Đồ án Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHOA MƠI TRƯỜNG VÀ CƠNG NGHỆ SINH HỌC ------------o0o----------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG PHÁT SINH HÌNH THÁI CỦA LÁT MỎNG TẾ BÀO PHÁT HOA ĐỒNG TIỀN (Gerbera jamesonii) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Chuyên ngành: Cơng Nghệ Sinh Học Mã ngành : 111 GVHD: CN. BÙI VĂN THẾ VINH SVTH : ĐẶNG LÂM TRÚC MSSV : 105111070 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009 1. Đầu đề Đồ án tốt nghiệp: “Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro” 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): ™ Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi 3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 01/04/2009 4. Ngày hồn thành nhiệm vụ: 24/06/2009 5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn CN. Bùi Văn Thế Vinh Tồn bộ Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thơng qua Bộ mơn. Ngày tháng năm 2009 CHỦ NHIỆM BỘ MƠN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HỒ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC ------------------------ KHOA : MƠI TRƯỜNG & CNSH BỘ MƠN : CNSH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN : ĐẶNG LÂM TRÚC MSSV : 105111070 NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : 05DSH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MƠN Người duyệt (chấm sơ bộ): ……………………… Đơn vị:…………………………………………… Ngày bảo vệ:…………………………………….. Điểm tổng kết:…………………………………… Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: Lời cảm ơn Cuối cùng tơi cũng được đặt chân vào trường Đại học, đĩ khơng chỉ là mong ước của chính bản thân mà cịn là điều kỳ vọng của những người thân của tơi. Và mục tiêu kế tiếp là được như các đàn anh được làm luận văn tốt nghiệp. Ngay lúc này đây, tơi vẫn cịn đang “sợ” vì khơng biết mình cĩ được bảo vệ đề tài hay khơng? Đơn giản, chỉ vì khả năng làm luận văn cịn quá tệ để mà … Câu viết xin được bỏ ngõ, thay vào đĩ tơi sẽ cố gắng – cố gắng hơn nữa. Đề tài của mình sẽ là gì ??? Tơi vẫn chưa biết chính xác trong khi luơn ao ước là được làm luận văn. Nhưng thật may mắn, Đại học năm thứ 3 tơi cũng đã chọn được cho mình hướng đi khi được học mơn Cơng nghệ thực vật. Biết được Thầy, người truyền đạt kiến thức và khơi dậy niềm yêu thích từ lâu trong bản thân mình. Khơng biết nĩi gì hơn, người học trị này xin chân thành cảm ơn thầy –Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, tuy chưa lần nào được gọi trực tiếp là thầy, nhưng tơi vẫn luơn mong mỏi điều đĩ. Vì thầy đã là người khơi dậy niềm đam mê nghiên cứu khoa học từ một người học trị mà lẽ ra chỉ yêu thích Cơng nghệ thơng tin… Chính nhờ thầy mà giờ đây, em đã may mắn được học hỏi từ người học trị ấy. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy – Bùi Văn Thế Vinh, người hiện đang dẫn dắt và hướng dẫn tận tình khơng những cho em mà cịn 3 người học trị khác nữa. Để cĩ thể viết ra cuốn luận văn này, em xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Kỹ Tthuật Cơng Nghệ và thầy cơ phịng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện để em cĩ thể hồn thành đề tài này. Tơi cũng cám ơn các bạn, những người đã gắn bĩ cùng tơi trong những tháng vừa qua tại phịng thí nghiệm, đĩ sẽ luơn là kỷ niệm hạnh phúc trong tơi : Hiền, Xuân, Quyên cám ơn các bạn nhé. Ngồi ra, người đã luơn ủng hộ tơi trong những lúc chán nản sau khi gặp nhiều thất bại khi làm luận văn, đĩ là Phúc, người bạn thân nhất của tơi. Vẫn cịn nhiều lời cảm ơn mà tơi thực sự muốn gủi đến như bạn Trinh, Cẩm, Khánh Linh và thầy Thành nữa, nhờ thầy mà khơng khí ở phịng thí nghiệm thực vật “bùn tẻ” này đã trở nên vui nhộn và ấm áp. Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ nhiều lắm, điều mà cĩ lẽ con chưa bao giờ nĩi ra : con yêu ba mẹ và nhĩc con “lớn xác”- nhỏ em cũng như người bạn của tơi. Đồng Nai, tp. Biên Hịa ngày 29 tháng 6 năm 2009 Đặng Lâm Trúc MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt .............................................................................................. i Danh mục bảng ........................................................................................................ii Danh mục hình........................................................................................................iii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ......................................................................1 1.2.1. Mục đích ........................................................................................................1 1.2.2. .Nội dung ........................................................................................................1 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống..............................................................2 2.1.1. Khái niệm.......................................................................................................2 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ ...............................................................2 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro..........................................................................2 2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro ...................................6 2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định ..........................................................................7 2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định..............................................................................9 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro ..............................11 2.1.5.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy.............................................................................11 2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng và phát triển của thực vật ..........14 2.1.6. Các chất khử trùng hĩa học được dùng trong nuơi cấy mơ............................15 2.2. Kỹ thuật nuơi cấy lớp mỏng tế bào ..............................................................17 2.2.1. Giới thiệu .....................................................................................................17 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào ...........................................................17 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào...........19 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền ........................................................21 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền ..........................................22 2.3.1.1. Vị trí phân loại ...........................................................................................22 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái .....................................................................................22 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ....................................................................................23 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền .....................25 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 30 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 30 3.1.2. Mẫu cấy....................................................................................................... 30 3.1.3. Các loại mơi trường..................................................................................... 30 3.1.4. Điều kiện nuơi cấy....................................................................................... 30 3.2. Phương pháp thí nghiệm............................................................................. 31 3.2.1. Khử trùng mẫu ............................................................................................ 31 3.2.2. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel ... 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 32 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 33 3.2.2.4. Thí nghiệm 4: : Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................ 34 3.2.3. Phân tích thống kê ....................................................................................... 34 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền .......................................................................38 4.3. Thí nghiệm 3: Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền ................................................41 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận.........................................................................................................48 5.2. Đề Nghị..........................................................................................................48 Phần 6 : TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. Tài liệu tham khảo trong nước.......................................................................a 6.2. Tài liệu tham khảo nước ngồi.......................................................................a e Danh mục chữ viết tắt f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e i f # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Danh mục chữ viết tắt ¾ MS : MS medium (Murashige và Skoog, 1962) ¾ TCL : Thin cell layer ¾ tTCL : Transverse thin cell layer ¾ lTCL : Long thin cell layer ¾ ELS : Embro-like structure ¾ NAA : Naphthalene acetic acid ¾ BA : 6-benzylladenine acid ¾ TDZ : N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea e Danh mục bảng f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e ii f #Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Danh mục bảng Bảng 3.1. Nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu cấy Bảng3. 2. Mơi trường khảo sát nồng độ BA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.3. Mơi trường khảo sát nồng độ NAA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.4. Khảo sát nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự ti sinh chồi của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Javel lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. e Danh mục hình f Danh mục hình Hình 2.1. Mười hai lồi thuộc họ Cúc (Asteraceae), từ các phân họ Asteroideae, Cichoriodeae và Carduoideae. Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) Hình 2.3. Một số lồi hoa Đồng tiền trên thế giới. Hình 2.4. Cụm hoa đầu (B - C) và hoa Đồng tiền. Hình 4.1. Ảnh hưởng chất điều hịa tăng trưởng lên sự phát sinh hình thái tTCL phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e iii f # Đặng Lâm Trúc Khoa MT & CNSH 05DSH e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 1: MỞ ĐẦU e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 1 - 1.1. Đặt vấn đề Hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) là cây cảnh thuộc họ cúc (Asteraceae). Cây rất phổ biến được dùng làm cây trang trí trong sân vườn hay dùng làm cây cắt cành. Nên cĩ tầm quan trọng về mặt thương mại, hoa Đồng tiền đứng hàng thứ năm trong số các loại hoa được cắt để bán trên thế giới (chỉ sau hoa hồng, cẩm chướng, cúc đại đĩa và tulip). Ngồi ra cây cịn chứa các dẫn xuất của comarin nguồn gốc tự nhiên – cĩ tính chất chống đơng máu. Nhân giống in vitro là một cơng cụ kỹ thuật quan trọng nhằm tạo một số lượng cây lớn mà vẫn giữ được đặc tính di truyền như cây mẹ. Trên thế giới cũng như Việt Nam đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về cây hoa Đồng tiền trong lĩnh vực nuơi cấy in vitro, và đã thiết kế được nhiều quy trình nhân giống số lượng lớn và đồng nhất từ mẫu ban đầu là chồi đỉnh, cuống lá, mặt lá, rễ, đế hoa, và cánh hoa. Đề tài “Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vtro” nhằm bổ sung thêm nguồn mẫu ban đầu để xây dựng một quy trình nhân giống mới từ tế bào phát hoa. Trong nghiên cứu này, mẫu cấy sử dụng là các lát mỏng tTCL được cắt từ phát hoa cây Đồng tiền. Các kết quả cho thấy được kỹ thuật nuơi cấy lát mỏng tế bào phát hoa tương lai cĩ thể dùng để nhân giống cây hoa Đồng tiền cùng với các kỹ thuật khác đã nghiên cứu thành cơng 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu thực hiện nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro . 1.2.2. Nội dung Nghiên cứu khử trùng mẫu cấy để xác định nồng độ hĩa chất, thời gian khử trùng tối ưu. Nghiên cứu các nồng độ của chất điều hịa sinh trưởng ảnh hưởng lên mẫu cấy. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 2 - 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuơi cấy mơ đều là thuật ngữ mơ tả các phương thức nuơi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm cĩ chứa mơi trường xác định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trường cĩ chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khống, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Cơng Kiên, 2002). 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật cĩ ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nĩ cĩ giá trị đĩng gĩp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: 9 Lai tạo giữa những lồi xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuơi cấy tế bào trần). 9 Nuơi cấy tế bào thực vật trong mơi trường lỏng (nuơi cầy huyền phù tế bào) trên quy mơ lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cơng nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nơng nghiệp. 9 Chọn lọc tế bào cĩ những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (nuơi cấy tế bào đơn). 9 Sản xuất dịng cây đồng hợp tử (nuơi cấy bao phấn và túi phấn). 9 Vi nhân giống những giống cây cĩ giá trị khoa học và thương mại. 9 Bảo quản phơi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. 9 Nuơi cấy phơi sinh dưỡng, phơi hợp tử. 9 Nuơi cấy quang tự dưỡng. 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: ¾ Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phịng tăng trưởng. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 3 - Kết quả nhân giống tốt nhất cĩ thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vơ trùng và vẫn cịn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. Mẫu thu được phải rửa dưới vịi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đĩ rửa mẫu bằng xà phịng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vơ trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng cịn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và cĩ thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong mơi trường nuơi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. Mẫu cấy của vài lồi thực vật cĩ thể hĩa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuơi cấy. Khi bị hĩa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hĩa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy cĩ chứa một lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mơ non thường ít bị hĩa nâu hơn mơ trưởng thành hay mơ già. Hiện tượng hoại tử hoặc hĩa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase cĩ nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nĩ được tổng hợp và phĩng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 4 - Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hĩa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5 g/l. Ngồi ra cịn cĩ một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol. Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện tượng hĩa nâu. Tĩm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hĩa nâu của mẫu cấy nên: Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mơ non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào mơi trường. Nuơi cấy mẫu trong mơi trường lỏng cĩ lượng O2 thấp, khơng cĩ ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu. Chuyển mẫu từ mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuơi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ khơng tích tụ. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuơi cấy được cấy trên mơi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Cĩ hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, cĩ những lồi cây trồng khơng cĩ khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mơ sẹo. Để nhân giống, trong mơi trường nuơi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 5 - ¾ Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuơi cấy là những thể chồi, mơi trường nuơi cấy thơng thường giống với mơi trường tạo thể chồi, đơi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuơi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro cĩ trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vơ hạn. ¾ Tái sinh cây hồn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh cĩ đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra mơi trường bình thường. Các chất cĩ tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đĩ là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuơi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngồi, một bước thuần hĩa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hịa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. ¾ Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khĩ khăn nhất trong quá trình nhân giống vơ tính. Cây in vitro được nuơi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng cĩ cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ khơng khí mát, ẩm độ cao…cây con thường được cấy trong luống ươm cây cĩ cơ chất dễ thốt nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thốt nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mơ sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 6 - 2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro Sự tái sinh cơ quan trong nuơi cấy mơ khơng xảy ra ngay khi vừa cơ lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì: ¾ Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình thành. ¾ Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau: 9 Loại bỏ sự phản biệt hĩa của các tế bào phản biệt hĩa (dẫn đến sự trẻ hĩa tế bào). 9 Sự phân chia tế bào (đơi khi dẫn đến sự hình thành mơ sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra. 9 Sự hình thành cơ quan 9 Sự phát triển cơ quan 9 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: 9 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy 9 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngồi thiên nhiên 9 Vị trí của mẫu cấy trên cây 9 Thời gian thu mẫu trong năm 9 Hàm lượng chất điều hịa sinh trưởng thực vật nội sinh 9 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuơi, thành phần dưỡng chất trong mơi trường nuơi cấy, các chất điều hịa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuơi cấy như nhiệt độ, ánh sáng…, sự bổ sung một số cơ chất khác vào trong mơi trường… Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuơi cấy mơ rất phức tạp, chúng ta khơng thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý đến một số vấn đề sau: 9 Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (mơi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hịa sinh trưởng,…). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 7 - 9 Khơng thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các lồi vì mỗi lồi khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau. 9 Khĩ cĩ thể điều hịa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi lồi khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đĩng vai trị quyết định do đĩ các yếu tố ngoại sinh như chất điều hịa ảnh hưởng khơng nhiều. 9 Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sĩt. Để thu nhận một cây hồn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đĩ cảm ứng tạo rễ. 2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giống vơ tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn. Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như: Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin… Cĩ nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định: 9 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành cơng khi sử dụng các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984). 9 Đường luơn luơn đĩng vai trị quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ). 9 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic. 9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định ¾ Ánh sáng Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng cĩ một số trường hợp ngoại lệ là cĩ một số cây trồng lại cĩ thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên mơi trường khơng cĩ cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi cĩ trọng lượng tươi lớn hơn là được nuơi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên mơi trường cĩ BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 8 - lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên mơi trường khơng cĩ cytokinin. ¾ Nhiệt độ Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồ nhưng cũng cĩ một số trường hợp ngoại lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus ( Appelgren và Heide, 1972). ¾ Chất điều hịa sinh trưởng thực vật Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định cĩ phần phức tạp: Cĩ những lồi thực vật về mặt cơ bản khơng cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966). Hầu hết các lồi thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại cĩ vai trị ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968). Cĩ một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đĩ là trường hợp Lili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều lồi thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bơng cải (Margara, 1969). Chúng ta cĩ thể kết luận rằng ở những lồi cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hịa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều lồi thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng). Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng cĩ thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948). Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở lồi Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 9 - chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn cĩ trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas. 2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mơ của chúng cịn giữ khả năng phân sinh. Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nĩ ảnh hưởng đến khả năng sống sĩt của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm. Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền của lồi, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hịa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 2.1.5.1. Anh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuơi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro: ¾ Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thơng thường cĩ khả năng tái sinh mạnh hơn cây một số lá mầm và cây hạt trần rất khĩ tái sinh (trừ khi chúng cịn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một lồi dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng cĩ những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như khơng cĩ khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng cĩ thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này cĩ thể do sự hấp thu các chất điều hịa sinh trưởng cĩ trong mơi trường nuơi cấy. ¾ Tuổi của cây Các mơ phơi thường cĩ khả năng tái sinh cao do đĩ ở ngũ cốc người ta thường dùng phơi và hạt làm vật liệu nuơi cấy mơ. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 10 - chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi. Khi mơ phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đơi khi qua nhiều lần cấy chuyển, mơ phân sinh già từng bước được trẻ hĩa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica. ¾ Tuổi của mơ và cơ quan Những mơ cịn non và mềm thường dễ nuơi cấy hơn những mơ cứng nhưng cũng cĩ nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá cịn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những lồi khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa cịn non đơi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica ( Coumans và cộng sự, 1979). ¾ Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro. Thơng thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đơng (cuối thu đầu đơng) khĩ nuơi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển). ¾ Vị trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ơng nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong mơi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily (Robb, 1957). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 11 - Điều đáng lưu ý là những mơ sẹo phát sinh từ những mẫu cấy cĩ nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều cĩ phản ứng in vitro giống nhau. ¾ Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mơ phân sinh khĩ cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự nĩ cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đĩ mẫu cấy cĩ kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây cĩ chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên mơi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh. ¾ Vết thương Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đĩng vai trị quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hịa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngồi ra, cĩ thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương. ¾ Phương pháp cấy Các mẫu cấy cĩ thể được đặt trên mơi trường theo nhiều cách khác nhau: cĩ cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống mơi trường) hoặc khơng cực (cắm phần ngọn xuống mơi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy khơng cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đĩng vai trị quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy khơng cực cĩ các chất dự trữ khơng cĩ khả năng khuếch tán vào trong agar do nĩ khơng tiếp xúc với mơi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đĩ phương pháp cấy khơng cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy cĩ cực. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 12 - 2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều hịa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp,ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại. Các chất điều hịa nội sinh cĩ thể được kiểm sốt do cơ chế chuyển hĩa của tế bào nên chúng được kiểm sốt hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hịa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế. Cĩ 5 nhĩm chất điều hịa quan trọng trong nuơi cấy mơ thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen. ¾ Auxin Auxin là hợp chất cĩ nhân indole, cĩ cơng thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm cĩ hai loại là auxin cĩ nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D,...). Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nĩ tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hịa tăng trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thầu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phĩng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hĩa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phơi sinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mơ sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả cịn non và lưu thơng từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 13 - thấy rõ trên các cơ quan thực vật cịn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hĩa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luơn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. Đối với một số lồi, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004). ¾ Cytokinin Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong mơi trường nuơi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, cĩ 2 nhĩm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngồi ra cịn cĩ 2 nhĩm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuơi cấy mơ thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi cĩ sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đơi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể. Cytokinin cĩ vai trị trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hĩa, bảo vệ các chất chuyển hĩa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hĩa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn. Tĩm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mơ, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hĩa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuơi cấy in vitro. ¾ Gibberellin Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng GA3. Đây là các chất cĩ cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng cĩ sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây. Tác động này cũng cĩ thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép cĩ một sự chín tốt hơn e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 14 - hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các lồi nho cĩ chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thống hơn). Trong nuơi cấy in vitro, gibberellin cĩ tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng cĩ tác động trên sự đậu trái của các trái khơng hạt, chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống. Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt. ¾ Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái được sử dụng cho phép thu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…). Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều cĩ khả năng tổng hợp etylen, nơi sản xuất quan trọng nhất là trái cây, kế đến ở mức độ kém hơn là hoa, cũng nhu chúng cĩ ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. ¾ Abscisic acid Acid abscisic (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuơi cấy phơi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium (K+), do tác động này nĩ đã ảnh hưởng trên sự đĩng các lỗ hổng của tế bào. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuơi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nĩ cĩ thể hồn tồn (như cây volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nĩ cĩ thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây epinard, lolium temulentum). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 15 - Trong nuơi cấy mơ, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuơi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khĩ khăn. Tĩm lại, trong nuơi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hịa với nhau và trong số đĩ cĩ hai chất chính mà vai trị tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: 9 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ.Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mơ sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. 9 Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mơ sẹo. Các chất hữu cơ khác 2.1.6. Các chất khử trùng hĩa học được dùng trong nuơi cấy mơ Khi tiến hành nuơi cấy mơ khĩ khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống in vitro vơ trùng. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiêm trùng, trong quá trình nuơi cấy cĩ thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì cĩ rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số lồi thực vật được bao phủ bên ngồi bởi một lớp sáp dày hoặc cĩ lơng tơ thì càng khĩ khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngồi ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mơ mạch thì xem như khơng thể dùng phương pháp khử trùng thơng thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Nhằm tăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mơ cấy với xà phịng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng 3 - 5 lần. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 16 - Một số chất khử trùng thường sử dụng như: 9 Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khĩ đào thải, vì vậy cần cẩn thận khi tiếp xúc. 9 Sodium hypochlorite NaOCl: Cĩ trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v). Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mơ thực vật, làm cản trở sự tăng cường của mơ về sau. 9 Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mơ cấy từ 5 – 30 phút. 9 Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuơi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút. 9 Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hĩa cực mạnh, cĩ thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vơ trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mơ thực vật, do đĩ phải rửa thật sạch. 9 Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khơ. 9 Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mơ thực vật, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này. 2.2. Kỹ thuật nuơi cấy lớp mỏng tế bào 2.2.1. Giới thiệu Những biểu hiện về cơ chế kiểm sốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật là những kiến thức cơ bản được áp dụng rỗng rãi. Để phân tích những cơ chế này, chúng ta cần thiết lập một chương trình biệt hĩa cho một mẫu thí nghiện cĩ sẵn trong nuơi cấy in vitro trước khi cố gắng giải thích câu hỏi: làm thế nào để một chương trình biệt hĩa được thực hiện, ví dụ như trong cơ thể thực vật. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 17 - Từ giai đoạn phơi đến giai đoạn trưởng thành, sự biệt hĩa tế bào thực vật trải qua nhiều sự kiện liên kết với nhau, và cuối cùng tạo thành những hình dạng, chức năng, cấu trúc phức tạp. Tất cả các sự kiện này xảy ra trong một mối liên quan hệ thống rất nhạy cảm với các nhân tố mơi trường. Những tác động này thống nhất trên tồn bộ cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, trong đĩ những hiểu biết hết về sự kích thích, tiến trình, vận chuyển của chúng đến các tế bào đích khơng thể dùng để nghiên cứu, mặc dù hiện nay những kỹ thuật về sinh học phân tử rất mạnh. Các khái niệm về mạng lưới ức chế, trong đĩ sự tăng trưởng, phát triển và lão hĩa bắt nguồn từ mối tương quan cĩ thể điều chỉnh giữa: i) cơ quan, mơ, tế bào, ii) các cụm tế bào khác nhau, iii) các bào quan trong tế bào đâ đưa GS. K. Trần Thanh Vân đến với khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 thế kỷ XX. Với hệ thống này SG. K. Trần Thanh Vân cố gắng tách một hoặc một vài lới trong tế bào; và cố gắng chương trình hĩa lại chúng trong nuơi cấy in vitro, trong đĩ “biệt hĩa” là một tiêu chí quan trọng. Tất cả các quá trình biệt hĩa đĩ được kiểm sốt một cách riêng biệt hoặc tái chương trình hĩa theo trình tự thời gian hoặc khơng gian tùy theo người nghiên cứu và khơng bị áp đặt bởi quá trình phát triển cá thể. 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào Hệ thống lớp mỏng tế bào – thin cell layer – TCL bao gồm các mẫu cấy cĩ kích thước nhỏ được cắt ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, phơi). Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được cắt theo chiều ngang gọi là tTCL. Các lTCL (1 mm x 0,5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mơ như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2/0,5 mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mơ khác nhau (mơ biểu bì, mơ vỏ, thượng tầng, mơ ruột hay tế bào nhu mơ) (Tran Thanh Van và Gendy, 1996). tTCL và lTCL cĩ đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đĩng vai trị quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hĩa cĩ thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế bào đáp ứng. Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng khơng mong muốn (Tran Thanh Van, 2002). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 18 - Khi cắt mẫu, mơ thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng cĩ mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phĩng thích của oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng các yếu tố khác bên tong mơi trường để “kiểm sốt” sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên, cũng bởi vì lý do đĩ cĩ thể nĩi chúng khá phụ thuộc vào mơi trường, lát mỏng cĩ ưu điễm là đồng nhất, nên dễ phản ứng một các đồng nhất với mơi trường. Ngược lại các mẫu cấy lớn hơn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với mơi trường và cĩ thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trưởng thực vật nên chúng khơng phụ thuộc nhiều vào mơi trường. Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như tre6nmang những tổ chức khơng gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức khơng gian và thời gian khác biệt với sự tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mơ hay cơ quan cho. Hơn nữa hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần cĩ sự hình thành mơ sẹo, phơi sinh dưỡng trộn lẫn tế bào khơng phải là phơi như các tế bào ống và rễ. Ngược lại, hệ thống TCL cĩ sự hình thành phần đĩ với số lượng lớn hơn. Khơng nhữ chúng được tiếp xúc trực tiếp với mơi trường mà cịn được chương trình hĩa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với khơng gian và thời gian (Tran Thanh Van, 1973). Việc giản số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào cĩ ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hĩa mơ, cơ quan. Bên cạnh đĩ, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu cĩ phản ứng. Như trên mẫu lTCL của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) cĩ kích cỡ 1 x 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây đươc biệt hĩa trực tiếp trên bề mặt TCL (mà khơng e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 19 - trài qua quá trình mơ sẹo trng gian): i) 50 hoa trong chương trình hoa, ii) 500 -700 chồi trong chương trình chồi, iii) 15-20 rễ trong chương trình rễ. Các tính chất mong muốn khác cĩ được trong phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền, và cĩ thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật. Tuy nhiên điều kiện mơi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL cịn phụ thuộc vào lồi và phải thử nghiệm lại tất cá các điều kiện in vitro gồm chất dinh dưỡng, chất điều hịa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ (Tran Thanh Van, 1980). 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào Trên thế giới đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu để ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào trên các đối tượng như cây lương thực, ngũ cốc và dược liệu. Amaranthus edulis Là cây hai lá mầm C4 rất quý, thuơc họ Amaranthaceae. Hạt của cây được quan tâm rất nhiều do cĩ chừa hàm lượng protein (16 – 18%) và lysin cao. Các nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro đối với nhiều lồi đã được báo cáp trên mơ sẹo xuất phát từ mặt lá, trụ dưới lá mầm, cuống lá, thân,phát hoa và cả thân cây Amaranthus. Tuy nhiên, thời gian trung bình cần để tái sinh chồi khoảng 4 – 6 tuần và tần số tái sinh rất thấp đối với các kiểu di truyền được thí nghiệm (Bagga và cộng sự, 1987). Trong một nỗ lực để thu được tần số tái sinh cây cao hơn trong một thời gian ngắn đối với cây A. edulis, Bui và cộng sự (1998) đã sử dụng hệ thống nuơi cấy TCL để cảm ứng biệt hĩa chồi in vitro. Chỉ sau một tuần nuơi cấy, 100% mẫu cấy tTCL từ rễ, lá mầm và trụ dưới đều hình thành mơ sẹo dạng bở và xốp. 100% mẫu cấy tTCL được cắt từ ngọn và vùng cĩ sự tái sinh chồi trực tiếp khơng thơng qua mơ sẹo. Beta vulgaris L. Cĩ nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhân giống in vitro đối với cây củ cải đường. Sự hình thành chồi nách từ đỉnh chồi của cây con (Hussey và Hepher, 1978) và sự phát triển của chồi nách từ các phân đoạn thể phát hoa e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 20 - (Saunden, 1982) là hai phương pháp thường được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn chồi. Kỹ thuật TCL đối với cây củ cải đường là một phương pháp tỏ ra rất hiệu quả trong việc nghiên cứu phát sinh hình thái và vi nhân giống (Dectrez và cộng sự, 1988). Brassica napus Brassica napus (cây cải dầu) khá phổ biến trong việc nghiện cứu nuơi cấy mơ mở rộng. Klimaszewska và keller (1985) đã tiến hành thí nghiệm với các lát mỏng TCL bao gồm biểu bì và lớp tế bào cận biểu bì được cắt dọc theo lĩng thân cây. Chồi cĩ thể được phá hiện ở một đầu cuối cảu mẫu cấy sau 12 – 15 ngày. Hệ thống nuơi cấy này cĩ khả năng tạo ra tần số tái sinh chồi và số lượng chồi trên mỗi mẫu cấy cao. Hơn nữa, nguy cơ nhiễm vi sinh vật của mẫu cấy cũng khơng cịn là một vấn đề nghiêm trọng. Lupinus mutabilis và lipinus albus Đậu lupin là cây trồng quan trọng giúp khắc phục vấn đề thiếu hụt protein trong nguồn dinh dưỡng động vật. Nhưng khả năng thành cơng bị giới hạn trong quá trình nhân giống đối với nhiều lồi đậu lupin đã được báo cáo (Sator, 1985). Mulin và Bellio-Spataru (2000) đã nghiên cứu thành cơng khả năng tái sinh của mẫu cấy TCL được cắt từ vùng nốt trụ dưới lá mầm của cây Lupinus spp. Phaseolus vulgaris L. Là cây đậu xanh, loại đậu chủ yếu tự thụ phấn, cung cấp nguồn protein lớn trong khẩu phần ăn của người dân các nước Mỹ La Tinh và Đơng Phi. Tuy nhiên, cây trồng này rất nhạy cảm với hạn hán và nhiều tác nhân gây bệnh. Việc tạo ra cây đậu chuyển gen cĩ khả năng kháng hạn hoặc mang gen phịng vệ thơng qua di truyền sẽ rất cĩ ích, nhưng quá trình chuyển gen chỉ cĩ thể thành cơng nếu thiết lập được một hệ thống tái sinh cĩ hiệu quả. Cruz de Carvalho và cộng sự (2002) đã phát triển thành cơng một hệ thống tái sinh chồi trực tiếp bằng tTCL, nhờ đĩ tăng khả năng áp dụng phương pháp này cho quá trình chuyển gen. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 21 - Oryza sativa L. Cây lúa đã được trồng như một loại cây lương thực chính yếu cách đêy hơn 7.000 năm và hiện đang nuơi sống hơn 50% dân số thế giới. Trong những năm gần đây, nuơi cấy mơ đĩng một vai trị rất quan trọng trong việc cải tiến chất lượng cây lúa. Tuy nhiên, cũng như các lồi đơn tử diệp khác, khơng phải tất cả các lồi lúa đều đáp ứng như nhau với các điều kiện tái sinh khi nuơi cấy trong ống nghiệm và cần cĩ một quy trình gồm nhiều bước địi hỏi một khoảng thời gian dài để phát triển thành cây hồn chỉnh. Nhut và cộng sự (2000) đã nỗ lực tìm kiếm một phương pháp tái sinh trực tiếp đối với cây lúa bằng cách sử dụng hệ thống nuơi cấy TCL. tTCL được nuơi cấy trong tối 2 tuần và sau đĩ đưa ra sáng . Vào ngày thứ 7, hơn 93% tTCL hình thành các cấu trúc giống phơi (Embryo-like Structure – ELS) trong mơi trường bổ sung 1µM BAP. Các cấu trúc này biệt hĩa trực tiếp thành chồi mà khơng qua trung gian mơ sẹo. Tĩm lại, cây lương thực, thực phẩm và dược liệu tạo nên một phần khơng thể thiếu trong đời sống con người. Cho đến nay, cĩ rất nhiều lồi thực vật chưa đươc nhân giống in vitro thành cơng, quá trình cải thiện và nhân giống với số lượng lớn thơng qua các phương pháp truyền thống hay phân tử vẫn cịn giới hạn. Kỹ thuật TCL cho phép tái sinh thành cơng các cơ quan in vitro và nhờ sự phát sinh hình thái được kiểm sốt đã mở đường cho những thành cơng trong chuyển gen nhờ vào các đặc tính vốn cĩ của hệ thống. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền Thuộc họ Cúc (Asteraeae). Tên gọi Gerbera được đặt theo tên nhà tự nhiên học người Đức Traugott Gerbera. Cĩ khoảng 30 – 100 lồi sống hoang dã, phân bố Nam Mỹ, châu Phi, Madagascar và cùng nhiệt đới châu Á (Nepal, Trung Quốc). Các lồi G.jamesonii được đặt tên khi Robert Jameson cùng một số người đến khu mỏ vàng gần Barberton (phí đơng của núi Drakensberg) thuộc khu Transvaal vào năm 1884. Sau đĩ Bolus, một nhà thực vật học đã gủi mẫu cây gerbera vào vườn thực vật ở Kew (gần London). Cây được hính thức miêu tả bởi Joseph Dalton Hooker, khi thực hiện tạp chí thực vật Curtis năm 1889. Ơng miêu tả Gerbera jamesonii – theo đúng danh pháp e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 22 - khoa học cho lồi này – ở Nam Phi được biết dưới tên gọi là cúc Transvall hay cúc Barberton. Gerbera rất phổ biến và được trồng làm cây trang trí trong các mảnh vườn hay để cắt cành. Các giống trồng tại vườn chủ yếu là lai ghép chéo giữa Gerbera jamesonii và một lồi khác ờ Nam Phi là Gerbera Vindifolia. Giống lai ghép chéo này cĩ tên gọi là Gerbera Hybrida. Cây đa dạng về hình dạng và kích thước hoa, cĩ nhiều màu sắc. Phần trung tâm củ hoa đơi khi cĩ màu đen, thơng thường trên một bơng các cánh hoa cĩ thể cĩ một vài màu khác nhau. Những cây hoa Đồng tiền là một trong những loại hoa trồng chủ yếu là cắt cành. Được nhập khẩu vào Châu Au từ thế kỷ 19, ngày nay cĩ giá trị thương mại kinh tế cao. Phổ biến ở Hà Lan, Columbia, xung quanh các nước Nam Mỹ và Israel. Tại Việt Nam, hoa Đồng tiền khá phổ biến, cĩ giá trị kinh tế và cĩ thể ra hoa ở miền Bắc vì đây là thời gian hiếm hoa trong năm (Nguyễn Quang Thạch, 2002). Với diện tích 2.000m2 trồng hoa Đồng tiền cĩ thể cho thu nhập khoảng 15 triệu đồng/tháng (Nguyễn Hà và Hồng Nhung, 2007). 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền 2.3.1.1. Vị trí phân loại ¾ Giới: Plantae ¾ Ngành: Magnoliophyta ¾ Lớp: Magnoliosida ¾ Bộ: Asterales ¾ Họ: Asteraceae ¾ Chi: Gerbera ¾ Lồi: Gerbera jamesonii Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 23 - 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 9 Thân, lá: thân ngầm, khơng phân cành, chỉ đẻ nhánh, cĩ chiều cao từ 45 – 63cm, cĩ khoảng 10 lá trên một cây. Lá và hoa phát triển từ thân cây, lá mọc chếch một gĩc so với mặt đất một gĩc 15 – 450, hình dáng lá thay đổi theo sinh trưởng của cây (từ hình trứng thuơn đến thuơn dài); lá dài 15 – 25cm, rộng 5 – 8cm, cĩ hình lơng chim, xẻ thùy nơng hoặc sâu (tùy thuộc vào từng loại giống), mặt thân của lá cĩ lớp lơng nhung. 9 Rễ: thuộc dạng rễ chùm, hình ống, phát triển khỏe, ăn ngang và nối với một phần trên mặt đất, vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra. 9 Hoa: hoa là dạng hoa tự đơn hình đầu và bơng hoa được tạo bởi hai loại cánh hoa hình lưỡi và hình ống. Cánh hình lưỡi lớn hơn, xếp thành một vịng hoặc một vài vịng phía ngồi; cánh hình ống nhỏ hơn, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa. Trong quá trình hoa nở, cánh hoa hình lưỡi nở trước, cánh hoa hình ống nở sau theo thứ tự từ ngồi vào trong theo từng vịng một. Cụm hoa đầu cĩ bề ngồi dường như là một bơng hoa, trên thực tế là một tập hợp của hàng trăm hoa nhỏ riệng biệt. Tùy theo từng giống mà phân cấp theo chiều dài cành và kích thước đường kính hoa. 9 Đồng tiền là cây hoa của vụ Đơng xuân nên chịu rét khỏe, chịu nĩng kém hơn. Vào mùa hè cây cho hoa cĩ màu sắc và hình dáng kém chất lượng. Nhưng giống hoa kép và màu nhạt chịu nĩng tốt nhất, cĩ tuổi thọ cao hơn. Hình 2.4. Cụm đầu hoa (B - C) và hoa Đồng tiền (A) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 24 - 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ¾ Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng hoa. Đa số các giống Đồng tiền được trồng hiện nay đều thích hợp ở khoảng nhiệt độ từ 15 – 250C. Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 120C hoặc lớn hơn 350C, cây sẽ kém phát triển. ¾ Ẩm độ: Đồng tiền là cây trồng trên cạn, khơng chịu được úng nhưng lại cĩ sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều, do vậy khả năng chịu hạn kém. Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm khơng khí từ 55 – 65% thuận lợi cho cây Đồng tiền sinh trưởng, phát triển; đặc biệt vào thời gian thu hoạch cần độ ẩm vừa phải để tránh nước đọng trên các vết cắt, gây thối hoa và sâu bệnh phát triển. ¾ Đất đai: Đất cần tơi xốp, nhiều mùn, thống khí, tốt nhất là đất thịt pha cát. Cĩ độ pH 6 – 6,5. Đất phải cĩ khả năng giữi nước và thốt nước tốt, khơng bị ứ đọng trong mùa mưa. ¾ Các yếu tố dinh dưỡng: Các loại phân hữu cơ, phân vơ cơ, phân vi lượng cĩ ý nghĩa quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển, phẩm chất và năng suất hoa Đồng tiền. ¾ Phân hữu cơ chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng mà cây hoa đồng tiền cần, vì tạo nên sự cân đối về dinh dưỡng cho cây, đồng thời cải tạo đất (tăng độ mùn và độ tơi xốp). Phân hữu cơ thường được bĩn lĩt (phân phải được hoại mục). ¾ Các nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cây Đồng tiền. Nếu thiếu các nguyên tố vi lượng này sẽ làm cây ít lá, sự hình thành hoa bị ức chế, hoa nhỏ. ¾ Việc bĩn phân cho cây cần được quan tâm nhiều. Lượng phân bĩn tính cho 1000m2/năm : 70kg vơi (bĩn trước khi cày đất), 120kg Super lân, 40kg Ure, 25kg KCl, 70kg NPK (20 – 15 – 15). ¾ Chăm sĩc: e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 25 - 9 Cây Đồng tiền khơng thích hợp với độ ẩm cao, vì vậy phải tùy theo điều kiện thời tiết mà tưới cây vừa đủ ẩm. 9 Sau khi trồng 80 – 90 ngày cây sẽ cho hoa. Số lá, nụ, hoa cần cĩ tỷ lệ hợp lý. Để đảm bảo cho cây sinh trưởng, phát triển tốt thì trung bình mỗi nhánh cây phải cĩ năm lá cơng năng để cung cấp dinh dưỡng cho cây. 9 Để cây phát triển tốt, phải thường xuyên ngắt bỏ lá già vàng úa, lá sâu, bệnh. Tỉa lá tạo độ thơng thống cho cây, giảm sâu và phịng trừ sâu bệnh. 9 Thu hoạch: Thời gian thu hái hoa c1o ảnh hưởng rất lớn đến độ bền của hoa khi cắm bình, do đĩ thời thu hái tốt nhất là khi cuống hoa đừng thẳng, các cánh hoa phải mở phẳng ra; cây lấy hoa đang ở tình trạng sinh trưởng mạnh. Cắt hoa vào lúc sáng sớm hoặc chiều mát, lúc này cuống hoa dang chứa nhiều nước, tươi được lâu. 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền Hiện nay hoa Đồng tiền được nhân giống chủ yếu bằng hai phương pháp: truyền thống (tách cụm) và vi nhân giống (từ chồi đỉnh, cụm hoa đầu, lá và rễ). Phương pháp nhân giống truyền thống khơng cung cấp đủ số lượng theo nhu cầu thị trường vì hệ số nhân chậm. Trong khi đĩ hệ số của phương pháp vi nhân giống cao hơn và tốc độ nhanh hơn, tuy nhiên vẫn cịn nhiều nghi ngại về tính biến dị soma xuất hiện ở các dịng in vitro thế hệ sau, các dịng cấy chuyển sau này khơng cịn giữ đúng đặc tính ban đầu của cây mẹ. Từ năm 1962, Murashige và Skoog đã tìm ra được mơi trường tái sinh cho cây thuốc lá là mơi trường MS, ngày nay mơi trường này đã được sử sụng chủ yếu trong mơi trường nuơi cấy in vitro đối với cây hoa Đồng tiền. Những nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro ở nhiều lồi Gerbera jamesonii đã được báo cáo đối với các mẫu cấy từ lá và cuống lá (S Kuma, J.K Kanwa và D.R Sharma, 2004); mẫu từ lá, cuống lá và mơ rễ (Azlina, Rosna Mat Taha và Asmah Awal, 2008); chồi cây Gerbera jamesonii Bolus (J.K. Kanwar và D.R sharma, 2008); phát hoa Gerbera hyhrid (Chen-young Chun và Min-chang e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 26 - Huang, 1985). Chuyển gen vào cây Đồng tiền: Teresa Olikowska và Danuta Kucharka, 1996; Purnima Tyagi and S. L. Kothari, 2004; các tác giả V. Nagaraju, G.S.L. Srinivas và G.Lakshmi Sita (1998) đã nghiên cứu và chuyển được các gen nptII và uidA cho cây hoa Đồng tiền dịng RCGH 164 bằng vi khuẩn Agrobacterium. Các kết quả thu được từ các thí nghiệm cho thấy mẫu cấy từ hạt, lá và cuống lá đều tạo được nhiều chồi trên mỗi mẫu cấy. Sự tái sinh từ phát hoa, cụm hoa đầu bị hạn chế, ít tạo được chồi và mơ sẹo phát triển mạnh. Trong một nghiên cứu của Chenna Reddy Aswah và Mewa Lal Choudhary (2002) lấy mẫu nguyên liệu ban đầu là mơ sẹo từ lá cĩ sẵn, tần số tái sinh là 83,3% đối với các mẫu cấy. Tạo được chồi và rễ chuyển sang mơi trường đất với tỉ lệ sống là 95%. Tại Việt Nam, việc ứng dụng nuơi cấy mơ cho cây Đồng tiền cũng đang phát triển mạnh. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2002) đã phát triển quy trình nhân nhanh cây Đồng tiền, Các phương pháp nghiên cứu tạo giống mới bằng cách chuyển gen cũng được áp dụng cho các đối tượng hoa cây cảnh. Nghiên cứu tạo giống hoa Đồng tiền bằng kỹ thuật chuyển gen đã gĩp phần tạo được nguồn vật liệu ban đầu phục vụ cơng tác tạo giống hoa cĩ các đặc tính như mong muốn (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2002), với nguồn mẫu cấy là callus Đồng tiền giống Ferrari. Phương pháp đã sử dụng vi khuẩn chủng EHA 105 mang vector ITB2c mang gen để chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens. Vì tính biến di soma xuất hiện ảnh hưởng đến đời sau, nên R Bhatia cùng các cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhằm đánh giá ảnh hưởng nguồn gốc mẫu cấy đến tính biến dị soma bằng ISSR maker. Kết quả cho thấy dịng in vitro tái sinh từ chồi và cụm hoa đầu cĩ tính ổn định di truyền cao hơn từ mơ lá. e Phần 3 – Vật Liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 30 - 3.1. Vật liệu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng chính được sử dụng trong nghiên cứu là cây hoa Đồng tiền kép (Gerbera jamesonii). Cây cho hoa màu cam, chiều dài cành hoa từ 40 – 50cm, đường kính hoa khoảng 13 – 15cm. Nguồn mẫu được sử dụng để tiến hành thí các nghiệm là phát hoa được chọn từ các cửa hàng hoa. Các phát hoa được chọn là một đoạn gần sát cụm hoa, phải cịn non cĩ sức sống tốt, lấy chiều dài khoảng 4cm và khơng bị hư, thối. 3.1.2. Mẫu cấy Hoa được mua về phịng thí nghiệm, dùng dao cắt một đoạn phát hoa tính từ phía dưới cụm đầu hoa một đoạn cĩ chiều dài khoảng 4cm, được dùng làm mẫu cấy ban đầu cho các thí nghiệm. 3.1.3. Mơi trường nuơi cấy Mơi trường được sử dụng là mơi trường khống cơ bản của Murashige và Skoog (1962) cĩ bổ sung thêm đường sucrose (30g/l), agar (8g/l) và các chất điều hịa tăng trưởng thực vật. Tùy theo mục đích của các thí nghiệm mà mơi trường cĩ thể được bổ sung riêng lẽ hoặc kết hợp với các chất điều hịa tăng trưởng ở những nồng độ khác nhau. Các loại mơi trường trên sau khi bổ sung chất điều hịa sinh trưởng được điều chỉnh về pH = 5,8 (bằng NaOH 1N hay HCl 1N) và hấp khử trùng bằng autoclave trong 25 phút ở nhiệt độ 1210C và áp suất 1 atm. 3.1.4. Điều kiện nuơi cấy 9 Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ngày 9 Cường độ chiếu sáng: 2500 lux 9 Nhiệt độ: 25 ± 20C 9 Độ ẩm trung bình: 75 – 80% e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 31 - 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1. Khử trùng mẫu Phần mẫu sau khi được cắt ra được cho vào bình erlen và tiến hành tuần tự theo các bước khử trùng mẫu sau: Khử trùng sơ bộ 9 Đặt mẫu dưới vịi nước chảy trong 15 phút để rửa sạch bụi và các chất bẩn bám trên mẫu. 9 Ngâm mẫu vào dung dịch nước rửa chén Sunlight pha lỗng trong 5 phút. 9 Rửa lại bằng nước máy 3 – 4 lần và đưa vào tủ cấy. Khử trùng bên trong tủ cấy 9 Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng. 9 Tiến hành lắc khử trùng bằng cồn 700 trong 1 phút. 9 Tiếp tục lắc khử trùng mẫu bằng dung dịch Javel nồng độ 5 - 7% riêng lẽ và 5 – 7% kết hợp thêm 2 – 3 giọt Tween 80% trong các khoảng thời gian khác nhau. 9 Rửa lại bằng nước cất vơ trùng 4 – 5 lần. 9 Ngâm mẫu trong nước cất vơ trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Mẫu cấy từ phát hoa cây Đồng tiền cĩ hình trụ trịn sau khi khử trùng được cắt thành từng lát mỏng theo chiều ngang (tTCL) tạo thành các lớp mỏng cĩ bề dày khoảng 0,5 – 1 mm. Các lớp mỏng này được nuơi cấy trên mơi trường MS cĩ bổ sung 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và các chất điều hịa tăng trưởng tùy theo yêu cầu của từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu theo dõi: Các mẫu sau khử trùng được cho vào bình thủy tinh cĩ chứa sẵng mơi trường, bố trí 30 mẫu / nghiệm thức, mỗi bình 3 mẫu, lặp lại 10 lần. e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 32 - 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel ¾ Mục đích thí nghiệm: Xác định được thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy bằng dung dịch Javel với các nồng độ và thời gian khác nhau. ¾ Tiến hành thí nghiệm Mẫu sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ và đưa vào tủ cấy, cho mẫu vào bình erlen đã vơ trùng lắc khử trùng bằng cồn 700 trong một phút, tiến hành khử trùng bằng Javel với các nồng độ 5%, 7%, 5% + Tween và 7% + Tween với thời gian khử trùng khác nhau. ¾ Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ sống sĩt, tỉ lệ nhiễm và tỉ lệ chết của mẫu cấy ứng với các khoảng thời gian và nồng độ khác nhau. Ghi nhận kết quả và chọn khoảng thời gian khử trùng cĩ tỉ lệ mẫu cấy nhiễm ít nhất đồng thời tỉ lệ mẫu sống sĩt phải cao để áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất điều hịa tăng trưởng cytokinin BA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy bằng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong mơi trường MS cĩ bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và chất điều hịa tăng trưởng BA với các nồng độ khác nhau như bảng 3.1. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 33 - Bảng 3.1. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền Ký hiệu BA (mg/l) A0 - A1 0,5 A2 1 A3 1,5 A4 2 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động của chất điều hịa tăng trưởng auxin NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy bằng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong mơi trường MS cĩ bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar và chất điều hịa tăng trưởng NAA với các nồng độ khác nhau như bảng 3.2. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. Bảng 3.2. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiển Ký hiệu NAA (mg/l) A0 - B1 0,1 B2 0,5 B4 1 . e Phần 3 – Vật liệu và phương pháp f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 34 - 3.2.2.4. Thí nghiệm 4: : Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi ¾ Mục đích thí nghiệm Đánh giá tác động phối hợp của BA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái và khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy bằng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào phát hoa. ¾ Tiến hành thí nghiệm Các tế bào phát hoa sau khi cắt mỏng được đặt trong mơi trường MS cĩ bổ sung 10 g/l đường sucrose, 8 g/l agar, kết hợp chất điều hịa tăng trưởng BA và NAA với các nồng độ. Sau 8 tuần, ghi nhận sự phát sinh hình thái của mẫu cấy và thu nhận số liệu. Bảng 3.3. Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền Ký hiệu BA (mg/l) NAA (mg/l) Tỉ lệ BA/NAA C1 0,5 0,1 5/1 C2 1 0,1 10/1 C3 1,5 0,1 15/1 C4 2 0,1 20/1 C5 0,5 0,5 1/1 C6 1 0,5 2/1 C7 1,5 0,5 3/1 C8 2 0,5 4/1 C9 0,5 1 1/2 C10 1 1 1/1 C11 1,5 1 3/2 C12 2 1 2/1 3.2.3. Phân tích thống kê Tất cả các số liệu sau khi được đo đạc ứng với từng chỉ tiêu theo dõi được phân tích, xử lý thống kê bằng chương trình MS-EXCEL và Statgraphics. e Phần 4 – Kết Quả và thảo luận f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 35 - 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel Mơi trường khảo sát thời gian khử trùng là MS bổ sung thêm 30 g/l đường sucrose, 8 g/l agar. Tỉ lệ mẫu nhiễm, tỉ lệ mẫu sống và chết được ghi nhận sau 7 ngày. Kết quả thí nghiệm thu được theo số liệu trong bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Javel lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Kết quả thí nghiệm STT Nồng độ Javel Thời gian khử trùng (phút) Tỉ lệ mẫu sống (%) Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) Tỉ lệ mẫu chết (%) 1 5% 5 - 100 - 2 7% 5 40 60 - 3 5% + Tween 5 30 70 - 4 7% + Tween 5 10 13,33 76,66 5 5% 10 16,67 83,33 - 6 7% 10 36,68 46,66 16,66 7 5% + Tween 10 83,34 16,66 - 8 7% + Tween 10 20 - 80 Khi tiến hành nuơi cấy mơ thực vật thì vấn đề lớn nhất là phải tạo được nguồn mẫu nuơi cấy đảm bảo vơ trùng. Mục đích của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy tTCL phát hoa vơ trùng và vẫn cịn khả năng tăng trưởng để tạo ra nguồn nguyên liệu cho các các thí nghiệm sau. Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật cĩ chứa đường, muối khống và vitamin thì rất thích hợp cho các lồi nấm, vi khuẩn phát triển do tốc độ phân chia tế bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 36 - Trong tự nhiên, cây hoa Đồng tiền sống ở những nơi cạn, khơng chịu được úng nhưng đất phải cĩ độ ẩm từ 60 – 70% mới thuận lợi cho cây phát triển. Đồng thời các bộ phận của cây Đồng tiền đều chứa một lớp lơng tơ, là nơi chứa nhiều bụi bẩn, các sinh vật nhỏ và nấm sinh sống dễ gây bệnh cho cây khi cĩ độ ẩm tăng cao. Theo nghiên cứu về cây Đồng tiền thì đa số trên bề mặt cá bộ phận cây thường là nấm mốc Gray Mildew. Vì thế việc khử trùng bằng cách rửa dưới vịi nước và ngâm trong cồn 700, hơ trên lửa khĩ mà tạo được mẫu sạch. Nếu do nấm, chúng ta thấy sự phát triển của khuẩn ty cĩ cấu trúc sợi, thường màu trắng hoặc hơi xám. Nếu sợi khuẩn ty màu xanh, chắc chắn là do nấm penicillium. Nếu sợi thể hiện các hạt đen nhỏ (dạng quả), cĩ thể là do nấm rhizopus nigricans, nấm này sẽ sinh sơi rất nhanh. Nếu việc nhiễm trùng phát đi từ vùng tiếp xúc giữa mơ và mơi trường cấy thì đây là nhiễm do mơ. Nếu sự nhiễm khởi đi từ một điểm bất kỳ nào đĩ trong mơi trường thì nguồn nhiễm cĩ thể do khơng khí hoặc sự khử trùng mơi trường khơng tốt hoặc do nhiễm từ khơng khí xung quanh (Dương Cơng Kiên, 2002). Trong giai đoạn vơ mẫu, mẫu cấy là nguồn gây nhiễm chính và đưa mẫu từ bên ngồi vào là giai đoạn khĩ khăn trong vi nhân giống. Nếu vi khuẩn đã nhiễm vào hệ thống mơ mạch thì chất khử trùng khĩ mà làm sạch mẫu. Khi bị nhiễm khuẩn thì chúng ta sẽ thấy một màng cĩ dạng sữa, phát triển bên trong mơi trường và ở bề mặt. Màng này đơi lúc cĩ màu (như hồng, vàng,…). Vài lồi vi khuẩn thường gây nhiễm: Acinebacter, Aerococcus, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas…Do vậy việc dùng chất hĩa học để khử trùng mẫu cấy phát hoa cây Đồng tiền vơ cùng khĩ khăn. . Đã cĩ nhiều thí nghiệm trong việc khử trùng mẫu cấy Đồng tiền, mẫu cấy cĩ thể là đốt thân, đỉnh sinh trưởng, hạt, mẫu lá hay rễ non. Surinder Kumar và Jitender Kumar Kanwar (2007) đã tiến hành khử trùng bề mặt mẫu cấy là lá Đồng tiền bằng dung dịch HgCl 0,1% từ 3 đến 4 phút, sau đĩ rửa lại 4 lần nước cất vơ trùng. Chất khử trùng này đã cho tỉ lệ mẫu cĩ khả năng sống sĩt và tái sinh là 88,7%. Cũng mẫu lá, nhưng trước đĩ Chenha Reddy Aswath (2002) đã rửa mẫu trực tiếp dưới vịi nước trong 5 phút, tiếp tục ngâm cồn 700 trong 30 giây, trong tủ cấy đã dùng 0,1% sodium e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 37 - hypochlorite khử trùng bể mặt. Sau 15 phút rửa lại bằng nước cất 5 lần. Tỉ lệ nhiễm đối với quy trình này tương đối thấp nhưng thời gian khử trùng lâu. Trong thí nghiệm này, chúng tơi đã sử dụng Javel. Vì tính chất hĩa học của Javel đáp ứng được các yêu cầu: hàm lượng Clo hoạt tính trong nước Javel là 3,5-4 g/l vừa đủ ức chế được vi sinh vật, cĩ tính sát khuẩn cao, an tồn, khi sử dụng nồng độ thích hợp Javel cĩ độc tính thấp với tế bào chủ. Cơ chế tác động của chất khử trùng là: 9 Phá huỷ lớp màng phospholipid, phân huỷ lipid và acid béo. 9 Hình thành chloramine – cản trở quá trình biến dưỡng của tế bào vi sinh vật. 9 Gây oxi-hĩa ức chế khơng thuận nghịch các loại enzyme của vi sinh vật – cần thiết cho quá trình biến dưỡng, phân chia tế bào, hình thành vách tế bào, sinh tổng hợp lipid, vận chuyển các electron trong quá trình hơ hấp của tế bào vi sinh vật. 9 Khi hypoclorit hịa tan trong nước, chúng sinh ra ac id hyp oclo rơ (HOCl), chất này sẽ tồn tại trong dung dịch ở hai dạng OCl- và H+. Hai dạng này sẽ chuyển qua lại, tùy theo độ pH của dung dịch. 9 Acid hypoclorơ tồn tại trong dung dịch, sẽ tác động đến các chất hữu cơ như một chất hịa tan, hình thành clorua là một chất oxy-hĩa mạnh sẽ thay thế những hydro (H) trong nhĩm amino (NH) của protein hình thành chloramine dẫn đến sự phân huỷ amino acid, làm biến tính protein. Tính nguyên vẹn của màng nguyên sinh chất bị thay đổi, phospholipid hoặc các acid béo khơng no của màng tế bào vi sinh vật bị phân huỷ do quá trình xà phịng hĩa (Estrla và cơng sự, 2002). Từ bảng 4.1 cho thấy khi dùng Javel 5% trong thời gian khử trùng là 5-10 phút thì chưa đủ để tạo ra mẫu cấy vơ trùng, tỉ lệ mẫu nhiễm nấm và vi khuẩn rất cao với tỉ lệ nhiễm tương ứng là 100% và 83,33%. Điều này cũng tương tự khi tăng nồng độ Javel từ 5% lên 7%. Tuy số lượng mẫu nhiễm cĩ giảm, nhưng khơng đáng kể, kết quả 46-60% mẫu vẫn cịn bị nhiễm nấm và vi khuẩn. Hiệu lực của các chất khử trùng phụ thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng vào các kẽ ngách lồi lõm trên bề mặt mơ cấy, khả năng e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 38 - đẩy hết các bọt khí bám trên bề mặt mơ cấy và cĩ độc tính thấp đối với mơ cấy. Để tăng tính linh động và khả năng xâm nhập của chất diệt khuẩn thì chúng tơi đã thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng để làm tăng hiệu quả khử trùng, vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật, như vậy, bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn (Nguyễn Đức Lượng – Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Kết quả thu được cho thấy, Javel và Tween đã cĩ tác dụng tốt lên mẫu cấy, tỉ lệ mẫu nhiễm giảm từ 83,33% chỉ cịn 16,66% khi dùng Javel 5% và Tween trong 10 phút. Đối với nồng độ Javel 7% cùng Tween trong 10 phút cĩ tác dụng tốt nhất, mẫu cấy hồn tồn sạch, khơng bị nhiễm khuẩn. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ Javel lên 7% bổ sung thêm Tween, dung dịch này hoạt động quá mạnh làm mẫu tuy khơng bị nhiễm nhưng tần suất mẫu bị chết tăng cao, thời gian càng lâu thì số lượng mẫu chết càng nhiều. Như vậy, thời gian khử trùng thích hợp nhất đối với mẫu cấy tTCL từ phát hoa là 10 phút khi dùng Javel 5% kết hợp Tween 20, với tỉ lệ mẫu sống sĩt và tái sinh là 83,34%. 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy BA là một trong những cytokinin tổng hợp được dùng phổ biến trong phịng thí nghiệm để thay thế cho zeatin và 2-iP (vì chúng cĩ giá thành cao). Cytokinin này ảnh hưởng rất rõ rệt lên sự hình thành và phân hĩa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hĩa chồi. Chúng thường được dùng để kích thích tạo chồi bất định. Ảnh hưởng của cytokinin trong nuơi cấy mơ và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, lồi thực vật và loại mơ được nuơi cấy. Chúng tơi đã sử dụng BA với các nồng độ để bổ sung vào mơi trường MS, kết quả được ghi nhận sau 8 tuần nuơi cấy, cho thấy nồng độ BA đã ảnh hưởng lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền (Bảng 4.2). e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 39 - Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL Khối lượng mơ sẹo (g) STT Ký hiệu mơi trường Sau 3 tuần Sau 6 tuần Sau 8 tuần Đặc điểm mơ sẹo sau 8 tuần. 1 A0 - - - Mẫu tTCL trương phồng, màu xanh nhạt, đường kính 1cm, khơng phát sinh hình thái. 2 A1 0,145d 0,164d 0,171d Mơ sẹo cĩ màu xanh, đường kính 1,5 cm 3 A2 0,147bc 0,325c 0,558c Mơ sẹo màu xanh đậm, khỏe, đường kính 1,5cm 4 A3 0,149b 0,764b 0,910b Mơ sẹo màu xanh, đường kính 2cm 5 A4 0,155a 1,030a 1,406a Mơ sẹo xanh đậm, phát triển nhanh, đường kính trên 2cm Ghi chú: Các chữ giống nhau trên cùng 1 cột khác biệt khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê với P = 0.05. Trên mơi trường đối chứng khơng bổ sung các chất điều hịa tăng trưởng, những mẫu cấy chỉ phồng lên, cĩ màu xanh nhưng khơng cĩ sự phát sinh hình thái, các tTCL bị già hĩa chỉ sau vài ngày nuơi cấy. Điều này cĩ thể do lượng hormon nội sinh trong các mẫu cấy TCL rất ít, khơng đủ để cảm ứng quá trình phát sinh hình thái. Các TCl dường như cĩ rất ít chất điều hịa nội sinh so với các mẫu cấy phức tạp lớn hơn (Hicks, 1981). Khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy TCL phụ thuộc rất nhiều vào sự hiện diện của các chất điều hịa sinh trưởng được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy (Detrez và cộng sự, 1988). Ngược lại khi các tTCL được nuơi cấy trên mơi trường MS bổ sung BA, kết quả cĩ sự khác biệt: mẫu cấy tạo mơ sẹo. Mơ sẹo là một đám tế bào khơng phân hĩa, cĩ đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Bùi Trang Việt, 2000). Cĩ rất nhiều mơ và cơ quan thực vật cĩ thể đươọc sử dụng để làm vật liệu tạo e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 40 - mơ sẹo; tuy nhiên, trạng thái hay tuổi sinh lý của mẫu cấy cĩ ảnh hưởng đến việc tạo mơ sẹo dưới tác dụng mạnh của chất điều hịa sinh trưởng khi được dùng chung hay riêng lẽ, cịn những cơ qua trưởng thành thường khơng cĩ khả năng này. Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy ảnh hưởng của các mơi trường nuơi cấy đến sự gia tăng khối lượng mơ sẹo khá rõ rệt. Các mơi trường nuơi cấy khác nhau thì sự gia tăng trọng lượng mơ sẹo khác nhau. Tất cả các mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền trên mơi trường bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau đều cảm ứng hình thành mơ sẹo. Đặc biệt là mơi trường A4 cĩ bổ sung 2 mg/l BA, sau khi nuơi cấy đã thể hiện sự gia tăng khối lượng. Cụ thể khối lượng mơ sẹo tăng từ 0,875 – 1,251 g sau 6 tuần. Khi đặt mẫu vào mơi trường, sau 7 ngày các mẫu cấy bắt đầu phồng ra, do việc hấp thu nước, dinh dưỡng và chất điều hịa tăng trưởng. Những tế bào này, dưới tác dụng của các yếu tố kích thích, sau khi phân chia liên tục theo hai giai đoạn (giai đoạn đầu chỉ phân chia theo hướng ngang, giai đoạn sau phân chia theo hai hướng ngang và dọc) tạo ra những vùng cĩ tính sinh trưởng cao và kích thước lớn hơn những vị trí khác, cĩ thể thấy được bằng mắt thường. Những vị trí cĩ vết thương thường cảm ứng tạo cấu trúc này trước. Vì cytokinin (chất kích thích hình thành cấu trúc đặc biệt trong sự tạo chồi) cũng như những chất khác trong mơi trường nuơi cấy được hấp thu nhanh hơn tại những vị trí của vết thương. Khi chỉ dùng BA, cytokinin này cĩ tác dụng tăng kích thước tế bào, kích thích phân nhân và sinh tổng hợp protein (Bùi Trang Việt, 2000). Do đĩ, những tế bào của mẫu tTCL đã phồng lên nhanh hơn và lớn hơn (đường kính mẫu từ 1,5 – 2cm). Mặc dầu dùng phương pháp tế bào lát mỏng, việc hấp thu BA cũng như các thành phần khác qua bề mặt vết thương vẫn xảy ra (De Klerk, 2003), nhưng mẫu cấy vẫn khơng thể phát sinh chồi trực tiếp hay thơng qua mơ sẹo khi nồng độ BA tăng cao (2 mg/l). Trong nghiên cứu với nồng độ BA từ 1-2 mg/l chỉ thích hợp cho việc tạo chồi hay cụm chồi từ đối tượng ban đầu là chồi cây in vitro (Jerry và Lubomsky, 1991). Ngồi ra mẫu cấy là các lát mỏng tế bào phát hoa, được lấy phần cịn non của phát hoa cây Đồng tiền, nên rất nhạy cảm với mơi trường nuơi cấy và dễ bị ngộ độc e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 41 - bởi nồng độ hormon ngoại sinh cao. Kiểu di truyền ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh của tTCL phát hoa dưới tác dụng của các chất điều hịa tăng trưởng khác nhau. Trong quá trình phát sinh hình thái từ tTCL phát hoa phần non, cảm ứng mơ sẹo sẽ là quá trình được ưu tiên nhất. Để tạo được chồi cây Đồng tiền in vitro, Chien-young Chou và Min-chang Huang (1983) đã dùng đến 10 mg/l BA bổ sung vào mơi trường MS từ nguồn mẫu ban đầu là đế hoa. Khi Kanataka. Agric (2008) dùng mẫu cấy là lá, mẫu đã phát sinh chồi với 3 mg/l BA, nhưng hầu hết tầng số tạo chồi rất thấp. Ngồi BA, một số nghiên cứu khác đã thay thế bằng một số cytokinin khác như TDZ. Zhou, Zhang Mei và Zeng Song-jun (2007) sử dụng TDZ bổ sung vào mơi trường MS để nuơi cấy chồi hoa Đồng tiền, kết quả cho thấy TDZ khi sử dụng ở 0,3 mg/l TDZ kết hợp 0,1 mg/l NAA đã tạo được cụm chồi. TDZ là một chất tạo chồi đặc biệt hiệu quả trên cây thân gỗ, đặc biệt là cây bạch đàn (Chen và cộng sự, 1995). TDZ kích thích tạo chồi trực tiếp khi nuơi cấy tế bào, thúc đẩy sự biệt hĩa các trung tâm tăng trưởng, làm giảm sự ngủ của các đỉnh sinh trưởng ngọn, dẫn đến hình thành chồi bên và chồi bất định trực tiếp từ mơ nuơi cấy. Kết quả khi chỉ sử dụng BA trong việc nuơi cấy lớp mỏng tế bào tTCL phát hoa trong thí nghiệm này thì hầu hết các mẫu cấy đều tạo mơ sẹo. Cĩ thể do một mình cytokinin này – tuy đã cho thay đổi nồng độ - nhưng vẫn chưa cĩ tác dụng mạnh lên mẫu cấy tTCL, mà cần thêm cĩ sự kết hợp với auxin. 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy Kết quả ghi nhận sau 8 tuần nuơi cấy cho thấy NAA đã ảnh hưởng chuyên biệt lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL được cắt từ phát hoa của cây Đồng tiền (Bảng 4.3). NAA là một auxin nhân tạo, cĩ hoạt tính mạnh nên thường được sử dụng trong quá trình kích thích ra rễ để tái sinh cây hồn chỉnh từ chồi in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỉ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hĩa của mẫu, và kiểu di truyền của mẫu cấy. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 42 - NAA tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào; sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào dài ra. Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL từ phát hoa Đồng tiền. STT Ký hiệu mơi trường Số lượng rễ /mẫu cấy Chiều dài rễ (cm) Đặc điểm hình thái mẫu cấy tTCL 1 A0 - - Mẫu tTCL trương phồng, màu xanh nhạt, đường kính 1cm, khơng phát sinh hình thái. 2 B1 - - Mẫu tTCL tạo mơ sẹo cĩ màu xanh, đường kính 1 – 1,5 cm. 3 B3 2 - 3 7 - 10 4 B4 3 6 - 9 Mẫu tTCL tạo mơ sẹo, màu xanh đậm, phát sinh rễ sau 4 tuần. Kết quả chỉ ra trong thí nghiệm này cho thấy nồng độ NAA khác nhau được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy đã cĩ ảnh hưởng đến sự hình thành rễ của các mẫu cấy tTCL. Tuy nhiên sự hình thành rễ của các mẫu cấy chỉ được hình thành thơng qua trung gian là mơ sẹo. Các nồng độ NAA (0,1; 0,5 và 1 mg/l) trong thí nghiệm này đã khơng thể làm cho mẫu tTCL phát sinh rễ trực tiếp. Dưới tác dụng của một auxin, mơ cĩ thể hình thành mơ sẹo hoặc rễ tùy thuộc vào loại auxin và nồng độ của nĩ. Hầu hết các mẫu cấy này đều tạo mơ sẹo màu vàng xanh, đặc, chắc và khơng cĩ sự phát sinh chồi hoặc rễ. Theo Bùi Trang Việt (2002) thì trên mơi trường chỉ chứa auxin (NAA) khơng phối hợp với cytokinin thì mẫu cấy chỉ tăng kích thước mà khơng cĩ sự phát sinh hình thái rõ rệt. Trong mơ thực vật, cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện cĩ auxin. Ngược lại, trong sự nuơi cấy các mơ nghèo cytokinin, auxin kích thích sự nhân đơi nhiễm sắc thể, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng khơng cĩ sự phân vách; sự phân vách chỉ xảy ra khi cĩ cytokinin ngoại sinh. Tuy nhiên trong thí e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 43 - nghiệm này, khi sử dụng NAA ở nồng độ 0,5 và 1 mg/l cho thấy cĩ sự phát sinh rễ qua trung gian mơ sẹo. Kết quả thí nghiệm cho thấy dù NAA ở nồng độ thấp (0,1 mg/l) hoặc tăng lên 10 lần (1,0 mg/l) đều cảm ứng mơ sẹo. Sự phát triển của mơ sẹo cĩ thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hĩa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mơ cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hĩa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mơ sẹo khác nhau và cĩ thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phơi. Trong thí nghiệm này một số mơ sẹo hình thành đã tạo được rễ với các nồng độ NAA (0,5 và 1,0 mg/l). Khi ở liều lượng thấp (0,1 mg/l) mẫu cấy chỉ hình thành mơ sẹo và tăng kích thước mà khơng cĩ sự phát sinh hình thái rõ rệt. Điều này cho thấy mơ sẹo hình thành từ tTCL phát hoa cây Đồng tiền dưới tác dụng của NAA cĩ thể được cảm ứng tạo rễ cho quá trình hình thành cây hồn chỉnh sau này. Khi dùng NAA trong mơi trường nuơi cấy, mơ sẹo cĩ màu xanh, mỗi mơ sẹo chỉ cĩ hai hoặc ba rễ phát sinh, rễ rất to và khỏe. Hầu hết các rễ khi bắt đầu hình thành đều cĩ một lớp lơng hút, nhưng nếu tiếp tục phát triển trong mơi trường thạch thì lơng hút khơng cịn. Khi nuơi cấy trong mơi trường agar thì lơng sẽ khơng phát triển bình thường vì mơi trường thạch cĩ điều kiện thơng khí kém. Lơng hút của rễ cây con nhân giống theo phương pháp truyền thống thì dài, mỏng, dẻo dai và đan quyện vào nhau như một mạng lưới cịn lơng hút của cây in vitro thì ngắn, dày hơn và thẳng. Điều này cĩ ý nghĩa quan trọng khi tạo cây hồn chỉnh trong in vitro, vì khi rễ hình thành nếu cĩ nhiều lơng hút sẽ giúp cây thích nghi với mơi trường đất tốt hơn, cĩ vai trị quan trọng trong giai đoạn thích nghi khí hậu. Vì lơng hút cĩ vai trị quan trọng trong vùng rễ, tăng diện tích bề mặt rễ, tăng sự hấp thu nước và các chất khống cho cây (Kramer, 1983). Lơng hút quá ít hoặc khơng cĩ sẽ làm cho rễ chính giảm đi chức năng của nĩ và gia tăng stress cho cây. Rễ phát triển trên mơi trường thạch thường ít hoặc khơng cĩ lơng hút, và nếu cĩ thì khi chuyển ra vườn ươm lơng hút sẽ chết đi. Do đĩ, làm cho cây con bị chết hoặc ít nhất thì sự sinh trưởng của cây bị tạm ngừng (Preece và Sutter, 1991). Chúng tơi cũng đã cho tăng thử nồng độ NAA lên 4 mg/l thì đã cĩ sự ức chế kéo dài rễ và số lượng rễ tạo thành ít dần. Điều này cĩ thể do auxin – NAA khi ở e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 44 - nồng độ cao đã kích thích sự tạo sơ khởi rễ nhưng sẽ cản trở sự tăng trưởng của các rễ sơ khởi này (Bùi Trang Việt, 2000). 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi. Bảng 4.4. Kết quả ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên mẫu cấy từ phát hoa Đồng tiền STT Mơi trường Đặc điểm hình thái 1 C1 2 C2 3 C3 Mẫu cấy tạo mơ sẹo sau 3 tuần, xanh đậm, phần sát thạch xuất hiện thêm một khối mơ sẹo xốp hơn, màu xanh nhạt. 4 C4 Mẫu cấy tạo mơ sẹo, màu xanh, xuất hiện rễ xung quanh ở tuần thứ 4. 5 C5 6 C6 7 C7 8 C8 Mẫu cấy tạo mơ sẹo, màu xanh, phát triển lớn, đường kính 1-1,5 cm. 9 C9 10 C10 11 C11 12 C12 Mẫu cấy tạo mơ sẹo, màu xanh, vàng nhạt. Phát triển lớn, đường kính 2 cm Với mục đích tạo chồi bất định thì sự kết hợp của auxin và cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng một mình cytokinin (Vũ Văn Vụ, 1999). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhĩm song tử diệp khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo trong mơi trường chỉ cĩ auxin mà cần phải cĩ một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự (1993) khi nghiên cứu trên cây đơn tử diệp Azadirachta indica A. cần AIA ở nồng độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để cĩ thể tạo mơ sẹo; lá của Solanum tuberosum L ; cần cĩ sự phối hợp giữa 2,4-D 3,0 mg/l, NAA 1,0 e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 45 - mg/l và kinetin 0,2 mg/l cho sự tạo mơ sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Cĩ một số cơng trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey, 1977 trên mơ rễ cây đậu nành, ghi nhận cĩ sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin. Nếu mơi trường chỉ cĩ auxin, thì hàm lượng DNA được ghi nhận là khơng thay đổi. Từ kết quả bảng 4.4 cho thấy, khi kết hợp BA và NAA, sau 4 tuần tất cả các mẫu cấy đều hình thành mơ sẹo. Khơng cĩ sự hình thành chồi trong suốt quá trình mơ sẹo phát triển. Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mơ sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như khơng tác động trên mơ phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuơi cấy thì nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hồng Anh, 2000). Sau 8 tuần, các mẫu cấy vẫn tồn tại ở dạng mơ sẹo, cĩ màu xanh, khối rắn chắc, khơng cĩ khả năng phát sinh mơ và cơ quan. Theo Tanimoto và Shimomura (1996), đối với mẫu cấy thân, auxin cĩ tác dụng ức chế sự tạo chồi ngay ở nồng độ thấp. Khi dùng phát hoa cây Đồng tiền lượng auxin nội sinh cũng cĩ tác dụng tương tự. Đĩ cĩ thể là lí do tại sao khi nồng độ auxin càng tăng (nồng độ NAA 1 mg/l) thì mơ sẹo chuyển hĩa sang vàng xanh. Các kết quả thu được từ thí nghiệm, cho dù tăng nồng độ BA lên cao (2 mg/l) và giữ nồng độ NAA ở mức thấp hoặc trung bình (0,5 và 1 mg/l) đều tạo mơ sẹo. Trái ngược với các thí nghiệm từng làm trước đây, vẫn dùng nồng độ BA và NAA như đã trên, nhưng vẫn tạo được chồi bất định cho kết quả cao (Gaspar và cộng sự., 2003) với đối tượng là mẫu lá Torenia. Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003). Khi giữ mức NAA cố định 0,1 mg/l và BA lên đến 1 mg/l, các mẫu cấy vẫn tạo mơ sẹo sau 3 tuần, tuy nhiên sau đĩ mơ sẹo này, phía sát mặt thạch, một khối mơ sẹo mới được hình thành từ mơ sẹo cũ. Mơ sẹo mới này cĩ màu xanh nhạt hơn, xốp hơn. e Phần 4 – Kết quả và Thảo luận f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 46 - Tiếp tục giữ NAA ở nồng độ cũ và tăng hàm lượng BA đến 2 mg/l, mẫu cấy tạo mơ sẹo, sau đĩ cảm ứng hình thành rễ. Kết quả này khác với thí nghiệm của Barbosa (1993), chỉ cần từ 1-2 mg/l BA kết hợp NAA ở nồng độ 0,4 mg/l đã tạo được chồi, với nguồn mẫu là cụm hoa đầu. Cũng là mẫu là cụm hoa phải dùng 3 mg/l BAP tạo chồi, trong khi Henrique phải dùng từ 3-9 mg/l BAP. Điều này cho thấy, tuy cùng một nguồn mẫu nhưng nồng độ cĩ thể khác nhau để tạo chồi bất định hay rễ. Qua 3 thí nghiệm đã cho thấy, hiệu quả tác dụng của các chất điều hịa sinh trưởng phụ thuộc vào nồng độ các chất rất nhiều. Đồng thời, giữa các bộ phân khác nhau của thực vật và tuổi khác nhau thì sẽ cảm ứng với chất điều hịa tăng trưởng khơng giống nhau. So với các thí nghiệm khác đã từng thực hiện, thì nồng độ BA (0,5; 1; 1,5 và 2 mg/l) vẫn chưa thích hợp để cảm ứng mạnh, thúc đẩy sự ra chồi trực tiếp hay qua trung gian mơ sẹo. Đặc điểm của TCL phát hoa là “mỏng” cĩ ít số lượng tế bào, nên lượng hormon nội sinh quá ít hoặc khơng cĩ, để cĩ thể cùng với hormon ngoại sinh (BA) phát sinh cơ quan. Đồng thời các điều kiện về sinh thái và các yếu tố dinh dưỡng cũng rất quan trọng, các chất điều hịa sinh trường chỉ tăng cường các quá trình trao đổi chất mà khơng tham gia trực tiếp vào. Như vậy, sự phối hợp giữa cytokinin (BA) và auxin (NAA) vẫn chưa đủ tạo nên mối quan hệ khăng khít để mẫu cấy phát sinh chồi. Như đã nĩi ở thí nghiệm 2, cĩ thể do khi sử dụng mẩu cấy là phát hoa dạng tTCL, nên thiếu số lượng tế bào biểu bì, dưới biểu bì (các chồi bất định thường phát sinh từ những tế bào này, theo Joy IV và Thorpe, 1999. Bùi Trang Việt, 2000). Đồng thời, phát hoa được lấy phần cịn non và đang tăng trưởng, cĩ thể tồn tại lượng auxin/cytolinin nhất định, việc cảm ứng tạo chồi hay rễ tùy thuộc vào lượng cân bằng hormon nội sinh. Nên nguồn mẫu từ phát hoa tTCL khơng thích hợp phát triển tạo chồi khi dùng chất BA để kích thích. Cho dù BA được dùng riêng lẽ hay kết hợp với NAA thì các mẫu cấy vẫn hình thành mơ sẹo trong suốt thời gian khảo sát. e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 45 - 5.1. Kết luận Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hịa tăng trưởng lên mẫu cấy tế bào lát mỏng từ phát hoa cây Đồng tiền nhằm tạo thêm được một phương pháp ưu việt nữa của kỹ thuật vi nhân giống. Với kỹ thật này việc tái sinh cây từ mọi bộ phận của cây là hồn tồn cĩ thể. Qua quá trình tiến hành các thí nghiệm đối với lát mỏng tế bào phát hoa từ cây hoa Đồng tiền cĩ thể rút ra kết luận sau: Vấn đề khĩ khăn lớn nhất khi bắt đầu tiến hành nuơi cấy in vitro đối với phát hoa Đồng tiền là tạo được nguồn mẫu cấy vơ trùng. Tồn bộ cây Đồng tiền là một lớp lơng tơ mịn, là nơi tập trung nhiều bụi bẩn và vi khuẩn, lớp lơng này đã ngăn cản dung dịch khử trùng tác động lên mẫu cấy. Việc dùng Javel 5% bổ sung thêm Tween trong thời gian 10 phút là một tác nhân khá cĩ hiệu quả đối với mẫu cấy phát hoa Đồng tiền, với tỉ lệ sống sĩt cao là 83.84%. Quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL chịu ảnh hưởng rấ lớn bởi sự hiện diện của các chất điểu hịa sinh trưởng thực vật được bổ sung vào mơi trường nuơi cấy. Trong các thí nghiệm trên cho thấy hầu hết các chất BA và khi dùng riêng kẽ hay kết hợp đều tạo hình thái là mơ sẹo. Do đặc điểm mỏng của mẫu cấy nên mơi trường cĩ ảnh hưởng rất lớn lên đáp ứng của mẫu cấy, tTCL phát hoa là nguồn mẫu cấy rất nhạy cảm với mơi trường nuơi cấy và dễ bị ngộ độc bởi nồng độ hormon ngoại sinh cao. Kiểu di truyền ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tái sinh của tTCL phát hoa dưới tác dụng của các chất điều hịa tăng trưởng khác nhau. Trong quá trình phát sinh hình thái từ tTCL thân non, cảm ứng mơ sẹo là quá trình được ưu tiên nhất. NAA với nồng độ 0,5 mg/l khi dùng riêng lẽ đã tạo mơ sẹo và bắn rễ trong thời gian một tháng. Sự kết hợp 0,1 mg/l NAA và 2 mg/l BA tạo mơ sẹo, sau đĩ phát sinh rễ sau 6 tuần. 5.2. Đề Nghị Do thời gian tiến hành thí nghiệm và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm cĩ hạn nên tơi xin đưa ra một số đề nghị để nghiên cứu này được hồn thiện hơn. Khảo sát thêm các yếu tố liên qua trong quá trình khử trùng mẫu như: tuổi mơ cấy, thời điểm thu mẫu khử trùng nhằm nâng cao hiệu quả khử trùng và khả năng tái e Phần 5 – Kết luận và kiến nghị f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 46 - sinh của mẫu cấy. Nghiên cứu thêm về các loại hĩa chất chất khử trùng khác khi đưa mẫu từ bên ngồi vào. Khảo sát thêm ảnh hưởng của một số chất điều hịa tăng trưởng mới lên khả năng phát sinh hình thái và khả năng tái sinh chồi của mẫu cấy TCL. Khảo sát khả năng hình thành chồi của các TCL được cắt từ các bộ phận khác của cây hoa Đồng tiền Sử dụng cả hai dạng lTCL và tTCL trên cùng mẫu phát hoa để từ đĩ cĩ thể thấy được hiệu quả của mỗi dạng TCL. Giải phẫu hình thái đối với các mẫu cấy TCL để nghiên cứu những thay đổi về mơ học bên trong mẫu cấy theo thời gian. e Phn 6 – Tài liu tham kho f GVHD: CN. Bùi Vn Th Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO e Phần 6 – Tài liệu tham khảo f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH a 6.1. Tài liệu tham khảo trong nước Bùi