Đồ án Nấm men công nghiệp

CHÚ Ý: SAU KHI SỬA XONG gủi LẠI CHO CÔ. CHÚ Ý ĐỂ NGUYÊN (KHÔNG ĐƯỢC BỎ ĐI) PHẦN CHÚ Ý MÀ CÔ ĐÃ ĐÁNH TRONG ĐỒ ÁN PHải có tên đề tài. khi đánh sử dụng 1,3 line. Canh lề lại. Đánh số trang. font times new roman, cỡ chữ 13 phần mục lục (đề cương chi tiết-phải viết đúng theo phần cô đã chỉnh- lần sau không sửa đúng cô không duyệt) Lời mở đầu chưa viết Chú ý lỗi chính tả quá nhiều. Sau dấu chấm phải có cách ô PHần mục lục viết cho đúng(ví dụ: chương 1., mục 1.1 đến mục 1.1.1 đến 1.1.1.1) Các thông tin có được phải cho biết có trong tài liệu nào-nếu thiếu phần này đồ án không có ý nghĩa (ví dụ: [1,12] tức tham khảo ở tài liệu số 1, trang số 12. tài liệu số bao nhiêu do phần tài liệu tham khảo mà các em đã chọn để tham khảo. I)LỜI NÓI ĐẦU chưa viết? Ngày nay, với sự bùng nổ của cuộc cách mạng sinh học,và với sự ứng dụng của nó,công nghệ sinh học đã làm thay đổi bộ mặt của thế giới và tạo ra những điều mới lạ mà chúng ta không hề tưởng, đặc biệt một số sản phẩm do nó tạo ra không những đáp ứng cho thời đại mà còn hứa hẹn cho một ngành sản xuất năng lượng đầy tiềm năng trong tương lai thay thế cho những năng lượng tự nhiên đang ngày càng bị cạn kiệt. Nấm men- một vi sinh vật bé nhỏ, được mệnh danh là trái tim của ngành công nghệ lên men đã tạo ra những sản phẩm đầy thú vị, mới lạ và đầy tính ứng dụng cao không những trong ngành thực phẩm mà còn mở rộng ra ở những ngành khác. Thực tế điển hình như sản xuất cồn: Brazil đã sử dụng cồn-một loại sản phẩm được lên men từ nấm men sacharomyces cerevisiae, được thay thế một phần xăng dầu cho sự tiêu thụ năng lượng của nước mình. Do vậy, tôi chọn đề tài:kĩ thuật nuôi cấy và bảo quản nấm men công nghiệp để làm đồ án riêng cho bản thân. Bước sang thế kỉ XXI loài người đã hiểu biết về sự đa dạng nấm men đã được tích lũy thông qua các phương pháp phát hiện và mô tả của nhiều nhà vi sinh vật học. Kết quả là một số lượng lớn thông tin về hệ sinh thái nấm men đã được tích lũy và số lượng lớn các loài nấm men được biết gia tăng nhanh chóng nhờ vào các kỹ thuật sinh họ phân tử.  Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu. II)NỘI DUNG II.1)PHÂN LOẠI NẤM MEN Từ cổ xưa loài người đã biết nấu rượu. tác nhân chuyển hoá đường là một loại nấm men thường gọi là men rượu. Theo hệ thống phân loại nấm men thuộc vào giới nấm (Kingdom Fungi theo Whitaker , 1969,Takhtakjan,1970). Fungi bắt nguồn từ chữ la tinh Fungus có nghĩa là nấm, đôi khi còn dùng Mycetes bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mukes. Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi. Nấm men có thể thuộc về hai lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn(Deutero-mecetes hoặc Fungi imperfect). Tiêu chí phân loại nấm men Đơn vị cơ bản phân loại nấm men trong sản xuất lên men là nòi hoặc chủng. Đây là các tế bào thuần chủng của một loài xác định. Các nòi (chủng) được hợp nhất thành loài (Specise), các loài hợp thành giống (genus,genera), các giống hợp thành họ… Nấm men và các loài giống nấm men thuộc về hai nhóm nấm: nhóm nấm túi tạo thành bào tử được gộp chung vào lớp nấm túi (Ascospor) và nhóm nấm không tạo thành bào tử-lớp nấm không hoàn thiện (Fungi imperfect) hay còn gọi là lớp nấm bất toàn. Qua sơ đồ phân loại nấm của W.Carol Frarier ta thấy: Lớp nấm túi là những nấm sinh bào tử nang hay còn gọi là nấm thật. Dưới lớp là bộ gồm các đơn bào (unicelloceteles). Đây là những nấm men. Dưới bộ là họ Schizosaccharo-mycetaceae gồm các giống sacharomycodes, Sackira,Hanseniaspora, Nasodia… PHần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống sacharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn. Giống Endomyces vernalis là một loài nấm men dùng trong thế chiến thứ nhất để tổng hợp chất béo. Giống sacharomyces ,quan trọng nhất là loài sacharomyces cerevisiae được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của nấm men này dùng làm men nở bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glycerol hoặc enzim invertaza. Sacharomyces fragilis lên men đường lactoza đón Sơ đồ phân loại nấm men (theo W.Carol Frazier) 1- nấm men tạo màng 2-nấm men hình chuỳ 3 -nấm men tạo thành khuẩn ti thật hoặc khuẩn ti giả EumycopHyta (nấm) Ascomycetes (Fungi imperfect) Deuteromycetes Endomycetes Moniliales Endomyceetceae Sacharomycetaceae Crytoccaceae Rhodotorulaceae Endomyces Schizosaccho- omycess Sacharomyces Zygosaccharomyces Toruiaspora Picha 1 Hasenula 1 Debaryomyces Crytococus Kloeskera 2 Mycoderma Candida 1 Georichum 3 Trichosporum Rhodotorula X X X X Vai trò quan trọng quan trọng trong sản xuất sữa và các sản phẩm của sữa. Có lẽ trong tương lai loài người trông cậy vào loại giống nấm men này để thu nhận cồn tuyệt đối từ những nguyên liệu tái tạo được để thay thế xăng khi dầu mỏ của trái đất bị cạn kiệt. Giống Zygosacharomyces. Một vài tác giả coi giống này là giống phụ của giống sacharomyces. Cac loài của giống này có thể phát triển ở dịch đường nồng độ cao và làm hỏng mật siro.Zygosacharomyces nusbarumeri được tìm thấy trong mật. Các loài này tham gia vào lên men rượu vang và đặc biệt là lên men đậu tương làm thành một thứ đồ uống đặc biệt. Các giống Pichia, Hansenula, Debaryomyces… cũng như giống Mycoderma, candida… là những nấm men không hình thành màng trên mặt dịch nuôi cấy, phát triển trên bề mặt dịch ướp chua dưa chuột và các loại rau quả. Chúng oxy hoá các chất hữu cơ làm giảm độ chua và làm tăng ph của dịch ướp. Hansenula và Pechia có thể chịu đựng độ cồn cao và oxy hoá rượu etylic. Debaryomyces có thể chịu được muối cao, đặc biệt ở phosphat có muối tới 24% vẫn thấy men này phát triển. Nấm men tạo màng không hoặc sản sinh ít rượu etylic từ đường. Giống sacharomycodes và Hansenula sporacos hình quả chanh, cũng như các men giả Kloeckera không sinh bào tử có thể hình thành chuỳ. Những giống men này làm hỏng rượu, đặc biệt là mất mùi rượu vang. Lớp men giả còn gọi là lớp men không hoàn toàn thuộc lớp nấm bất toàn (Fungiimperfect hay Deuteromycetes). Nấm trong lớp nấm này không tạo thành bào tử. Thuộc lớp này có Moniales gồm hai họ là Cryptococcaceae và Rhodorulaceae. Họ Cryptococcaceae hay Cryptococides gồm các giống Cryptoccocus, Torulopsis, Pityrosporum, Brettanomyces, Candida, Trigonopsis, Rhodotorulua. II.3)CHỦNG NẤM MEN sacharomyces khi đã nói đến chủng nấm men là phải nhắc đến có những giống nấm men nào?, lí do chọn giống saccaromyces? Giống này gồm những loài nào? .II.3.Giống saccharomyces menyen ? (thực ra đây là giống saccaromyces giống này gồm các loài nấm men (câu này viết sai) có thể lên men đường sinh ra rượu etylic .các loài của giống này phổ biến rất rộng rãi trong tự nhiên đặc biệt một số nòi đã được chúng ta nghiên cứu và biết khá rõ. Các men này có vai trò rất to lớn trong sản xuất các sản phẩm lên men có chứa cồn. đặc điểm chung của giống này là gì, môi trường lên men, điều kiện len men? Giống sacchromyces có hình dáng tế bào là hình cầu,hình ôvan hay elip. Sinh sản vô tính bằng nẩy chồi. Thường có 1-4 bào tử tong một nan,ít khi có 8 bào tử. Thế hệ sinh dưỡng của các giống này trong điều kiên bình thường là các thể lưỡng bội.khi già chúng thường kết thành vòng và mọc trên dịch men sợi giả,có thể kết thành màng nổi. Lên men đường tốt,nhưng nồng độ đường không quá 30% (chính vì điều này những nấm men này được gọi là “nấm đường”) và tạo thành 18% cồn etylic. Chúng không đồng hoá được muối nitrat. Theo Kudrêyxeva,giống này có 18 loài.Chúng không khác nhau về hình thái,nhưng lại khác nhau nhiều về quan hệ với các loại đường (xem bảng 1.1) không được viết như thế này. PHải viết: bảng số mấy: tên bảng (tài liệu tham khảo, trang số?) Bảng 1.1 Khả năng đồng hoá các nguồn hydratcacbon của nấm men. (tài liệu tham khảo “nấm men công nghiệp,trang số 19). giống sacchromyces Quan hệ với các nguồn cabon dinh dưỡng Các loại đường Các loại rượu cácloại axit hữu cơ glucoza galactoza sacroza rafinoza lactoza maltoza dextrin inulin xyloza Arabioz aa etanol glixeryl mannit dulxit sorbit axetic lactic xucsinic malic tartaric xitric S.vini + + + 1/3 - + - - - - + + - - - + + - - - - s.cerevisiae + + + 1/3 - + + - - - + + - - - + + - - - - s.uvarum + + + + - + - - - - + + - - - + + - - - - s.carlsbergensis + + + + - + + - - - + + - - - + + - - - - s.chevalieri + - + 1/3 - + - - -- - + + - - - + + - - - - s.oviformis + - + 1/3 - + - - - - + + - - - + + - - - - s.chodati + + - - - + - - - - + + - - - + + - - - - Ghi chú: + đồng hoá - không đồng hoá Rafinoxa khi bị phân huỷ thành fructoza(1) và melbioza(2).Nấm men khi chỉ đồng hoá được fructoza còn melbioza không đồng hoá được ,nên chỉ ghi là 1/3 dưới đẩy sẽ giới thiệu 7 loài chính thộc giống sacchromyces .Các loài này có nhiều ý nghĩa và đóng vai trò to lớn trong sản xuất lên men. II.4)GIỚI THIỆU các loài được giới thiệu theo mức độ quan trọng giảm dần. đồng thời cho biết loài đó lên men được môi trường nào II.4.1)sacchromyces cereviseae menyen Loài nấm men này được dùng trong công nghiệp cồn etylic,men bánh mì và bia. Hình dáng của chủng nó không khác lắm nhiều so với các chủng cùng giống (hình 1.8). Khả năng tạo thành bào tử túi của sacharomyces cerevissiea kém hơn sacharomyces vini,sacharomyces uvarum. Loài này có đặc điểm lên men đường từ tinh bột sâu xa (không được viết như thế này) hơn với các loài khác, vì rằng nó có thể lên men được các dextrin đơn giản. II.4.2)sacchromyces vini menyen Đây là loài nấm men rất phát triển ở các loại quả ngọt ,ở dịch rau quả. Chúng lên men dịch quả,đặc bệt là dịch quả nho tạo thành những loại rượu nho và thường được gọi là rượu vang. Tên của loài này trước đây gọi là sacchromyces ellípsoideus.bắt nguồn từ hình dáng tế bào của chúng là hình ellip. Hình 1.2(x2000) Hình 1.3 (x2000) Sacchromyces vini sacchromy cescerevissiae Trong dịch quả lên men ta thấy giống sacchromyces chiếm 80% số tế bào vi sinh vật (không được viết tắt) có mặt. Dịch lên men được phủ một lớp bọt trên bề mặt. Men này có hai dạng:dạng bụi dễ làm đục và dạng bông dễ kết tủa, dễ lắng làm trong dịch men. Nói chung các nòi thuộc loài này cần có nguồn dinh dưỡng là đường, rượu axit hữu cơ. Các nguồn chất sinh trưởng của chúng là axit panotenic (vtm B3), biotinvtm H hay B7, mezoinzoit, tiamin(B1) và piridoxin(vtm B6) II.4.3)sacchromyces uvarum Beiyrinck Các chủng loài này được phân lập từ dịch quả phúc bồn tử,dịch nho lên men và dịch bia. Một số chủng được dùng làm men bánh mì,chúng có độ lắng tốt (loại men chìm) được dùng trong sản xuất bia. Hình thái loài này có dáng chung của các loài sacchromyces. sự tạo thành bào tử của loài này xảy ra mạnh mẽ khi nuôi trên môi trường thạch –malt trong khoảng thời gian đầu sau khi tách được chúng từ điều kiện tự nhiên. Có một số chủng loài này dễ tạo thành dạng bông trong lên men.Vì vậy mà chúng được dùng trong sản xuất rượu vang và có thể tích tụ trong dịch lên men được. Hình1.4 (x2000) Hình 1.5 (x2000) Sacchromyces uvarum sacchromyces carsbergenis II.4.4)Sacchromyces carsbergenis Hansen Các chủng của loài này được dùng nhiều trong sản xuất bia. Chúng là loại nấm men chìm,hình thái tế bào cũng tương tự các loài men khác cùng giống (hình 1.10). Khả năng sinh bào tử yếu và ít gặp. Khả năng lên men đường không kém các loài sacchromyces khác,nhưng loài men này có thể phát triển và lên men ở nhiệt độ thấp (5-100C). Vì lẽ này Kudrreyxeva xếp chúng thành một loài riêng. Trong dịch nho ít gặp loài này. Vì vậy trong sản xuất rượu nho các chủng thuộc loài này khôg có vai trò gì thật đặc biệt,nhưng chúng là chủ lực trong lên men bia. II.4.5)Sacchromyces chevalieri guillermond Các chủng thuộc loài này thường được phân lập từ dịch quả nho tự lên men và từ van non của dịch quả cọ dừa. Hình thái men này xemhình 1.11. (không được viết như thế này). Loài này thường phát triển trên dịch quả nho và có thể tích tụ tới 160 cồn,song không vượt được sacchromyces vini trong lên men rượu vang Hình 1.6 (x2000) Hình 1.7 (x 2000) Sacchromyces chevalieri sacchromyces oviform II.4.6)Sacchromyces oviformis Osterwadrrer Các chủng thuộc loài men này đựơc phân lập từ dịch quả nho lên lên tự nhiên thường dùng trong sản xuất rượu sâmpanh (champange) Những giống oviforrmis thuần chuẩn có tế bào tương tự như các loài khác (hình 1.12) phát triển tốt ở dịch nho,lên men gần như toàn bộ đường trong dịch quả và có thể tíchtụ với 180 cồn (nếu dịch quả có hàm lượng cao hoặc qúa trình lên men được bổ sung đường). Nhu cầu về chất sinh trưởng của loài men này cũng giống như sacchromyces vini,nhưng