Đồ án Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn probiotics

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ------------o0o----------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CẢI THIỆN CHẤT LƯỢNG MÔI TRƯỜNG NƯỚC CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN PROBIOTICS Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 111 GVHD: TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH KS. PHẠM MINH NHỰT SVTH: NGUYỄN VĂN THỊNH Lớp: 05DSH MSSV: 105111060 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 06 năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC ------------------------ KHOA: Môi Trường và CNSH BỘ MÔN: Công nghệ sinh học NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MSSV: LỚP: HỌ VÀ TÊN: NGÀNH: 1. Đầu đề đồ án tốt nghiệp 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu) 3. Ngày bàn giao Đồ án tốt nghiệp 4. Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn 1/ ……………………………… 2/ ……………………………… Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn. Ngày …… tháng……..năm 2009 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH ( Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): Đơn vị: Ngày bảo vệ: Điểm tổng kết: Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: NHẬN XÉT GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Điểm bằng số Điểm bằng chữ TP.HCM, ngày ….. tháng…….năm 2009 (GV hướng dẫn ký và ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến quí thầy cô trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ, đặc biệt là thầy cô Khoa Môi trường và Công nghệ Sinh học đã cố gắng sắp xếp và tạo điều kiện cho em được thực tập và làm đề tài tốt nghiệp ở Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam bộ. Em xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh đã luôn quan tâm và đóng góp ý kiến trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Em xin cảm ơn KS. Phạm Minh Nhựt đã hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em rất nhiều trước và trong suốt quá trình thực tập. Xin cảm ơn KS. Hoàng Thanh Lịch đã rất thân thiện và nhiệt tình giúp em hoàn thành tốt công việc của mình. Em xin chân thành cảm ơn ban Giám Đốc Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam bộ đã đồng ý cho em vào thực hiện đề tài và đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng em trong suốt quá trình này. Một lần nữa em xin kính chúc quí thầy cô cùng anh chị luôn dồi dào sức khỏe và hạnh phúc để tiếp tục hướng dẫn những thế hệ sau tốt hơn và ngày càng cảm thấy yêu và nhiệt huyết hơn với nghề. MỤC LỤC TRANG Trang tựa i Nhiệm vụ của đồ án ii Nhận xét của giáo viên iii Lời cảm ơn iv Mục lục v Danh sách các bảng ix Danh sách các hình x Danh sách các từ viết tắt xi Chương 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 2 1.3. Nội dung đề tài 2 1.4. Giới hạn đề tài 2 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………….3 2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản 3 2.1.1. Các yếu tố thủy lý 3 2.1.1.1. Nhiệt độ 3 2.1.1.2. Màu sắc nước 4 2.1.1.3. Độ trong 4 2.1.1.4. Mùi nước 5 2.1.1.5. Vị nước 5 2.1.2. Các yếu tố thủy hóa 5 2.1.2.1. Chỉ số pH 5 2.1.2.2. Độ mặn 7 2.1.2.3. Độ kiềm 7 2.1.2.4. Độ cứng 8 2.1.2.5. Sắt 9 2.1.2.6. Ammonia (NH3 và NH4+) 9 2.1.2.7. Nitrite (NO2-) 10 2.1.2.8. Nitrate (NO3-) 10 2.1.2.9. Hàm lượng oxygen hòa tan (DO) 11 2.1.2.10. Nhu cầu oxy hóa học (COD) 11 2.1.2.11. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD) 11 2.1.3. Các chỉ tiêu sinh học 12 2.1.3.1. Vi khuẩn (Bacteria) 12 2.1.3.2. Virus 13 2.1.3.3. Vi tảo (microalgae) 13 2.2. Tổng quan về probiotics 14 2.2.1. Khái niệm probiotics 14 2.2.2. Thành phần probiotics 15 2.2.2.1. Vi khuẩn gram dương 15 2.2.2.2. Vi khuẩn gram âm 15 2.2.2.3. Bacteriophages 16 2.2.2.4. Nấm men 16 2.2.2.5. Vi nấm 16 2.2.3. Tác dụng của probiotics 16 2.2.3.1. Trong bảo vệ môi trường 17 2.2.3.2. Trong chăn nuôi 17 2.2.3.3. Trồng trọt 19 2.2.3.4. Cơ chế hoạt động của probiotics trong nuôi trồng thủy sản 19 2.2.5. Tình hình sử dụng chế phẩm probiotics ở Việt Nam 20 Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.2. Nội dung thực hiện 22 3.3. Vật liệu 22 3.3.1 Hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm 22 3.3.1.1. Vật liệu 22 3.3.1.2. Mô tả 23 3.3.2 Hệ thống môi trường 23 3.3.2.1. Vật liệu 23 3.3.2.2. Mô tả 23 3.3.3 Các yếu tố thủy hóa 23 3.3.3.1. Nhiệt độ 23 3.3.3.2. pH 23 3.3.3.3. NH3-N 23 3.3.3.4. NO2-N 24 3.3.3.5. COD 24 3.4. Bố trí thí nghiệm 24 3.4.1 Bố trí thí nghiệm theo dõi các chỉ tiêu môi trường trong hệ thống ương cá chẽm 24 3.4.2. Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường 25 3.5. Phương pháp nghiên cứu 26 3.5.1. Quy trình nhân sinh khối vi khuẩn và bổ sung vi khuẩn 26 3.5.1.1. Nhân sinh khối vi khuẩn. 26 3.5.1.2. Bổ sung vi khuẩn vào các nghiệm thức. 26 3.5.2. Đo các chỉ tiêu thủy hóa 26 3.5.2.1. Đo pH 28 3.5.2.2. Đo nhiệt độ 28 3.5.2.3. Đo NH3-N 28 3.5.2.4. Đo NO2-N 29 3.5.2.5. Đo COD 29 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Kết quả thủy hóa tại các bể ương ấu trùng. 30 4.1.1 Nhiệt độ 30 4.1.2 pH 31 4.1.3 NH3-N 33 4.1.4 NO2-N 34 4.2 Kết quả thủy hóa tại các bể môi trường. 36 4.2.1 Nhiệt độ 36 4.2.2 pH 36 3.2.3 NH3-N 37 3.2.4 NO2-N 38 3.2.5 COD 39 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 5.2. Kiến nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm hệ thống ương ấu trùng cá chẽm Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường Hình 4.1 – Sự biến thiên nhiệt độ theo ngày Hình 4.2 – Sự biến thiên pH theo ngày Hình 4.3 – Sự biến thiên hàm lượng NH3-N theo tuần Hình 4.4 – Sự biến thiên hàm lượng NO2-N theo tuần Hình 4.5 – Sự biến thiên nhiệt độ theo ngày Hình 4.6 – Sự biến thiên pH theo ngày Hình 4.7 – Sự biến thiên hàm lượng NH3-N theo tuần Hình 4.8 – Sự biến thiên hàm lượng NO2-N theo tuần Hình 4.9 – Sự biến thiên hàm lượng COD theo tuần DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT OD: Oxygen Demand BOD: Biochemical Oxygen Demand COD: Chemical Oxygen Demand Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay nuôi trồng thủy sản được coi là ngành kinh tế mũi nhọn, trong đó khu vực Nam bộ có lợi thế đặc biệt do có vị trí địa lý và điều kiện tự nhiên rất thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản. Nhận thức được tầm quan trọng đó, việc định hướng và đề ra chiến lược phát triển bền vững và lâu dài cho ngành nuôi trồng thủy sản là rất quan trọng. Trong nuôi trồng thủy sản, việc quản lý môi trường nước ương nuôi được xem là khâu khá quan trọng, có thể nói đây là khâu chính yếu quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nuôi. Ngoài các yếu tố thủy hóa đánh giá chất lượng nước ương nuôi, vi khuẩn hiện diện trong nước ương nuôi cũng được xem là nguyên nhân chính ảnh hưởng đến tỉ lệ sống và sự tăng trưởng của đối tượng nuôi trồng thủy sản. Sự sống sót, sinh trưởng và sinh sản của tôm, cá nuôi phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố môi trường. Do đó, để tăng năng suất, nâng cao sản lượng của tôm, cá nuôi, con người cần phải can thiệp, quản lý duy trì và nâng cao chất lượng nước trong quá trình nuôi thủy sản. Điều kiện khí hậu ở Việt Nam rất đa dạng, đòi hỏi việc áp dụng kĩ thuật và cải thiện môi trường theo từng vùng phải được tuân thủ triệt để và nghiêm túc. Do sự khác biệt về kỹ thuật nuôi và khí hậu nên tác động thủy hóa và sự ô nhiễm môi trường nước bởi những tác nhân vi sinh vật cũng khác nhau. Phần lớn các bệnh trên thủy sản có nguyên nhân chính là do thức ăn và do sự ô nhiễm môi trường sống của thủy sản. Từ lâu, người dân đã biết sử dụng các hóa chất tổng hợp để hạn chế sự ô nhiễm nguồn nước ương nuôi hoặc sử dụng thuốc kháng sinh để khống chế sự hiện diện của vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản. Ngoài những lợi ích trên, việc sử dụng kháng sinh dễ tạo nên các chủng vi khuẩn bị kháng thuốc và chúng sẽ xuất hiện ngày càng nhiều hơn nếu ta sử dụng hóa chất trị bệnh vào trong việc phòng bệnh trong nuôi thủy sản. Nghiêm trọng hơn là sự tồn dư của những hóa chất, thuốc kháng sinh không được cấp phép sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Từ thực tế trên, một giải pháp có thể chấp nhận được là sử dụng các chế phẩm probiotics để hạn chế sự phát triển của mầm bệnh và cải thiện chất lượng nước môi trương ương nuôi. Nhiều nhóm vi sinh vật đã được ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản nhằm nâng cao tỷ lệ sống và cải thiện chất lượng môi trường do chúng có khả năng chịu mặn, chịu kiềm, chịu acid, tổng hợp được các chất hữu cơ có khả năng phân hủy, tác dụng tiêu diệt vi khuẩn. Nhờ đó, tôm cá có khả năng miễn dịch tốt, tăng trưởng nhanh và cho hiệu quả kinh tế cao. Việc ứng dụng probiotics đã được các nước trên thế giới tiến hành khá rộng rãi, tuy nhiên ở Việt Nam, ứng dụng probiotics trong nhiều lĩnh vực nói chung và trong lĩnh vực thủy sản nói riêng hiện vẫn chưa được quan tâm và đầu tư đúng mức. Từ tình hình thực tế nói trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn probiotics”. Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam bộ - Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. 1.2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu, đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước ương nuôi của một số chủng vi sinh vật probiotics thông qua bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường nuôi. 1.3. Nội dung đề tài Tiến hành bố trí hệ thống thí nghiệm. Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn. 1.4. Giới hạn đề tài Chỉ tiến hành khảo sát các chỉ tiêu: nhiệt độ, pH, NH3-N, NO2-N, COD. Chỉ tiến hành thực hiện khảo sát khả năng cải thiện chất lượng nước của 3 chủng vi khuẩn probiotics. