các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, phôi, noãn, đế hoa, lá, đầu rễ, thân củ… tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn và nấm. Lúa non khi còn trong bẹ, mô thịt bên trong quả… thường ít bị nhiễm vi sinh vật ngược lại lá, thân, đặc biệt các bộ phận nằm trong đất như rễ, củ có lượng nấm khuẩn tạp rất cao. Hầu như không thể vô trùng mô cấy được nếu nấm khuẩn nằm sâu ở các tế bào bên trong mô chứ không hạn chế ở bề mặt. Phương pháp vô trùng mô cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hoá học có hoạt tính diệt khuẩn. Hiệu lực diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mô cấy, khả năng đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lý mô cấy trong vòng 30 giây trong rượu ethanol 70%, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn. Đồng thời ta cho thêm các chất giảm sức căng bề măt như tween 80, fotoflo, teepol vào dung dịch diết khuẩn. Street (1794) đã sử dụng một số chất khử trùng mô cấy trong bang 1.2 Bảng 1.2 Một số chất khử trùng được sử dụng phổ biến trong nuôi cấy mô. Tác nhân vô trùng Nồng độ (%) Thời gian xử lý (phút) Hiệu quả. Calci hypochlorit 9-10 5-30 Rất tốt Natri hypochlorit 2 5-30 Rất tốt Hydro peroxid 10-12 5-15 Tốt Nước Brom 1-2 2-10 Rất tốt HgCl2 0.1-1 2-10 Trung bình Chất kháng sinh 4-50 mg/l 30-60 Khá tốt Các chất kháng sinh trên thực tế ít được sử dụng vì mỗi chất kháng sinh chỉ có hiệu quả đối với mỗi loại nấm hoặc vi khuẩn nhất định. Ngòai ra nó còn ảnh hưởng không tốt lên sự sinh trưởng của mô cấy. Trong thời gian xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt khuẩn. Đối với các bộ phận có nhiều bụi cát, trước khi xử lý nên rửa kỹ bằng nước xà phòng bột và rửa sạch lại bằng nước máy. Khi xử lý xong, mô cấy được rửa lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng (tối thiểu là 3 lần). Những phần mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng ra cần phải cắt bỏ trước khi đặt mô cấy lên môi truờng. Để tránh ảnh hưởng trực tiếp của tác nhân vô trùng lên mô cấy nên chú ý nên để lại một lớp bọc ngoài khi ngâm mô vào dung dịch diệt khuẩn. Lớp cuối cùng này sẽ được cắt bỏ hoặc bốc đi trước khi đặt mô cấy lên môi truờng. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy nhiên, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thí nghiệm sẽ đạt kết quả. 1.5.2.3 Vô trùng nơi thao tác cấy và tủ cấy vô trùng Nguồn tạp nhiễm quan trọng và thường xuyên nhất là bụi rơi vào dụng cụ thuỷ tinh chứa môi trường trong khi mở nắp hoặc nút bông để làm thao tác cấy. Người ta đã áp dụng nhiều biện pháp khác nhau để chống lại nguồn tạp nhiễm này. Phòng cấy trước khi đưa vào sử dụng, cần phải được xử lý hơi formol bằng cách rót formol 40% ra một số đĩa petri để một vài nơi trong phòng cho bốc hơi tự do. Có thể sử dụng kết hợp với KMnO4 để tăng hiệu quả xử lý. Đóng kín cửa phòng cấy trong 24 giờ, sau đó bỏ formol đi và khử hơi formol thừa bằng dung dịch amoniac 25% trong 24 giờ. Các dụng cụ khi mang vào buồng cấy phải được vô trùng trước: quần áo, mũ vải, khẩu trang của người cấy, dao, kẹp, giấy… Hiện nay, tủ cấy vô trùng laminar flow hood được sử dụng rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và vi sinh vật. Tủ cấy có thiết bị thổi không khí đã lọc vô trùng vào nơi thao tác cấy. Tủ cấy loại trừ một cách hiệu quả nguồn tạp nhiễm bên ngoài vào tạo điều kiện thoải mái cho người cấy. Trước khi cấy, người làm thí nghiệm cần lau tay kỹ đến khuỷ tay bằng cồn 70 độ. Để đảm bảo mức độ vô trùng cao, cần giảm sự chuyển động của không khí ở trong phòng cấy đến mức tối thiểu, vì vậy tất cả dụng cụ phục vụ việc cấy đều phải chuẩn bị đầy đủ để khi cấy tránh đi lại, ra vào buồng cấy nhiều lần. Nên bật đèn UV 30 phút trước khi cấy. Trên bàn cấy thường xuyên có một đèn cồn để sử dụng trong khi cấy và một cốc đựng cồn 96 độ. 1.6 NHÂN GIỐNG TRUYỀN THỐNG 1.6.1 Nhân giống hữu tính bằng hạt Trong thiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện. Cánh môi của hoa lan có cấu tạo và hình dạng đặc biệt thuận lợi cho côn trùng đậu vào, tiếp xúc với khối phấn và mang phấn đi. Thông thường, để đạt tỷ lệ thụ phấn thành công cao, con người cần chủ động thụ phấn cho cây. Phương pháp nhân giống bằng hạt hiện nay là một phương pháp nhân giống thường dùng, cây lan mọc từ hạt gọi là cây thực sinh. Lan hồ điệp phải thông qua thụ phấn tự nhiên hoặc nhân tạo mới có thể đậu trái và cho hạt được. Hạt của nó phát triển không hoàn toàn, không có nội nhủ mà chỉ có một lớp vỏ rất mỏng, gieo hạt trong điều kiện tự nhiên rất khó có được cây hoàn chỉnh. Năm 1899, nhà thực vật Pháp Noel Bernard đã phát hiện ra được nguyên nhân làm cho hạt lan có thể nảy mầm liên quan đến sự có mặt của nấm rễ. Nếu không có nấm cộng sinh thì lan không thể nảy mầm. Với vai trò là nguồn cung cấp đường cho hạt lan, hệ thống rễ sợi của nấm xâm nhập vào trong phôi và cung cấp nguồn carbon cho phôi phát triển. Năm 1922, Knudson đã nghiên cứu thành công việc thay nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt. Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn. Khi quả đã chín khoảng 2/3, có thể khử trùng quả bằng dung dịch thuốc tẩy và cồn. Sau đó, dùng dao tách vỏ và lấy hạt ra để lên môi trường nuôi cấy trong điều kiện vô trùng. Gieo hạt trong điều kiện vô trùng, hạt sẽ nảy mầm theo 1 trong 2 phương thức sau: Dạng thứ nhất là mọc qua thể tiền chồi (Protocom): khi hạt mới nảy mầm đều hình thành nên thể tiền chồi hình cầu nàu trắng, kích thướt thể tiền chồi lớn dần lên, trên bề mặt sẽ xuất hiện rễ giả dạng lông hút, tiếp đó thể tiền chồi sẽ chuyển sang màu xanh lục, nhưng thể tiền chồi không mọc dài ra thêm. Trên đầu chóp của thể tiền chồi sẽ nảy ra chồi. Thông thường các thể tiền chồi đều có khả năng phân hóa ra cây Dạng nảy mầm thứ hai là mọc qua thân rễ: khi hạt nảy mầm ban đầu cũng là thể màu trắng, nhưng sẽ mọc dài ra rất nhanh tạo thành một dạng hình trụ dài, rồi hình thành nên thân rễ. Sau đó trên các kẽ của bề mặt thân rễ mọc ra các rễ giả dạng lông mao, trên môi trường phân hóa, đỉnh chồi của thân rễ sẽ mọc ra cây con, nhưng tỉ lệ phân hóa ra cây con là rất thấp. Phương thức nảy mầm này thường thấy ở các giống địa lan. Sau khi hạt nảy mầm được 30 – 60 ngày chuyển cây con sang môi trường mới. Rễ thường hình thành khi cây con đã có 2 – 3 lá. Cấy chuyền cây con sau mỗi 30 – 60 ngày đồng thời giảm mật độ cây trong bình. Quá trình nhân giống từ hạt cho đến khi cây có thể ra hoa mất khoảng 4 năm hoặc nhiều hơn tùy giống. Tuy nhiên, một đặc điểm nổi bật ở các cây họ lan là biến dị xảy ra thường xuyên và dễ dàng, điều này đã giúp đem lại sự đa dạng cho các loài lan nhưng cũng gây khó khăn cho quá trình nhân giống vì các cây con tạo thành từ hạt không đồng nhất về mặt di truyền. Những nhà lai tạo thường áp dụng phương pháp này nhằm lai tạo ra những giống lan mới. Tuy nhiên, phải mất rất nhiều thời gian mới có thể cho ra giống mới được. Do đó việc lai tạo hoa lan luôn được thực hiện liên tục nhằm đáp ứng nhu cầu thị trường. 1.6.2 Nhân giống vô tính bằng cách tách chiết Thời vụ tách chiết tốt nhất đối với các loài lan là vào đầu mùa tăng trưởng. Trong điều kiện ẩm độ tốt hoặc trồng trong các nhà kính mang tiểu khí hậu nhân tạo thì có thể tách chiết quanh năm. Vào thời kỳ cuối mùa sinh trưởng của cây, cây được cắt rời cây thành từng đơn vị và vẫn giữ nguyên trong chậu. Sau một thời gian, lấy cây ra đem cắt bỏ các rễ hư rồi rửa bằng dung dịch khử trùng để tiêu diệt hết mầm móng gây bệnh, sau đó, đặt các đơn vị lan vừa tách chiết vào giữa chậu mới. Để cây ở nơi có điều kiện ẩm độ và ánh sáng thích hợp với từng loài cụ thể để cây sinh trưởng và phát triển tốt. Những loài lan đơn thân như Phalaenopsis không có giả hành nhưng trồng lâu năm cây vẫn cao lên, có nhiều rễ gió. Muốn cắt trồng nên cắt phần ngọn có 3 rễ, bôi thuốc kích thích ra rễ, dùng giá thể thật thoáng với than gỗ to. Phần bên gốc cây đã cắt sẽ nảy ra 2 – 3 cây con ở nách lá, gần chỗ cắt. Có thể dùng dây kẽm cột siết chặt giữa thân cây, dưới chỗ cột sẽ mọc lên 2 – 3 cây con. Khi cây con có 2 – 3 rễ mạnh thì cắt ra trồng, mở dây kẽm ra, cây mẹ vẫn sống bình thường. Hoặc khi hoa tàn thì cắt bỏ và chừa 3 – 4 mắt phía trên phát hoa, những mắt này sẽ mọc lên cây con (keiki). Phalaenopsis trồng lâu năm cũng có thể ra cây con từ các nách lá ở gần dưới gốc. Keiki: Khi keiki có bộ rễ khỏe và 2 – 3 lá (sau khoảng 6 tháng), ta có thể chiết cây trồng vào chậu. Sử dụng phương pháp nhân giống này có thể giúp Phalaenopsis ra hoa trong khoảng 18 tháng đến 2 năm. Việc nhân giống vô tính bằng phương pháp tách chiết truyền thống tạo được cây con đồng nhất nhưng thời gian nhân giống rất dài và hệ số nhân rất thấp, hơn nữa cây con tạo thành có sức sống không cao. Phương pháp nhân giồng này chỉ áp dụng đối với những người trồng lan để thưởng thức. Muốn trồng với qui mô lớn thì không thể áp dụng phương pháp này. 1.7 VI NHÂN GIỐNG PHALAENOPSIS Hầu hết các giống lan rất dễ xảy ra biến dị, vì vậy việc nuôi cấy bằng hạt không thể tạo được cây con đồng nhất (Arditti, 1992). Vì vậy, để sản xuất cây con đồng loạt cần phải áp dụng phương pháp mới. Hiện nay phương pháp được áp dụng phổ biến nhất đó là: nhân giống vô tính. Khó khăn lớn nhất trong nhân giống vô tính Phalaenopsis là nguồn mẫu rất hạn chế do hồ điệp là lan đơn thân, sử dụng chồi đỉnh để nuôi cấy như nhiều loài lan khác sẽ làm tổn thương cây mẹ (Intuwong và Sagawa, 1974). Hơn nữa, Phalaenopsis thường tiết nhiều hợp chất phenol từ bề mặt cắt ra môi trường nuôi cấy, gây độc cho mẫu mô (Fast, 1979). Một số phương pháp nhân giống vô tính Phalaenopsis thành công được trình bày sau đây: 1.7.1. Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh Chồi đỉnh của cây lan Phaleanopsis khi bị tổn thương hoặc già cõi có khả năng tạo ra được một hoặc nhiều chồi từ các chồi ngủ ở gốc. Từ quan sát này, các nhà làm vườn đã mạnh dạn cắt phần đỉnh phía dưới các rễ khí của cây và nuôi cấy riêng lẻ chúng để nhân thành các cây mới theo ý muốn. Phương pháp này được xem là phổ biến nhất. Chồi có thể phát triển từ phần gốc khi được nuôi cấy ở 27oC (Tran Thanh Van, 1974). Từ phương pháp này, một chồi ban đầu có thể tạo ra 3 đến 4 chồi khác trong 10 tháng (Tran Thanh Van, 1974). Các chồi sinh dưỡng phát triển từ chồi ngủ trên trục cây Phalaenopsis, từ nách lá mỗi chồi sẽ tạo ra hai chồi mới (Koch, 1974; Holters, 1983). Phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh tạo PLB thành công đầu tiên được biết đến do trường Đại Học Hawai thực hiện (Intuwong và Sagawa, 1974). Vật liệu là chồi đỉnh mang 6 – 7 lá non của các cây P. amabilis, P. x Star của Santa Cruz, P. x Surfrider, P. x Ituby Lips, P. x Arcadia, và P. cochlearis. Phương pháp sử dụng chồi đỉnh được ứng dụng thành công cho nhiều loài lan. Tuy nhiên, đối với các loài lan đơn thân như Phalaenopsis, khi sử dụng phương pháp nuôi cấy chồi đỉnh sẽ làm tổn thương cây mẹ, do đó, hiện nay phương pháp nhân giống dùng phát hoa từ cây mẹ được sử dụng phổ biến hơn. 1.7.2. Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis Gavino Rotor là người đầu tiên thành công trong việc nhân giống vô tính in vitro lan hồ điệp khi còn là nghiên cứu sinh của Lawrence McDaniels Đại học Cornell (Rotor, 1949). Ông đã sử dụng phát hoa đã bỏ lá bắc mang 4 đến 6 chồi ngủ, cắt phát hoa thành các đoạn mang một chồi nằm giữa cách hai đầu cắt 7 – 8 cm. Sau đó khử trùng bề mặt và cắt vô trùng thành các đoạn mang chồi cách hai đầu 1 – 2 cm. Cấy các đoạn phát hoa vào môi trường Knudson C làm rắn với agar, các đoạn phát hoa được cắm thẳng cho chồi hướng lên. Phương pháp của Rotor ít được chú ý đến do tỷ lệ nhiễm cao và hệ số nhân thấp. Nhưng 10 năm sau đó những nhà nghiên cứu khác đã tạo ra nhiều quy trình mới dựa trên phương pháp này (Sagawa và Niimoto, 1960; Sagawa, 1961; Kotomori và Murashige, 1965; Scully, 1966; Tse và cộng sự, 1971; Intuwong và cộng sự, 1972 a,b; Reisinger và cộng sự, 1976; Arditti và cộng sự, 1977a; 1997b; Tanaka và Sakanishi, 1977, 1978; Valmayor, 1977; Fast, 1979; Johnson và cộng sự, 1982). Intuwong và cộng sự (1972a, b) cho rằng lợi ích chính của phuơng pháp này là cây mẹ không bị tổn thuơng và nguy hiểm. Tanaka và Sakanishi (1978) đã sử dụng phát hoa của cây P. amabilis lai khoảng 6 tuổi nuôi cấy trên môi trường Vacin – Went bổ sung 2,5 ppm BAP. Các phát hoa được nuôi cấy ở 28oC, các nốt ở vị trí 4 và 3 cho tỷ lệ tăng trưởng của cây tốt nhất, có ít hoặc không có chồi ngủ, trong khi đó nhiều chồi ở nốt 1 và 2 vẫn chưa thoát khỏi sự ngủ. Khi nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn (20o – 25oC) ở nốt 3 và 4 sẽ tạo được số lượng mẫu đáng kể. Nhiệt độ nuôi cấy (28 – 30oC) là một yếu tố quan trọng để kích thích sự ngủ của chồi bên. Nghiên cứu của nhóm Ernst (1984) cho thấy khi nồng độ cytokinin trong môi trường tăng lên (25 đến 125 ppm BAP trong môi trường Knudson C hoặc môi trường REM) sẽ cảm ứng tạo cụm chồi và hình thành cây con từ nốt phát hoa. Cuống hoa còn non (hoa chưa nở) được khử trùng, cắt đoạn và cấy vào môi trường REM bổ sung 25 mg/l BAP sao cho chồi hướng lên. Sau 2 – 3 tháng, chồi phát triển, cấy chuyền sang môi trường REM chứa 10% nước chuối xay và không có chất điều hòa sinh trưởng để cây ra rễ sau 1 – 2 tháng tiếp theo. Phương pháp nhân giống từ phát hoa là phương pháp đặc trưng ở Phalaenopsis. Ưu điểm chính của phương pháp này là tạo ra cây con sạch bệnh và đồng nhất về di truyền, điều mà phương pháp gieo hạt truyền thống không thể đạt được. Ngoài ra, việc nhân giống in vitro từ phát hoa có ưu điểm lớn là không làm tổn thương cây mẹ, so với việc nhân giống từ chồi ngọn hoặc lá trưởng thành của cây mẹ. Tuy nhiên, phương pháp này có khuyết điểm là hệ số nhân thấp, do vậy, phương pháp nhân giống vô tính từ phát hoa thường được sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu mô in vitro cho các phương pháp hiệu quả hơn sau này. Một số phương pháp mới như phát sinh PLB trực tiếp từ mô in vitro, tạo mô sẹo và phát sinh phôi vô tính đem lại hệ số nhân cao đều dựa vào nguồn mẫu in vitro tạo thành nhờ nuôi cấy phát hoa (Tanaka và cộng sự, 1997; Park và cộng sự, 2000; 2002a). 