sức chịu đựng cồn lại cao hơn và như vậy ở giai đoạn cuối lại phát triển tốt hơn. Do vây nó thường được dùng kết hợp với sacharomyces vini trong lên men rượu vang có hàm lượng đường cao và để sản xuất vang “khô” (lên men hết đường). Các chủng sacharomyces oviformis khi kết thúc lên men thường tạo thành một lớp màng trên bề mặt dịch. Chúng thường được dùng trong sản xuất rượu vang từ dịch quả có hàm lượng đường cao,đặc biệt trong sản xuất sâmpanh để sản xuất lên men có nồng độ cồn cao hơn tự nhiên. *Sacchromyces oviformis cheresiensis (hình 1.13). Loài này lên men đường mạnh,có thể tạo thành tới 16.50 cồn trong dịch lên men. Khi kết thúc lên men cũng tạo thành lớp màng trên mặt dịch. Trong quá trình rượu bị oxi hoá và kết quả sẽ tạo thành chất axetaldehyt (tới 700mg/l) cùng với các este bay hơi làm cho vang có hương thơm quả anh đào. Điều kiện thích hợp cho sacharomyces oviformis cheres (không được viết thế này) phát triển tốt là nhiệt độ 18-200C và phải đủ không khí. Có thể dùng men này để chứa các loại vang có tích tụ axit axetic và axit lactic (vang có hai loại axit này thường có mùi chuột). II.4.7)Sacchromyces chodati Scheiner Men này thường phân lập từ nước nho lên men tự nhiên ở Thuỵ Sĩ. Không lên men được sacacroza,nhưng lên men tốt glucoza và fructoza. (Bổ sung thông tin cho lại này) Hình dáng tế bào và bào tử của sacharomyces chodati Scheiner Hình 1.8 (x2000) Hình 1.9 Sacchromyces oviformis var sacchromyces chodati Trong tất cả các loài kể trên thì loài sacharomyces cerevisiae được sqr dụng nhiều nhất trong công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất bia rượu và công nghệ sản xuất bánh như chúng ta đã biết từ trước đến nay. III)KĨ THUẬT NUÔI CẤY III.1) YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG GIỐNG NẤM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP: Nấm men phải cho ta sản phẩm như chúng ta mong muốn và năng suất cao, chất lượng tốt, có ý nghĩa kinh tế trong sản xuất, không tạo thành những sản phẩm phụ mà ta không mong muốn Sử dụng các nguồn nguyên liệu sẵn có rẻ tiền của địa phương Có khả năng tách dễ dàng các tế bào hoặc các sản phẩm tạo ra sau quá trình lên men Chủng nấm men phải rất thuần, không chứa vi sinh vật gây nhiễm khác, đặc biệt là không có bacteriophage kí sinh… Chủng nấm men phải khoẻ, giống sau khi cấy vào nồi nhân giống hoặc từ nồi nhân giống chuyển qua nồi lên men phải phát triển rất nhanh để tránh sự tạp nhiễm. Chủng giống phải dễ dàng phát triển cho nhiều tế bào sinh dưỡng, bào tử hoặc bằng các hình thức tái sinh khác Sản phẩm tạo ra trong thời gian lên men càng ngắn, càng tốt, thường 1-3 ngày Có khả năng chống được sự tạp nhiễm của các vi sinh vật lạ, tự bảo vệ bằng cách phát triển trong môi trường pH thấp, nhiệt độ cao hoặc sinh ra các chất ức chế vi sinh vật khác. Chủng được bảo quản dễ dàng, tồn tại và ổn định các đặc tính xuyên suốt trong thời gian sử dụng. Chủng có khả năng thay đổi được các đặc tính bằng cách kiểm tra dột biến, kĩ thuật gen để không ngừng nâng cao trong sản xuất. III.2)MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MEN: còn rất nhiều môi trường để nuôi cấy nấm men, đọc thêm tài liệu và bổ sung vào *Môi trường nước malt: Hoà bột malt với nước theo tỉ lệ 1:5,gia nhiệt đến 45-480C kết hợp với khuấy đảo. Giữ nhiệt trong 30 phút,sau đó nâng lên 500C giữ 1h, rồi nâng tiếp lên 620C-630C,giữ nhiệt cho đến khi đường hoá hoàn toàn. Dung dịch đường hoá được đun sôi 20-30 phút cần thêm nước khi đun tới thể tích ban đầu. Lọc bỏ bã Dịch lọc làm nguội đến 300C có 8-10% chất khô, cho vào bình tam giác, hấp thanh trùng với áp suất dư 0,5atm. *Môi trường thạch-malt Dịch đường malt mới lọc hoặc đã thanh trùng ở trong các bình tam giác có 8% chất khô và bổ sung thạch (20g cho 1 lít). Thạch sơ bộ hoà nước, nấu nóng chảy có thể phả lọc qua hai lớp vải màng xen vào giữa là lớp bông rồi cho vào dịch malt. Đun dịch thạch-malt cho nóng chảy đều và chia vào các ống nghiệm hoặc các bình tam giác. Thanh trùng ở 0,5-0,8atm. *Môi trường nước thịt-pêpton (MP) – xem lại đây là môi trường chủ yếu để nuôi cấy vi khuẩn. *Nước chiết men Có thể dùng men bia dạng sữa, men bánh mì dạng ép, dạng khô để chế ra nước chiết men 80g men dạng ép hay 50g dạng khô cho vào 1l nước điều chỉnh ph đến 6,8,sau đó đun sôi trong 30 phút, chiết lấy nước trong bỏ cặn, kiểm tra lại ph, lọc và thanh trùng, từ nước chiết men ta pha thành môi trường thạch-nước chiết men. Men tự phân và cao men: Nguyên liệu là men bánh mì dạng ép hoặc khô,.men bia rửa sạch ở dạng men sữa Men cũng được hoà với nước (men ép tỉ lệ 1:4,men khô tỉ lệ 1:6,men sữa tỉ lệ 1:1) giữ ở 500C trong vòng 24h. Chiết lấy phần nước trong, bỏ cặn trung hoà và đun sôi. Từ dịch men ta phân ta có thể pha thành môi trường thạch-nước men-đường (nước men được pha thêm 0,5% muối ăn,1-2% glicoza và 2% thạch), pH 6,8. Thanh trùng ở 0,5 at trong 30 phút. Có thể thay glucoza bằng 0.5% sacaroza, pH 6-6,5 Dịch men tự phân có thể cô đặc thành cao men, đem dùng dần để pha môi trường với tư cách là nguồn nitơ hữu cơ (pepton,peptit,axitamin,nucleotit…) và các nguồn vitamin, đặc biệt là vitamin nhóm B. *Môi trường Hansen Glucoza 20g (có thể thay bằng sacaroza 50g) Pepton 10g KH2P04 3g MgS04 2,5g nước cho đủ 1l *Môi trường Genneberg Sacaroza 150g Apragin hoặc pepton 3g KH2P04 5g MgS04 2g CaC03 5g nước cất cho đủ 1l *Môi trường Genneberg+ amôni Sacaroza 150g (NH4)2HP04 2g MgS04.7H20 1g CaC03 5g Nước cất cho đủ 1l *Môi trường Rider: thành phần môi trường có các loại muối sau,g/l Amoni sulfat 3 Magie sulfat 0,7 Canxi nitrat 0,4 Natri clorua 0,5 KH2P04 1 K2HP04 0,1 Dùng môi trường nuôi nấm men cần loại bỏ caxi nitrat, vì nấm men không đồng hoá được chất này, pH ban đầu của môi trường là 6,6 Để thử sinh trưởng của nấm men người ta thêm 2% đường vào môi trường. Để thử lên men của nấm men người ta thêm 5% đường vào môi trường Để môi trường tổng hợp được đầy đủ các chất dinh dưỡng và sinh trưởng ta cần phải bổ sung các hợp phần vitamin như sau,mg/ml Inozit 5 Biotin 0,0001 Axit pantotenic 0,25 Tiamin 1 Pyrodoxin 0,25 Axit nicotinic 0,5 Pha trong nước cất Chú ý: Khi dùng môi trường chọn lại của nấm men, để cho nấm men có ưu thế và ức chế vi khuẩn, ta cho vào môi trường chất kháng sinh neomixin với hàm lượng 20dv/1 ml môi trường, hoặc hỗn hợp penixilin với streptomixin cho đồng thời (50-100 dv trong 1 ml môi trường) Để ngăn chặn nấm mốc phát triển ở các môi trườg lỏng hoặc môi trường thạch người ta cho thêm vào môi trường cồn để có 40 cồn hoặc 0,2% natri propionat Khi phân lập từ nấm men tạo màng người ta cho vào môi trường axitiodua axetic với số lượng 0,1-0,2% *Môi trường Saburo Pepton 10g Glucoza 40g Thạch 15g Nước cho đủ 1l pH 5,6 *Môi trường mầm lúa: Ủ cho thóc nảy mầm, phơi khô mầm, xay thành bột. Cân 1kg bột cho vào đó 3 lít nước, đun cách thuỷ ở nhiệt độ 600C để đường hoá tinh bột.. Thử bằng dung dịch iodine.. Lọc lấy dịch thêm nước điều chỉnh cho nồng độ chất khử hoà tan đạt 10Bx, phân vào các dụng cụ chứa, hấp tiệt trùng 1210C trong 1 phút. *Môi trường khoai tây -đường- cám: Khoai tây 300g Sucrose 50g Cám 100g Khoai tây cắt nhỏ, rửa sạch, cân lấy 300g. Thêm 500ml nước, đun sôi trong 30 phút. Lọc lấy nước trong, trộn 2 loại dịch lọc trên và thêm 50 glucoza đường, bổ sung cho đủ 1 lít. *Môi trường giá đậu- đường: Cân 100 g giá đậu. Thêm 100 ml nước, đun sôi 30 phút, lọc để lấy dịch trong. Thêm cho đủ 1lít nứơc và thêm 50g đường. Môi trường lai giống nấm men: Glucoza 20g MgSO4 19g Biotin 3g Thạch 20g K2HPO4 2g (NH4)2SO4 1g Thiamin 200g nước 100ml Nếu sử dụng môi trường lỏng thì không cần thạch. Môi trường Acetate: Acetate natri 10g Thạch 20g KCl 5g Nước 1l Em đã có bổ sung thêm các môi trường trên,sau đây em xin bổ sung các môi trường mới, nhưng ở đây, em chọn tất cả các môi trường để nuôi cấy vi sinh vật, em rất xin lỗi vì đây, em không thể phân biệt được các loại môi trường là đặc hiệu dành cho nấm men, nên em đưa vào rất mong cô có thể phân biệt giúp em, em xin cảm ơn. Thạch thường (Meat Extr aga): Pepton 10g Cao thịt 3g NACl 5g Aga 12g pH 7 Đun tan các hợp phần trên trong 1l nước, hấp ở 1210C trong 15 phút. Nước muối sinh lý vô trùng Pha NACl trong nước cất với nồng độ 0,85%. Hấp ở 1210C trong 15 phút. BGBL (Brilliant Bile Lactose 2%) Pepton 10g Lactose 10g Mật bò 20g (Sodium desoxychocolate) Brilliant Green 0,0133g pH 7,4 Hoà tan pepton và lactose vào trong 500ml nước cất. Cho 20g mật bò vào 200ml nước cất (pH của dung dịch khoảng 7-7,5). Trọn hai dung dịch, thêm nước cất đến 975 ml. Chỉnh pH đến 7,4. Cho thêm 13,3 ml dung dịch Brilliant Green 0,1% trong nước cất. Thêm nước cất cho đủ 1l. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ 16mm có chuông Durham (mỗi ống 15ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút. Nước pepton Pepton 10g NaCl 10g pH 7,2 Đun tan các hợp phần trên trong 100 lit nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ 16mm (mỗi ống 5ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút. Môi trường MRVP Pepton 5g K2HPO3 5g Dextroza (hoặc Glucose) 5g pH 7,5 Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ 16mm( mỗi ống 5ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút. EMB(Eosine Methylene Blue Aga) Pepton 10g K2HPO3 10g pH 7,2 Đun tan các hợp phần trên trong 1l nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Endo Aga Pepton 10g Lactose 10g Cao thịt 10g NaCl 5g Funchsine basic 0,04g Na2SO3 2,5g Aga 15 pH 7,4 Đun tan cáchợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Simmons Citrate Aga: (NH4)2HPO4 1g K2HPO4 1g NaCl 5g Natri citrate 2g MgSO4 0,2g Bromotymol xanh 0,08g Aga 12,5g pH 6,6 Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Matinol Salt Broth NaCl 150g Pepton 20g Manitol 15g Cao thịt 5g Phnol đỏ 0,025g Natri sulfamezathine 0,055g pH 7,4 Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các ống nghiệm cỡ 16mm (mỗi ống 10ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút. Wilson Blair Aga NaCl 5G Pepton 10g Glucose 10g Cao thịt 3g Aga 10g pH 7 Đun tan hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Hấp ở 1210C trong 15 phút. Trước khi sử dụng, đun chảy môi trường và cứ 18ml môi trường + 1ml Na2SO3 (10g/100ml) +5 giọt FeSO4 (8g/100ml). Thêm 1ml Na2SO3 + 5 giọt FeSO4 vào ống thạch ngay trước khi bắt đầu trình tự tiến hành thí nghiệm. Chapman Aga: NaCl 75g Pepton 10g Matinol 10g Cao thịt 3g Phenol đỏ 0,025g Aga 12g pH 7,4 Đun tan các hợp phần trên trong 1 lít nước cất. Phân phối vào các đĩa pectri cỡ 100mm (mỗi đĩa 15-20ml). Hấp ở 1210C trong 15 phút. III.3)CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY NẤM MEN III.3.1) chuẩn bị dụng cụ nuôi cấy III.3.1.1) Xử lí dụng cụ 1- nguyên tắc chung Các loại dụng cụ để nuôi cấy vi sinh vật phải đạt độ trung tính thật sạch và trong ,không bị nứt mẻ - phương pháp xử lí -trung tính dụng cụ -rửa dụng cụ a) trung tính dụng cụ -Đổ vào bên trong dụng cụ nước có ph=7 (để kiểm tra trung tính) -Hấp khử trùng dụng cụ ở 1210C trong 15 phút bằng nồi hấp điện -Lấy dụng cụ ra để nguội rồi kiểm tra ph của nước trong dụng cụ -Nếu nước có ph kiềm thì tiếp tục ngâm dụng cụ vào HCL 2% cho đến khi kiểm tra lại và thấy nước có ph =7 thì mới thôi -Rữa kĩ bằng nước nhiều lần thì dùng được b)PHương pháp rửa dụng cụ Nhìn chung các dụng cụ làm bằng thuỷ tinh có độ bền hoá học,chịu được nhiệt độ cao rất khác về hình dạng và kích thước. Do đó các loại dụng cụ khác nhau cần có các phương pháp rửa khác nhau phiến kính Với phiến kính cũ (đã dùng làm tiêu bản) Chùi sạch mỡ và vaselin trên phiến kính bằng miếng vải tẩm xilen hoặc ngâm tiêu bản vào dung dịch sulfubricomate trong 48h Ngâm tiêu bản vào nước xà phòng và đun sôi trong vòng 1h Rửa nước,để ráo Ngâm tiêu bản vào cồn 900 trong 2h Lau khô chúng bằng vải mịn và sấy khô -Với phiến kính mới:cần kiểm tra độ ph và xử lí để đạt độ trung tính Yêu cầu:các phiến kính sau khi rửa phải đạt tiêu chuẩn sạch mỡ và trong ống nghiệm Chuẩn bị các loại ống nghiệm khác nhau để dễ dàng phân loại ống nghiệm -Đối với các ống nghiệm cũ đã bị nhiểm khuẩn Hấp vô khuẩn 1210C trong 15 phút Lấy ra và đổ các vật phẩm trong ống nghiệm ra khỏi ống nghiệm Ngâm ống nghiệm vào nước ấm Rửa ống nghiệm bằng cách Dùng chổi chấm xà bông cọ xát vào thành ống đều khắp nhiều lần Rửa nước 2-3 lần Úp ống nghiệm cho thật ráo nước và khô Sấy khô trong tủ ấm 400C -Với các ống nghiệm không bị nhiễm khuẩn hay chứa các vi khuẩn không gây bệnh thì không phải hấp khử trùng và tiến hành rửa