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản Để đánh giá chất lượng nước, người ta đưa ra những chỉ tiêu về chất lượng nước như sau: Các chỉ tiêu vật lý cơ bản (các yếu tố thủy lý) như: nhiệt độ nước, màu nước, độ trong, mùi nước, vị nước. Các chỉ tiêu hóa học của nước (các yếu tố thủy hóa) như: pH, độ mặn, độ kiềm, độ cứng, sắt, ammonia, nitrite, nitrate… Các chỉ tiêu sinh học: vi khuẩn, virus, vi tảo. 2.1.1. Các yếu tố thủy lý: 2.1.1.1. Nhiệt độ Nhiệt độ là đại lượng biểu thị trạng thái nhiệt của nước. Nguồn cung cấp nhiệt cho ao nuôi bao gồm: năng lượng mặt trời, sự tỏa nhiệt từ trái đất, các phản ứng hóa học và từ sự phân hủy các chất hữu cơ trong nước và nền đáy ao. Rowland (1986) cho rằng khoảng nhiệt độ thích hợp cho sống sót và sinh sản của các loài tôm, cá nuôi là tương đối rộng, nhưng khoảng nhiệt độ cho tăng trưởng cực đại thì rất hẹp. Ví dụ: dải nhiệt độ giới hạn cho tôm sú từ 12 - 37.50C, nhưng khoảng nhiệt độ thích hợp cho tăng trưởng của nó chỉ từ 25 – 300C. Nhiệt độ ảnh hưởng đến các quá trình sinh học và hóa học của sinh vật. Tốc độ các phản ứng hóa học và sinh học sẽ tăng gấp đôi khi nhiệt độ tăng lên 100C và hoạt động trao đổi chất của động vật thủy sinh cũng tăng theo sự tăng nhiệt độ. Đồng thời chúng cũng sử dụng oxygen tăng thêm 2 lần. Nhiệt độ là một yếu tố điều chỉnh năng suất vật nuôi trong ao. Khi nhiệt độ tăng trong khoảng thích hợp thì tốc độ tiêu hóa thức ăn của tôm, cá tăng lên rất mạnh và hệ số tác dụng hữu ích của thức ăn cũng tăng lên một cách tương ứng. Ví dụ: đối với cá chép, thang nhiệt độ cá thích ăn là: 12-330C, tối ưu là: 23-290C (quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản, Nguyễn Đình Trung). Nhiệt độ còn ảnh hưởng tới khả năng gây bệnh của mầm bệnh. Ví dụ: bệnh gây ra do nhóm vi khuẩn Aeromonas spp., khi nhiệt độ nước 40C thì chỉ có 14% cá bị chết, nhưng khi nhiệt độ tăng lên 210C thì có 100% cá mắc bệnh bị chết. 2.1.1.2. Màu sắc nước Nước nguyên chất là chất lỏng không màu nhưng nước trong ao nuôi thường mang các màu rất khác nhau. Sự hình thành của màu nước do sự kết hợp của 3 yếu tố: ánh sáng, các vật thể trong nước và hệ thống tiếp thu màu. Sự cấu thành của màu nước là hiện tượng hội tụ của 3 yếu tố: Ánh sáng. Các vật thể trong nước. Hệ thống tiếp thu màu (mắt). Việc xác định màu nước được mô tả về sắc thái và cường độ màu bằng lời chứ không thể bằng con số định lượng. 2.1.1.3. Độ trong Nước tinh khiết là chất lỏng trong suốt nhưng nước trong các ao nuôi thì luôn có một giá trị nhất định của độ trong. Khi độ trong của nước thấp gọi là nước bị đục. Độ trong của nước ở các ao nuôi chủ yếu phụ thuộc vào số lượng và đặc tính của khối chất cái (seston) trong nước, đó là tập hợp những sinh vật sống trong tầng nước và vật thể lơ lửng trong nước. Thành phần của seston: Chất bẩn vô cơ. Mùn bã hữu cơ. Sinh vật phù du (kể cả động vật và thực vật phù du). Độ trong là một chỉ tiêu đơn giản, dễ xác định, thông qua chỉ tiêu này nuôi có thể đánh giá được tình trạng ao nuôi mà có biện pháp xử lý thích đáng. Độ đục gây ra bởi các phần tử phù sa (đất sét và bùn) gọi là độ đục vô cơ, làm giảm khả năng truyền ánh sáng vào ao nuôi. Khi độ đục vô cơ cao thì cá, tôm khó hô hấp, cường độ bắt mồi giảm. Còn nếu độ đục của nước do sinh vật phù du gây nên thì khi đó giá trị của độ trong sẽ trở thành chỉ số năng suất. Tuy nhiên, nước đục không có nghĩa là nước ô nhiễm. 2.1.1.4. Mùi nước Nước tinh khiết không có mùi, mùi của nước tự nhiên được tạo nên bởi các chất có trong nước và có khả năng bay hơi được. Và khi những chất bay hơi này tiếp xúc với mũi thì ta cảm nhận được mùi. Các chất gây ra mùi trong nước có thể chia ra thành 3 nhóm: Các chất gây mùi có nguồn gốc vô cơ: mùi clo (do quá trình khử clo), mùi trứng thối (do nhiều khí H2S). Các chất gây mùi có nguồn gốc hữu cơ: trong chất thải công nghiệp, dầu mỡ, thuốc bảo vệ thực vật.. Các chất gây mùi từ các quá trình sinh hóa, các hoạt động của vi khuẩn, rong tảo: mùi tanh hôi (do có vi khuẩn phát triển), mùi bùn (do tảo lục phát triển), mùi tanh cá (do tảo lam phát triển). Mùi được xem là một tín hiệu, một chỉ tiêu cho biết mức độ nhiễm bẩn của nguồn nước. Các thuật ngữ thường dùng là: không mùi, thoang thoảng, rõ rệt và nặng mùi. 2.1.1.5. Vị nước Nước tinh khiết không có vị, vị của nước phụ thuộc vào nồng độ các chất khoáng và các chất tan trong đó quyết định. Căn cứ vào vị của nước có thể biết được mức độ và đặc điểm hòa tan của muối trong nước: Vị mặn: do muối NaCl hòa tan > 500mg/l. Vị nhạt: do nhiều khí CO2 hòa tan. Vị chua: do muối Al và Fe gây ra. Vị chát: do Na3CO3, MgSO4 và MgCl2 gây ra. Vị đắng: do hàm lượng Mg2+>1 g/l. Các chất gây ra vị trong nước là ảnh hưởng đến giá trị thương phẩm của đặc sản thủy sản vì chúng làm cho tôm, cá có vị không ngon. Tiêu chuẩn về thành phần và tính chất nước nuôi trồng thủy sản là không có màu, mùi và vị lạ. 2.1.2. Các yếu tố thủy hóa 2.1.2.1. Chỉ số pH Yếu tố pH có ảnh hưởng rất lớn đối với môi trường, tác động đến đời sống thủy sinh vật, liên quan trực tiếp đến quá trình trao đổi chất, sự trao đổi nước và muối giữa cơ thể và môi trường. Vì thế, pH là một yếu tố quyết định giới hạn sự phân bố thủy sinh vật đối với môi trường sống, ảnh hưởng đến quá trình phát triển phôi, các quá trình dinh dưỡng, sinh trưởng và sinh sản. Nước biển thường có độ pH = 8.2, pH của hầu hết các ao nuôi nước ngọt là từ 6-9 và biến động trong ngày, pH ao nuôi nước lợ, nước mặn từ 8-9 và ít biến động trong ngày. Thông thường pH trong khoảng từ 6-9 là an toàn cho động vật thủy sản, nếu pH11 có thể gây chết một số loài động vật thủy sản. Trong môi trường nước, khi động thực vật thủy sinh hô hấp nhiều, khí CO2 thải ra làm cho pH giảm xuống. Còn khi quá trình quang hợp của tảo xảy ra mạnh, tiêu thụ nhiều khí CO2 thì giá trị pH lại tăng lên. Ngoài ra, các chất thải hữu cơ tích tụ lại trong ao cũng là một yếu tố gián tiếp ảnh hưởng đến giá trị pH của nước. Khi các hợp chất hữu cơ đó bị phân hủy, hàm lượng CO2 tăng lên làm cho pH giảm xuống. Ảnh hưởng trực tiếp mang tính chất sinh lý của pH đối với cá, tôm nuôi là duy trì sự cân bằng pH trong máu. Khi pH giảm xuống thấp (pH 9) sẽ làm cho tế bào ở mang và các mô của tôm bị phá hủy. Tuy nhiên, trong ao nuôi thủy sản, rất ít khi pH 9. Do đó, những ảnh hưởng trực tiếp do pH quá cao hay quá thấp như trên rất ít xảy ra và không đáng kể bằng ảnh hưởng gián tiếp của pH: Trong những ao nuôi có độ kiềm thấp, pH không đủ thấp để gây hại đến tôm, cá nhưng nó đủ thấp để thiếu oxy cho tảo quang hợp. Những ao nuôi mà hàm lượng ammonia cao, pH cao sẽ làm tăng độc tính của NH3 đối với cá, tôm nuôi. Nếu cá, tôm được chuyển từ vùng nước này đến vùng nước khác có sự sai khác lớn về pH thì chúng sẽ bị sốc pH và chết. 2.1.2.2. Độ mặn Theo R.A.Cox thì độ mặn là hàm lượng tổng cộng của các chất rắn vô cơ hòa tan (tính theo gam, trong điều kiện chân không) có trong 1kg nước biển (cũng trong điều kiện chân không) ở điều kiện tấc cả cacbonat CO3-2 chuyển sang oxit, số đương lượng của Br- và I- được thay thế bằng số đương lượng ion Cl-, tấc cả các chất hữu cơ bị oxy hóa, phần bã được sấy khô ở 4800C đến trọng lượng không đổi gọi là độ mặn. Vì độ mặn tính theo gam các chất hòa tan trong 1kg nước biển nên độ mặn được kí hiệu là S0/00. Việc đo độ mặn trực tiếp bằng những phương pháp hóa học rất khó khăn nên người ta chọn ion Cl- làm thành phần định tính cơ bản để tính toán độ mặn của nước biển. Bởi vì trong nước biển ion Cl- có tính điển hình nhất và là cấu tử có tính bảo thủ nhất. Nó có tính điển hình nhất vì nước biển có độ mặn 35%0, nghĩa là trong 1kg nước biển có 35g chất tan thì ion Cl- đã chiếm tới 18.98g. Tính bảo thủ thể hiện ở chỗ: dù trong những vùng biển có độ mặn khác nhau, ion Cl- bao giờ cũng chiếm tỷ lệ 55.04% trong tổng số các ion tạo muối trong nước biển, không bao giờ thay đổi. Căn cứ vào độ mặn, năm 1934, Zernop đã phân chia giới hạn các loại nước tự nhiên như sau: Nước ngọt: S%0 = 0.2 – 0.5%0 Nước lợ: S%0 = 0.5 – 16%0 Nước mặn: S%0 = 16 - 47%0 Nước quá mặn: S%0 > 47%0 Độ mặn ảnh hưởng trực tiếp đến việc điều hòa áp suất thẩm thấu của thủy sinh vật, các thay đổi độ mặn vượt ra ngoài giới hạn thích ứng của cá, tôm nuôi đều gây ra sốc và làm giảm khả năng kháng bệnh của tôm, cá nuôi. 2.1.2.3. Độ kiềm Độ kiềm của nước tự nhiên được quy ước bởi sự có mặt của các ion kiềm và kiềm thổ Na+, K+, Ca+2, Mg+2 có ở trong nước, kết hợp với các acid yếu, trước hết là acid carbonic H2CO3. Do đó, độ kiềm là chỉ số các dạng chủ yếu của các ion HCO3- và CO3-2 trong nước. Độ kiềm giữ vai trò rất quan trọng trong việc duy trì hệ đệm của môi trường nước, đây được xem là một trong những chỉ tiêu rất quan trọng để duy trì sự biến động thấp nhất của pH nước ao nuôi, hạn chế tác hại của những chất độc sẵn có trong môi trường nước, nhằm ngăn chặn những sốc bất lợi cho tôm, cá nuôi. Đối với nước ngọt độ kiềm thường dưới 40mg CaCO3/l và đối với vùng nước lợ, nước mặn thì độ kiềm ở những giá trị lớn hơn 80mg CaCO3 được xem là thích hợp (Nguyễn Đình Trung, 2004). Những nguyên nhân làm giảm độ kiềm trong các ao nuôi là: Đất ao bị phèn. Lượng nước mưa trong ao nhiều vào mùa mưa. Trong ao nuôi có nhiều ốc. Khi độ kiềm giảm, bón vôi CaCO3 và CaMg(CO3)2 được xem là biện pháp hữu hiệu để duy trì và làm tăng độ kiềm trong nước ương nuôi. Bartchi (1954) đã xác định rằng độc tính của CuSO4 lên tảo giảm với sự gia tăng của pH và độ kiềm. Khi nước có độ kiềm nhỏ hơn 50mg CaCO3/l thì nồng độ CuSO4 dùng để diệt tảo là 0.5-1.0mg/l; khi nước có độ kiềm lớn hơn 50mg CaCO3/l thì CuSO4 được dùng ở nồng độ 2.0mg/l (Quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản, Nguyễn Đình Trung, 2004). Kleinholz (1990) đề nghị xác định lượng CuSO4 cần sử dụng theo công thức: Lượng CuSO4 (mg/l) = độ kiềm (mg CaCO3/l)/100 (quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản, Nguyễn Đình Trung) 2.1.2.4. Độ cứng Độ cứng của nước được quy ước bởi hàm lượng của các ion Ca+2 và Mg+2 liên kết với tất cả các acid mạnh cũng như acid yếu ở trong nước. Người ta chia độ cứng ra làm 2 loại: Độ cứng do các ion Ca+2 và Mg+2 trong các muối cacbonnat gây ra là độ cứng tạm thời, vì chúng dễ bị loại ra khỏi nước bằng cách đun nóng: t0 Ca(HCO3)2 = CaCO3 + CO2 + H2O t0 Mg(HCO3) = MgCO3 + CO2 + H2O Độ cứng do những ion Ca+2 và Mg+2 trong các muối clorua và sunphat gây ra là độ cứng vĩnh cửu, vì chúng rất khó loại bỏ khỏi nước. Dựa vào độ cứng người ta chia nước ra làm 4 loại: Mềm: 0-75 ppm CaCO3 Hơi cứng: 75-150 ppm CaCO3 Cứng: 150-300 ppm CaCO3 Rất cứng: trên 300 ppm CaCO3 Độ cứng của nước ương nuôi ảnh hưởng tới tôm, cá nuôi ở vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu, ảnh hưởng tới điều hòa lượng Ca2+ trong máu. Bên cạnh đó, độ cứng còn ảnh hưởng đến