1.7.3 Tạo mô sẹo Sự hình thành mô sẹo từ nhiều loại mô khác nhau đã được nghiên cứu ở Phalaenopsis. Tuy nhiên, có rất ít báo cáo công bố về quá trình này. Mô sẹo Phalaenopsis có thể được thu nhận từ chồi ngủ trên phát hoa bằng phương pháp gây vết thương, các chồi ngủ này không có khả năng hình thành chồi nhưng tạo được mô sẹo (Tse và cộng sự, 1971; Hackett và cộng sự, 1973). Có 3 phương pháp gây vết thương như sau: Bỏ 2/3 của mỗi chồi bằng cách cắt xéo theo trục hoa, song song trục thân. Cắt đôi chồi bằng cách cắt dọc trục cuống. Đâm thủng chồi theo chiều dọc trục bằng kim nhọn vô trùng. Phương pháp 1 và 3 cho kết quả hình thành mô sẹo cao nhất trên môi trường Knudson C hoặc MS (Murashige và Skoog, 1962) thay đổi. Các chồi bất định hình thành mô sẹo trên bề mặt, sau đó các mô sẹo tiếp tục phát triển thành chồi. Khoảng 12 cây con có thể hình thành trong 6 tháng tiếp theo trên mỗi nốt, và sau đó các cây khác được tạo ra. Từ phương pháp này, các tác giả đã tiếp tục phát triển phương pháp nhân giống mới thông qua mô sẹo. Tanaka (1976) nuôi cấy chóp rễ từ cây gieo hạt in vitro và thu nhận được dạng mô sẹo màu vàng, các mô sẹo tiếp tục phát triển thành PLB và tái sinh cây con. Lin (1986) tạo được các mô sẹo màu vàng sáng khi nuôi cấy lóng phát hoa non, tỷ lệ mô sẹo tạo thành trên môi trường chứa 1 mg/l BAP là 26% và 53% trên môi trường 5 mg/l BAP. Sagawa (1990) đã tạo được mô sẹo Phalaenopsis và đề nghị quy trình nhân giống. Kim và cộng sự (1994) thu được dạng mô sẹo tơi xốp màu vàng sáng khi nuôi cấy lát cắt mỏng phát hoa Phalaenopsis. Các mô sẹo này sẽ tiếp tục biệt hóa thành phôi, hình thành PLB và tái sinh cây con. Kobayashi và cộng sự (1993) nuôi cấy mô sẹo và tách thành công protoplast. Ichihashi và Hiraiwa (1996) cũng đã nghiên cứu sự phát triển của mô sẹo và cho rằng môi trường làm rắn với gelatin phù hợp cho mô sẹo tăng sinh. Mô sẹo Phalaenopsis có thể thu nhận thành công từ nuôi cấy mô lá in vitro 2 cm và từ PLB (Ishii và cộng sự, 1997), tuy nhiên việc tạo mô sẹo từ PLB dễ dàng hơn từ mô lá khi nuôi cấy trên môi trường VW bổ sung 40 g/l sucrose, 20% (v/v) nước dừa và làm đông với gellan gum. Mô sẹo sau khi chuyển sang môi trường không chứa sucrose sẽ dễ dàng chuyển thành PLB, và sau đó tiếp tục tái sinh cây con trên môi trường thích hợp. Các nghiên cứu trên cho rằng PLB là dạng phôi vô tính ở Phalaenopsis và các mô sẹo tơi xốp màu vàng có khả năng sinh tạo phôi (mô sẹo tạo phôi – embryogenic callus) (Kim, 1994; Ichihashi và Hiraiwa, 1996; Tanaka và cộng sự, 1997). 1.7.4 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis M. Tanaka và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu việc nhân giống vô tính cây Phalaenopsis từ mô lá tại trường Đại học Osaka, Nhật Bản (Tanaka và cộng sự, 1975; Tanaka và Sakanishi, 1977, 1980, 1985). Nguyên liệu cho các thí nghiệm ban đầu của nhóm là mô lá lấy từ cây trưởng thành và từ cây con in vitro tạo thành nhờ gieo hạt. Tuy nhiên các lá trưởng thành này không có khả năng tạo PLB, trong khi đó lá của các cây con mới nảy mầm lại tạo được PLB. Như vậy, khả năng tạo PLB giảm xuống khi tuổi của cây giống tăng lên (Tanaka và cộng sự, 1975). Theo phương pháp này, PLB có thể tạo ra từ nuôi cấy mẫu lá in vitro trên môi trường MS, mỗi mẫu tạo ra trung bình khoảng 3,8 PLB (từ 1 đến 7 PLB) tại mặt cắt của mẫu lá. Các PLB này có thể biệt hoá tiếp tục trên môi trường lỏng Vacin-Went bổ sung 20% nước dừa và tiếp tục được tái sinh trên môi trường gieo hạt Phalaenopsis. Sau khi chuyển sang vườn ươm cây tiếp tục phát triển bình thường và nở hoa. Quy trình này tạo được số lượng lớn cây giống đồng nhất về mặt di truyền. Phương pháp tạo PLB từ nốt phát hoa cắt nhỏ của Phalaenopsis cũng như từ mẫu lá tạo thành từ phát hoa này được Haas-von Schmude (1983, 1985) thực hiện. Các mẫu phát hoa 1 – 1,5 cm mang 1 chồi bên của cây lai Phalaenopsis Munsterland Stern “Alpha”, Babette “Symphony”, Windspiel ‘Dusseldorf’, và Barbara Moler “Firecracker” được sử dụng. Sau khi khử trùng với dung dịch sodium hypochlorite 0,6%, mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS lỏng, lắc 100 vòng/phút trong vài tuần hoặc trên môi trường rắn. Chồi nuôi trong môi trường lỏng tạo ra được PLB trong khi đó các mẫu trong môi trường rắn tạo cây con. Các PLB được tạo thành dọc theo mặt cắt, trên đỉnh và đáy của mẫu lá. Các nhà khoa học đã tìm thấy nhiều tế bào nhỏ với nhân to tương tự ở phôi. Các mô này được cắt và nuôi cấy lỏng lắc trong môi trường MS như mô tả trên. Phương pháp này có thể tạo ra 30000 cây con từ một phát hoa Phalaenopsis Babette ‘Symphony’ ban đầu trong 3 năm, Phalaenopsis Munsterland Stern ‘Alpha’ tạo 10000 cây trong 2 năm, và Phalaenopsis Barbara Moler ‘Firecracker’ tạo 3000 cây con trong 18 tháng (Haas-von Schmude, 1984). Cả 3 cây lai đều từ P. lueddemanniana và P. fasciata, các loài này có khả năng hình thành keiki và dễ tăng sinh hơn cây lai của P. amabilis và các loài có hoa lớn khác. Từ phương pháp của Haas-von Schmude (1983, 1985), tương tự như