như trên Đĩa pectri -Đặt ngữa đĩa pectri trong lòng bàn tay -Tay phải dùng dẻ chấm tro có xà bông xát vào 2 mặt của đĩa, các khe ở chân đĩa và thành đĩa -Rửa nước 2-3 lần -Úp riêng các đĩa trong rổ nhựa cho thật khô Pipet -Dùng que hoặc dây thép nhỏ rút nút bông ở đầu lớn pipet ra -Khử trùng pipet ở 1210C trong vòng 15 phút Ngâm trong dung dịch sulfurbicromate trong 24h -Xát kĩ hai đầu vào phần ngoài pipet bằng giẻ và nước xà bông -Dùng nước xả ngược để thông cặn pipet -Cắm pipet trên giá đầu nhọn để lên trên Các dụng cụ thuỷ tinh khác -Dùng giẻ với nước xà bông đặt lắc kĩ để rửa phần trong dụng cụ -Rửa nước nhiều lần cho thật sạch và để ráo Nút và ống cao su -PHân loại các dụng cụ này theo kích thước to nhỏ, xấu,tốt sạch hay bẩn -Ngâm từng loại riêng vào nước ấm (50-800C) trong 3-4 h rửa nước lã nhiều lần -PHơi nắng 2-3 h rồi cất đi dùng III.3.1.2) Bao gói dụng cụ 1 nguyên tắc -Dụng cụ được bao gói phải đảm bảo thật sạch và khô -Bao gói phải thât kín và cẩn thận để sử dụng sau khi sử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng 2 phương pháp bao gói dụng cụ Việc bao gói dụng cụ gồm 2 khâu Làm nút bông: cho các ống nghiệm,hình tam giác,pipet… bao gói: cho hầu hêt các dụng cụ thuỷ tinh )Cách làm nút bông Với các ống nghiệm -Lấy một miếng bông không thấm nước cuộn lại -Dùng khúc tre ấn vào giữa cuộn bông -Yêu cầu: Nút có kích thước độ chặt vừa phải Đầu nút trong. phần ngoài lớn hơn phần trong ống nghiệm Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng Với các chai lọ bình tam giác có kích thước lớn :cách làm tương tự nhưng lượng bông đưa vào phải nhiều hơn và lọc bằng một lớp vải gạt Với các pipet, dùng một sợi dây thép nhỏ nhét một ít bông vào đầu lớn của pipet b) Cách bao gói dụng cụ Với các dụng sụ sau khi làm nút bông, cần được bao gói phần có nút bông bằng giấy dầu hay giấy báo để khi hấp khử trùng nút bông không bị ướt, đảm bảo điều kiện vô trùng tốt hơn,cách làm như sau: -Cắt các băng giấy hình chữ nhật với kích thước cần theo dụng dụ cần bao gói -Quấn băng giấy quanh đầu có nút bông -Gập ống giấy sát vào nút bông ở mặt trước và hai bên -Gập nốt phần giấy còn lại và cài sâu vào trong Yêu cầu -PHần giấy bao ngoài phải chặt kín -Bao bằng giấy dầu với dụng cụ hấp ướt -Bao bằng giấy báo với dụng cụ sấy khô khi khử trùng Với các dụng cụ như pipet, dĩa pectri,que gạt phải dùng giấy bao kín toàn bộ.có thể thay giấy báo bằng một hộp nhôm kín đựng tất cả các dụng cụ trên để khử trùng 3.3 Khử trùng dụng cụ 10-Nguyên tắc Sau khi khử trùng cần phải đảm bảo -Sự vô trùng tuyệt đối cho các vật phẩm và các dụng cụ -Không làm thay đổi chất lượng mẫu vật -bảo đảm an toàn tuyệt đối cho người III.3.1.3) Khử trùng dụng cụ Khi khử trùng bằng nhiệt,các tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật có thể bị tiêu diệt dễ dàng trong khi các bào tử vẫn còn có thể tồn tại ở ngay nhiệt độ đó khả năng chịu nhiệt của vi sinh vật phụ thuộc vào: -Tính chất môi trường -Số lượng tế bào vi sinh vật -Độ ph của vật định khử trùng Do đó để khử trùng bằng nhiệt có hiệu quả, cần xác định ngưỡng nhiệt độ thấp nhất và khoảng thời gian ngắn nhất cần thiết để tiêu diệt toàn bộ vi sinh vật và các bào tử của chúng có trong dụng cụ cần khử trùng. Có thể khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô hay nhiệt ướt a)khử trùng bằng phương pháp nhiệt khô Dưới tác dụng của sức nóng khô,các cấu tử của tế bào vi sinh vật bị oxi hoá,tế bào bị khô hoàn toàn và chết -Khử trùng bằng tủ sấy Phương pháp khử trùng này được thực hiện trong tủ sấy Cách tiến hành: Các dụng cụ khử trùng cần được bao gói cẩn thận và xếp vào tủ sấy Bật công tắc tủ để hoạt động Xoay các núm để điều chỉnh kim chỉ trên đồng hồ nhiệt độ và kim chỉ trên đồng hồ thời gian tới các chỉ số mong muốn (1600C trong vòng 2h hay 1800C trong vòng 30 phút) Tủ nhiệt và thời gian mong muốn sẽ được duy trì nhờ bộ phận đièu chỉnh tự động Tắt tủ sấy để nguội 600C mới mở tủ lấy dụng cụ. Tránh mở tủ lấy dụng cụ khi nhiệt độ trong tủ đang còn cao sẽ làm dụng cụ thuỷ tinh dễ bị vỡ Các dụng cụ sau khi sấy mà giấy bao có màu hơi vàng là được -Khử trùng bằng cách đốt qua lửa nung đỏ PHương pháp này dùng để khử trùng pipet, que cấy ,đầu ống nghiệm,miệng các bình tam giác sau khi lấy nút bông ra -Cách khử trùng Hơ dụng cụ trên ngọn lửa đèn cồn, đưa qua đưa lại 3-4 lần.que cấy phải được nung thật đỏ hết chiều dài que cấy Đợi cho dụng cụ nguội mới được dùng để tránh vỡ dụng cụ và vi sinh vật không bị tiêu diệt khi lấy giống. Cũng có thể nhúng dụng cụ vào cồn etylic 900C rồi đốt nhiều lần để khử trùng a)Khử trùng bằng sức nóng ướt 1-Đun sôi trong nước -Phương pháp này dùng khi cần khử trùng nhanh các dụng cụ:cốc thuỷ tinh. Kim tiêm kẹp,chai,lọ… -Cách khử trùng Dùng nước máy sạch đổ ngập dụng cụ Đun sôi từ từ 30 phút đến 1h PHương pháp này chỉ có tác dụng tiêu diệt tế bào sinh dưỡng chứ không tiêu diệt được bào tử vi sinh vật. Để khắc phục hạn chế này, người ta pha thêm một ít acid phenic 5% 2)Hấp gán đoạn ở 1000C -Phương pháp này dùng để hấp khử trùng một số loại môi trường nuôi cấy nấm men bánh mì,men gia súc… và những vi sinh vật tạo bào tử khác -Cáchs khử trùng Hấp môi trường ở 1000C từ 30-40phút Lấy ra để tủ ấm 24h cho các bào tử của vi sinh vật nảy mầm Hấp môi trường lần 2 ở 1000C trong 30-40 phút để tiêu diệt các bào tử vừa mới nảy mầm Lặp lại quá trinh này từ 3-4 lần -Kết quả: Môi trường vừa được vô trùng,vừa đảm bảo không bị biến đổi 4-Khử trùng bằng hơi nước bão hoà ở áp suất cao -PHương pháp này thường được thực hiện ở nồi hấp tiệt trùng ở áp suất cao. Đó là thiết bị làm bằng kim loại,chịu được nhiệt độ và áp suất cao,có khả năng tự động điều chỉnh áp suất và thời gian tiệt trùng theo yêu cầu của người sử dụng 5)Nguyên tắc hoạt động -Làm gia tăng nhiệt để khử trùng các vật bằng hơi nước bão hoà dưới áp suất lớn bình thường của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng thì nhiệt độ trong nồi cũng tăng cũng tăng nhờ hệ thống van rất chặt chẽ. -Mối quan hệ giữa áp suất ghi trên áp kế với nhiệt độ trong nồi biểu hiện qua bảng dưới đây Áp suất (atm) Nhiêt độ(0C) Áp suất(atm) nhiệt độ(0C) 0 100 1.5 128 0.5 112 2 `134 1.0 121 Cách sử dụng Chuẩn bị các dụng cụ chứa môi trường (ống nghiệm,bình tam giác đã được bao gói phần nút bông để tránh làm ướt nút bông để tránh làm ướt nút bông) Cho 3 l nước vào nồi hấp rồi kiểm tra và điều chỉnh mức nước cho phù hợp. Luôn kiểm tra mức nước ở trong nồi hấp trước khi tiến hành khử trùng. Xếp các dụng cụ vào rổ inox và đưa và đưa hấp Đóng chặt nồi hấp Cắm phích địên Điều chỉnh kim đồng hồ điện áp và chỉ số mong muốn. Điều chỉnh kim đồng hồ thời gian khử trùng và chỉ số mong muốn Đóng kín van xả Bật công tắt khử trùng (hay nhấn nút start) của nồi hấp Nhờ sự điều chỉnh của hệ thống tự động,quá trình hấp và khử trùng được diễn ra và kêt thúc bằng còi báo hiệu -Chờ kim quay kế chỉ về số 0,mới mở nắp nồi từ từ,để nhiệt độ hạ thấp rồi lấy dụng cụ,vật liệu đã khử trùng ra. Rút phích điện (ngưng cung cấp điện cho nồi hấp) Dán nhãn ghi ngày,tháng năm khử trùng vào dụng cụ hay nguyên vật liệu vừa khử trùng để tiện việt sử dụng Chú ý Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của công việt hấp khử trùng,người làm thí nghiệm cần phải. kiểm tra lại nồi hấp trước khi sử dụng Thận trọng thực hiện đúng quy trình được chỉ dẫn Tránh cung cấp điện đột ngột để không gây vỡ dụng cụ,nguyên liệu hoặc gây nổ nguy hiểm Trực tiếp theo dõi qúa trình hấp khử trùng cho đến khi kết thúc và ngắt điện Định kì kiểm tra chất lượng đồng hồ áp kế và van an toàn Tóm lại,phương pháp hấp khử trùng bằng hơi nước bão hoà ở áp suất cao là phương pháp phổ biến và hiệu quả nhất trong tất cả các phương pháp khử trùng nhờ khả năng tiêu diệt được cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử của vi sinh vật Gần đây một số phòng thí nghiệm vi sinh vật học của các viện và trường đã được trang bị mới loại nồi hấp áp suất cao dưới dạng hình khói hình chữ nhật,gọn đẹp và tiện sử dụng hơn nhưng nguyên tắc hoạt động vẫn giữ nguyên c)Khử trùng bằng cách lọc PHương pháp này cùng để khử trùng các loại môi trường không thích hợp với phương pháp khử trùng ở nhiệt độ cao (như môi trường huyết thanh,dung dich albumin,đôi khi cả môi trường đường). Ngoài ra có thể dùng biện pháp này để tách các vi sinh vật với các sản phẩm trao đổi chất của chúng trong dung dịch nuôi cấy Nguyên tắc:cho dung dịch đi qua màng lọc (của dụng cụ lọc) mà kích thước lỗ màng nhỏ hơn kích thước vi sinh vật cần lọc. Nhờ đó dịch qua lọc được vô trùng Cấu tạo bình lọc: Có rất nhiều loại dụng cụ lọc khác nhau nhưng phổ biến nhất là bình lọc zeilz. Cấu tạo của nó gồm 3 bộ phận bộ phận trên có hình trụ để chứa dịch lọc (ống lọc) Bộ phận ở dưới dùng để chứa dịch đã qua lọc Bộ phận ở giữa dùng làm màng lọc (quan trọng nhất) Màng lọc bừng amiăng,hình tròn dày 3-5mm cả ba bộ phận trên liên kết nhau nhờ các ốc vít Bình lọc này có thể nối với một bình tam giác có vòi hút chân không để tạo nên sự chênh lệch áp suất giữa trên và dưới màng lọc do đó làm tăng tốc độ lọc Cách tiến hành -Hấp khử trùng ống lọc,bình chứa dịch lọc và các phụ tùng kèm theo ở 1 atm,trong 15 phút ở nhiệt độ 1210C Đặt màng lọc vào giữa ống lọc và bình đựng dịch lỏng cố định 3 bộ phận này nhờ các ốc vít Đỗ dịch lọc vào ống lọc Nối bình đựng dịch lọc với bình tam giác được gắn với bình hút chân không .Trong đoạn vòi nối có bông gòn để hạn chế sự nhiễm trùng dịch lọc Cho máy hút chân không hoạt động để đưa độ chênh lệch áp suất lên từ từ và dịch lọc chảy thành từng giọt. Áp suất tạo ra không quá 30-40 cm thuỷ ngân Thời gian lọc không được quá kéo dài 30 phút Lọc xong,lấy một ít dịch lọc cấy vào môi trường thạch-nước thịt pepton để trong tủ ấm 370C. Kiểm tra độ vô trùng của dịch lọc Bỏ màng lọc đi vì màng này chỉ được sử dụng 1 lần d)Tủ cấy vô trùng Thiết bị này dùng để thực hiện các thao tác phân phối môi trường vào các dụng cụ cấy chuyền, phân lập và tuyển chọn vi sinh vật Nguyên tắc: Bầu không khí bên trong tủ cấy (nơi diễn ra các thao tác cấy…) luôn luôn đảm bảo được vô trùng hay ít nhất cũng hạn chế được tối đa sự tồn tại của các vi sinh vật không mong muốn như bào tử của chúng Cấu tạo: Tủ kính có cửa để đưa vào hay lấy ra các dụng cụ Hệ thống bơm và lọc không khí bên ngoài thành không khí vô trùng thổi vào tủ đồng thời với bộ phận hút khí ra để đảm bảo sự cân bằng áp suất trong và ngoài tủ Chú ý: khi tiến hành thao tác xong ở trong tủ,cần chuyển ngay các hoá chất,dụng cụ, nguyên vật liệu khỏi tủ,vô trùng lại rồi mới tắt các hệ thống bơm lọc khí của tủ III.3.2) Chuẩn bị môt trường nuôi cấy trong phòng thí nghiệm III.3.2.1) Chuẩn bị nguyên liệu Các nguyên vật liệu đem làm môi trường nhất thiết phải cung cấp đầy đủ các thành phần dinh dưỡng cho các quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men,đồng thời phải duy trì được thế oxi hoá-khử ,áp suất thẩm thấu và tạo được sự ổn định của ph thích hợp cho môi trường -Các thành phần nguên liệu phải được cân đong chính xác và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn -Đối với môi trường dịch thể ,các thành phần nguyên vật liệu được cân, đong rồi hoà tan với nước - Đi với môi trường thạch bột thì cần dùng với các thành phần khác rồi hoà tan và nước ,nếu có thạch sợi thì phải cần thạch sợi ,ngâm vào nước vớt thạch ra rồi vắt khô cho vào nồi nấu môi trường để đun III.3.2.2) Làm trong môi trường Nếu môi trường dịch thể không có đủ độ trong cần thiết,việc làm trong môi trường giúp quan sát việt phát triển của nấm men dễ dàng hơn.có thể làm trong môi trường bằng phương pháp lọc môi trường qua bông gòn,vải thưa hay giấy lọc cũng có thể lộc môi trường bằng than hoạt tính hay lòng trắng trứng gà. Trong phương pháp lọc bằng lòng trắng trứng gà ,cứ 1 l môi trường thì phải sử dụng 1 quả trứng gà. Trước tiên trộn lòng trắng trứng với 1 thể tích nước tương đương rồi đánh cho đến khi sủi bọt. Sau đó cho hỗn hợp này vào môi trường ,khuấy đều rồi đun sôi trong vòng 10-15 phút ,để lắng và lọc III.3.2.3) Điều chỉnh ph của môi trường Các nấm men khác nhau chỉ có thể sinh trưởng trong những khoảng ph khác nhau và chỉ phát triển tối ưu tại 1 khoảng ph xác định nào đó,vì vậy ph của môi trường phải điều chỉnh sao cho thích hợp Các chất thưòng điều chỉnh ph trong môi trường nuôi cấy:NA0H,K0H,HCL,H2SO4,NA2CO3… Để xác định ph của moi trường,có thể sử dụng các chất chỉ thị màu như giấy quỳ tím hay xanh brômmthymol.thuy nhiên,việc sử dụng máy đo ph có sẵn trong phòng thí nghiệm