độc tính của một số hóa chất và thuốc trừ sâu. Nước có hàm lượng ion Ca2+ cao có khả năng làm giảm tính độc của một số ion kim loại nặng và thuốc trừ sâu. 2.1.2.5. Sắt Trong nước tự nhiên, sắt tồn tại dưới 2 dạng: Fe2+ (ferrous) và Fe3+ (ferric). Sắt Fe2+ gây độc cho cá, tôm nuôi vì quá trình oxy hóa chúng thành Fe3+ tiêu tốn rất nhiều oxy môi trường và tạo thành Fe(OH)3 bám trên mang cá làm cản trở hô hấp của cá. Sắt Fe3+ thường không gây độc nhưng nếu hàm lượng của chúng quá cao cũng ảnh hưởng đến tôm, cá nuôi. Hàm lượng sắt trong nước biển rất thấp, chỉ khoảng vài phần trăm đến vài phần mười ppm. Trong nước ngọt thì hàm lượng của chúng cao hơn, có khi lên đến hàng chục ppm. 2.1.2.6. Ammonia (NH3 và NH4+) Trong hệ thống nuôi thủy sản, ammonia được hình thành từ sản phẩm bài tiết của vật nuôi, quá trình phân hủy protêin trong thức ăn thừa và xác chết thủy sinh vật Ammonia hiện diện dưới 2 dạng: không ion hóa (NH3) và ion hóa (NH4+), trong đó dạng ion hóa (NH4+) được cho là ít độc đối với động vật thủy sản, NH3 có độc tính cao hơn NH4+ từ 300 đến 400 lần. Nồng độ gây chết của NH3 đối với cá là 0.5-1.0mg/l (Quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản, Nguyễn Đình Trung, 2004). Tỉ lệ NH3/NH4+ phụ thuộc vào độ pH của nước, pH thấp thì hàm lượng NH4+ cao hơn NH3. Khi đồng thời nhiệt độ tăng và pH cao thì độc tính của NH3 tăng theo gây rối loạn hô hấp, phá vỡ sự cân bằng của tế bào làm cho thủy sinh vật hoạt động mất thăng bằng và khả năng miễn dịch giảm. Tuy nhiên, nếu hàm lượng ammonia quá thấp thì thủy sinh vật cũng chậm phát triển, nồng độ ammonia nhỏ hơn 0.02ppm thì thủy sinh vật có thể phát triển dị hình. Ngưỡng cho phép trong nuôi trồng thủy sản đối với ammonia tổng cộng (NH3 + NH4+) nhỏ hơn 0.5 mg/l (Vũ Thế Trụ, 1995). Biện pháp hạn chế ammonia trong nước ương nuôi: Kiểm soát lượng thức ăn vừa đủ cho cá, tôm. Có biện pháp không để thức ăn thừa bị phân hủy ở đáy ao. Nếu hàm lượng NH3 quá cao cần phải tăng cường oxy hòa tan bằng quạt hay sục khí liên tục, nếu không cải thiện được thì nên thay nước nếu có đủ điều kiện. Nên duy trì sự phát triển của tảo trong ao nuôi, vì ao có tảo phát triển tốt sẽ làm cho hàm lượng NH3 thấp. 2.1.2.7. Nitrite (NO2-) Nitrite là sản phẩm chuyển hóa của ammonia (NH4+) nhờ nhóm vi khuẩn tự dưỡng Nitrosomonas. Nitrite có độc đối với động vật thủy sản do nó cản trở sự vận chuyển oxy trong máu, nitrite có độc tính cao đối với thủy sản nước ngọt. Tuy nhiên, trong nước mặn động vật thủy sản có thể chịu được hàm lượng Nitrite cao gấp 50-100 lần so với nước ngọt, do trong nước mặn ion chloride kết hợp với gốc nitrite làm giảm độc tính của nó (Vũ Thế Trụ, 1995). Schwedler (1985) đã xác định được rằng các yếu tố sau ảnh hưởng đến độc tính của nitrite: pH, nồng độ ion Cl-, kích cỡ vật nuôi, tình trạng nuôi dưỡng, mức độ nhiễm bẩn và nồng độ oxy hòa tan. Do đó rất khó để có thể đưa ra lời khuyến cáo về nồng độ gây chết hoặc nồng độ an toàn của NO2- trong ao nuôi thủy sản. 2.1.2.8. Nitrate (NO3-) Một nhóm vi khuẩn tự dưỡng khác là nitrobacter chuyển nitrite thành nitrate với sự có mặt của oxy. Nitrate không gây hại đối với thủy sinh vật. Khi hàm lượng NO3 2mg/l thì tảo lục và tảo khuê sẽ phát triển mạnh. Hàm lượng thích hợp của NO3 trong các ao nuôi tôm, cá là từ 2-3mg/l. 2.1.2.9. Hàm lượng oxygen hòa tan (DO) Oxy hòa tan là sản phẩm của quá trình quang hợp, sự khuyếch tán oxy từ không khí vào trong nước là nguồn cung cấp oxygen chủ yếu cho hoạt động sống của sinh vật. Lượng oxygen bị tiêu thụ là do thủy sinh vật hô hấp, các quá trình trao đổi chất và sự phân hủy hợp chất hữu cơ dư thừa trong thức ăn. Trong hệ thống nuôi tuần hoàn, lượng oxy hòa tan bị suy giảm nhanh chóng là do sự tiêu thụ của thủy sản và quần đàn vi khuẩn. Trong hệ thống nuôi tuần hòan này, lượng DO thấp luôn là vấn đề khá quan trọng, nếu lượng oxy hòa tan thấp hơn 3.8 mg/l thì hoạt động sống của sinh vật sẽ giảm, tôm cá sẽ giảm cường độ bắt mồi và tăng cường độ hô hấp, nếu từ 2.5 đến 2.8 mg/l thì tôm cá sẽ nổi đầu, bơi chậm và rất dễ bị nhiễm bệnh. Do đó nên kiểm soát lượng oxy hòa tan trong nước từ 5 – 8 mg/l là tốt nhất, tuy nhiên nếu hàm lượng này cao quá cũng không tốt vì sẽ gây ra tình trạng bọt khí trong máu và xuất huyết vảy, cá di chuyển mất thăng bằng. Chỉ có nước không bị ô nhiễm mới đầy đủ lượng oxy bão hòa đáp ứng cho nhu cầu của thủy sản (Phạm Văn Tình, 2004). 2.1.2.10. Nhu cầu oxy hóa học (COD) Nhu cầu oxy hóa học là lượng oxy cần thiết để oxy hóa hết các hợp chất hữu cơ trong nước thành CO2 và H2O. Trong thực tế COD được dùng rộng rãi để đặc trưng cho mức độ các chất hữu cơ trong nước ô nhiễm (kể cả những chất hữu cơ dễ bị phân hủy sinh học và khó bị phân hủy sinh học). 2.1.2.11. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD) Nhu cầu oxy sinh hóa là lượng oxy cần thiết để vi sinh vật tiêu thụ trong quá trình phân hủy các chất hữu cơ trong nước trong điều kiện hiếu khí. Chất hữu cơ + O2 CO2 + H2O (vi sinh vật). Oxy sử dụng trong quá trình này là oxy hòa tan trong nước. Chỉ số BOD chỉ ra lượng oxy mà vi sinh vật tiêu thụ trong phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ trong nước, chỉ số BOD càng cao chứng tỏ lượng chất hữu cơ có khả năng phân hủy sinh học trong nước càng lớn. Quá trình oxy hóa các chất hữu cơ trong nước có thể xảy ra theo 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: chủ yếu oxy hóa các hợp chất cacbuahydro, quá trình này kéo dài khoảng 20 ngày ở 200C. Giai đoạn 2: oxy hóa các hợp chất nitơ, bắt đầu sau ngày thứ 10 nhưng cũng có trường hợp bắt đầu vào ngày thứ năm. Để xác định gần đúng nhu cầu oxy sinh hóa, cần phải đo sau 20 ngày, vì trên thực tế tại thời điểm đó khoảng 98 – 99% lượng chất hữu cơ trong nước sẽ bị oxy hóa. Nhưng đo như vậy tốn quá nhiều thời gian nên ta có thể đo gần đúng bằng cách xác định BOD sau 5 ngày, vì tại thời điểm này có khoảng 70 – 80% các chất hữu cơ bị oxy hóa, chỉ tiêu này được kí hiệu là BOD5. 2.1.3. Các chỉ tiêu sinh học Để đánh giá chất lượng nước, sự có mặt của sinh vật trong nước được quan tâm chủ yếu về 3 mặt: sinh vật làm sạch nước, sinh vật làm ô nhiễm nước và sinh vật làm chỉ thị cho tình trạng nước. Bao gồm: 2.1.3.1. Vi khuẩn (Bacteria) Là các loài thực vật đơn bào, kích thước khoảng 0.5-5 mm, vi khuẩn có dạng hình cầu, hình que hay hình xoắn, chúng có thể tồn tại ở dạng đơn lẻ, dạng cặp hoặc liên kết thành mạch dài. Phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng, vi khuẩn được chia thành 2 nhóm chính: Vi khuẩn dị dưỡng (heterotrophic): là vi khuẩn sử dụng các chất hữu cơ làm nguồn năng lượng và nguồn cacbon để thực hiện quá trình sinh tổng hợp. Vi khuẩn tự dưỡng (autotrophic): là những vi khuẩn có khả năng oxy hóa chất vô cơ để thu năng lượng và sử dụng khí CO2 làm nguồn cacbon cho quá trình sinh tổng hợp. Nhóm vi khuẩn tự dưỡng bao gồm vi khuẩn nitrit hóa, vi khuẩn lưu huỳnh và vi khuẩn sắt. Các vi khuẩn nitrit hóa (Nitrosomonas và Nitrobacter) có mặt trong các hệ thống xử lý sinh học bật hai (bể lọc sinh học) trong điều kiện tải lượng hữu cơ thấp và nhiệt độ ấm. Các vi khuẩn sắt có khả năng oxy hóa sắt hòa tan trong nước thành sắt không tan: Fe+2 (tan) + O2 Fe(OH)3 + năng lượng Các vi khuẩn lưu huỳnh có khả năng chịu được pH thấp và có thể ôxy hóa H2S hòa tan trong nước thành H2SO4 gây ăn mòn vật liệu xây dựng công trình nuôi trồng thủy sản. Các vi khuẩn này chỉ được phát hiện bằng kính hiển vi quang học. 2.1.3.2. Virus Nước trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản thường tồn tại nhiều loại virus, chúng có kích thước cực nhỏ từ 20-100 nm. Virus là nhóm vi sinh vật chưa có cấu tạo tế bào, không có khả năng sống độc lập mà phải ký sinh nội bào trong tế bào ký chủ từ vi khuẩn cho đến tế bào thực vật, động vật và cả người. Chúng sinh sản trong tế bào vật chủ vì chúng không có hệ thống chuyển hóa để tự sinh sản. Những virus có khả năng phá vỡ tế bào là virus độc, những virus có khả năng tạo nên trạng thái tiềm tan gọi là virus không độc. Trong điều kiện có môi trường nước thì virus mới hoạt động được và hiện chưa có thuốc đặc hiệu để diệt virus. 2.1.3.3. Vi tảo (microalgae) Vi tảo có cấu tạo đơn bào hay đa bào, sống lơ lửng, trôi nổi trong nước. Toàn bộ cơ thể vi tảo đều chung chức năng quang hợp. Trong các hệ thống nuôi nước ngọt thường gặp các ngành: tảo khuê, tảo lục, tảo lam, tảo mắt, tảo giáp, tảo vàng và tảo vàng ánh. Trong các hệ thống nuôi nước mặn thường gặp các ngành: tảo khuê, tảo giáp, tảo lam, tảo lục, tảo mắt và tảo vàng ánh. Trong hệ thống nuôi thủy sản thành phần vi tảo càng phong phú càng tốt cho tôm, cá nuôi. Sự hiện diện của các vi tảo và các sắc tố trong các loài vi tảo quyết định màu nước ao nuôi. Vi tảo còn làm giảm cường độ ánh sáng đi sâu vào nước ao, ngăn cản sự phát triển của tảo đáy. Vi tảo góp phần làm ổn định nhiệt độ nước và tham gia điều chỉnh giá trị pH của ao nuôi. Một quần xã vi tảo ổn định đảm bảo lượng oxy hòa tan thông qua quá trình quang hợp và làm giảm các độc tố trong nước nhờ khả năng hấp thụ ammonia NH4+ và giữ các ion kim loại nặng. 2.2. Tổng quan về probiotics 2.2.1. Khái niệm probiotics Thuật ngữ “probiotics” được Lilly và Stilwell đề xuất năm 1965 để tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm 1989 Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: Probiotic là những sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ. Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng (có lẽ là cho phép hai chữ tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotic - sự sống). Trong nuôi trồng thủy sản, probiotics là sự bổ sung các chất chứa vi sinh vật sống có lợi đối với vật nuôi bằng cách biến đổi hệ vi sinh vật xung quanh hoặc liên quan đến vật chủ, bằng cách nâng cao khả năng sử dụng thức ăn hay nâng cao giá trị dinh dưỡng của thức ăn, nâng cao đáp ứng của vật nuôi đối với mầm bệnh hoặc cải thiện chất lượng môi trường xung quanh thông qua quá trình phân hủy chất hữu cơ trong nước nhanh hơn. Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhưng tác dụng của nó nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic. Năm 1908, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài tuổi thọ cho con người. Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, bảo vệ sức khoẻ, bảo vệ môi truờng. Tuy nhiên việc dung chế phẩm này vào nuôi trồng thuỷ sản (tôm, cua, cá nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây. Tại Nhật Bản, với chế phẩm probiotic có tên là E.M. (chế phẩm các vi sinh vật hữu hiệu – Effective Microoganims) do giáo sư , tiến sĩ TeRuo Higa, Trường Đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm 1980 và được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cung như bảo vệ môi trường đều cho kết quả khả quan. Đến nay chế phẩm này được hơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam. (Lương Đức phẩm, 2007). 2.2.2. Thành phần probiotics Các chủng loại vi sinh vật sử dụng trong probiotics được xác định có sự hiện diện của cả vi khuẩn gram âm, vi khuẩn gram dương, bacteriophages, nấm men và cả nấm đơn bào (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.1. Vi khuẩn gram dương Các vi sinh vật gram dương, hiếu khí và sinh bào tử như chủng Bacillus spp được sử dụng như probiotics nhằm mục đích nâng cao chất lượng nước ao nuôi do ức chế hệ vi sinh vật gây hại trong nước và làm giảm số lượng mầm bệnh. Một lợi ích trực tiếp trong việc sử dụng trực khuẩn này là làm giảm việc sử dụng kháng sinh, hóa chất trong việc nuôi trồng thủy sản và nâng cao tỷ lệ sống của các loài nuôi trồng thủy sản (Irianto and Austin, 2002). Ngoài các chủng Bacillus, vi khuẩn lactic trong các chế phẩm probiotics được ứng dụng khá nhiều trong nuôi trồng thủy sản như sử dụng chế phẩm chứa Lactobacillus bulgaricus, L. acidophillus, L. sporogenes, L. casei, L. plantarum, Streptococcus thermophillus (Venkat et al., 2004). Lợi ích của việc sử dụng vi khuẩn lactic trong chế phẩm probiotics là làm giảm tỷ lệ chết của ấu trùng cá (Irianto and Austin, 2002) đồng thời làm tăng hiệu quả hấp thu thức ăn (Venkat et al, 2004) 2.2.2.2. Vi khuẩn gram âm Pseudomonas fluorescens được chứng minh là có khả năng ức chế Saprolenia và A. salmocinida trên các loài cá có vây và ngăn chặn các mầm bệnh trên tôm từ Vibrio spp, đồng thời có tác dụng làm giảm tỷ lệ chết trên cá hồi (Irianto and Austin, 2002) Một vi khuẩn gram (-) khác cũng có tác dụng cải thiện chất lượng của ấu trùng cua, hàu và cá bơn, đó là V. proteolyticus. Chủng này cải thiện quá trình tiêu hóa protein ở cá bơn khi được cung cấp qua con đường cho ăn, Alteromonas làm tăng tỷ lệ sống của ấu trùng pacific oyster (Irianto and Austin, 2002). 2.2.2.3. Bacteriophages Hiện nay có rất nhiều tranh cãi về vai trò của bacteriophages trong chế phẩm probiotics. Tuy nhiên, trong một số nghiên cứu, các nhà khoa học đã nuôi cấy được bacteriophages từ cá thơm, Plecoglossus altivelis và thông qua con đường cho ăn, người ta đã nhận thấy rằng bacteriophages chống lại sự nhiễm P. plecoglossicida trên cá thơm và từ đó họ đi đến kết luận rằng bacteriophages làm giảm nhanh chóng số lượng tế bào vi khuẩn P. plecoglossicida trong thận của cá thơm và trong môi trường nước (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.4. Nấm men Nấm men được ứng dụng trong probiotic phổ biến nhất là chủng Saccharomyces cerevisiae. Với sự hiện diện của nấm men, nó sẽ bám dính vào ruột, làm nâng cao sự tiết enzyme amylase và kích thích các enzyme màng ở ấu trùng sau 27 ngày tuổi (Irianto and Austin, 2002) 2.2.2.5. Vi nấm Nấm đa bào Tetraselmis suecica, được sử dụng làm thức ăn cho các loài tôm thuộc họ tôm he và các loài cá thuộc họ cá hồi đã phát hiện ra rằng loài nấm này làm giảm mật độ bệnh do vi khuẩn. Trên cơ sở đó, một số tác giả cũng đã đưa ra phương thức hoạt động của vi nấm này chống lại các tác nhân gây bệnh dựa vào sự hiện diện của các hợp chất kháng khuẩn không chuyên biệt trên tế bào vi nấm. (Irianto and Austin, 2002) 2.2.3. Tác dụng của probiotics Như chúng ta đã biết, chế phẩm probiotic được sử dụng trong các lĩnh vực: chăn nuôi, trồng trọt, bảo vệ môi trường và sức khoẻ. Hiệu quả của chế phẩm này có nhiều tác dụng dương tính khá bất ngờ như làm cây trồng, vật nuôi tăng sản lượng, tăng trọng, các chỉ tiêu cảm quan đều tốt hơn…, thậm chí còn làm tăng sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ. Cơ chế tác dụng còn nhiều điều bàn cãi, song hiệu quả thực tế là những minh chứng mà nhiều người không thể phủ nhận.Tác dụng cơ bản của chế phẩm probiotics như sau: 2.2.3.1. Trong bảo vệ môi trường Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tuỳ tiện có khả năng sinh ra các enzyme thuỷ phân ngoại bào. Vì vậy, khi vào môi trường nuôi chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gây bệnh phát triển, chúng còn phân huỷ các chất hữu cơ do thức ăn dư thừa và phân của vật nuôi bài tiết…để làm giảm thiểu ô nhiễm. Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S và các khí thối khác là dẫn xuất của khí này. Các loài vi khuẩn tía không lưu huỳnh Rhodobacter sp, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas viridis, Rhodopseudomonas palutris, Rhodomicrobium vanniell có khả năng sử dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt. (kể tên loài vi khuẩn làm phân huỷ NH3,NO2..) Đồng thời các nấm men có khả năng lên men rượu từ đường có trong môi trường, tạo mùi thơm, cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hệ số tiêu hoá của thức ăn cho vật nuôi. 2.2.3.2. Trong chăn nuôi Probiotics có tác dụng đối với tất cả vật nuôi, gồm các loại gia súc, gia cầm, thủy cầm, thủy sản. Đối với vật nuôi giúp cho: Phát triển hệ vi sinh vật đường ruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hoá và hấp thu dinh dưỡng từ các loại thức ăn. Đối với gia súc dạ cỏ chế phẩm này còn giúp cho hệ vi sinh vật dạ cỏ phát triển và hoạt động tốt hơn. Khi probiotic được đưa vào đường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong chế phẩm làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái, điều chỉnh môi trường, ức chế vi sinh vật gây hại hoặc gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các vi sinh vật có hại này gây nên, làm cho chức năng của đường ruột được hoạt động tốt hơn. Liên quan đến việc làm sạch đường ruột có tác dụng thúc đẩy quá trình lọc máu và lọc các chất độc cần bài tiết. Một số vi sinh vật của chế phẩm, đặc biệt là nhóm vi khuẩn acidlactic và nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột, đó là Samonella, Vibrio, Shigella rất rõ. Ngoài ra, acid lactic tạo thành có tác dụng làm sạch ruột, làm cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho động vật tiêu hoá. Các hoạt chất kháng sinh do vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế (cùng với vi khuẩn lactic) các vi sinh vật gây hại. Tăng cường hiệu quả tiêu hoá của thức ăn: tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức ăn. Kích thích chức năng miễn dịch của cơ thể. Làm lành mạnh và hoạt hoá khả năng tự nhiên của tế bào. Hai tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ các chế phẩm probiotic có hoạt tính sinh học, như acid amin, các enzyme, các nucleotit, các acid nucleic, các vitamin, đặc biệt là biotin. Các hoạt chất này có lien quan đến khả năng đổi mới của tế bào của cơ thể, làm tăng kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trình não hoá, làm tăng sức khoẻ chống sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh. Các tác dụng trên đây thường thấy khi sử dụng trộn chế phẩm với thức ăn của vật nuôi, hoặc cho người hay động vật uống các dịch chiết từ chế phẩm. Các chế phẩm này có thể dùng ở dạng dịch hoặc bột (phun hoặc rắc vào môi trường nước hay chuồng trại) để xử lý môi trường. Làm tăng sức khoẻ vật nuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng. Làm cho gia súc, gia cầm mắn đẻ hơn. Tăng chất lượng thịt, tăng năng suất chăn nuôi. Ức chế và có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại. Làm giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi. Vì vậy, dung chế phẩm probiotic hoà vào thức ăn hay nước uống cho vật nuôi đều có tác dụng dương tính. Dùng dạng dịch pha loang phun trực tiếp lên cơ thể con vật như chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào đầu vú con cái thì khgi cho con bú se tránh bị nhiễm khuẩn có hại. Với môi trường nước nuôi tôm, cá khi đưa probiotics vào sử dụng thì nước ao đầm có pH thay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột. Các chỉ số BOD, COD cũng vậy, hàm lượng NH3 và H2S thường không quá giới hạn cho phép nên thời gian của một chu kì thay nước sẽ kéo dài hơn. Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khoẻ hơn, tăng trọng nhanh hơn và chi phí thức ăn cho một đơn vị tăng trọng giảm. 2.2.3.3. Trồng trọt Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trông (bao gồm cây lương thực, cây ăn quả, cây rau màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác nhau. Tác dụng với cây trồng ta thấy: Kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả, và quá trình chin của quả. Cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh. Tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng. Kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống, làm cho hoa trái tươi lâu. Dùng chế phẩm probiotic khi được đưa vào đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng dễ. Cây trồng sẽ phát triển tốt ở đất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nâng cao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ. 2.2.3.4. Cơ chế hoạt động của probiotics trong nuôi trồng thủy sản Cạnh tranh vị trí gắn kết: một trong những cơ chế ngăn ngừa sự hình thành của tập đoàn vi khuẩn gây bệnh là cạnh tranh vị trí gắn kết trên ruột hay trên hay trên bề mặt các mô, đây là hàng rào phòng bệnh đầu tiên chống lại vi khuẩn gây bệnh. Sản xuất các chất ức chế: tạo ra các chất ức chế trong thành ruột của vật chủ tạo nên hàng rào bảo vệ chống lại các bệnh cơ hội. Cạnh tranh nguồn năng lượng: các vi sinh vật probiotics và các vi khuẩn gây bệnh cạnh tranh ion sắt với nhau, siderophore là tác nhân giữ ion sắt chuyên biệt, có trọng lượng phân tử thấp, có khả năng phân hủy sắt kết tủa và biến nó thành sắt mà vi sinh vật có thể sử dụng được. Tăng cường sự hấp thu dinh dưỡng: sử dụng nấm men để nâng cao sự ổn định của hệ vi sinh vật đường ruột, tăng tỉ lệ sống của ấu trùng do kích thích enzyme tiêu hóa. Tác dụng lên hệ thống nước xanh: probiotics bổ sung các vi nấm có lợi nhằm làm tăng tỉ lệ tăng trưởng và sống sót của ấu trùng cá, khởi động quá trình tiêu hóa và hình thành vi sinh vật. Probiotics nâng cao đáp ứng miễn dịch: sử dụng các chất kích thích miễn dịch như bêta-glucan, peptidoglycan… để tăng cường hệ thống phòng vệ đối với vi khuẩn gây bệnh. Can thiệp vào hệ thống quorum sensing: tạo ra một số chất có khả năng phân hủy quorum sensing làm ức chế khả năng gây bệnh của vi khuẩn. 