nghiên cứu của Reuter (1983), có thể thấy các kiểu di truyền Phalaenopsis có đáp ứng khác nhau khi nuôi cấy trong cùng điều kiện. 1.7.5. Tái sinh PLB Phalaenopsis từ nhiều nguồn mô Nhiều quy trình nhân giống đã sử dụng các phần mô của cây con tạo ra từ phát hoa làm vật liệu nuôi cấy (Fu, 1979; Kushnir và Budak, 1980). Zimmer và cộng sự tiến hành nuôi cấy toàn bộ cây con từ chồi in vitro để thu nhận PLB, nghiên cứu được thực hiện tại trường Đại học Kỹ thuật Hannover (Đức) và thu được kết quả khả quan (Zimmer và Pieper, 1976, 1978, 1979). Phát hoa của cây Phalaenopsis lai màu hồng Zada x Zada, Lipperose, và Zauberrose được nhân giống in vitro để tạo ra cây con. Các cây con này sẽ được tách rời thành mô lá, mô rễ, mô cuống và nuôi cấy trên môi trường Knudson C thay đổi có chứa BA và KNA (potassium naphthaleneacetate) giúp cảm ứng sự hình thành PLB. Sau đó, các PLB được nuôi cấy trên môi trường Knudson C để biệt hóa thành cây con. Để thay thế cho nước dừa (do giá thành nước dừa tại Châu Âu cao), sử dụng 10% nhựa cây bulô thêm vào môi trường Knudson C để giúp PLB phát triển (Zimmer và Pieper, 1976). Phương pháp có thể tạo ra khoảng 500 đến 1000 cây có thể được tạo thành bằng phương pháp này từ một phát hoa ban đầu (Zimmer và Pieper, 1978; Holters, 1983). Tuy nhiên, nhựa của cây bulô không phổ biến nên phương pháp này khó áp dụng rộng rãi ở nhiều nơi khác. Năm 1976, Tanaka phát triển qui trình nhân giống Phalaenopsis từ chóp rễ của cây lai P. amabilis gieo hạt in vitro. Sau đó, cắt các đầu rễ dài 3 mm của cây con mới tạo thành đặt vào môi trường MS bổ sung auxin và cytokinin. Khoảng 40% mẫu 349 ngày tuổi tạo được PLB sau 120 đến 272 ngày trên môi trường MS. Môi trường O (Ojima và Fujiwara, 1962) tạo đươc PLB sau 260 ngày. Sau 3 tháng, các PLB tạo hình cầu ở đỉnh hoặc mặt sau của mẫu chóp rễ. Các khối cầu biệt hóa thành mô sẹo và sau đó phát triển dần thành PLB. Chỉ 10% mẫu 194 ngày tuổi hình thành sinh khối mô sẹo màu sáng trên môi trường MS cải biến. Khi các mô sẹo được tách rời và cấy chuyển sang cùng môi trường sẽ thu được 12 PLB. Các PLB sau đó có thể tăng trưởng thành cây con trên mô trường gieo hạt. Một số chóp rễ không tạo được PLB đã kéo dài và phát triển chồi. Các mẫu rễ từ cây con thường không có giá trị nhiều vì chúng không được sử dụng để nhân sinh khối. Tuy nhiên các mẫu mô rễ của cây con sau khi cắt rời có khả năng tạo PLB và tái sinh cây con (Zimmer và Pieper, 1978). Vì chất lượng hoa của các cây này ổn định, do vậy quy trình này có thể được ứng dụng rộng rãi. Năm 1986, Lin đã nhân giống Phalaenopsis bằng cách cắt các phiến mô mỏng của mẫu lóng phát hoa. Lóng phát hoa của cây Phalaenopsis lai 3 năm tuổi trồng trong vườn ươm được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy. Các PLB thường tạo được ở các phát hoa 60 – 75 ngày tuổi và năng suất PLB cao nhất khi dùng phát hoa 35 – 45 ngày tuổi. Các phát hoa từ 180 ngày tuổi trở lên sẽ không tạo được PLB. Các phát hoa già thường chỉ tạo PLB ở phần nốt giữa gần đỉnh. Đối với các mẫu phát hoa đã bắt đầu nở hoa không có khả năng tạo PLB, chỉ những mẫu phát hoa non gần đỉnh mới tạo được 22,5 đến 44,7% PLB. Tần số cảm ứng PLB cao nhất (62,9% đến 77,1%) thu được khi dùng các mẫu phát hoa non chưa tạo hoa. Phát hoa Phalaenopsis vẫn còn khả năng tái sinh PLB (4,8 đến 6,5%) ở vị trí gần đỉnh dù phát hoa đã cho hoa nở xong. Năng suất PLB cao nhất thu được trên môi trường chứa 1 mg/l BAP không bổ sung auxin, và sau đó là môi trường 5 mg/l BAP không auxin. Một số PLB hình thành khi bổ sung 1 mg/l NAA vào môi trường có BAP, các PLB này không tròn. Trên môi truờng chỉ có kinetin, hoặc kinetin và NAA, hay BAP không có sự hình thành PLB. Các PLB được cấy chuyền sang cùng môi trường chứa BAP 1 mg/l, không bổ sung auxin để tái sinh cây con. Phương pháp nhân sinh khối PLB bằng bioreactor cũng đã được phát triển bởi Park và cộng sự (2000). Các PLB hình thành từ mô lá in- vitro là nguyên liệu để nuôi cấy bioreactor. Nuôi cấy chìm chu kỳ trong 2 lít môi trường Hyponex bổ sung than hoạt tính, độ thông khí trong bioreactor là 0,5 hoặc 2,0 ppm trong vòng 8 tuần sẽ tạo được 18000 PLB mới từ 1000 PLB ban đầu. Qua đây, vai trò kích thích sự tăng sinh PLB của than hoạt tính được chứng minh. Ngoài ra, trong số các môi trường sử dụng để tái sinh cây con từ PLB như MS, VW, KC, Lindemann và Hyponex thì môi trường Hyponex thích hợp nhất (Park và cộng sự, 2000; Ishii và cộng sự, 1997). 