cho kết quả chính xác hơn III.3.2.4) Vô khuẩn môi trường Phương pháp vô khuẩn và các điều kiện vô khuẩn một môi trường nào đó phụ thuộc vào tính chất của môi trường đó.phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để vô khuẩn môi trường là phương pháp hấp tiệt trùng môi trường bằng hơi nước ở áp suất cao: thiết bị auto clave thời gian 20 phút.nhiệt độ là 1210C III.3.2.5) Làm thạch nghiêng,thạch đứng và thạch đĩa 1- thạch nghiêng -Phân phối môi trường (có chứa thạch) vào ống nghiệm hay lọ thuỷ tinh có nút bông hay nắp đậy sau khi vô khuẩn môi trường. Thể tích môi trường được phân phối và ống nghiệm hay lọ phụ thuộc vào yêu cầu về độ dài của mặt thạch nghiêng hay độ cao của phần thạch sâu. Thông thường ,người ta cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng 1/3 thể tích ống nghiệm để làm thạch nghiêng -Cần phải thực hiện các thao tác phân phối thật nhanh,gọn gàng với các kĩ thuật vô trùng để tránh nhiễm khuẩn từ bên ngoài -Để nguội ống nghiệm hay lọ có chứa môi trường ở tư thế nghiêng góc sao cho mặt nghiêng và phần thạch đạt yêu cầu -Để yên cho đến khi môi trường đặt lại.bề mặt thạch nghiêng phải được bằng phẳng không gồ ghề,nhẵn và liên tục. 2-Thạch đứng -Tiến hành phân phối môi trường như đối với thạch nghiêng nhưng làm nguội ống nghiệm ở tư thế đứng.thông thường người ta cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng ¾ thể tích ống nghiệm của thạch đứng -Để yên cho đến khi môi trường đặc lại 3thạch đĩa Proteins-việc phân phối môi trường vào thạch đĩa thường phải được thực hiện trong tủ cấy vô trùng -Đĩa pectri thường phải được vô lhuẩn -Tiến hành song song với các kĩ thuật vô trùng -Có thề phân phối môi trường vào đĩa bằng pipet hay rót trực tiếp ra dĩa. Tuỳ vào yêu cầu cụ thể của từng thí nghiệm mà thể tích môi trường được phân phối vào dĩa có khác nhau để tạo môi trường thạch có độ dày ,mỏng khác nhau -Lưu ý: nắp hộp chỉ được mở một phần khi cho môi trường vào -Đậy nắp lại,xoay đĩa theo đường tròn ,tới lui một cách nhẹ nhàng nhưng để tránh môi trường dấy lên nắp và thành đĩa -Để yên cho đến khi môi trường đặc lại III.3.2.6) PHân phối môi trường vào dụng cụ chứa Các dụng cụ chưa môi trường thường là bình tam giác,các loại ống nghiệm,hay hộp đĩa pectri. Quá trình phân phối môi trường vào dụng cụ chứa phải tuân thủ một số nguyên tắc cơ bản sau: -Môi trường phải được phân phối ở trạng thái lỏng -Nếu dụng cụ chứa là đĩa pectri và môi trường cần phảo được vô khuẩn thì môi trường này cần phải vô khuẩn thì dĩa này cần phải hấp tiệt trùng trước khi phân phối môi trường -Nếu dụng cụ chứa là ống nghiệm hay bình tam giác thì phải sử dụng phễu –các thao tác phân phối cần phải được nhanh gọn,khéo léo để môi trưòng không bị giấy lên miệng hay thành của dụng cụ chứa và phải hoàn thành trước khi môi trường bắt đầu hoá rắn. III.3.2.7)Bảo quản,kiểm tra môi trường -Môi trường chưa được sử dụng cần phải được bảo quản ở nơi khô thoáng mát tránh ánh sáng nhiệt độ phải thích hợp (thường 0-50C) và có độ ẩm thích hợp để tránh làm khô môi trường -Thời gian bảo quản phải được tuân thủ nghiêm ngặt theo yêu cầu của từng thí nghiệm để đảm bảo chất lượng môi trường. III.4)PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GIỐNG NẤM MEN Viết lại phần phân lập giống và chọn chủng loại. Ban đầu chưa thể tách giống thuần chủng từ khuẩn lạc riêng biệt mà phải tiến hành tăng sinh, pha loãng mẫu. tiếp đến cấy mẫu và ủ mẫu rồi mới phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trưng. Cuối cùng là kiểm tra tính thuần khiết của giống, chủng, loài mà mình chọn. Phân lập một vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu vật hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu nhận giống ở dạng thuần khiết. Giống vi sinh vật thuần khiết rất quan trọng trong công nghệ sinh học.Chúng chỉ gồm các tế bào được sinh ra ban đầu. Hầu hết các ứng dụng trong công nghệ sinh học đều liên quan đến việc sử dụng giống thuần. Phần lớn các phương pháp phân lập giống thun khiết dựa trên các kĩ thuật pha loãng,thường gồm các bước sau: chuẫn bị mẫu,tăng sinh mẫu,pha loãng mẫu,cấy mẫu lên môi trường thạch dĩa thích hợp,ủ mẫu,kiểm tra và phát hiện khuẩn lạc đặc trưng,chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạo giống thuần và kiểm tra giống thuần III.4.1) KỸ THUẬT TẠO GIỐNG DÙNG TRONG SẢN XUẤT CÔNG NGHIỆP III.4.1.1)Phân lập giống trong tự nhiên: Thiên nhiên là nguồn vô tận cho việc phân lập giống vi sinh vật. Vi sinh vật trong tự nhiên phân bố không đều. Chúng thường tập trung những nơi giàu chất dinh dưỡng và phát triển ở điều kiện thuận lợi. Do đó phải nắm chắc một số nguyên tắc cơ bản:ở đâu tồn tại một chất cơ nào đó thì ở đó có nhiều vi sinh vật phân huỷ chất cơ đó. Một đặc điểm quan trọng khác của vi sinh vật trong tự nhiên là năng suất sinh học không cao. Muốn có giống tốt phải cải tạo giống này. Do đó phân lập trong điều kiện tự nhiên chỉ là những giống gốc, từ đó tiến hành những biện pháp nâng cao chất lượng đáp ứng yêu cầu sản xuất. Các bước tiến hành tạo lập giống từ điều kiện tự nhiên: Tìm vị trí để phân lập giống. Vị trí để phân lập giống thường là nơi hay vật phẩm có sự tập trung khá cao về mật độ giôngd vi sinh vật mà ta quan tâm. Chọn đúng vị trí hay vật phẩm dùng để phân lậpcoi như bước đầu khẳng định khả năng thành công của công việc. Sau khi xác định được vị trí hay vật phẩm đê phân lập, người ta cân 1g hay một ml( nếu vật phẩm là dạng lỏng đem đi phân lập). Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các môi trường tập trung. Môi trường tập trung là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng có khả năng thích hợp cho nhiều vi sinh vật cùng loài. Ở đó các vi sinh vật trong cùng một loài sẽ phát triển rất mạnh, các vi sinh vật của các loài khác sẽ không phát triển hoặc phát triển rất kém. Mục đích của việc sử dụng môi trường tập trung là loại dần những vi sinh vật mà ta không quan tâm. Sau khi pha loãng tới mức độ pha loãng nhất định vật phẩm phân lập ta cấy chúng trong những ống nghiệm hoặc vào họp pectri có môi trường tập trung. Song song đó ta chuẩn bị môi trường đặc hiệu và sau khi các vi sinh vật đã phát triển mạnh trên các hộp môi trường tập trung, ta chuyển chúng sang môi trường đặc hiệu. Môi trường đặc hiệu là môi trường chỉ cho phép các vi sinh vật mà ta quan tâm phát triển còn các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế không phát triển được. Bước cuối cùng là kiểm tra những đặc điểm của vi sinh vật mà ta quan tâm. Mục đích là tuyển chọn các vi sinh vật cùng loài có thể có những đặc điểm đặc trưng mà ta quan tâm. III.4.1.2) Phân lập giống trong điều kiện sản xuất: Khác với giống được phân lập trong điều kiện tự nhiên, các giống vi sinh vật phân lập trong điều kiện sản xuất có những ưu điểm riêng: Giống được phân lập trong điều kiện sản xuất là giống đã qua quá trình sản xuất, đã có khả năng thích ứng với điều kiện sản xuất (trong khi đó giống trong điều kiện tự nhiên chỉ quen với điều kiện không ổn định của tự nhiên). Đặc điểm đã quen với điều kiện sản xuất rất có ý nghĩa trong sản xuất vì đặc tính này đảm bảo tính của giống trong điều kiện nhân tạo. Giống được phân lập trong quá trình sản xuất thường là những giống đã qua biến đổi gen và có những đặc tính sinh hoá cao hơn hẳn những chungr nguuyên gốc. Do đó việc phân lập chúng và tạo được giống từ đây sẽ có năng suất và chất lượng sản phẩm sinh học cao hơn. Trong các điều kiện sản xuất( dịch đang lên men, nước thải, chất thải) thường tồn tại khá tập trung những giống vi sinh vật mà ta quan tâm. Những giống này đang trong quá trình sản xuất và sẽ theo nước thải chất thải ra ngoài. Như vậy trong nước thải, mật độ các vi sinh vật này nhiều nhất trong tất cả các mẫu vật mà ta quan tâm. Nhiều nghiên cứu rất thành công trong việc sử dụng nước thải, chất thải để phân lập lại. Như vậy trong công việc phân lập giống vi sinh vật từ quá trình sản xuất có những bước sau: .Chọn vị trí và mẫu vật phẩm phân lập: Trong quá trình sản xuất giống vi sinh vật có thể bị thoái hoá. Trong tổng thể có rất nhiều cá thể bị thoái hoá nhưng không phải tất cả, trong đó có nhiều cá thể vẫn giữ được những đặc tính mà ta quan tâm. Do đó nhiệm vụ là:từ tập hợp vi sinh vật có trong quá trình sản xuất đó, ta phân lập ra những giống còn giữ được những đặc điểm ban đầu. Địa điểm và mẫu vật đem đi phâ lập ở điều kiện sản xuất bao gồm: Dịch đang tiến hành lên men Nước thải của nhà máy Chất thải của nhà máy Trong đó dịch đang lên men cho xác xuất thu nhận được kết quả cao hơn. .Sau khi chọn đươc vị trí và vật phẩm dùng để phân lập, ta chỉ còn thực hiện các bước sau giống như các bước trong phân lập giống vi sinh vật từ tự nhiên. III.4.1.3)Phân lập giống trong những ống nghiệm đã bị thoái hoá: Các ống giống là tập hợp các tế bào vi sinh vật có cùng môt nguồn gốc di truyền. Tuy nhiên do điều kiện bảo quản bất thường mà ống giống thay đổi một số đặc điểm sinh hoá, từ đó khó ứng dụng trong sản xuất. Tuy nhiên cũng phải nhận thấy rằng , trong hàng tỉ tế bào có trong ống giống đó tất cả không phải đã bị thoái hoá mà còn rất nhiều cá thể vẫn bảo tồn được đặc tính ban đầu. Việc ứng dụng cả ống giống vào trong sản xuất sẽ là tăng năng suất và chất lượng sản phẩm.Thực chất của việc phân lập giống trong những ống nghiệm đã thoái hoá là quá trình tuyển chọn lại giống từ các ống giống. Công việc này hoàn toàn khồn phức tạpvì vị trí và vật phẩm phân lập rất rõ ràng. Vấ đề còn lại là tiến hành các qúa trình phân lập giống từ điều kiện tự nhiên. Công việc này là công việc rất thường xuyên ở nhiều phòng thí nghiệm và phòng kĩ thuật trên thế giới. Nhờ đó mà người ta luôn duy trì giống tốt cho quá trình sản xuất. III.4.2) CHUẨN BỊ TĂNG SINH VÀ PHA LOÃNG MẪU Mẫu có chứa vi sinh vật nếu ở dạng rắn phải được nghiền ta đem hoà tan vào nước cất vô khuẩn hoặc nước muối sinh lí. Nếu mẫu chứa rất ít số tế bào vi khuẩn cần phân lập,cần thiết phải sử dụng môi trường tăng sinh,môi trường tăng sinh cho 1 loại vi sinh vật là loại môi trường tổng hợp có chứa các yếu tố chọn lọc cần thiết cho sự sinh trưởng cả vi sinh vật đó. Quá trình tăng sinh phải qua giai đoạn ủ ở nhiệt độ thích hợp để tế bào vi sinh vật có thể phát triển đến số lượng cần thiết,sau đo mới tiến hành pha loãng và cấy mẫu lên môi trường thạch để tạo các khuẩn lạc phát triển riêng lẻ. Dung dich đem chọn pha loãng có thể là nước cất,nước muối sinh lí hay một loại dung dịch đệm nào đó sao cho khi pha loãng tế bào vi sinh vật vẫn có thể thực hiện các qúa trình trao đổi chất bình thường. Mẫu nên được pha loãng ở nhiều nồng độ khác nhau (thường 1:10,1:100…) nằm tránh hiện tượng không có khuẩn lạc hoặc các khuẩn lạc phát triển dày khít lên nhau trên măt thạch và như thế sẽ không phân lập được. Hình 3.1. Sơ đồ pha loãng dung dịch huyền phù nấm men và cấy lên môi trường thạch ở hộp pectri III.4.3)KĨ THUẬT CẤY MẪU VÀ Ủ MẪU Môi trường phân lập thường không giống nhau đối với việt phân lập các vi sinh vật khác nhau.hơn nữa các vi sinh vật khác nhau nhưng có quan hệ gần nhau thì có thể phat triển thành khuẩn lạc có đặc diểm tương tự nhau. Chính vì vậy,việc chọn môi trường phân lập đóng vai trò rất quyết định hiệu quả phân lập. Thông thường các môi trường chuyên biệt cho sự của một vi sinh vật nào đó được sử dụng để phân lập vi sinh vật này. Tuy nhiên việc nuôi cấy vi sinh vật đòi hỏi các kĩ thuật vô trùng. Bằng các kĩ thuật vô trùng, người thao tác thí nghiệm có thể ngăn ngừa giống vi sinh vật và các dung dịch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật không mong muốn. Thao tác các kĩ thuật vô trùng phải chính xác cũng giúp người thí nghiệm tránh các vi sinh vật gây bệnh. 1 -Vệ sinh sạch các khu vực thí nghiệm bằng các hoá chất sát trùng để giảm tối đa lượng vi sinh vật gây nhiễm 2-Các dụng cụ cấy chuyền phải được tiệt trùng 3- Các thao tác phải được thực hiện nhanh chính xác có hiệu quả để rút ngắn thời gian, qua đó giống vi sinh vật có thể bị nhiễm Các bước cấy chuyền nấm men từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác phải được thực hiện như sau 1-Đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn 2-Mở nút bông hay nắp và hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trên ngọn lửa đèn cồn 3-Thu một ít vi sinh vật bằng que cấy và chuyển qua môi trường tinh khiết 4-Hơ lại miệng ống nghiệm hay lọ trên ngọn lửa đèn cồn và đậy nút bông hay nắp lại 5-Đốt que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Các kĩ thuật vô trùng đối với hộp pectri