2.2.5. Tình hình sử dụng chế phẩm probiotics ở Việt Nam Hiện nay, Việt Nam đang đẩy mạnh việc nghiên cứu để sản xuất probiotics dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên sản phẩm tinh chế thì giá thành còn cao nên ở nước ta hiện nay vẫn sử dụng nguồn nguyên liệu chủ yếu là các loại phụ phẩm của ngành nông nghiệp. Do đó, giá thành của probiotic giảm xuống nhiều và cũng giúp cho vật nuôi tiêu hóa tốt hơn, giảm tỉ lệ bệnh và góp phần cải thiện môi trường. Từ bã khoai mì mà ngay cả động vật cũng chê, các chuyên gia thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo ra thức ăn kích thích tăng trưởng cho mọi vật nuôi, kể cả thủy sản. Võ Thị Hạnh với chế phẩm Probiotic Bio I và Bio II gồm hỗn hợp các vi sinh vật sống và enzyme tiêu hóa dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản đã nhận được giải thưởng WIPO dành cho nhà khoa học nữ xuất sắc nhất. Trong nuôi trồng thủy sản, công ty công nghệ hóa sinh Việt Nam đã sản xuất những sản phẩm phục vụ công tác cải thiện chất lượng môi trường nước nuôi tôm, cá đạt hiệu quả như sau: BIO - DW - làm sạch nước, nền đáy ao nuôi; ngăn chặn dịch bệnh; tăng sản lượng tôm, cá. BIO - PROBIOTIC - Thức ăn bổ sung cho tôm, cá. EMC - Phức hợp vi sinh vật có lợi, vitamin và các enzyme hữu hiệu dùng nuôi tôm, cá. Probiotics là một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học. Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và hiệu quả mà nó thể hiện. Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotics đang chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Như vậy, nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào cuộc sống là một công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục hoàn thiện probiotics, đem lại hiệu quả cao hơn, chất luợng cuộc sống ngày được cao hơn, an toàn hơn đáp ứng nhu càu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta. Có thể nói, đây là bản chất tự nhiên trung hòa bản chất tự nhiên, là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn. Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian thực hiện: từ tháng 04 đến tháng 06 năm 2009. Địa điểm thực hiện: Trung tâm Quốc gia Giống hải sản Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi Trồng Thủy sản II. Địa chỉ: số 167 Thùy Vân, Thành phố Vũng Tàu. 3.2. Nội dung thực hiện Giữ giống vi khuẩn trong phòng thí nghiệm và bổ sung vào các nghiệm thức. Tiến hành đo các yếu tố thủy hóa (nhiệt độ, pH, NH3, NO2, COD) ở cả 2 lô thí nghiệm (bể ương và môi trường). Đánh giá khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước của một số chủng vi khuẩn. 3.3. Vật liệu Thí nghiệm gồm 2 hệ thống được bố trí song song nhau: hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm và hệ thống môi trường. 3.3.1 Hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm 3.3.1.1. Vật liệu Bể ương ấu trùng: 15 bể composite 0.5 m3. Hệ thống thoát nước và hệ thống dẫn khí được lắp đặt bằng ống nhựa. Hệ thống sục khí: van khí, dây khí, đá… Hệ thống cấp nước: 2 bể composite 3 và 4 khối, 2 máy bơm nước,.. Nguồn ấu trùng cá chẽm: được cung cấp trực tiếp tại Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam bộ. Nguồn vi khuẩn: được phân lập từ Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II, bao gồm các chủng sau: Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng trong thí nghiệm STT Ký hiệu khuẩn lạc Kết quả định danh 1 Ch102 Flavimonas sp. 2 Ch201 Micrococcus sp. 3 Ch104 Bacillus sp. 3.3.1.2. Mô tả Nước biển được xử lý chlorine và được trung hòa bằng Natri thiosulphate, cấp nước vào 15 bể composite 0.5 m3, sục khí liên tục. Tiến hành định lượng ấu trùng cá chẽm và bổ sung vào những bể trên. Vi khuẩn được bổ sung song song với ấu trùng vào bể. Mật độ là 105 CFU/ml và được bổ sung liên tục 2 ngày 1 lần. 3.3.2 Hệ thống môi trường 3.3.2.1. Vật liệu Bể môi trường: 15 bể composite 100 lít. Hệ thống dẫn khí: được lắp đặt bằng ống nhựa. Sục khí: van khí, ống khí, đá… Hóa chất: ammonium chloride NH4Cl. 3.3.2.2. Mô tả Nước biển không xử lý được bơm trực tiếp vào 15 bể, mỗi bể 45 lít và được sục khí liên tục. Bổ sung NH4Cl duy nhất một lần vào đầu mỗi đợt thí nghiệm với nồng độ 10 mg/l. Vi khuẩn được bổ sung song song với hệ thống bể ương ấu trùng. Mật độ cũng là 105 CFU/ml và cũng được bổ sung 2 ngày 1 lần. 3.3.3 Các yếu tố thủy hóa 3.3.3.1. Nhiệt độ: máy đo nhiệt độ (nhiệt kế). 3.3.3.2. pH: máy đo pH. 3.3.3.3. NH3-N Chai nhựa (lấy mẫu). Erlen 250ml (15 cái). Giấy lọc Whatman. Erlen 100ml (15 cái). Pipette (2 cái). Hóa chất: dung dịch phenol, dung dịch Natri nitropruside, dung dịch Citrate kiềm, dung dịch Natri hypochlorite 1.5N hay 5%, dung dịch oxy hóa. Tủ hút. Máy đo quang phổ. 3.3.3.4. NO2-N Chai nhựa (lấy mẫu). Giấy lọc Whatman. Erlen 250ml (15 cái). Erlen 100ml (15 cái). Pittete (2 cái). Hóa chất: nước cất loại nitrite, dung dịch sulfanilamide, dung dịch NED. Tủ hút. Máy đo quang phổ. 3.3.3.5. COD Chai nhựa (lấy mẫu). Erlen 100ml (6 cái). Nước cất. Hóa chất: dung dịch NaOH 25%, dung dịch KMnO4 0.01N, dung dịch H2SO4 25%, dung dịch KI 10%, dung dịch Na2S2O3 0.01N và dung dịch hồ tinh bột. Pittete (2 cái). Máy đun. Bóp cao su. 3.4. Bố trí thí nghiệm 3.4.1 Bố trí thí nghiệm theo dõi các chỉ tiêu môi trường trong hệ thống ương cá chẽm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 chủng vi khuẩn probiotics khác nhau tương ứng với 5 nghiệm thức (4 nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn probiotics và 1 nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn). Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần (phụ lục 1). Thí nghiệm được tiến hành trên 15 bể composite 0.5 m3. Thí nghiệm được tiến hành trên ấu trùng cá chẽm mới nở. Nước biển được lọc và xử lý chlorine (nồng độ 30ppm), sục khí mạnh trong 3 giờ đồng hồ, sau đó trung hòa chlorine bằng natrithiosunphat (nồng độ 30ppm) trước khi thả cá. Nước biển dùng để ương nuôi ấu trùng phải được lọc sạch, độ mặn 30-32%o, nhiệt độ 280C-310C, sục khí vừa đủ. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu môi trường: nhiệt độ, pH (đo hằng ngày), NH3-N, NO2-N (mỗi tuần một lần). Hình 3.1: Bố trí thí nghiệm hệ thống ương ấu trùng cá chẽm Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường Thí nghiệm được thực hiện trên 15 bể composite 100 lít. Thí nghiệm được tiến hành bằng nước biển chưa qua xử lý, được bổ sung NH4Cl một lần vào đầu mỗi thí nghiệm với nồng độ 10 mg/l. Vi khuẩn được bổ sung giống và song song với hệ thống ương nuôi ấu trùng cá chẽm đối với từng nghiệm thức. Tiến hành theo dõi các chỉ tiêu môi trường: nhiệt độ, pH (đo hằng ngày), NH3-N, NO2-N, COD (mỗi tuần một lần). Hình 3.2: Bố trí thí nghiệm hệ thống môi trường 3.5. Phương pháp nghiên cứu 3.5.1. Quy trình nhân sinh khối vi khuẩn và bổ sung vi khuẩn 3.5.1.1. Nhân sinh khối vi khuẩn. Được thực hiện trong phòng thí nghiệm. Ba chủng vi khuẩn sử dụng cho mỗi đợt thí nghiệm được bảo quản trong tủ lạnh, thời gian tối đa 1 tháng. Chỉ bắt đầu nhân sinh khối trước khi bắt đầu thí nghiệm từ 1-2 ngày. Ba chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong 3 erlen (loại 1 lít) khác nhau, có sục khí liên tục. Thể tích nuôi 500ml. Môi trường nuôi sinh khối vi khuẩn là Tryptic Soy Broth (TSB). Cứ sau 2 ngày lại tiến hành cấy chuyển một lần để nhân sinh khối mới. 3.5.1.2. Bổ sung vi khuẩn vào các nghiệm thức. Hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm: có 2 phương pháp : Phương pháp 1: Bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường nước trong bể ương: Mật độ vi khuẩn trong bình nuôi cấy được xác định bằng cách đo quang (OD) bằng máy quang phổ ở bước sóng 600nm. Công thức tính như sau: Mật độ vi khuẩn = 1,02 x 109 x OD600 (CFU/ml) Mật độ vi khuẩn cần bổ sung vào bể ương : 105 CFU/ml. Bổ sung vào bể trước khi cho trứng vào ấp. Sau đó bổ sung 2 ngày 1 lần. Công thức tính thể tích dịch vi khuẩn cần thiết bổ sung vào mỗi bể: Thể tích bể nuôi x 105 CFU/ml Thể tích vi khuẩn (ml) = Mật độ vi khuẩn Phương pháp 2: Bổ sung vi khuẩn gián tiếp vào bể ương thông qua giàu hóa thức ăn tự nhiên: Giàu hóa luân trùng (Rotifer): Tính toán số lượng luân trùng cần thiết của mỗi nghiệm thức của 1 lần cho ăn để tiến hành thu luân trùng và làm giàu vi khuẩn trong 10lít/nghiệm thức. Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua luân trùng là: 106 CFU/ml (tính trên thể tích luân trùng sau khi thu). Thể tích vi khuẩn cần thiết để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức (ml) = 106 x thể tích luân trùng sau khi thu x 103 / Mật độ vi khuẩn Thời gian giàu hóa luân trùng: trong 2 giờ (có sục khí). Giàu hóa Artemia: Artemia sau khi nở khoảng 6 giờ cho đến giai đoạn instar 2 (8 giờ sau khi nở) (lúc này ấu trùng Artemia đã mở miệng). Tính toán số lượng Artemia cho ăn cần thiết của mỗi nghiệm thức. Thu và cho vào 5 bình khác nhau tương ứng với 5 nghiệm thức. Xác định thể tích Artemia trong mỗi bình. Mật độ vi khuẩn làm giàu thông qua Artemia là: 106 CFU/ml (tính trên thể tích Artemia sau khi thu). Thể tích cần thiểt để làm giàu đối với mỗi nghiệm thức: Tương tự như làm giàu thông qua Rotifer. Thời gian giàu hóa Artemia: Trong 2-4 giờ (có sục khí). Không bổ xung vi khuẩn ở các nghiệm thức đối chứng. Sử dụng một chủng vi khuẩn cho mỗi nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức được lặp lại ba lần. Hệ thống môi trường Bổ sung vi khuẩn trực tiếp vào môi trường. Mật độ vi khuẩn cần bổ sung vào môi trường nước là 105 CFU/ml. Tiến hành bổ sung 2 ngày 1 lần. Công thức tính thể tích dịch vi khuẩn cần thiết bổ sung vào mỗi bể môi trường cũng tương tự như hệ thống bể ương: Thể tích bể nuôi x 105 CFU/ml Thể tích vi khuẩn (ml) = Mật độ vi khuẩn 3.5.2. Đo các chỉ tiêu thủy hóa 3.5.2.1. Đo pH Dụng cụ: máy đo pH. Cách đo: nhúng trực tiếp đầu máy đo vào bể ương và môi trường, đảo đều, chờ kết quả ổn định và đọc kết quả hiện lên trên máy. 3.5.2.2. Đo nhiệt độ Dụng cụ: nhiệt kế. Cách đo: nhúng trực tiếp nhiệt kế vào nước và đọc kết quả. 3.5.2.3. Đo NH3-N Phương pháp phân tích: phương pháp Indophenol (phenate). Nguyên tắc: phenol và ClO3- phản ứng trong dung dịch có tính kiềm tạo ra phenylquinone-monoimine để tiếp tục phản ứng với amonia tạo thành indophenol theo phản ứng sau: 2 C6H5O - + NH3 + 3 ClO - à -OC6H4N=O + 2 H2O + OH - + 3 Cl – Indophenol làm cho dung dịch có màu xanh, độ đậm phụ thuộc vào nồng độ ammonia. Natri nitropruside được thêm vào để tăng cường màu xanh. Trong phương pháp này cả ammonia và ammonium được đo do trong môi trường kiềm tất cả ammonium chuyển thành ammonia. Đo ở bước sóng 630 nm vì màu xanh này được hấp thu cực đại ở bước sóng này. Cách đo: Lọc nước vào erlen qua giấy lọc Whatman. Đong 50 ml cho vào erlen. Thêm 2 ml dung dịch phenol, lắc đều. Thêm 2 ml dung dịch Natri nitropruside, lắc đều. Thêm 5 ml dung dịch oxy hóa, lắc đều. Để yên mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ. Miệng erlen được phủ bởi giấy nhôm để tránh sự lây nhiễm ammonia từ không khí. Đọc độ hấp thu mẫu ở bước sóng 630 nm. 3.5.2.4. Đo NO2-N Phương pháp phân tích: phương pháp Diazo hóa (0-0.3 mg/l NO2-N hoặc 5-1000 mg/l). Nguyên tắc: NO2-N được xác định thông qua sự hình thành phẩm nhuộm azo màu tím đỏ ở pH = 2.0-2.5 bằng sự ghép nối thông qua liên kết azo giữa sunfanilamide với N-(1-naphthyl)-etylendiamine dihydrocliride (NED dihydrocloride). Hệ màu tuân theo định luật Lambert Beer đến nồng độ 180 microgam/lit với cuvet 1 cm ở 543 nm. Cách đo: Lọc mẫu vào erlen qua giấy lọc Whatman. Đong 50 ml mẫu vào erlen. Thêm 1 ml dung dịch sulfanilamide, lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 1 ml NED, lắc đều, để yên trong 10 phút. Tiến hành đo độ hấp thu mẫu ở bước sóng 540 nm, mẫu trắng là mẫu nước cất. 3.5.2.5. Đo COD Phương pháp phân tích: xác định độ oxy hóa của nước trong môi trường kiềm theo phương pháp permangannat iot thiosulfat. Cách đo: Đong 25 ml mẫu vào erlen. Đong 25 ml nước cất vào erlen. Thêm 1 ml dung dịch NaOH 25%, thêm 10 ml dung dịch KMnO4 0.01N, đậy giấy bạc và đem đun cách thủy ở 960C trong 90 phút. Lấy ra để nguội ở nhiệt độ phòng hay có thể nhúng trong chậu nước. Thêm 2 ml dung dịch H2SO4 25%, thêm 2 ml dung dịch KI 10%, lắc đều và để yên trong 5 phút. Chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0.01N với chỉ thị là hồ tinh bột (3-5 giọt). Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả thủy hóa tại các bể ương ấu trùng. 4.1.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến nhiều phương diện trong đời sống của cá như: hô hấp, tiêu thụ thức ăn, đồng hóa thức ăn, miễn nhiễm đối với bệnh tật, sự tăng trưởng…và có ảnh hưởng không nhỏ đến các chỉ số vật lý, hóa học trong môi trường sống của cá. Đối với ấu trùng cá chẽm có sức sinh trưởng nhanh ở nhiệt độ từ 26 – 30oC. Tiến hành đo nhiệt độ của các bể ương hàng ngày vào lúc 14h và kết quả được biểu diễn ở hình sau: Hình 4.1 – Sự biến thiên nhiệt độ theo ngày Từ hình 4.1 cho thấy nhiệt độ ở các bể ương trong suốt quá trình thí nghiệm diễn ra khá ổn định và chỉ dao động từ 28.50C đến 300C. Mức biến đổi về nhiệt độ sau một ngày luôn không vượt quá 10C, điều đó chứng tỏ nhiệt độ thí nghiệm khá ổn định. Vì các bể ương nuôi được đặt ở trong nhà có mái che, thoáng khí nên không có sự chênh lệch lớn về nhiệt độ nước nuôi khi đo nhiệt độ các bể ương ở cùng một thời điểm trong ngày (cụ thể nhiệt độ được đo vào lúc 14 h hàng ngày). Sự tăng giảm không nhiều về nhiệt độ nước nuôi sau thời gian 1 ngày như vậy sẽ giúp cho ấu trùng cá phát triển tốt và tránh xảy ra hiện tượng sốc nhiệt, đồng thời giảm được sự thay đổi đột ngột của các yếu tố môi trường khác như NH3, NO2 hay ổn định được sự phát triển của các sinh vật, hệ vi sinh trong nước đảm bảo sức khỏe cho ấu trùng cá chẽm trong suốt quá trình ương nuôi. 4.1.2 pH Độ pH của nước rất quan trọng, có ảnh hưởng lớn đến cá nuôi và phiêu sinh vật. Khi pH quá cao hay quá thấp sẽ không tốt cho sức khỏe của mọi động vật thủy sản, làm thay đổi hệ phiêu sinh vật trong nước nuôi theo chiều hướng không tốt và nhiều yếu tố lý – hóa – vi sinh trong môi trường cũng biến động. Theo Đỗ Văn Khương và cộng tác viên năm 2001 cho rằng, giá trị pH thích hợp cho ương nuôi ấu trùng cá chẽm là 7.5 – 8.5. Trong suốt quá trình thí nghiệm, giá trị pH được đo hàng ngày vào lúc 14h và kết quả được thể hiện dưới bảng sau: Hình 4.2 – Sự biến thiên pH theo ngày Sự chênh lệch độ pH của nước ương nuôi ấu trùng cá chẽm, so sánh giữa các nghiệm thức có bổ sung các chủng vi khuẩn với nhau và với nghiệm thức đối chứng trong cùng một ngày là rất nhỏ (độ pH chênh lệch không quá 0.3 giữa các nghiệm thức). Đặc biệt, ta thấy pH nước ở các bể ương biến động nhiều giữa các ngày liên tiếp trong giai đoạn ấu trùng được 13 ngày tuổi đến 23 ngày tuổi. Độ pH tăng dần từ ngày tuổi thứ 11 đến ngày tuổi thứ 16 và pH cao nhất đạt 8,7. Sau đó lại thấy pH giảm dần đến ngày tuổi thứ 23, rồi ổn định hơn ở giai đoạn 24 – 30 ngày tuổi. Sự biến động pH như vậy có thể là do biến động lượng chất hữu cơ và sự phân hủy các chất hữu cơ trong nước nuôi. Điều này liên quan đến các giai đoạn chăm sóc ấu trùng. Ở giai đoạn này, pH tăng cao nên ta cần phải kiểm soát lượng NH3 trong bể ương ở mức thấp nhất vì pH cao sẽ làm tăng độc tính của NH3 rất có hại cho ấu trùng cá trong bể. Ở giai đoạn 10 – 15 ngày tuổi, ấu trùng cá chẽm ăn lượng thức ăn nhiều hơn (ấu trùng chuyển sang ăn Artemia) và sinh trưởng rất nhanh (có thể quan sát thấy được sự khác biệt về kích thước của ấu trùng cá sau 1 ngày). Vì vậy lượng phân thải của cá sẽ tăng lên, chất hữu cơ phân hủy trong nước tăng dẫn đến hàm lượng các khí NH3, NO2,… tăng, cùng với đó thì tỷ lệ thay nước hàng ngày vẫn giữ ở mức 30% thể tích nước/bể/ngày, đây có thể là nguyên nhân chính dẫn đến biến động pH nước nuôi nhiều hơn theo xu hướng tăng dần. Đến giai đoạn ấu trùng từ 15 – 25 ngày tuổi thì lượng thức ăn cho ấu trùng cá tăng, đồng thời tỷ lệ thay nước cũng tăng lên 50% thể tích nước/bể/ngày, tỷ lệ thay nước này đã góp phần làm giảm đáng kể lượng hữu cơ trong nước nuôi, khắc phục được hiện tượng tăng cao của pH, làm pH nước nuôi giảm xuống. Như vậy, lúc này lượng chất hữu cơ bị loại bỏ khi thay nước nhiều hơn lượng chất hữu cơ sinh ra trong bể ương. Giai đoạn ấu trùng từ 25 – 30 ngày tuổi, tỷ lệ thay nước là 70% thể tích nước/bể/ngày và lượng thức ăn tiếp tục tăng lên. Ta thấy pH nước nuôi ổn định hơn, chứng tỏ ở giai đoạn này có sự cân đối hơn giữa lượng hữu cơ tăng lên trong nước nuôi (do dư thức ăn, do phân thải của cá) và lượng hữu cơ bị loại bỏ (do thay nước). Độ pH đạt ở mức cao (pH =8,7) sẽ ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của ấu trùng cá. Tuy nhiên, pH cao trong thời gian không dài (pH cao trong thời gian 1-2 ngày thì giảm xuống mức phù hợp với ấu trùng và giảm một cách từ từ) nên mức độ gây độc đến ấu trùng cá sẽ không nhiều nếu ở thời điểm đó các khí độc trong nước có hàm lượng thấp. Vào ngày pH đạt giá trị cực đại, giá trị của nhiệt độ lại giảm ở mức thấp nhất nên mức độ gây độc của NH3 và NO2.. lên ấu trùng cá là không đáng kể. Nói chung pH như trên là có thể chấp nhận được cho hệ thống ương nuôi ấu trùng cá chẽm. 4.1.3 NH3-N Hàm lượng NH3-N trong nước ương nuôi cao sẽ rất nguy hại đến sức khỏe của động vật thủy sản. Theo Đỗ Văn Khương và cộng tác viên (năm 2001) cho rằng, hàm lượng NH3-N trong nước nuôi nhỏ hơn 1.0 mg/l là an toàn đối với sức khỏe của ấu trùng cá chẽm. Trong suốt quá trình thí nghiệm, hàm lượng NH3-N được khảo sát mỗi tuần một lần và kết quả được biểu diễn qua hình sau: Hình 4.3 – Sự biến thiên hàm lượng NH3-N theo tuần Dựa vào hình 4.3 ta thấy hàm lượng NH3-N tăng lên vào tuần thứ 2 và bắt đầu giảm vào tuần thứ 3 và tuần cuối cùng. Sự tăng giảm hàm lượng NH3-N đồng đều giữa các nghiệm thức. Hàm lượng NH3-N giữa các tuần có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0.0000). Hàm lượng NH3-N ở tuần 2 và tuần 3 cao hơn so với tuần 1 và tuần 4, điều này do vào tuần 2 và tuần 3, cá phát triển mạnh, khả năng chuyển hóa thức ăn nhiều hơn, tạo ra nhiều chất thải hơn, bổ sung thức ăn nhiều hơn và có thể dẫn đến thức ăn thừa cũng nhiều hơn. Đối với các chủng vi khuẩn probiotics, khả năng phân hủy NH3-N của chúng không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0.1142). Trong số các chủng thí nghiệm, những bể thí nghiệm bổ sung chủng Ch201 thì hàm lượng NH3-N cao nhất so với các chủng còn lại, các chủng Ch104, Ch102 tuy có hàm lượng NH3-N thấp hơn nhưng lại không có sự khác biệt một cách có ý nghĩa về phương diện thống kê học. Tuy nhiên, hàm lượng NH3-N ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn thấp hơn nhiều so với đối chứng. Điều này chứng tỏ khả năng phân hủy NH3-N của các chủng thí nghiệm trong các bể ương ấu trùng có hiệu quả. Mặc dù hàm lượng trong các bể đối chứng cao nhất nhưng chưa đạt được đến giá trị 1.0 mg/l. Do đó, ở tất cả các nghiệm thức thì hàm lượng NH3-N trong các bể thí nghiệm tương đối an toàn cho ấu trùng cá chẽm. 4.1.4 NO2-N Hàm lượng NO2-N có trong thủy vực là dạng đạm gây độc đối với thủy sinh vật, chúng ngăn cản việc oxy kết hợp với hemoglobine trong máu hình thành oxyhemoglobine làm cá chết ngạt. Theo Kungvankij et al. (1986) ghi nhận rằng hàm lượng NO2-N thích hợp cho sự sinh trưởng của cá chẽm từ 0-0,2 mg/l. Tuy nhiên, người quản lý môi trường nước nuôi nên quan tâm nhiều hơn khi hàm lượng NO2-N lên đến mức khoảng 0,3 mg/l (Boyd, 1998). Tiến hành đo hàm lượng NO2-N mỗi tuần một lần và kết quả được biểu diễn như sau: Hình 4.4 – Sự biến thiên hàm lượng NO2-N theo tuần Dựa vào hình 4.4 ta thấy, hàm lượng NO2-N của các nghiệm thức qua 4 tuần đều không vượt quá ngưỡng 0.2 mg/l. Hàm lượng NO2-N giữa các tuần có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0.0000). Hàm lượng NO2-N ở tuần thứ 4 cao hơn rất nhiều so với 3 tuần đầu tiên. Đối với các chủng vi khuẩn probiotics, khả năng phân hủy NO2-N của chúng không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P = 0.1802). Đối với các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn thì nghiệm thức hỗn hợp có hàm lượng NO2-N cao nhất nhưng vẫn chưa vượt quá 0.2 mg/l, các chủng còn lại tuy có nồng độ thấp hơn nhưng cũng không có sự khác biệt đáng kể về phương diện thống kê học. So với nghiệm thức đối chứng, hàm lượng NO2-N ở các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn cũng không thấp hơn, điều này chứng tỏ khả năng phân hủy NO2-N của các chủng vi khuẩn probiotics không đạt hiệu quả. Mặc dù hàm lượng NO2-N ở nghiệm thức hỗn hợp là cao nhất nhưng vẫn chưa đạt ngưỡng 0.2 mg/l nên vẫn an n cho ấu trùng cá ương nuôi. Tóm lại, việc bổ sung các chủng vi khuẩn Ch102, Ch104 và Ch201 vào môi trường nước ương nuôi tuy chưa đạt hiệu quả cao nhưng có thể chấp nhận được. Nhiệt độ, pH luôn ở mức ổn định, hàm lượng NH3-N trong môi trường nước ương nuôi đã giảm, hàm lượng NO2-N tuy tăng lên nhưng vẫn trong giới hạn cho phép nên không gây ảnh hưởng đến ấu trùng cá chẽm. 4.2 Kết quả thủy hóa tại các bể môi trường. 