1.8 PHÁT SINH PHÔI VÔ TÍNH Ở PHALAENOPSIS 1.8.1 Thuật ngữ Protocorm là thuật ngữ được đặt ra đầu tiên bởi nhà quản lý Melchoior Treub của vườn bách thảo Bogor Indonesia (hiện nay là vườn Kebun Raya), ông dùng từ này để chỉ một giai đoạn phát triển của rêu (Treub, 1890). Sau đó Noel Bernard dùng protocorm cho các cây họ lan vào những năm 1899 – 1910. Hiện nay, protocorm dùng để mô tả những cấu trúc hình cầu nhỏ của lan hình thành từ hạt. Các thể có cấu trúc tương tự hình thành từ các mẫu cấy in vitro không được gọi là protocorm. Protocorm like body (PLB) là thuật ngữ dùng để chỉ các thể có cấu trúc tương tự protocorm được hình thành từ mô nuôi cấy hoặc mô sẹo in vitro. Thuật ngữ này được ông Georges Morel sử dụng đầu tiên trong một bài báo tiếng Anh về nuôi cấy chồi đỉnh. Preembryogenic determined cell (PEDC) là thuật ngữ dùng để chỉ những tế bào tiền phôi, có khả năng hình thành phôi vô tính trực tiếp. Induced embryonic determined cell (IEDC) là thuật ngữ dùng để chỉ những tế bào có khả năng phát sinh tế bào phôi, từ đó mới hình thành phôi. Giai đoạn IEDC xảy ra trước PEDC. 1.8.2 Phôi hữu tính ở thực vật họ lan Phôi của các loài thực vật thuộc họ lan có kích thước rất nhỏ và chưa phân hóa. Quá trình phát triển của phôi lan có thể phân biệt với phôi của các loài thực vật có hoa khác như sau: Phôi ở thực vật hai lá mầm: dạng cầu à dạng thủy lôià dạng có lá mầm. Phôi ở thực vật một lá mầm: dạng cầu à dạng khiên à dạng diệp tiêu. Phôi ở thực vật họ lan: dạng cầu à dạng chuyển tiếp à dạng protocorm. Giai đoạn đầu phát triển của phôi ở các loài thuộc họ lan tương tự với những loài thực vật có hoa khác (Veyret, 1965; 1974). Lần phân chia đầu tiên tạo ra phôi hợp tử ở giai đoạn 2 tế bào. Sau khi phân chia, các tế bào ban đầu phân chia thành phôi 4 tế bào. Sau đó tế bào phân chia đồng đều hoặc không đồng đều để hình thành dạng phôi cầu (Savina, 1965; Shamrov và Nikiticheva, 1992; Andronova, 1997a; Clements, 1999). Vỏ phân sinh ngọn (protoderm) có thể nhận thấy rõ ở giai đoạn phôi cầu. Các tế bào vỏ phân sinh ngọn ở phôi lan có hình dạng và kích thước khác nhau (Johansen, 1950; Andronova, 1997b). Sự khác biệt về hình thái giữa phôi của các loài họ lan với các họ thực vật có hoa khác được nhận thấy rất rõ từ giai đoạn phôi cầu. Ở các thực vật có hoa khác, tất cả tế bào của phôi cầu đều thuộc mô phân sinh. Riêng phôi lan, chỉ tế bào đỉnh và tế bào mô phân sinh ngọn mới phân chia để kéo dài, còn các tế bào khác sẽ không phân chia hoặc tăng kích thước. Vì vậy phôi lan có hai vùng phân chia rõ ràng: cực chồi với tế bào nhỏ và cực đáy với tế bào lớn. Tế bào ở các vùng này phân chia thành nhiều kích cỡ khác nhau. Kích thước tế bào ở “vùng tế bào nhỏ” phụ thuộc vào giai đoạn phát triển của phôi lan, vùng tế bào này có thể chiếm hơn 1/3 phôi ở hạt trưởng thành, còn lại là tế bào nhu mô có kích thước rất lớn, chứa tế bào chất đậm đặc (Veyret, 1965; 1974; Batygina à Nikitiche và Vasilyeva, 1983a, 1983b; Shamrov và Nikiticheva, 1992). Dựa vào đặc tính phát sinh tử diệp, phôi lan được phân chia thành hai nhóm: Nhóm phôi không mang tử diệp: các phôi này thường có hình bầu dục, chẳng hạn ở loài Dactylorhiza baltica. Nhóm phôi có mang tử diệp: các phôi này thường có hình thuôn dài, chẳng hạn ở Polystachya microbambusa, Dendrochilum glumaceum. Cấu trúc dạng lá phát sinh đầu tiên của protocorm ở cả hai nhóm có thể được xem là tử diệp (Burgeff, 1936; Teryokhin, 1977) hoặc lá (Batygina và Vasilyeva, 1983a, 1983b), một số nghiên cứu khác còn cho rằng tất cả cấu trúc dạng lá hình thành đầu tiên của protocorm đều là là tử diệp (Teryokhin, Nikiticheva, 1968). Ở phần cực của phôi và protocorm là một cực chồi, tại cực này các lá (hoặc tử diệp) phát triển bao quanh cực chồi (ở Listera ovata) hoặc hình thành dạng lưỡi liềm (ở Dactylorhiza baltica). Phôi lan gồm vỏ phân sinh ngọn, nhu mô và một cực chồi. Mô mạch không phát triển trong giai đoạn phôi, vì vậy, phôi lan không chứa vùng mô phân sinh rễ. Trong khi đó, phôi ở các loài thực vật có hoa khác luôn phân rõ hai cực chồi, rễ. Đây là điểm khác biệt lớn giữa phôi lan với các loài thực vật có hoa khác. Một số nghiên cứu cho rằng phần đáy protocorm có thể xem là “trục hạ diệp” (Nishimura, 1991; Teryokhin, 1997), phần này có khả năng phát sinh hình thái như hình thành lông biểu bì (epidermal hair), các cụm lông thường phủ dày ở phần đáy và rụng đi khi rễ bắt đầu hình thành, lúc này rễ sẽ mang nhiều lông (Duckett và cộng sự, 1994). Tuy nhiên, do phôi lan không mang tử diệp, do vậy “trục hạ diệp” thực chất là “phần gốc phôi mang nhiều lông”, và thuật ngữ “trục hạ diệp” không phù hợp (Vinogradova và Andronova, 2002). Hạt lan không có nội nhũ nên phần gốc phôi mang nhiều lông có nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng trong môi trường để hạt nảy mầm. Vì vậy, phần gốc phôi này có vai trò tương tự nội nhũ (Batygina và Vasilyeva, 1983b). 