cũng được thực hiện tương tự Như vậy người làm thí nghiệm phải 1-Luôn luôn tiệt trùng que cấy bằng cách đốt trước khi đưa nó vào bất kì một ống nghiệm nào chứa giống vi sinh vật 2-Luôn hơ miệng ống nghiệm hay lọ chứa vi sinh vật trước khi đưa que cấy tiệt trùng vào ống nghiệm để lấy hoặc cấy giống vi sinh vật 3-Luôn luôn đậy kĩ các ống nghiệm hay lọ… đựng giống vi sinh vật với các nắp tương ứng khi không thực hiện cấy chuyền.tuyệt đối tránh nhầm lẫn các ống nghiệm này nới nắp ống nghiệm kia. Không đặt các nắp ống nghiệm hay nắp dĩa pectri lên mặt bàn hay tiếp xúc với bất cứ vật gì khac ngoài ống ngiệm hay dĩa pectri đựng gống vi sinh vật tương ứng để tránh lây nhiễm.khi chuyển các khuẩn lạc,vào đĩa Perti,sử dụng nắp đĩa như là vật che chắn,bảo vệ giống khỏi bị nhiễm bằng cách nâng nghiên nắp đĩa lên một góc đủ để đưa que cấy vào. 4-Thao tác chính xác khi mở nút hay nắp ống nghiệm/lọ. 1-Đối với vi sinh vật hiếu khí Cấy mẫu Tuỳ theo yêu cầu từng loại môi trường mà cách gieo cấy khác nhau. Sau đây là những cách hay dùng: Cấy chuyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác Gieo cấy trên thạch nghiêng Cấy đâm sâu trên thạch đứng Cấy trên thạch hộp. FCách 1:Trộn vật gieo cấy lỏng vào thạch trước khi đổ ra hộp. Trình tự tiến hành như sau: Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch Đun chảy ống thạch, để nguội 50-550C Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy cho vào ống thạch đậy nút bông lại. Khẽ lắc ống thạchhoặc lăn nó giữa hai bàn tay để trộn đều vật gieo cấy với thạch, thạch dàn đều ra trên đáy hộp. Để yên cho thạch hoàn toàn đặc lại, lật ngược hộp và cho vào tủ ấm để nuôi. FCách 2:Trộn vật gieo cấy vào hộp thạch, tiến hành như trình tự sau: Dùng hộp pectri đã vô khuẩn, chưa có thạch Đun chảy ống thạch để nguội 50-550C Dùng pipet vô khuẩn hút một lượng nhất định vật gieo cấy lỏng ,hé mở hộp, nghiêng qua nghiêng lại hoặc xoay nhẹ hộp để chúng dàn đèu trên đáy hộp. Hé mở nắp hộp, nhanh tay đổ thạch vào, đậy nắp và xoay nhẹ vài vòng trên bàn cho thạch và vật gieo cấy trộn đều đồng thời dàn thành một lớp trên đáy hộp. Để thạch đặc lại, lật ngược hộp, cho vào tủ ấm. FCách 3: Dàn đều vật gieo cấy trên bề mặt thạch. Tiến hành trình tự như sau: Dùng hộp thạch vô khuẩn Dùng pipet lấy một ít vật gieo cấy lỏng Hé mở nắp hộp và cho vật gieo cấy lên mặt thạch Dùng que trang( bằng thuỷ tinh) dàn đều vật gieo cấy trên mặt thạch (que trang phải chuẩn bị trước, sạch, khô, bọc giấy, vô khuẩn) Đậy nắp hộp, để yên một lúc cho mặt thạch ráo nước, quay ngược hộp, cho vào tủ ấm. Thể tích các mẫu (kể cả pha loãng và không pha loãng) được cấy lên thạch đĩa thường là 0.1ml. Tránh cấy mẫu với thể tích lớn,vì như thế thạch sẽ không hấp thụ hết mẫu và chất lỏng còn lại trên mặt thạch sẽ làm cho các khuẩn lạc phát triển dính liền như sau khi ủ. -Lấy que gạt vô trùng (nhúng vào cồn 90o,rồi đốt cháy với ngọn lửa đèn cồn,để nguội trong vài dây,phân bố đều mẫu lên mặt thạch đậy nắp dĩa lại,để thạch thấm hút hết mẫu trong vòng vài phút. -Úp ngược đĩa thạch rồi đem ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.tuỳ theo từng loại vi sinh vật mà thời gian ủ khác nhau. 2) Đối với vi sinh vật kị khí Chưng cách thuỷ môi trường trong ống nghiệm để đuổi hết oxi trong môi trường Để môi trường nguội đến 45-500C. Cấy 0.1ml dung dịch các mẫu (pha loãng và không pha loãng) vào môi trường đậy kín lại và lắc ống nghiệm quanh trục của nó để phân bố đều mẫu trong môi trường -Rót thật nhanh môi trường trong ống nghiệm này ra đĩa pectri rồi đậy nhanh nắp đĩa lại -Dùng paraphin dán kín kẻ hở giữa đáy đĩa và nắp đĩa rồi đem ủ ở nhiệt độ thích hợp . Thời gian ủ phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật cần phân lập. Thông thường các vi sinh vật khác nhau có khuẩn lạc mang những đặc điểm khác nhau trên môi trường phân lập. Sử dụng que cấy khối môi trường có khuẩn lạc đặc trưng phát triển riêng lẻ rồi cấy vào môi trường dịch thể .để ủ môi trường lỏng nhiệt độ và thời gian thích hợp để kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật. Ủ mẫu: Trong trường hợp nuôi tĩnh được thực hiện trong tủ ấm có điều chỉnh nhiệt độ. Với từng loài ta cần giữ nhiệt độ tối thích cho nó phát triển hoặc những khoảng nhiệt độ cần nghiên cứu. Máy lắc có những tốc độ khác nhau được đặt trong các phòng có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ. Nếu nuôi giống nhiều thể tích lớn phải cung cấp đủ khí oxi, sục khí và dùng các loại cánh khuấy thích hợp Các giống hiếu khí thường nuôi trên máy lắc trong bình tam giác hoặc bình cầu có nút bông. Sau khi cấy xong, ta nuôi ở 25-280C trong vòng 4-5 ngày Trên môi trường lỏng vi sinh vật phát triển khắp môi trường, có thể tạo thành váng, làm đục môi trường, có trường hợp lắng xuống đáy các dạng kết tủa hình bông, sợi lơ lửng lắc khó tan hoặc dễ tan…, sinh ra mùi hoặc màu đặc trưng. Trên môi trường đặc mỗi tế bào phát triển thành một khuẩn lạc. Khi quan sát ta nên chú ý các khuẩn lạc phát triển đứng riêng rẽ, xem hình dạng kích thước, rìa mép, nhìn bề mặt xem bóng, mịn ướt, khô, gợn sóng, nhăn heo, nhìn xem toàn bộ đục mờ hay trong suốt, xem màu sắt và ngửi mùi… III.4.4)Phát hiện và chọn khuẩn lạc đặc trưng Sau khi nuôi trong một thời gian ngắn,vi sinh vật đã mọc giống tốt, chọn khuẩn lạc mọc riêng rẽ, mọc tốt đều và đẹp hoặc những điểm giống mọc tốt trên đường ziczac chuyển vào môi trường lỏng ( dịch malt, dịch quả) đã vô khuẩn trong ống nghiệm hoặc trong bình tam giác. Nuôi 2-3 ngày ở 280C để giống phát triển. Từ đây ta tiến hành phân lập lại một lần nữa (có thể qua quá trình pha loãng) để chọn các khuẩn sạch từ các khuẩn lạc riêng rẽ, mọc tốt trên bề mặt môi trường đặt trong đĩa pectri. Chú ý: Sau 2 ngày , vi sinh vật chưa phát triển thì có thể để lâu hơn Phải chọn khuẩn lạc thật riêng biệt. Phương pháp phân lập trên môi trường đặc là phương pháp thông dụng, dễ làm và kết quả tương đối đảm bảo nhưng có thể có những nhược điểm sau: Khuẩn lạc có thể không phát sinh từ một tế bào mà từ nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng biệt, nhưng qua một thời gian ngắn chúng lài dính liền với nhau. Để khắc phục những nhược điểm đó và đảm bảo canh trường hoàn toàn thuần khiết ta có thể tiếp tục phân lập như trên vài lần, đồng thời làm tiêu bản quan sát để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách. I:Phương pháp cấy ria Phương pháp cấy ria góc Tạo các góc phần tư bằng cách vẽ hai đường vuông góc bên ngoài đáy đĩa thạch chia dĩa thạch làm 4 phẩn bằng nhau Đốt nóng que cấy vòng ,để nguội trong vòng vài giây rồi đưa que cấy vào trong ống nghiệm chứa vi sinh vật và lấy một ít vi sinh vật này Chạm nhẹ que cấy lên bề mặt thạch rồi trược nhẹ que cấy theo đường ziczac liên tục trên ¼ dĩa thạch đã được chia.sử dụng nắp đĩa để bảo vệ bề mặt thạch khỏi bị nhiễm bởi các vi sinh vật rơi từ không khí vào.tránh thọc sâu que cấy vào trong thạch Đốt nóng que cấy để nguội chạm đầu que cấy vào thùng thạch thuộc góc phần tư thứ nhất (đã được cấy ria) ,trượt que cấy từ vùng này qua vùng thạch thuộc góc phần tư thứ hai,rồi tạo đường ziczac liên tục trên góc phần tư này. Luôn luôn đốt nóng que cấy sau mỗi lần tạo vạch trên mỗi góc phần tư của thạch,làm như vậy sẽ tiêu diệt bất cứ tế bào bám vào đầu que cấy và tránh cho lần cấy ria tiếp theo bị nhiễm . Lặp lại các ước cấy ria như thế trên vùng thạch thuộc góc phần trên thuộc góc phần tư thứ ba và thứ tư. Đốt nóng đầu que cấy lần nữa sau khi đã ria xong trên một đĩa thạch Phương pháp cấy ria liên tục Lấy một ít giống vi sinh vật lên que cấy và trược đều đầu que cấy lên một nữa bề mặt thạch theo một đường ziczac liên tục Không đốt nóng que cấy và không đưa que cấy ra khỏi đĩa,không quay bề mặt đầu que cấy, quay đĩa thạch 900và tiếp tục tạo đường ziczac liên tục như đã làm như trên vùng thạch trước đó Chuẩn bị đĩa cấy ria đối chứng trong đó người tiến hành cấy ria chỉ sử dụng que cấy đã tiệt trùng không có vi sinh vật sống bám vào.chỉ cần sử dụng một trong hai phương pháp cấy ria trên. Đây là những đĩa chỉ thị cho kĩ thuật vô trùng. Nếu các kĩ thuật vô trùng được thực hiện chính xác,sẽ không có bất cứ vi sinh vật nào phát triển trên những đĩa này. III.4.5) Kiểm tra tính thuần khiết của nấm men: Kĩ thuật vô trùng trong sản xuất là phương pháp hết sức quan trọng để khắc phục tình trạng tạp nhiễm, thông thường người ta kiểm tra nhằm phát hiện những vi sinh vật tạp niễm và phát hiện sự có mặt các thực thể của giống vi sinh vật dùng cho sản xuất. Để phát hiện vi sinh vật tạp nhiễm, người ta thường dùng 2 phương pháp: Phương pháp soi kính hiển vi Phương pháp soi kính hiển vi tiện lợi và nhanh nhưng không phải bao giờ cũng cho kết quả mong muốn. Khi bị nhiễm tạp trùng có kích thước hình dáng tế bào không khác xa giống nuôi cấy dưới các trường. nhìn kíng hiển vi ta khó phát hiện được. Vì vậy cần có những phương pháp đặc biệt để xác định những tế bào sống và tế bào chết của tạp khuẩn. Phương pháp nuôi cấy trên một vài môi trường. Người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy một vài giọt mẫu của môi trường nhân giống hoặc lên men trên các môi trường dinh dưỡng. Quan sát bằng mắt thường hoặc dùn kính hiển vi các tế bào sống, cũng như các tế bào chết kết hợp với nhuộm gram. Phương pháp này cho kết quả tốt, song hơi chậm vì phải sau ít ngày mới biết kết quả được. Những môi trường dinh dưỡng thường dùng trong phòng thí nghiệm để kiểm tra vi sinh vật thường là môi trường nước thịt-pepton gọi là “canh thang”. Có glucoza , môi trường thạch-thịt-pepton. Môi trường nước thịt –pepton gồm 1% pepton, 0,5% NaCl trong nước thịt bò. Khi cho môi trường này vào các ống nghiệm có thêm 1% glucoza , pH môi trường là+7-7,2. Môi trường thạch-thịt-pepton được chế từ môi trường nước thịt pepton thêm 2% thạch. Phương pháp phát hiện tạp khuẩn trên hộp pectri. Trong kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm, phương pháp đơn giản nhất là dùng hộp thạch có phân vùng để cấy các mẫy kiểm tra. Dùng bút viết thuỷ tinh chia hộp pectri ra làm nhiều vùng, ở mỗi vùng là một khâu sản xuất trong dây chuyền bằng 1 đường cấy mẫu kiểm tra lên mặt thạch. Vùng 1,2,3 dùng để kỉêm tra giống cấp I,II,III.. Sau khi nuối ở nhiệt độ và thời gian nhất định, giống phải phát triển tốt, yêu cầu ở đâylà dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, nghĩa là giống thuần khiết. Vùng 4,5,6,7 dùng kiểm tra các mẫu môi trường lên men sau khi đã thanh trùng và một số thành phần của môi trường vì yêu cầu kĩ thuật phải thanh trùng riêng. Yêu cầu ở trường hợp này là hoàn toàn không có vi sinh vật phát triển, tức là các mẫu kiểm tra này phải hoàn toàn vô trùng. Vùng 8,9,10 dùng kiểm tra các mẫu dịch lên men sau khi đã lên men một thờigian(vd:3h-12h). Yêu cầu giống phải phát triển dày dần từ mẫu 3h đến mẫu 12h, và dạng khuẩn lạc phải hoàn toàn đồng nhất, hoàn toàn là dạng của giống sản xuất chứ không phải là một giống lạ nào khác. Một số vùng trên hộp pectri dành kiểm tra một số mẫu nữa theo yêu cầu của thực tế sản xuất. Như vậy nếu kết quả kiểm tra vô trùng đạt đươc như đã trình bày ở trên thì vấn đề tạp nhiễm không xảy ra, ngược lại nếu đợt sản xuất bị nhiễm những vi sinh vật lạ thì ta có thể chủ động biết được là nhiễm ở khâu nào, từ đó có những phương pháp khắc phục. 3 4 5 10 1 2 6 7 8 9 1 1,2,3: giống phát triển tốt,thuần khiết. 4,5,6,7: vô trùng, không có vi sinh vật phát triển. 