4.2.1 Nhiệt độ Nhiệt độ môi trường nước của hệ thống môi trường giống với nhiệt độ nước ương nuôi ấu trùng cá chẽm vì được bố trí song song nhau, trong cùng điều kiện môi trường (trong nhà có mái che và thoáng khí). Tiến hành đo nhiệt độ hàng ngày, song song và được kết quả tương đương với hệ thống bể ương ấu trùng cá chẽm: Hình 4.5 – Sự biến thiên nhiệt độ theo ngày Dựa vào hình 4.5 ta thấy, nhiệt độ môi trường nước khá ổn định, nhiệt độ thấp nhất là 28.50C và cao nhất là 300C. Mức chênh lệch nhiệt độ qua từng ngày không cao, tăng giảm không vượt quá 10C một ngày nên rất thuận lợi cho vi khuẩn được bổ sung vào phát triển và hoạt động, nhiệt độ ổn định nên rất tốt cho tác động của vi khuẩn đến hàm lượng NH3-N, NO2-N và COD. 4.2.2 pH Giá trị pH được đo hàng ngày song song với hệ thống ấu trùng và kết quả được biểu diễn bằng hình sau: Hình 4.6 – Sự biến thiên pH theo ngày Sự chênh lệch độ pH khi so sánh giữa nghiệm thức bổ sung vi khuẩn với nghiệm thức đối chứng trong cùng một ngày là không lớn (độ chênh lệch không vượt quá 0.2 giữa các nghiệm thức). Từ ngày đầu tiên đến ngày thứ 19, pH liên tục tăng lên, từ khoảng 8.1 – 8.2 tăng khá đều lên đến 8.8 – 8.9 và đạt cực đại ở ngày thứ 19. Và sau đó pH giảm dần về ngưỡng bình thường. Khá tương đồng là giá trị pH của bể ương ấu trùng cá chẽm cũng tăng dần và đạt cực đại vào ngày thứ 19 rồi giảm dần về giá trị bình thường. So với bể ương ấu trùng, giá trị pH cực đại của hệ thống môi trường cao hơn (khoảng từ 0.2 – 0.4) và giá trị pH trung bình hàng ngày của từng nghiệm thức cũng cao hơn. Giá trị pH ở các nghiệm thức là khá cao, tăng mạnh ở tuần thứ 3 và giảm rất ít vào tuần cuối cùng. Tác dụng của việc sử dụng các chủng vi khuẩn: Ch102, Ch104, Ch201 và hỗn hợp của chúng trong cải thiện pH môi trường là chưa rõ rệt và chưa đạt hiệu quả. 3.2.3 NH3-N Vào đầu thí nghiệm, trước khi bổ sung vi khuẩn, hệ thống nước biển chưa xử lý được bổ sung NH4Cl nhằm làm tăng hàm lượng NH3-N trong nước. Hàm lượng NH3-N được khảo sát mỗi tuần một lần và kết quả được biểu diễn bằng hình sau: Hình 4.7 – Sự biến thiên hàm lượng NH3-N theo tuần Hàm lượng NH3-N giữa các tuần có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P= 0.0000). Hàm lượng NH3-N cao nhất ở tuần đầu tiên (do có sự bổ sung NH4Cl vào đầu thí nghiệm) và giảm dần ở những tuần 2, tuần 3 và đạt giá trị rất thấp ở tuần cuối cùng. Đối với các chủng vi khuẩn thí nghiệm, khả năng phân giải NH3-N của chúng không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P=0.6927). Những bể môi trường có bổ sung chủng vi khuẩn Ch102 có hàm lượng NH3-N cao nhất, các bể bổ sung chủng Ch104, Ch201 có hàm lượng thấp hơn nhưng cũng không có sự khác biệt nào đáng kể về phương diện thống kê học. Hàm lượng NH3-N ở các bể môi trường có bổ sung vi khuẩn thấp hơn so với đối chứng. Điều này chứng tỏ khả năng phân hủy NH3-N của các chủng vi khuẩn thí nghiệm khá đạt hiệu quả. 3.2.4 NO2-N Trong hệ thống môi trường, hàm lượng NO2-N được khảo sát mỗi tuần một lần và kết quả được biểu diễn qua hình sau: Hình 4.8 – Sự biến thiên hàm lượng NO2-N theo tuần Dựa vào hình 4.8 ta thấy sự biến thiên hàm lượng NO2-N ở 2 tuần đầu tiên nhưng rất ít, tuy nhiên, bước sang tuần 3 và tuần 4 thì hàm lượng NO2-N tăng lên rõ rệt. Hàm lượng NO2-N giữa các tuần có sự khác biệt rõ rệt về phương diện thống kê học (P=0.0000). Hàm lượng NO2-N ở tuần 3 và tuần 4 cao hơn rất nhiều so với 2 tuần đầu tiên. Đối với các chủng vi khuẩn thí nghiệm, khả năng phân giải NO2-N của chúng không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P=0.0875), các bể môi trường có bổ sung chủng vi khuẩn Ch102 có hàm lượng NO2-N cao nhất, các bể có bổ sung chủng Ch104, Ch201 tuy có hàm lượng NO2-N thấp hơn nhưng không có sự khác biệt về phương diện thống kê học. So với các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn, nghiệm thức đối chứng có hàm lượng NO2-N thấp hơn. Điều này chứng tỏ các chủng vi khuẩn probiotics thí nghiệm chưa đạt hiệu quả trong việc phân giải NO2-N trong môi trường nước. 3.2.5 COD Chỉ tiêu COD của hệ thống môi trường được tiến hành đo mỗi tuần một lần và kết quả được biểu diễn qua hình sau: Hình 4.9 – Sự biến thiên hàm lượng COD theo tuần Hàm lượng COD giữa các tuần có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P=0.0000). Hàm lượng COD ở tuần 3 và 4 cao hơn rất nhiều so với tuần 1 và 2. Đối với các chủng vi khuẩn probiotics, khả năng phân giải chất hữu cơ của chúng không có sự khác biệt có ý nghĩa về phương diện thống kê học (P=0.5767). Trong số các bể thí nghiệm, những bể bổ sung chủng vi khuẩn Ch201 có hàm lượng COD cao nhất, các bể bổ sung chủng Ch102, Ch104 tuy có hàm lượng COD thấp hơn nhưng vẫn không có sự khác biệt về phương diện thống kê học. Hàm lượng COD ở các bể có bổ sung vi khuẩn đều cao hơn so với đối chứng. Điều này chứng tỏ khả năng phân hủy chất hữu cơ trong môi trường nước của các chủng vi khuẩn thí nghiệm không đạt hiệu quả. Tóm lại, việc bổ sung các chủng vi khuẩn Ch102, Ch104, Ch201 vào môi trường tuy có dấu hiệu tích cực nhưng hiệu quả chưa cao. Nhiệt độ, pH ở mức ổn định, hàm lượng NH3-N giảm xuống rõ rệt, tuy nhiên, hàm lượng NO2-N, COD vẫn còn khá cao và không có dấu hiệu giảm xuống. Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Ứng dụng các chủng vi khuẩn Ch102, Ch104 và Ch201 để phân hủy NH3-N trong môi trường ương nuôi và trong hệ thống môi trường tuy đạt hiệu quả nhưng chưa thật sự rõ rệt. Khả năng phân hủy NH3-N của chúng còn chưa cao. Các chủng vi khuẩn trên không có hiệu quả trong việc làm giảm hàm lượng NO2-N trong môi trường nước. Hàm lượng COD cũng không có dấu hiệu giảm khi bổ sung các chủng vi khuẩn trên. 5.2. Kiến nghị Để kết quả nghiên cứu về tác dụng xử lý môi trường nước được chính xác hơn, cần tiếp tục tiến hành thử nghiệm các chủng vi khuẩn probiotics như trên trong nhiều điều kiện khác nhau, đặc biệt là các điều kiện gần với các điều kiện sản xuất thực tế. Cần mở rộng nghiên cứu nhiều chủng vi khuẩn probiotics khác và thử nghiệm trên nhiều đối tượng thủy sản nuôi hiện nay, để tổng hợp và đưa ra các chủng vi khuẩn probiotics có khả năng cải thiện chất lượng môi trường nước đạt hiệu quả nhất. Cần cố gắng phân lập ra các chủng vi khuẩn có tác động chuyên biệt đến từng chỉ tiêu môi trường nước ương nuôi thủy sản để việc ứng dụng chúng được dễ dàng và phổ biến hơn. Nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotics vào trong lĩnh vực nuôi trồng thủy sản và cải thiện chất lượng môi trường nước là một vấn đề cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục đem ứng dụng của các nghiên cứu vào thực tiễn nhằm nâng cao chất luợng môi trường nước dẫn đến nâng cao chất lượng sản phẩm thủy sản, bảo đảm an toàn thực phẩm, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao và khắt khe của xã hội. Tuy nhiên, để việc nuôi thủy sản thành công thì ứng dụng probiotic kết hợp với nhiều giải pháp đồng bộ nhất định sẽ mang lại kết quả khả quan. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Báo cáo phương pháp phân tích: Một Số Chỉ Tiêu Lý Hóa Của Nước, Bộ Thủy sản viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II. Lương ĐứcPhẩm, 2007, Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản, NXB Nông Nghiệp Hà Nội – 2007 Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Trần Thạnh Phong, 2004, Nghiên cứu sản xuất chế phẩm VEM dùng trong nuôi trồng thủy sản, tuyển tập Hội thảo toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản. Nguyễn Đình Trung, 2004, Quản lý chất lượng nước trong nuôi trồng thủy sản-water quality management for aquaculture, nhà xuất bản Nông nghiệ Vũ Thị Thứ và ctv, 2004a, Nghiên cứu sử dụng Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học Biochie xử lý nước nuôi thủy sản, tuyển tập Hội thảo toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản. Vũ Thị Thứ và cộng sự, 2004b, Lên men chế phẩm sinh hoc BioF và ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản, tuyển tập Hội thảo toàn quốc về NC&ƯD KHCN trong nuôi trồng thủy sản Tăng Thị Chính, Đặng Đình Kim, Sử dụng chế phẩm sinh học trong nuôi tôm cao sản, Viện Công nghệ môi trường, Viện KH&CN Việt Nam. Đỗ thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Huy Dũng, Nguyễn Thị Muội, Bệnh học thủy sản, NXB Nông Nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh - 2004 (Tr 117-118). Đỗ Văn Khương và ctv, 2001. Tài liệu Tiếng Anh: Wongsumnuk, S. and S. Maneewongsa, 1976. Biology and artificial propagation of seabass Lates calcarifer Bloch. Report on the First Mangrove Ecology Workshop. Vol. 2, No. 3. pp. 645–664. “Standard Methods for the Examination of water and wastewater” của nhiều tác giả thuộc các Hiệp Hội Về Sức Khỏe Cộng Đồng, Hiệp Hội Nghiên Cứu Về Nước Và Môi Trường Nước của Mỹ. Physical & Chemical Analysis of Fresh Waters, H L Golterman, R S Clymo và M A M Ohnstad Standard Methods, 19th Edition, 1995. Tài liệu trên website: Đặng quốc bảo. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm Ch 104 Ch 102 Ch 201 Hỗn hợp Đối chứng Đối chứng Ch 102 Ch 104 Ch 201 Hỗn hợp Đối chứng Hỗn hợp Ch 201 Ch 104 Ch 102 Phụ lục 2: Thành phần môi trường TSB (Tryptic Soy Broth): Trypticase peptone 17g Phytone peptone 3g NaCl 5g K2HPO4 2.5g Glucose 2.5g Nước cất 1lít Phụ lục 3: Cách pha hóa chất Pha hóa chất đo NH3-N: - Dung dịch phenol: hòa tan 11 ml phenol vào cồn 950, sau đó định mức thành 100 ml. - Dung dịch natri nitropruside: hòa tan 1g natri nitropruside vào 200 ml nước đã loại ion. Trữ trong chai nâu. Dung dịch ổn định trong 1 tháng. - Dung dịch Citrate kiềm: hòa tan 100g citrate kiềm và 5g NaOH vào 500ml nước đã loại bỏ ion. Dung dịch này ổn định rất lâu. - Dung dịch Natri hypochlorite 1.5N: có bán sẵn. Ổn định trong 2 tuần. - Dung dịch oxy hóa: trộn dung dịch citrate kiềm và dung dịch natri hypochlorite với nhau theo tỉ lệ 4:1. Trữ trong chai đóng nắp chặt. Dung dịch được chuẩn bị trước mỗi lần đo. Pha hóa chất đo NO2-N: - Nước cất loại nitrite: thêm 1 ml H2SO4 đặc vào 0.2 ml dung dịch MnSO4 (36.4g MnSO4.2H2O pha vào 100 ml nước cất) vào mỗi lít nước cất. Tạo màu hồng với 3 ml dung dịch KmnO4 (400 mg/l nước cất). - Dung dịch Sunfanilamide: hòa tan 5g sunfanilamide vào 300 ml nước cất loại nitrite và 50 ml HCl đặc. Khuấy đều và định mức thành 500 ml bằng nước cất loại nitrite. Dung dịch này có thể sử dụng trong vài tháng. - NED: hòa tan 0.5g amine trong 500 ml nước cất loại nitrite, dung dịch được bảo quản trong chai nâu, tránh ánh sáng. Dung dich này cần thay mới khi màu nâu mất. Pha hóa chất đo COD: - Dung dịch NaOH 25%: pha 20g NaOH vào nước cất và định mức thành 100 ml. - Dung dịch KMnO4 0.01N: cân 0.316g KMnO4 cho vào nước cất nóng và định mức thành 1 lít. - Dung dịch H2SO4 25%: pha 25 ml H2SO4 đậm đặc vào nước cất và định mức thành 100 ml. - Dung dịch KI 10%: hòa tan 10g KI vào nước cất và định mức 100 ml. - Dung dịch Na2S2O3 0.01N: hòa 100 ml dung dịch Na2S2O3 0.1N trong nước cất và định mức thành 1 lít. Phụ lục 4: Số liệu đo NH3-N bể ương ấu trùng: Tuần tuổi Ch 102 Ch 104 Ch 201 Hỗn hợp Đối chứng 1 0.135 0.125 0.169 0.137 0.108 2 0.477 0.525 0.479 0.431 0.557 3 0.320 0.407 0.441 0.370 0.514 4 0.222 0.226 0.201 0.200 0.309 Phụ lục 5: Số liệu đo NH3-N hệ thống môi trường: Tuần tuổi Ch102 Ch104 Ch201 Hỗn hợp Đối chứng 1 1.039 1.044 1.029 1.038 1.013 2 1.030 0.995 0.932 0.907 0.856 3 0.122 0.078 0.202 0.208 0.137 4 0.012 0.010 0.011 0.012 0.009 Phụ lục 6: Số liệu đo NO2-N bể ương ấu trùng: Tuần tuổi Ch 102 Ch 104 Ch 201 Hỗn hợp Đối chứng 1 0.007 0.007 0.007 0.006 0.007 2 0.008 0.007 0.006 0.009 0.009 3 0.001 0.001 0.007 0.004 0.002 4 0.042 0.045 0.052 0.077 0.041 Phụ lục 7: Số liệu đo NO2-N hệ thống môi trường: Tuần tuổi Ch102 Ch104 Ch201 Hỗn hợp Đối chứng 1 0.028 0.027 0.025 0.023 0.026 2 0.049 0.048 0.035 0.051 0.031 3 0.351 0.348 0.336 0.332 0.337 4 0.347 0.351 0.347 0.352 0.343 Phụ lục 8: Số liệu đo COD hệ thống môi trường: Tuần tuổi Ch102 Ch104 Ch201 Hỗn hợp Đối chứng 1 1.3 1.0 2.0 1.3 1.3 2 1.0 1.7 2.3 1.7 1.0 3 4.0 3.3 4.3 2.7 2.7 4 6.0 6.7 7.3 6.0 6.3 Phụ lục 9: Xử lý thống kê NH3-N-cá a. Analysis of Variance for ABC.Ket_qua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:ABC.Tuan 1.2113743 3 .4037914 26.395 .0000 B:ABC.Nghiem_thu .1199959 4 .0299990 1.961 .1142 RESIDUAL .7955008 52 .0152981 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 2.1268710 59 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. b. Multiple range analysis for NH3-N .Ket_qua by NH3-N.Tuan -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 15 .1349333 X 4 15 .3324000 X 3 15 .3331333 X 2 15 .5368000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.40187 0.11988 * 1 - 3 -0.19820 0.11988 * 1 - 4 -0.19747 0.11988 * 2 - 3 0.20367 0.11988 * 2 - 4 0.20440 0.11988 * 3 - 4 0.00073 0.11988 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. c. Multiple range analysis for NH3-N.Ket_qua by NH3-N.Nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Hon hop 12 .2847500 X Ch102 12 .2885000 X Ch104 12 .3289167 X Doi chung 12 .3717500 X Ch201 12 .3976667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits Ch102 - Ch104 -0.04042 0.14270 Ch102 - Ch201 -0.10917 0.14270 Ch102 - Hon hop 0.00375 0.14270 Ch102 - Doi chung -0.08325 0.14270 Ch104 - Ch201 -0.06875 0.14270 Ch104 - Hon hop 0.04417 0.14270 Ch104 - Doi chung -0.04283 0.14270 Ch201 - Hon hop 0.11292 0.14270 Ch201 - Doi chung 0.02592 0.14270 Hon hop - Doi chung -0.08700 0.14270 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 10: Xử lý thống kê NO2-cá a. Analysis of Variance for NO2-N.Ket_qua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:NO2-N.Tuan .0233964 3 .0077988 63.594 .0000 B:NO2-N.Nghiem_thu .0008004 4 .0002001 1.632 .1802 RESIDUAL .0063769 52 1.22633E-004 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) .0305737 59 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. b. Multiple range analysis for NO2-N.Ket_qua by NO2-N.Tuan -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 15 .0031333 X 1 15 .0066667 X 2 15 .0079333 X 4 15 .0513333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.00127 0.01073 1 - 3 0.00353 0.01073 1 - 4 -0.04467 0.01073 * 2 - 3 0.00480 0.01073 2 - 4 -0.04340 0.01073 * 3 - 4 -0.04820 0.01073 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. c. Multiple range analysis for NO2-N.Ket_qua by NO2-N.Nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Ch102 12 .0144167 X Doi chung 12 .0148333 X Ch104 12 .0149167 X Ch201 12 .0180833 X Hon hop 12 .0240833 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits Ch102 - Ch104 -0.00050 0.01278 Ch102 - Ch201 -0.00367 0.01278 Ch102 - Hon hop -0.00967 0.01278 Ch102 - Doi chung -0.00042 0.01278 Ch104 - Ch201 -0.00317 0.01278 Ch104 - Hon hop -0.00917 0.01278 Ch104 - Doi chung 0.00008 0.01278 Ch201 - Hon hop -0.00600 0.01278 Ch201 - Doi chung 0.00325 0.01278 Hon hop - Doi chung 0.00925 0.01278 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 11: Xử lý thống kê NH3-N môi trường a. Analysis of Variance for NH3-N.Ket_qua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A: NH3-N.Tuan 12.575332 3 4.1917773 586.428 .0000 B: NH3-N.Nghiem_thu .016012 4 .0040030 .560 .6927 RESIDUAL .3716954 52 .0071480 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 12.963039 59 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. b. Multiple range analysis for NH3-N.Ket_qua by NH3-N.Tuan -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 4 15 .0106000 X 3 15 .1494000 X 2 15 .9440667 X 1 15 1.0323333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 0.08827 0.08194 * 1 - 3 0.88293 0.08194 * 1 - 4 1.02173 0.08194 * 2 - 3 0.79467 0.08194 * 2 - 4 0.93347 0.08194 * 3 - 4 0.13880 0.08194 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. c. Multiple range analysis for HIHI.Ket_qua by HIHI.Nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung 12 .5037500 X Ch104 12 .5315833 X Hon hop 12 .5412500 X Ch201 12 .5434167 X Ch102 12 .5505000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits Ch102 - Ch104 0.01892 0.09754 Ch102 - Ch201 0.00708 0.09754 Ch102 - Hon hop 0.00925 0.09754 Ch102 - Doi chung 0.04675 0.09754 Ch104 - Ch201 -0.01183 0.09754 Ch104 - Hon hop -0.00967 0.09754 Ch104 - Doi chung 0.02783 0.09754 Ch201 - Hon hop 0.00217 0.09754 Ch201 - Doi chung 0.03967 0.09754 Hon hop - Doi chung 0.03750 0.09754 -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. Phụ lục 12: Xử lý thống kê NO2-N môi trường a. Analysis of Variance for NO2-N.Ket_qua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A: NO2-N.Tuan 1.4471460 3 .4823820 4709.995 .0000 B: NO2-N.Nghiem_thuc .0008813 4 .0002203 2.151 .0875 RESIDUAL .0053257 52 1.02417E-004 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 1.4533529 59 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. b. Multiple range analysis for NO2-N.Ket_qua by NO2-N.Tuan -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 15 .0258667 X 2 15 .0427333 X 3 15 .3409333 X 4 15 .3483333 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.01687 0.00981 * 1 - 3 -0.31507 0.00981 * 1 - 4 -0.32247 0.00981 * 2 - 3 -0.29820 0.00981 * 2 - 4 -0.30560 0.00981 * 3 - 4 -0.00740 0.00981 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. c. Multiple range analysis for NO2-N.Ket_qua by NO2-N.Nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung 12 .1844167 X Ch201 12 .1859167 X Hon hop 12 .1896667 X Ch104 12 .1935833 X Ch102 12 .1937500 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits Ch102 - Ch104 0.00017 0.01168 Ch102 - Ch201 0.00783 0.01168 Ch102 - Hon hop 0.00408 0.01168 Ch102 - Doi chung 0.00933 0.01168 Ch104 - Ch201 0.00767 0.01168 Ch104 - Hon hop 0.00392 0.01168 Ch104 - Doi chung 0.00917 0.01168 Ch201 - Hon hop -0.00375 0.01168 Ch201 - Doi chung 0.00150 0.01168 Hon hop - Doi chung 0.00525 0.01168 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 13: Xử lý thống kê COD môi trường a. Analysis of Variance for COD.Ket_qua - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A: COD.Tuan 250.93333 3 83.644444 23.355 .0000 B: COD.Nghiem_thu 10.43333 4 2.608333 .728 .5767 RESIDUAL 186.23333 52 3.5814103 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 447.60000 59 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. b. Multiple range analysis for COD.Ket_qua by COD.Tuan -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 15 1.4000000 X 2 15 1.5333333 X 3 15 3.4000000 X 4 15 6.4666667 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits 1 - 2 -0.13333 1.83424 1 - 3 -2.00000 1.83424 * 1 - 4 -5.06667 1.83424 * 2 - 3 -1.86667 1.83424 * 2 - 4 -4.93333 1.83424 * 3 - 4 -3.06667 1.83424 * -------------------------------------------------------------------------------- denotes a statistically significant difference. c. Multiple range analysis for COD.Ket_qua by COD.Nghiem_thuc -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Tukey HSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- Doi chung 12 2.8333333 X Hon hop 12 2.9166667 X Ch102 12 3.0833333 X Ch104 12 3.1666667 X Ch201 12 4.0000000 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference +/- limits Ch102 - Ch104 -0.08333 2.18339 Ch102 - Ch201 -0.91667 2.18339 Ch102 - Hon hop 0.16667 2.18339 Ch102 - Doi chung 0.25000 2.18339 Ch104 - Ch201 -0.83333 2.18339 Ch104 - Hon hop 0.25000 2.18339 Ch104 - Doi chung 0.33333 2.18339 Ch201 - Hon hop 1.08333 2.18339 Ch201 - Doi chung 1.16667 2.18339 Hon hop - Doi chung 0.08333 2.18339 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.