1.8.3 Phát sinh phôi vô tính Ngược với sự phát sinh cơ quan chỉ tạo ra hoặc cực rễ hoặc cực chồi, sự phát sinh phôi vô tính giúp tạo ra một cấu trúc hai cực, cả cực rễ lẫn cực chồi. Các phôi vô tính được nghiên cứu trên hơn 130 loài, bao gồm các loài ngũ cốc, các loài cỏ, cây họ đậu và các cây có quả hình nón (Ammirato, 1983a; Rangaswamy, 1986; Wann, 1988). Đầu tiên, phôi vô tính được nuôi cấy thành công từ các tế bào đơn trong dịch treo tế bào cà rốt bởi Steward (Steward và cộng sự, 1958) và Reinert (1958, 1959). Các tế bào trải qua 2 giai đoạn phát triển chính: các tế bào được cảm ứng để có chức năng sinh tạo phôi và sau đó là sự phát triển của chúng thành các phôi. Theo Sharp và cộng sự (1980, 1982), phôi vô tính có thể được thu nhận trong điều kiện in vitro thông qua hai con đường: Phôi được hình thành trực tiếp từ mẫu mô cấy ban đầu. Phôi được hình thành gián tiếp thông qua mô sẹo hoặc khối mô tương tự. Quá trình tạo phôi rất mềm dẻo nhưng theo một khuôn khổ nhất định, phụ thuộc vào các tế bào biệt hóa từ phôi hợp tử. Quá trình này chịu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy, môi trường sử dụng, sự khéo léo, kinh nghiệm trong việc chọn lựa xử lý mẫu mô nuôi cấy (Ammirato, 1983a). Hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào sự phát triển của phôi hơn là cả quá trình hình thành và phát triển để xác định được đặc điểm sinh lý, sinh hóa của phôi. Có nhiều tế bào phát sinh tế bào phôi mà không cần chất kích thích sinh trưởng như tế bào cây cà rốt (Daucus carota), đậu ván (Albizia lebbeck), ngược lại, nhiều loại tế bào cần auxin để tiến hành phân bào trước khi phát sinh tế bào phôi như ở một số loài hai lá mầm. Phương thức hoạt động của auxin trong sự phát sinh tế bào phôi (IEDC) cho đến nay vẫn chưa rõ nhưng sự có mặt của auxin thường thúc đẩy sự phân chia tế bào và tạo ra tế bào xốp (Evans và cộng sự, 1981). Tuy nhiên, các giai đoạn phát triển tiếp theo của phôi bị ức chế bởi auxin, cũng như gibberellin và abcisic acid (Fujimura và Komamine, 1975). Quá trình phát sinh phôi vô tính ở Phalaenopsis được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Theo các nghiên cứu này, phôi vô tính của Phalaenopsis có thể được tạo từ dạng mô sẹo tơi xốp nhờ nuôi cấy các mô trưởng thành in vitro (Kim, 1994; Ishii và cộng sự, 1997). Intuwong và Sagawa (1974) tiến hành nuôi cấy chồi đỉnh của Phalaenopsis và mô tả sự phát triển của PLB. Sau một tháng nuôi cấy, PLB màu vàng nhạt được tạo ra từ mẫu chồi ngủ và chồi nách. Ban đầu, các PLB có đường kính dưới 0,5 mm, tròn và nhăn. Sau đó khi đường kính là 0,5 – 1 mm thì các PLB chuyển sang màu sáng và phát triển nhiều cụm lông ở nửa dưới. Khi đạt đến đường kính 1 – 3 mm thì chúng chuyển sang màu xanh thẫm (màu xanh của lá mầm xuất hiện sau đó), lúc này các cụm lông vẫn tồn tại. Sau đó lá và rễ xuất hiện ở gần đáy khi PLB dài 4 mm. Đường kính của chúng không đổi khi các lá lớn thêm, rễ kéo dài và phát triển màng bao (velamen), quá trình này cần khoảng 3 tháng để phát triển. Quan sát mô học sự hình thành PLB thấy rằng sau 3 ngày nuôi cấy trong môi trường chứa 1 mg/l BA không có xảy ra thay đổi gì trên mô nuôi cấy (Lin, 1987). Các tế bào phân chia ở vùng biểu bì sau 7 ngày. Sau 11 ngày, tế bào phân chia rộng thành lớp vỏ đầu tiên và hình thành bó mạch ở dưới bề mặt cắt. Sau 15 ngày bắt đầu tạo ra các chỗ sưng phồng, do các tế bào ở vùng biểu bì và mặt cắt phân chia hình thành. Các PLB hình thành vùng biểu bì, vùng vỏ và các bó mạch trưởng thành, và vùng nhu mô sau 45 – 60 ngày. Các PLB mới hình thành không liên kết mạch với các mô khác, có hình dạng tương tự với protocorm từ gieo hạt, như vậy có thể kết luận PLB tương tự phôi vô tính (Nishimura, 1981; Ishii và cộng sự, 1997). Haas-von Schmude (1983, 1985) thực hiện nuôi cấy mô lá trên môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng. Sau một thời gian nuôi cấy các PLB hình thành dọc theo mặt cắt, trên đỉnh và đáy của mặt cắt lá. Quan sát dưới kính hiển vi thấy có sự hiện diện của nhiều tế bào nhỏ với nhân to tương tự ở phôi. Phôi vô tính hiện nay được xem là kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả hơn trong nhân giống cây trồng mà kỹ thuật nhân giống vô tính theo phương pháp cổ điển có hạn chế. Hơn nữa, kỹ thuật nhân giống bằng phôi vô tính có thể thực hiện trên quy mô công nghiệp nhằm tiết kiệm diện tích không gian, thực hiện tự động hóa với công lao động thấp nhất. Ngoài ứng dụng trong sản xuất giống công nghiệp, phôi vô tính còn có nhiều ứng dụng quan trọng khác, như sử dụng để tạo hạt nhân tạo, chuyển gen thực vật nhằm bảo vệ nguồn gen thực vật, bảo quản giống cây trồng, tạo giống cây mới. 1.8.4. Nuôi cấy mô sẹo Mô sẹo là khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không đồng nhất do không có lớp nhu mô. Mô sẹo có thể được hình thành từ nhiều nguồn mô khác nhau và có khả năng phát sinh phôi hoặc cơ quan tùy vào điều kiện nuôi cấy. Đặc điểm sinh trưởng của mô sẹo có liên quan với cơ quan hình thành mô sẹo, thành phần môi trường nuôi cấy, và điều kiện nuôi cấy. Sự hình thành mô sẹo chia ra ba giai đoạn: Phát sinh mô sẹo: Sự trao đổi chất kích thích tế bào chuẩn bị phân chia, giai đoạn này phụ thuộc vào loại mô mẫu, tình trạng sinh lý mẫu và điều kiện nuôi. Phân chia tế bào: Sau khi hình thành, các tế bào mô sẹo phân chia nhanh. Biệt hóa: Tế bào mô sẹo đi vào quá trình biệt hóa, xuất hiện các con đường trao đổi chất dẫn đến sự sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học. Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm. Trong quá trình phát triển, mô sẹo thường xuất hiện hai loại tế bào: Tế bào xốp, không bào to, nhân nhỏ và tế bào chất loãng. Tế bào chặt, không bào nhỏ, nhân to và tế bào chất đậm đặc. Quá trình phát sinh phôi gián tiếp thường thông qua giai đoạn mô sẹo. Lúc này, dạng mô sẹo tơi xốp có chứa nhiều tế bào sinh phôi (IEDC hoặc PEDC) có khả năng phát sinh phôi thành công. Đối với Phalaenopsis, mô sẹo (embryogenic callus) mang nhiều tế bào PEDC sẽ tạo phôi vô tính khi được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. 1.8.5 Quy trình nhân giống in vitro lan hồ điệp sạch bệnh Trong các bệnh gây hại trên cây hoa lan thì virus là bệnh nguy hiểm nhất, rất khó kiểm soát và phòng trị. Khi cây trồng bị nhiễm bệnh virus thì rất khó chữa trị và thường phải loại bỏ. Hiện nay người ta đã phát hiện hơn 50 virus ký sinh trên cây hoa lan, trong đó Cymbidium mosaic virus (CyMV) và Odontoglossum ringspot virus (ORSV) là hai loại virus phổ biến nhất, chúng có mặt trên toàn cầu. Hai bệnh virus này đã được đưa vào danh mục cấm của nhiều nước nhập khẩu cây trồng trên thế giới (Zettler, F. W. et al. 1990; Hu, J. S., et al. 1993; Wong, S. M. et al. 1994; Ajjikuttira et al., 2002). Các virus này tồn tại khá ổn định, chúng lan truyền trên diện rộng nhờ côn trùng trích hút làm môi giới hoặc các dụng cụ giải phẫu, trồng trọt (Wong, S. M. et al. 1994). Virus CyMV và ORSV ký sinh trên hầu hết các giống, loài hoa lan. Chúng tồn tại độc lập hoặc song tồn trên cùng một cây và xuất hiện ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây lan (từ chồi in vitro đến cây sản phẩm). Kết quả điều tra 4 năm liền (1988-1991) ở Singapore cho thấy: 12 giống thuộc 4 trại trồng hoa lan thương phẩm có 54,6% cây bị nhiễm CyMV; 4% nhiễm ORSV và 14,2% nhiễm cả hai bệnh. 29 giống lan của các vườn Bách thảo, có 34,5% cây bị nhiễm CyMV; 0,3% nhiễm ORSV và 8,3% nhiễm cả hai bệnh. 13 giống lan nuôi cấy trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của thảo cầm viên, có 50,5% cây bị nhiễm bệnh virus CyMV, không bị nhiễm bệnh ORSV và 0,5% nhiễm cả hai bệnh. Kết quả này cho thấy hai bệnh virus này xuất hiện phổ biến trên hầu hết các giống hoa lan, chúng xuất hiện và tồn tại ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây, từ cây in vitro trong phòng nuôi cấy mô đến cây trưởng thành và cây sản phẩm trong vườn sản xuất. Cây sạch bệnh (Pathogen-free plants): Trong nuôi cấy mô thực vật, việc vô trùng dụng cụ nuôi cấy và xử lý vật liệu nuôi cấy chỉ làm sạch được nấm và vi khuẩn. Việc làm sạch virus trên vật liệu nuôi cấy, hay nói khác đi là loại virus khỏi cây trồng để tạo cây sạch bệnh (pathogen free plants), từ những năm 1950, trên thế giới đã áp dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Vì mô phân sinh ở đỉnh chồi hay ở chóp rễ thường virus tập trung rất ít hoặc không tập trung (Kassanis năm, 1957). Nhiều nghiên cứu cho rằng nuôi cấy mảnh mô phân sinh của đỉnh chồi hoặc chóp rễ (phần mô nằm phía ngoài cùng) lấy trên cây bị nhiễm bệnh virus, có kích thước khoảng 0.1mm thường loại trừ được virus ra khỏi cây trồng. Cây trồng bị nhiễm bệnh virus nếu giữ ở điều kiện nhiệt độ cao hơn nhiệt độ bình thường sẽ làm ngưng sự di chuyển của virus trong cây (Berg và Bustamante, 1974). Dựa trên nghiên cứu này, trước khi cắt mô phân sinh đỉnh để nuôi cấy người ta thường xử lý cây vật liệu nuôi cấy ở nhiệt độ 36-370C liên tục trong vòng 6 tuần, để tăng khả năng tạo cây sạch bệnh virus. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh vẫn bị tái nhiễm virus do quá trình thao tác khi giải phẫu. Mặt khác tỉ lệ sống sót và khả năng tái sinh cây từ đỉnh sinh trưởng thường không cao do kích thước mẫu (mô) quá nhỏ, các tế bào ở đỉnh sinh trưởng thường bị chết do vết cắt và những tác động của môi trường nuôi cấy (Bommineni và cộng sự, 1989). Quy trình tạo và nhân cây giống hoa lan sạch bệnh (Nguyễn Ngọc Quỳnh, 2007) Xét nghiệm RT- PCR lần 2virus CyMV và ORSV Cây lan mẫu cần nhân giống (cây có phát hoa) Xét nghiệm RT- PCR lần 1virus CyMV và ORSV Cây không bị bệnh virus CyMV, ORSV Cây bị bệnh virus CyMV, ORSV Cây lan hồ điệp giống in vitro sạch bệnh Vườn ươm cây in vitro lan hồ điệp Chồi in vitro tạo từ mắt ngủ Chồi siêu sạch tạo từ PLB và cụm chồi Nuô