8,9,10: Giống phát triển dày dần, thuần khiết. III.4.6)Nhân giống nấm men trong công nghiệp: Nếu đi từ một chủng nấm men mà những điều kịên tối ưu để nuôi cấy và sản xuất hoạt chất đã được xác định bằng thực nghiệm và đồng thời đã biết cách bảo vệ những đặc tính của nó qua thời gian thì tốt hơn hết nên dự trữ chủng đó ở một lượng lớn.. Từ một ống cấy lại trên môi trường đặc và nuôi trong 12-36h. Người ta pha chế một thể tích thích hợp dung treo nấm men trong nước vô khuẩn, dung treo đó dùng để gieo vào bình nón chứa môi trường có công thức và số lượng nhất định, đến giai đoạn này người ta thường sử dụng một thể tích của môi trường nhân giống bằng 5-10% thể tích môi trường cần gieo cấy. Sau một thời gian phát triển tối ưu trên máy lắc, các bình nón sẽ được dùng để gieo cấy vào một nồi lên men nhỏ, nó dùng để nhân giống cho một hay nhiều nồi lên men có dung tích từ 50-1000lít và gọi là nồi nhân giống cấp 2 (cũng gọi là nồi ủ). Sau cùng, nồi nhân giống cấp 2 đó có thể để gieo cấy vào những nồi lên men công nghiệp có dung tích từ 50-100 m3. Số lượng và thể tích của nổi nhân giống cấp 2 này có thể tăng hay giảm tuỳ theo đặc điểm của vi sinh vật tuỳ theo kết quả cần đạt được hoặc tuỳ theo thể tích mà ta có. Ngoài ta trong quá trình các thao tác liên tiếp đó còn có rất lớn một số các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả, ta cần phải xác định tầm quan trọng của những yếu tố đó bằng những thực nghiệm có hệ thống. trình bày cách nghiên cứu, quan sát hình thái nấm men IV)NGHIÊN CỨU TẾ BÀO NẤM MEN DƯỚI KÍNH HIỂN VI IV.1) Hình thái sinh sản Nghiên cứu hình thái, kích thước tế bào nấm men…người ta hay dùng tiêu bản giọt ép hoặc giọt treo. Cách là như sau: Tiêu bản giọt ép: Ta nhỏ một giọt nước cất lên phiến kính khô, dùng que cấy lấy một ít tế bào nấm men ở khuẩn lạc hoặc từ ống thạch nghiêng cho vào giọt nước, rồi di nhiều lần cho tế bào men rải đều trong giọt nước, đậy một lam kính lên giọt nước. Chú ý khi đậy lam kính sao cho phần ép giữa lam kính và vật kính không có một bong bóng khí nào, chỉ là nước với tế bào nấm men. Đem soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 600 lần ( vật kính 40x và thị kính 50x). Tiêu bản giọt treo Ngoài hình thái tế bào còn có thể quan sát sự nảy chồi của nấm men. Lấy một giọt dịch có chứa nấm men bằng vòng que cấy vô khuẩn rồi chấm lên lam kính đã vô khuẩn, quay ngược lam kính xuống phía dưới rồi úp lam kính lên một phiến kính chuyên dùng đã vô khuẩn có một vết lõm hình tròn ở giữa. Giọt giống huyền phù chấm trên lam kính phải đúng vào giữa vết lõm (hình 10.3). Mép của lam kính được bôi bằng parafin nóng chảy hoặc vazơlin để không khí không ra vào được vết lõm. Như vậy, ta có thể quan sát sự sinh sản của tế bào nấm men hàng ngày. Mỗi tiêu bản giọt treo ta có thể theo dõi, quan sát hình thái và sinh sản nấm men hàng ngày. Thời gian lưu giữ có thể 8-10 ngày. Nhuộm tế bào và đánh giá chất lượng nấm men Trong nghiên cứu, cũng như trong sản xuất không chỉ theo dõi quan sát hình thái tế bào mà còn phải thường xuyên đánh giá tình trạng sinh lí của tế bào nhờ các tiêu bản nhuộm tế bào. Giống nấm men được coi là trẻ khoẻ có hình thái tế bào đặc trưng, số tế bào trẻ và nảy chồi nhiều, số tế bào chết ít (<=5%). Tốc độ sinh sản nhanh, số tế bào chứa chất dinh dưỡng dự trữ (hạt glycogen) nhiều. IV.2) Đếm số lượng tế bào trong dịch nuôi cấy để xác định tốc độ sinh sản và sinh trưởng của nấm men Đếm số lượng tế bào thường áp dụng phương phápbuồng đếm Goriaev-Thom. Buồng đếm (hình 10.4) là phiến kính dầy được chia thành phần đều nhau bằng các vạch thẳng.. Phần giữa của phiến kính lõm xuống mỗi cạnh thấp 1/10 mm, trên đó có vạch một mạng lưới. Diện tích của ô vuông lớn của lưới là 1/25 mm2, diện tích của ô vuông nhỏ là 1/400mm2. Cho dịch huyền phù (một giọt) lên lưới và phủ bằng một lam kính. Miết vài lần sao cho lam kính với hệ trạng lưới phiến kính không còn bọt kh, không còn khoảng trông không chứa dịch. Trừ các ô vuông. Như vậy, khoảng không gian giữa lam kính và phần giữa của phiến kính đủ chia thành ô lưới sẽ tạo thành buồng đếm. Các tế bào nấm men được đếm trên các ô lớn của lưới (bằng số lượng của mỗi ô nhỏ cộng lại). Thể tích của mỗi ô này là 1/250mm3. Ta phải đếm số lượng tế bào nằm trong các ô của lưới cũng như trên các cạnh phía trên và phái bên phải ủa môi ô. Vì độ chính xác của việc xác định phụ thuộc vào chỗ lam kính có áp suất vào bề mặt của buồng đếm hay không, cho nên tốt nhất là đếm lặp lại số lần, mỗi lần đếm 150-200 tế bào. Nếu bắt đầu đếm sau khi đã cho giống vào buồng đếm khoảng 3-5 phút, để cho tế bào lắng xuống, để cho tế bào lắng xuống, khi soi kính ta thấy chúng trên cùng một mặt phẳng. Số lượng tế bào trong 1 ml dịch huyền phù được tính theo công thức: M = ở đây: M- số lượng tế bào (triệu)/ml; a-số lượng tế bào trung bình; h- chiều sâu của buồng đếm, 1/10 mm; S- diện tích ô vuông lớn,1/25mm2. Đếm số lượng tế bào bằng phương pháp pha loãng rồi cấy trên hộp Pectri có môi trường thạch, nuôi vài ngày rồi đếm khuẩn lạc rồi suy ra số lượng tế bào theo hệ pha loãng. Phương pháp này chỉ đếm được tế bào sống và mất nhiều thời gian. Sơ đồpha loãng xem hình 10.1. Xác định mức độ sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục trên máy so màu với bước sóng 580-650nm (nanomet), thường dùng lọc màu đỏ 620nm. Nếu phương pháp này lọc đường cong chuẩn với mối tương quan OD và số lượng tế bào (qua đếm tế bào) thì ta có thể suy ra sô lượng tế bào nấm men 1ml dịch huyền phù. PHương pháp này chỉ thích hợp cho các môi trưởng lỏng đồng nhất, có thể không chính xác, nhưng cho phép ta xác định được sự sinh trưởng và phát triển của giống nghiên cứu. IV.3) Nghiên cứu hình thái bào tử của nấm men Khả năng tạo thành bào tử và nẩy mầm của bào tử cũng như hình dạng của bào tử là dấu hiệu của loài nấm men. Vì vậy, cần xác định một cách có hệ thống vị trí, trạng thái của chủng nấm men được phân lập khi cấy chúng vào môi trường đặc bịêt để tạo thành bào tử. Để nấm men sinh bào tử người ta có thể cấy chúng trên nhiều ôi trường khác nhau. Hiện nay người ta hay cấy chuyền giống nấm men 1-2 ngày trên môi trường đặc vào môi trường axetat. Thành phần môi trường đặc như sau: Pepton 10 Nước cho đủ cho đủ 1l Nước chiết men 5 Hấp thah trùng ở 0,8atm trong 30 phút Glucoza 20 Thạch 20 Thành phần môi trường axetat như sau(g/l): Natri axetat 10 Nước cho đủ 1 lit Kali clorua 5 môi trường được hấp thanh trùng ở 1atm trong vòng 30 phút Thạch 20 Hoặc cấy trên môi trường Gorotkova được Kregơvan-Rip cải tiến có thành phần(g/l): Glucoza 1 Nước đủ 1l Pepton 10 hấp thanh trùng ở 1200C trong 15 phút NACl 5 Thạch 30 Chú ý: Những bào tư nấm men được hình thành trong nang. Nang bào tử hình trong, hình trứng hoặc hình nón. Bào tử nang thường sinh ra ở môi trường nghèo. Nhuộm bào tử theo phương pháp Vieczơ(Wirtz) được Sap-fe và Fulton (Schaefier-Fulton) cải tiến. Cách làm như sau: Làm tiêu bản trên phiến kính và cố định bằng nhiệt: Nhỏ lên tiêu bản dung dịch malastit xanh lục đã pha loãng, để 30-60 giây, hơ nóng 3 lần đến khi bốc hơi. Rửa bằng nước thường 30 giây; Nhỏ lên tiêu bản dung dịch saframin 0,5%, để yên trong 30 giây. Rửa, sấy khô và soi vật kính dầu. Sau khi nhuộm bào tử bắt màu xanh lục, tế bào còn lại còn màu đỏ. Soi tìm bào tử cũng có cách làm hơi khác, như sau: Nấm men bình thường khó sinh bào tử, muốn chúng sinh bào tử phải nuôi chúng ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Một trong cách nuôi đó là phương pháp dùng khối thạch cao: Trộn 2 phần thạch cao (CaSO4) khan với 1 phần nước. Từ thạch cao nhão này ta nặn thành khối có đường kính d=2-3cm và chiều cao h=1-1,5 cm. Bề mặt của khối thạch cao được làm sạch. Khối này được đặt vào hộp đĩa Pectri và thanh trùng khô (trong tủ sấy 1600C/1h). Đáy hộp vào bề mặt khối thạch cao được làm ẩm bằng nước máy vô trùng. Cặn men được nuôi 2 ngày ở môi trường Gorotkova được dùng que cấy vô trùng bôi lên bề mặt khối thạch cao và để ở tủ ấm 25-30C trong 1-2 ngày. Sau 30h các tế bào nấm men đã có thể sinh bào tử Môi trường Gorotkova có thành phần (g/l) như sau: Pepton 10 Nước có đủ 1l Cao thịt 10 hấp 0,8atm trong 20-30 phút. NaCl 5,0 Glucoza 2,5 Lấy nấm men từ bề mặt khối thạch cao, làm tiêu bản, nhuộm bào tử rồi soi kính. Bào tử thường khó bắt màu hơn tế bào chất, vì vậy cần phải dùng thuốc nhuộm mạnh và gia nhiệt. Tất cả các phương pháp nhuộm đều dựa trên nguyên tắc: đầu tiên là nhuộm tiêu bản chung, sau tẩy phần màu của tế bào chất rồi nhuộm bổ sung cho các tế bào chất bắt màu riêng biệt. Nhuộm bào tử người ta thường dùng Fuxin carbolic (Fuxin có thêm phenol) cho ngập vết bôi, hơ qua ngọn lửa cùng với thuốc nhuộm trong ài phút tới khi bốc hơi ( nhưng không được sôi dịch trên vết bôI). Chất màu bay hơ dần, ta lại thêm thuốc nhuộm lên tiêu bản để tránh vết bôi bị khô. Để tẩy màu, người ta dùng dung dich H2SO4, HCl hoặc axit axetic.1-5%, dung dịch cồn 33%...Thời gian tẩy màu phụ thuộc vào đặc tính của từng tiêu bản, có thể là từ vài giây đến vài phút. Sau tẩy nàu là rửa bằng nước. Sau khi rửa bằng nướctiêu bản được nhuộm bổ sung bừng xanh metylen trong 1-2 phút. Soi kính thấy tế bào chất bắt màu xanh và bào tử màu V)BẢO QUẢN bảo quản giống vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật.Bảo quản nhằm mcj đích làm chậm qá trình hô hấp và trao đổi chất cả tế bào vi sinh vật,ngăn cản sự sinh sả của chúng,đồng thời không làm thay đổi bản chất ban đầu của chúng ,có nghĩa là nếu giống được bảo quản tốt thì các quá trình sinh lí,hoá y như ban đàu nếu gặo được điều kiện sinh trưởng như ban đầu.Giống đi đem bảo quản phải thuần khiết và và phải ở trạng thái sinh lý tốt có nhiều cách để bảo quản giống vi sinh vật,như phương pháp cấy chuyền định kì lên môi trường mới ,phương pháp giữ giống tren môi trường thạch có lớp dầu khoáng,phương pháp giữ giống trên cát hay hạt,hay phương pháp đông khô V.1) Phương pháp cấy chuyền và bảo quản lạnh trên môi trường thạch nghiêng PHương pháp này có thể áp dụng cho tất cả các vi sinh vật và bảo quản ở nhiệt độ thấp( koảng 40C. Tuy nhiên tuỳ thuộc vào loại nấm men mà thời gian cấy chuyền định kì khác nhau. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng thời gian bảo quản không lâu. Hơn nữa phẩm chất ban đầu của giống dễ bị thay đổi. Giống vi sinh vật được cấy chuyền định kì trong môi trường thạch đặc hiệu và được giữ trong điều kiện nhiệt độ nói trên. Nên cấy chuyền thường xuyên (thường vài tuần hoặc vài tháng tuỳ theo loài nấm men) và có sổ ghi chép để tiện theo dõi. Phương pháp tiến hành: Thuần khiết lại chủng vi sinh vật trên môi trường agar ở đĩa pectri,chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy trên môi trường thạch nghiêng thích hợp,sau đó nuôi trong tủ ấm để nấm men phát triển bình thường,lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 40C. Hàng tháng cấy chuyền lại vào môi trường mới. Để khắc phục hiện tượng bị mất nước,môi trường giữ giống bị khô làm cáêt nấm men người ta có thể thêm vào môi trường 1% dầu thực vật như dầu dừa,dầu lạc… khi làm môi trường. Nhược điểm của phương pháp này là Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc. Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữu các chủng trong quá trình bảo quản. Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản. Tốn nhiều công sức để cấy truyền. Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp. Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền. V.2) Phương pháp bảo quản giống trên lớp dầu khoáng Dầu khoáng được sử dụng ở đây có đây có thể là paraphin lỏng hay vaselin trung tính,có độ nhớt cao,vô hại đối với vi sinh vật. Dầu khoáng trước khi được thêm thành một lớp (khoáng một vài cm) trên môi trường thạch chứa trong ống nghiệm,phải được hấp vô khuẩn ở t0=1210C trong vòng 2 giờ rồi sấy khô ở 1700C trong 1-2h để nguội .trong khi thêm lớp dầu khoáng,miệng ống nghiệm phải được trét với paraphin đặt và ống nghiệm này phải được giữ ở điều kiện lạnh. Phương pháp này đơn giản những lại có hiệu quả cao,môi trường không mất nước và không bị khô. Cách thực hện như sau: chuẩn bị 3 ống vi sinh vật đã nuôi ở nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khoáng đã vô trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng paraphin rồi bảo quản. Cách tiến hành Cho môi trường agar thích hợp của từng loại nấm men vào 1/3 ống nghiệm,thanh trùng ở 1210C trong vòng 20-30 phút,lấy ra để nghiêng thạch một góc 450, chờ thạch đông, cấy nấm men và nuôi trong tủ ấm để nấm men phát triển tốt .Praffin lỏng được chuẩn bị bằng cách cho vào ống nghiệm sạch, thanh trùng ở 1210C trong vòng 30 phút, lấy ra để nguội. Khi nấm men trong ống nghiệm phát triển tốt (2 ngày đến 1 tuần) bằng các thao tác vô trùng ta đổ paraffin lỏng vào một lớp dày 2cm vào từng ống giống,dùng parafin đặt đun chảy đổ lên nút bông. Giống được chuẩn bị như vậy đem bảo quản trong phòng ở nhiệt độ thường hoặc ở trong tủ lạnh. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản không cần có trang thiết bị gì đặc biệt nên phòng thí nghiệm nào cũng có thể làm được,thời gian bảo quản có thể kéo dài đến 12 tháng,đỡ tốn nhân công cấy chuyền và ít có nguy cơ giống bị thoái hoá hoặc bị nhiễm tạp. V.3).Phương pháp làm mất nước trong môi trường bảo quản: Phương pháp này thường dùng cho các chủng nấm sợi và nấm men. Theo phương pháp này các chủng vi sinh vật có thể được bảo quản với các chất mang phổ biến như sau: a. Trên đất, cát và silicagel. Các nghiên cứu cho thấy là bào tử nấm có thể sống 4-5 năm khi bị làm khô trong đất mà không bị thay đổi các đặc tính sinh học. Ngày nay silicagel là chất mang được dùng phổ biến và có hiệu quả đối với bảo quản nấm men, nấm sợi. b. Bảo quản trên giấy: Các chủng nấm men và nấm sợi được làm khô trên giấy và sau đó được bọc bằng giấy bạc và đựng trong hộp kín. Ưu thế của phương pháp này là bảo quản được lượng mẫu lớn. c.Bảo quản trên gelatin: Để thực hiện phương pháp này, người ta tạo dịch huyền phù chủng vi sinh vật trong môi trường có gelatin. Sau đó các giọt mẫu được làm khô trong đĩa pectri. Phương pháp này có thể bảo quản được vi khuẩn trong vài năm. Nhìn chung, không có phương pháp nào là vạn năng cho bảo quản các nhóm vi sinh vật khác nhau. Thực ra là rất khó khi đánh giá một cách đầy đủ xét theo mọi yêu cầu đã được đặt ra ở trên. Chính vì vậy mà các phương pháp bảo quản phải được kiểm nghiệm thực tế với từng loại vi sinh vật, từ kết quả đó có thể chọn ra phương pháp thích hợp hoặc đồng thời sử dụng các phương pháp khác nhau. V.4) Phương pháp bảo quản giống trên hạt Hạt có thể được dùng để bảo quan các giống vi sinh vật có bào tử và không bào tử ,hạt thường đựoc sử dụng là các hạt ngũ cốc như lúa chẳng hạng,đem nấu cho hạt vừa nứt,vớt ra để ráo. Cho các hạt này vào ống nghiểm rồi phủ lên trên một lớp bông thắm nước. Cấy giống vi sinh vật cần được bảo quản lên lớp bông này,để cho chúng phát triển rồi sấy khô ở nhiệt độ <500C cho đến khi độ ẩm đạt 8-10%.sau đó đem bảo quản ở nhiệt độ 15-200C. Cách làm: Chọn hạt tốt (lúa,ngô,kê…) loại bỏ các tạp chất,rửa sạch cho vào nước sôi theo tỉ lệ 30ml nước sôi cho 100 gram hạt,khuấy đều,ngâm tiếp 30 phút,lọc bỏ nước,rải hạt ở trên khay sạch để rao nước,cho vào bình tam giác koảng 15-20 gram/bình 250ml,đậy nút bông,thanh trùng 1210C trong 40 phút,thanh trùng 3 lần như vậy mỗi lần cách nhàu 24h,bào tử hoặt thể dinh dưỡng của vi sinh vật đem hoà vào nước vô trùng,dùng pipet vô trùng cấy vào mỗi bình 3ml ,lắc đều nuôi ở nhiệt độ thích hợp cho từng chủng trong thời gian 8-10 ngày,hàng ngày lắc nhẹ để phá vỡ các khối hạt bết lại,làm khô trong tủ hút chân không cho đến khi độ ẩm còn 8%. Kiểm tra độ thuần khiết và khả năng sống của giống trước khi tráng paraffin lên nút bông và bảo quản trong phòng mát. Giống trên hạt kê có thể dùng dần dần làm nhiều lần. V.5). Phương pháp đông khô vi sinh vật và phương pháp đông khô trực tiếp: V.5.1). Phương pháp đông khô: Hình 2. Đông khô vi sinh vật. Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật. b. Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying): Ngoài phương pháp đông khô như mô tả ở trên, còn có phương pháp đông khô trực tiếp. Khác biệt với phương pháp trên ở chỗ dịch huyền phù vi sinh vật được làm khô nhanh ở chế độ chân không thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước. Phương pháp này đặc biệt có ý nghĩa đối với nhóm vi khuẩn không có khả năng sống trong nhiệt độ thấp của giai đoạn tiền đông. Các thông số quan trọng cần được quan tâm khi thực hiện phương pháp này là: -         Tuổi của vi sinh vật bảo quản. -         Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật. -         Tốc độ đông khô. -         Nhiệt độ đông khô thấp nhất. -         Khoảng thời gian làm khô mẫu và độ ẩm cuối cùng của mẫu. Phương pháp này nhanh và thuận lợi cho các đợt bảo quản số lượng lớn mẫu. Thông thường theo phương pháp này vi sinh vật được bảo quản từ 10-20 năm. Nói chung cả hai phương pháp này có nhiều ưu điểm so với các phương pháp trước như thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm được công sức và sai sót nhãn mác và tạp nhiễm. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là giá thành thiết bị. Độ ổn định của các chủng vi sinh vật bảo quản theo các đợt đông khô là khác nhau. Hơn thế nữa các chủng trước khi đem ra sử dụng phải được hoạt hoá trên môi trường thích hợp một số lần để phục hồi các đặc tính sinh học. V.5.2) Phương pháp bảo quản lạnh sâu:          Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thể và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C). Hình 3. Bảo quản lạnh sâu          Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích luỹ các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfoxide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như -20° C, -30° C, -40° C, -70° C, -140°C và -196° C. Nói chung mức nhiệt độ cao hơn -30° C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut.          Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng là phương pháp vạn năng hơn cả. Phương pháp này thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo và cả các dòng tế bào động vật. Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm như đầu tư kinh phí cho thiết bị và điện, nitơ lỏng hoặc rủi ro như cháy nổ... Đặc biệt phương pháp này không thích hợp với các chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến. Nói chung phương pháp này thường được dùng với các chủng vi sinh vật có những đặc tính quí mà không thích hợp với phương pháp đông khô. Hình 4. Bảo quản trong nitơ lỏng. V.6) Phương pháp lạnh đông Phương pháp này dựa trên cơ sở sự phát triển của vi sinh vật bị ức chế ở nhiệt độ lạnh, sau đây là phương pháp đang được sử dụng khá rộng rãi để giữ giống vi sinh vật.Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản,thời gian giữ được lâu. Cách làm: Để bảo vệ vi sinh vật không bị chết ở nhiệt độ lạnh sâu do các tinh thể nước gây ra người ta phải trộn vi sinh vật vào một trong các chất bảo vệ sau: -Glycerin 15% -Huyết thanh ngựa (loại không có chất bảo quản) -Dung dịch saccharose 10%+gelatin 1%,ph=6,8-7 -Dung dịch glucose hoặc lactose 10% Sau khi đã trộn đều vi sinh vật với chất bảo vệ ta cho vào ống nghiệm,đậy nút lại và cho vào làm lạnh từ từ,khi nhiệt độ đạt từ -200C—250C thì phải giữ tốc độ làm lạnh 1-20C/phút Thời gian cấy chuyền như sau Nếu ở giữ ở nhiệt độ -15—200C thì 6 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu giữ ở nhiệt độ -300C thì 9 tháng cấy chuyền và làm lại một lần Nếu ở ở nhiệt độ -40 0C thì 1 năm cấy chuyền 1 lần Nếu giử ở nhiệt độ -500C-600C thì 3 năm cấy chuyền và làm lại 1 lần Nếu giữ ở nhiệt độ 700C thì 10 năm cấy chuyền và làm lại lần Trước khi đưa ra phương pháp nâng cao chất lượng cần phải xét đến việc thực hiện quá trình kiểm tra mức độ phân giải hợp chất hữu cơ không chứa nito mà điển hình là quá trình lên men rượu của giống Saccaromyces VI)THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG ĐỒNG HOÁ CÁC HỢP CHẤT CACBON KHÁC Đây là đặc điểm sinh lý quan trọng dùng trong phân loại. Có 2 phương pháp chủ yếu được dùng là phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể và môi trường đặc. Tuy nhiên còn có thể sử dụng phương pháp dùng con dấu trên môi trường đặc. VI.1) Khả năng phân giải các chất không chứa nitơ Ở đây ta xét đến khả năng đồng hoá và lên men các loại đường của nấm men. Đối với nấm men rượu, hai thuật ngữ: đồng hoá và lên men là đồng nghĩa, còn đối với các loài không lên men rượu thì hai thuật ngữ này không đồng nghĩa, có nghĩa lào loài hoặc chủng nấm men này chỉ đồng hoá được nguồn đường ( nguồn cacbon dinh dưỡng) để ohục vụ cho sinh trưởng và tăng sinh khối, chứ không phục vụ cho lên men biến đường thành rượu. Dựa vào nguyên lí Kluyver và Dekker: Những loài nấm men không lên men được glucoza thì không lên men được các loại đường khác. những nấm men lên men được glucoza sẽ lên men được đờng fructoza và mannoza, vì vậy không cần thử với hai loại đường này. Không có nấm men nào đồng thời lên men được hai loại đường maltoza và lactoza. Thông thường người ta chỉ cần thử với các loại đường như sau: glucoza, sacharoza, maltoza, galactoza,rafinoza. Những loại đường này phải tinh khiết và không bị phân huỷ khi đun nóng. Cách tiến hành như sau: Pha dịch đường 20%, khử khuẩn (nếu qua lọc vô khuẩn Xaizơ là tốt nhất). Lấy 0,5 ml dịch đường này cho vào ống nghiệm có sẵn môi trường (pepton-0,5%, cao mưn 0,6% trong nướ cất đã khử khuẩn). Trong ống nghiệm có để sẵn một ống Durham. Cấy một vòng que cấy giống, lắc đều và gữ ở nhiệt độ 25-300C. Nếu nấm men lên men được đường trong môi trường sẽ sinh ra CO2 và CO2 vào ống Durham sẽ đẩy ống nổi lên trên. (hình 10.5) Ta có thể làm tương tự như vậy, nhưng môi trường cho vào ống Einhorn (hình con vịt) hoặc ống Dunba. Nếu CO2 sinh ra sẽ đẩy dịch môi trường khỏi đuôi ống (hình 6.1). Hình 6.1 A1 Bình Einhorn chứa dịch đường; a2- Bình Einhorn khi dịch đường lên men; b- ống Durham trong dịch đường lên men. Cũng có thể có nhiều cách khác, chủ yếu la xác định xem quá trình nuôi cấy nấm men có sinh ra CO2 hay không ? Nếu sinh ra CO2 thì ta kết luận được chủng nấm men đồng hoá được loại đường nghiên cứu và qua cảm quan hoặc phân tích có tích tụ rượu etylic hay không ta kết luận nấm men có lên men được đường đó hay không. Hình 6.2- Ống Dunba. a-đường lên men hoàn toàn, b-đường lên men không hoàn toàn c- đường không lên men. VI.2 Phương pháp đánh giá khả năng sinh trưởng trên môi trường dịch thể: - Sử dụng ống nghiệm có kích thước 100x15mm. Các ống nghiệm chứa 1,8 ml môi trường nitơ cơ sở (Nitrogen base) không có carbon và 0,2 ml nguồn carbon 10X. Các ống thí nghiệm chứa 1% nguồn carbon nghiên cứu khác nhau (tương đương 50mM), đồng thời làm một ống nghiệm kiểm tra âm (không có nguồn carbon nào) và một ống kiểm tra dương dùng nguồn carbon là D-glucoza. - 46 nguồn carbon gồm: glucoza, galactoza, L-sorboza, sucroza, maltoza, xenlobioza, trelaloza, lactoza, melibioza, raffinoza, melezitoza, inulin, tinh bột tan, D-xyloza, L-arabinoza, D- arabinoza, D-riboza, L-rhamnoza, D-glucosamin, N-acetyl-D-glucosamin, methanol, ethanol, glycerol, erythritol, ribitol, galactitol, D-mannitol, D-glucitol, a- metyl-D-glucosid, salicin, glucono-d-lacton, D-gluconat, 2-ketogluconat, 5-ketogluconat, DL-lactat, succinat, citrat, inositol, hexandecan, saccharat, xylitol, L-arabinitol, propan 1,2 diol, butan 2,3 diol, D-glucuronic acid, D-galacturonic acid. - Giống gốc được chuẩn bị trên môi trường thạch - pepton - glucoza - cao men - malt để qua đêm. Sau đó tế bào được lấy ra và pha trong môi trường nitơ cơ sở đạt tới mật độ tế bào là 25x106/ml (hay mật độ A640 = 1,0). - Sau đó lấy ra 1000l  cấy vào các ống môi trường đã chuẩn bị sẵn, sau đó để tĩnh hay lắc tay từng lúc (hàng ngày). Cũng có thể lắc nghiêng bằng máy lắc ngang (góc lệch 15-400) hay lắc tròn với các nấm men có độ lắng cao. Đánh giá sự sinh trưởng thường là dùng mắt so với hai ống dương và âm bằng cách đặt một miếng bìa trắng vạch một đường đen và đặt đằng sau các ống nghiệm để so sánh. Tuy nhiên có thể dùng phương pháp so màu để so sánh với các đường chuẩn được vẽ từ sinh khối khô (cách này thường ít được dùng với các tế bào nấm men có các tế bào kết dính với nhau). Thí nghiệm có thể kéo dài trong một tuần hoặc có thể đến 4 tuần. VI.3) Sinh trưởng trên môi trường thạch ống nghiệm có chứa 15ml môi trường thạch nitơ cơ sở ở 450C sau đó thêm 0,5 ml dịch huyền phù tế bào nấm men được chuẩn bị như đã mô tả ở trên và lắc cho đều (tránh tạo bọt). Các bước phải thao tác nhanh để thạch không bị đông và nấm men không bị chết. Sau đó đổ toàn bộ ra đĩa Pectri vô trùng để 370C sau 30 phút cho đông thạch. Có thể sau đó úp ngược để 370C trong 90 phút để khô mặt thạch. Sau đó đặt từ 2-5mg từng loại đường (nguồn carbon) nghiên cứu lên trên bề mặt thạch gần mép đĩa Pectri. Thông thường trong một đĩa dùng 3 loại đường khác nhau như: Đĩa thạch được chia làm 4 góc, 1 góc không cho nguồn carbon nào (tuy nhiên phải làm thí nghiệm kiểm tra cả với D-glucoza). Theo dõi kết quả sau 48 giờ đến 1 tuần. VI.4) Phương pháp dùng con dấu Đĩa Pectri gốc chứa môi trường malt - cao men - glucoza - pepton - thạch chứa khoảng 25 khuẩn lạc nấm men nghiên cứu khác nhau. Sau đó dùng con dấu nhung vô trùng in lên các đĩa thạch có nguồn carbon khác nhau (0,5% = 25 mM) (chú ý đánh dấu vị trí của các đĩa để khỏi bị nhầm lẫn). Một lần in từ đĩa gốc có thể in lên 10 đĩa khác nhau bắt đầu là đĩa đối chứng âm (không chứa nguồn carbon nào) và cuối cùng là đĩa đối chứng dương (chứa D-glucoza). Chú ý thạch sử dụng phải là loại thạch tốt không chứa một thành phần carbon dễ bị đồng hoá nào. Theo dõi thí nghiệm từ 48 giờ đến 1 tuần. VII)PHƯƠNG PHÁP NÂNG CAO CHẤT LƯỢNG GIỐNG NẤM MEN Hiện nay người ta đã nghiên cứu và tìm ra nhiều cách để nâng cao chất lượng giống nấm men như các phương pháp sau: Chọn lọc thích ứng Đột biến Sự tạo giống lai (Hybridization) Tái tổ hợp AND Tuy nhiên, với lí do khả năng và lí do không nằm trong chuyên ngành công nghệ sinh học nên tôi chỉ xin giới thiệu sơ bộ 3 phương pháp trên đó là: Huấn luyện thích nghi, đột biến và sự tạo giống lai VII.1) phương pháp huấn luyện thích nghi 1 nguyên tắc Phương pháp này dựa trên nguyên tắc tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng thích nghi rất cao đối với mọi tác động của môi trường. Những tác động vủa môi trường được lặp đi lặp lại nhiều lần tạo nên thich nghi bền vững.Tính thích nghi của vi sinh vật như là một biện pháp hữu hiệu để vi sinh vật tồn tại, phát triển trong những điều kiện môi trường khác nhau. dựa vào nguyên tắc trên ta có thể tạo ra giống tốt với điều kiện sản xuất công nghiệp. 2)nguyên liệu -Giống vi sinh vật: saccharomyces cerevísiae trên môi trường thạch nghiêng(M163) proteins-môi trường nước đường có hàm lượng đường 16.18.20.22.24.26% 3-Cách tiến hành -Chuẩn bị môi trường nước mạch nha trong ống nghiệm với dung tích là 10ml -Dùng que cấy cấy chuyền từ ống nghiệm giống sang vào môi trường nước mạch nha.nuôi chúng trong vòng 24h ở nhiệt độ 28-320C -Chuẩn bị các bình tam giác với 50 ml dung dịch có hàm lượng đường lần lượt 16.18.20.22.24.26% -Dùng pipet vô trùng chuyển 5 ml dịch nuôi cấy trong ống nghiệm sang bình tam giác 1 có 50 ml môi trường có hàm lượng đường 16%. Nuôi chúng ở nhiệt độ 28-320C trong thời gian 24h -Sau 24h. Lấy 5ml của bình tam giác này chuyển sang bình tam giác thứ 2 và nuôi trong vòng 24h ở nhiệt độ 28-320C. -Lần lượt như vậy cho đến khi bình tam giác có hàm lượng đường trong môi trường là 26% Bằng cách này ta loại trừ dần những tế bào nấm men không có khả năng thích nghi với nồng độ đường cao và ta nhận được những tế bào nâm men thích nghi với điềi kiện môi trường có nồng độ đường cao. Tạo lập được giống có khả năng lên men dung dịch đường hàm lượng đường cao rất có ý nghĩa trong sản xuất công nghiệp Tương tự như vậy ta có thể tạo tính thích nghi pH,chất tiệt trùng khả năng chịu nhiệt Trong thí nghiệm tạo tính thích nghi cần lưu ý hai điểm: -Thay đổi mức ảnh hưởng từ thấp đến cao hoặc từ cao đến thấp và phải từ từ, không nên có khoảng thay đổi khá rộng. -Yếu tố tạo tính thích nghi phải được lặp đi lặp lại nhiều lần Cuối cùng là kiểm tra tình trạng của giống thích nghi,nếu các tính trạng đáp ứng được mục tiêu đặt ra. Coi như thí nghiệm được thành công. VII.2) Đột biến Chọn lọc với sử dụng chất đột biến khác nhau là phương pháp tạo giống tích cực nhất để có thể chọn lọc ra các chủng giống có năng suất cao của các dạng hữu ích của vi sinh vật. Độ biến có hai dạng: Đột biến tế bào chất-những biến đổi có thể di truyền được, nẩy sinh ở tế bào chất và di truyền từ tế bào chất sang tế bào chất. Đột biến thuộc về nhân-những biến đổi có thể di truyền được, nẩy sinh ở nhân và di truyền từ nhân sang nhân. Có nhiều phương pháp nghiên cứu làm biến đổi và phát triển đặc tính di truyền của nấm men, như nâng cao hoạt tính, các tính trạng sinh lí, đồng hoá các loại đường, khả năng tạo cồn.. Các phương pháp đó là:sàng lọc, chọn đột biến, lai ghép… trong đó làm biến đổi gen là phương pháp hiện đại nhấtlàm biến đổi cấu trúc ADNvà do đó làm biến đổi vật liệu di truyền và thể hiện bằng các tính trạng trong đời sống nấm men được di truyền tf thế hệ này sang thế hệ khác. VIII)ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP phần này viết cô đọng không trình bày quá dài dòng và quá chi tiết. PHải nói lên khả năng ứng dụng của nó như thế nào? Và ít nhất phải nêu 3 ứng dụng VIII.1)SẢN XUẤT NẤM MEN BÁNH MÌ Men bánh mì là sinh khối của nòi men sacchromyces cerevisiae vẫn con sống khi trộn với bột nhào sẽ lên men rượu và CO2 làm nở bánh mì. Sản xuất nấm men bánh mì dưa trên quá trình sinh sản và tăng sinh khối của một số nòi nấm men. Trong quá trình này đường trong môi trường nuôi cấy được tiêu hao vào hai mục đích:lên men và hô hấp. Kết quả lên men là sự tạo thành rượu etylic và C02,còn hô hấp đưa đến tổng hợp các axit amin,axit nucleic và protein. Trong điều kiện kị khí nấm men gây lên men rượu. Nếu tăng dần lượng oxi trong môi trường tới 7mg/l thì có thể loại trừ được sự lên men rượu và thu được sinh khối men bánh mì. Hàm lượng oxi trong môi trường tới 1mg/l làm ức chế hoàn toàn khả năng sinh sản của nấm men. Nhu cầu oxi phụ thuộc vào tời gian tuổi của tế bào.1g men trẻ cần 80-100 mg/h còn các tế bào già 40-60mg/h. Trong các nhà máy sản xuất nấm men không khí được nén và được thổi vào các thùng nuôi men ở các dạng hạt hoặc dòng nhỏ phân tán. Lưu lượng không khí thổi qua các môi trường nuôi cấy là 30-100m3/h. Nguyên liệu được dùng trong sản xuất sinh khối nấm men bánh mì là rỉ đường-phế phẩm của công nghiệp đường hoặc các dịch bã rượu. Rỉ đường sử dụng trong sản xuất men bánh mì có những yêu cầu sau :hàm lượng chất khô không thấp hơn 75%,đường 40-50%, hàm lượng chất tro không thấp hơn 7,5%, tổng nitơ không thấp hơn 1,4%, số lượng tổng các vi sinh vật không quá 15000 tế bào trong 1g rỉ đường. Rỉ đường trước khi pha môi trường nuôi nấm men cần được xử lí. Trước tiên pha loãng rỉ đường theo tỉ lệ 1:1,1:4,axit hóa bằng axit H2S04 tới pH=5 rồi làm sạch theo phương pháp hoá học hoặc phươg pháp cơ học. Trong phương pháp hoá học người ta cho thêm vào dich rỉ đường các chất kết lắng để kết tủa các chấ keo. Phương pháp cơ học dùng các máy ly tâm đĩa(seperator) để tách cặn của rỉ đường. Khi kết tủa các chất keo người ta có thể đun nóng rỉ đường tới 80-1000C để giết tạp khuẩn. Bã rượu sau khi chưng cất cồn là một loại nguyên liệu tốt dùng để nuôi cấy nấm men. Bã rượu nói chung có khoảng 90-95% nước,chất khô khoảng từ 5-10%. Trong số các chất hoà tan của bã rượu có đường(1-2,5%),các hợp chất nitơ,các vitamin nhóm B. Ngoài ra trong ba rượu còn có các nguyên tố khoáng ,các nguyên tố vi lượng .Như vậy trong bã rượu còn có hơi ít đường, nhưng rất phong phú các chất kích thích sinh trưởng ,Vì vậy khi dùng bã rượu để nuôi cấy nấm men người ta lọc lấy phần dịch trong rồi bổ sung từ 1-3% rỉ đường, thêm superphootphat. để tăng nguồn Proteins và (NH4)2S04 hoặc urê làm nguồn nitơ. Quá trình nuôi men có thể chia thành 3 giai đoạn: nhân giống thuần khiết trong phòng thí nghiệm (giai đoạn A), nhân giống thuần khiết tự nhiên trong sản xuất (giai đoạn B), và nuôi men lớn (Giai đoạn Carbergellsis). Ở các nhà máy nhân giống ở phòng thí nghiệm và qua sản xuất phải tiến hành qua nhiều cấp để có đủ lượng tế bào men nuôi cấy ở giai đoạn C trong các thùng tới hàng trăm mét khối. Giống thuần khiết ở giai đoạn B có thể thu được ở dạng sữa men sau khi ly tâm tách hoặc ép thành bánh dùng cho giai đoạn C ở cùng nhà máy, hay một số nhà máy khác. Men nuôi cấy sau thay cho men A. Nhiệt độ nuôi cấy khoảng 29-300C. Trong suốt quá trình nuôi cấy ở giai đoạn B và Cần phải thông khí. Men Carbergellsis được tách bằng hệ ly tâm đĩa và lọc ép hoặc lọc chân không. Men sữa được qua sấy phun thành men bột có thể bảo quản được lâu dài. Men thương phẩm ở dạng bánh ép có 73-75% độ ẩm hoặc ở dạng các viên hay sợi khô có 7,5-9% độ ẩm được gọi là men khô. Ngoài ra ở các nhà máy bánh mì có thể tổ chức một phân xưởng sản xuất men nước để cung cấp cho nhu cầu của mình. Men nước dùng riêng để sản xuất bánh mì hoặc trộn lẫn với men khô hoặc men ép để giảm lượng dùng các men này đồng thời nâng cao đươc chất lượng bánh. Quá trình sản xuất men bánh mì tương tự sản xuất sinh khối nấm men proteins đơn bào., chỉ khác là các chủng nuôi cấy khác nhau và men bánh mì là những tế bào men còn sống. Hình 8.1. Sơ đồ công nghệ chuẩn bị môi trường dinh dưỡng nuôi cấy giống nấm men thuàn chủng (nhân giống) từ dịch bã rượu tinh bột VIII.3) Sản xuất rượu etylic VIII.3.1) nguyên liệu sản xuất rượu Nguyên liệu dùng để sản xuất rượu gồm có: Các loại hạt củ cớ chứa nhiều tinh bột như các loại ngũ cốc:gạo, ngô, đại mạch,cao lương… và các loại củ:sắn, khoai tây… Các loại rỉ đường từ mía hoặ từ củ cải đường. Dịch thuỷ phân từ gỗ (chủ yếu là xenllulose hay hemixenllulose). Chúng ta chỉ làm quen với hai loại lên men đó là lên men từ tình bột và lên men từ dịch rỉ đường. VIII.3.2)Nuôi cấy nấm men trong quá trình lên men rượu Trong nồi lên men cần phải tiến hành nhân giống để men giống sinh sôi đủ lượng tế bào có khả năng lên men tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Qúa trình nhân giống tiến hành nhiều cấp. Trong thực hiện lên men công nghiệp, cần phải đủ lượng tế bào nấm men, có độ trẻ, khoẻ, sinh sản mạnh. Đối với men rượu số lượng tế bào sacharomyces vào khoảng 120 triệu-160 triệu tế bào/1ml dịch lên men(sau khi nuôi cấy 12h) Giống từ môi trường thạch nghiêng cấy sang bình môi trường lỏng 10ml,rồi sang bình tam giác 100ml, sang bình cầu 1000ml,10l,100l,1000l…nuôi men từ thùng 100l cần phải thổi khí và khoảng 1-2h thì khuấy trộn môi trường 1 lần. Trong qúa trình nuôi cần phải duy trì nhiệt độ thích hợp đối với nấm men, nói chung cần giữ nhiệt độ 30-320C. Môi trường nhân giống từ 100ml-10l như sau: Đối với tinh bột thường dùng môi trường nước đường hoá có nồng đôj 12-14Bx hoặc 6-7 Be và pH 4-4,5.(tương đương 1,2-2g H2SO4/l). Đối với men rượu rỉ đường thường dùng môi trường rỉ đường đã được xử lí như sau:rỉ đường pha loãng đến 40 Bx điều chỉnh bằng H2SO4 tới pH 4,5, đun sôi trong 1h, rồi để yên trong 1-2 ngày, lọc bỏ cặn. Rỉ đường sau khi xử lí thì pha loãng đến 12-14 Bx(6-7 Be), thêm (NH4)2SO4 :0,2-0,5%, superphotphat:0,2-0,5%, điều chỉnh pH 4,5-4,8 (tương đương 1,2-1,5g H2SO4). Môi trường ở các nồinuôi giống tiếp theo cũng giống như trên, nhưng được thêm chất sát trùng Na2SiF6-0,02%. Trong nồi lên men chính dịch đường cần đạt đến nồng độ 90-120g/l (khoảng 12-14Bx), pH cần phải ở khoảng 4,5-4,8 để hạn chế các loại vi sinh vật tạp nhiễm. Môi trường sau khi thanh trùng thì được tiếp men giống và cho lên men tất cả khoảng 65h, trong đó 10h đầu cần phải sục khí để men sinh sản đủ lượng tế bào, sau đó cho lên men tĩnh và kị khí. Nấm men sau khi lên men có thể dùng lại cho đợt sau, nhưng phải làm sạch các I sinh vật tạp nhiễm theo cách sau: axit hoá bằng H2SO4 tới pH 2,7-3 giữ ở pH này 3-4 giờ và kiểm tra bằng kính hiển vi, khi có tới 50% lượng tế bào nấm men bị chết thì men được chuyển vào cấy trong dịch đường mới lên men. VIII.3.3) Lên men Sau khi đã chuẩn bị xong lên men có nồng độ 16-18% chất khô hoà tan (tương đương với 13-15% độ đường) cùng với chất sát khuẩn cũng như bổ sung các nguồn dinh dưỡng. Nhiệt độ lên men 28-320C, pH=4,2-5,2. Tế bào nấm men tiếp tục sinh sản và sinh khối phát triển đến nồng độ rượu là 5% sẽ dừng lại hoặ phát triển chậm dần đến ngừng hẳn. Quá trình lên men được tiến hành trong vòng 23 ngày. Đối với nhữngnòi nấm men chịu được nồng độ cao khi lên men đường giảm xuống 6-8%, có khi bổ sung thêm đường và như vậy nấm men sẽ tiếp tục chuyển hoá đường thành rượu, năng suất lên men được tăng lên. Bình thường một quá trình lên men với nồng độ đường ban đầu 13-15% thì rượu tạo thành là 7-8%, nếu bổ sung đường có kết quả:tổng đường trong lên men có thể tới trên 20% và lượng rượu sinh ra cũng nhiều hơn.(có khi đạt 10%). Quá trình lên men rươu cần chú trọng: Chống nhiễm tạp khuẩn, bảo vệ quá trình lên men. Làm nguội cho các thùng lên men( ở nước ta lên men mùa hè, nhiệt độ của dịch lên men là 350C,thường phun nước dôi từ trên xuống quanh thùng). Trường hợp lên men ở nhiệt độ cao dẫn đến các hậu quả xấu, sinh ra nhiều sản phẩm phụ, giảm chất lượng sản phẩm… Lên men rượu có thể tiến hành lên men gian đoạn theo từng mẻ, lên men bán liên tục hay lên men liên tục. VIII.3) Thu nhận chế phẩm enzim invectaza từ sacharomyces cerevisiae Nghiên cứu này khảo sát quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận chế phẩm invertase. Đầu tiên, sử dụng phương pháp thực nghiệm thay đổi giá trị của một yếu tố và cố định các giá trị của những yếu tố còn lại để xác định điều kiện thích hợp cho quá trình tự phân nấm men nhằm mục đích thu nhận invertase. Kết quả thu được như sau: tỉ lệ khối lượng giữa nấm men/dung môi (dung dịch đệm acetate): 1/6, nhiệt độ tự phân: 500C, pH ban đầu: 5,5 và thời gian tự phân: 50 giờ. Khi đó hoạt tính invertase thu được là 94,7 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men. Tiếp theo, tối ưu hóa hai yếu tố nhiệt độ và pH ban đầu của quá trình tự phân bã nấm men bia bằng phương pháp trực giao bậc hai cấu trúc có tâm. Kết quả cho thấy giá trị nhiệt độ và pH tối ưu của quá trình tự phân bã nấm men bia để thu nhận invertase lần lượt là 450C và 5,5. Khi đó, tổng hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme invertase thu được trong dịch tự phân là 120,9 đơn vị hoạt tính/g chất khô nấm men và 0,7 đơn vị hoạt