Đồ án Công nghệ cố định enzym và ứng dụng

~ i ~ ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM    BK TP HCM ĐỒ ÁN MÔN HỌC TRANG BÌA CÔNG NGHỆ CỐ ĐỊNH ENZYM VÀ ỨNG DỤNG SVTH : NGUYỄN BẢO DƢ MSSV : 60700443 GVHD : TS. TRẦN BÍCH LAM TRANG BÌA TP Hồ Chí Minh, 6/2011 Đồ án môn học ~ ii ~ NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... ...................................................................................................................................... Tp. Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2011 Chữ ký của giáo viên Đồ án môn học ~ iii ~ LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Bích Lam đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đồ án. Cảm ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Kỹ thuật Hóa Học, trƣờng Đại học Bách Khoa TpHCM đã giảng dạy nhiệt tình và truyền đạt những kiến thức quý báu của mình giúp tôi hoàn thành đồ án. Xin cảm ơn tất cả bạn bè, những ngƣời đã quan tâm, giúp đỡ tôi hoàn thành đồ án này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6/2011 Nguyễn Bảo Dƣ Đồ án môn học ~ iv ~ MỤC LỤC TRANG BÌA .......................................................................................................................... i NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN .................................................................... ii LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ........................................................................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................. vi DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ vi Chƣơng 1: TỔNG QUAN.................................................................................................. 1 1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định .................................................................... 1 1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định ...................................................................................... 2 1.2.1. Định nghĩa ...................................................................................................... 2 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định ........................................................................... 2 1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định ................................................................. 3 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym ..................................................................... 3 1.2.5. Vật liệu cố định ............................................................................................... 5 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme ............................................ 7 Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH ........................................................... 9 2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm ................................................................... 9 2.1.1. Enzym β-galactosidase ..................................................................................... 9 2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase ........................................................ 9 2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase .................................................... 9 2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase ................................... 10 2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định ......................................... 13 2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum ....................................... 13 2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) ..................................... 16 2.1.2. Enzym lipase ................................................................................................. 17 2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase ...................................................................... 17 2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase ................................................................. 17 2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase................................................... 18 2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm ................... 20 2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây ........... 20 2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ .................................................................................................... 21 2.1.3. Enzym α-galactosidase (raffinase) .................................................................. 23 Đồ án môn học ~ v ~ 2.1.3.1. Giới thiệu về enzym α-galactosidase ...................................................... 23 2.1.3.2. Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase .................................................. 23 2.1.3.3. Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase .................................. 23 2.1.3.4. Ứng dụng của enzym riffinase cố định .................................................... 26 2.2. Ứng dụng trong phân tích .................................................................................... 27 2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) .................................................. 27 2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học ............................................................. 27 2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học ...................................................... 27 2.2.1.3. Phân loại ................................................................................................ 28 2.2.1.4. Các yếu tố sinh học ................................................................................. 29 2.2.1.4.1. Enzym .............................................................................................. 29 2.2.1.4.2. Kháng thể ......................................................................................... 29 2.2.1.4.3. Vi sinh vật ........................................................................................ 30 2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) ..................................................................... 30 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa ......................................................................... 30 2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang ............................................................................. 30 2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt ............................................................................... 30 2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) ............................... 30 2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm ............................ 31 2.2.2.1. Giới thiệu ............................................................................................... 31 2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm ......................................................................... 31 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng ........................................................................ 31 2.2.2.2.2. Sự cố định enzym ............................................................................. 31 2.2.2.2.3. Điện cực ........................................................................................... 32 2.2.2.2.4. Thử nghiệm ...................................................................................... 32 2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng ........................................................................... 33 2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH ................................................................... 33 2.2.2.2.7. Xác định giá trị Km và Vmax ................................................................ 34 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định ............................................................ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................... 36 Đồ án môn học ~ vi ~ DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Mô hình biosensor .............................................................................................. 27 Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định ..... 32 Hình 2.3: Đƣờng hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học .............................................................................. 33 Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L ..................................................................................................................... 34 Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL .................................................... 34 Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L- GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U .......... 35 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Ƣu – Nhƣợc điểm của các phƣơng pháp cố định enzyme ...................................... 4 Bảng 2.1: Tóm tắt các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase ................................... 13 Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau .................................. 15 Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase .......................... 18 Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 1 ~ Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Lịch sử phát triển của enzym cố định [1] - Năm 1916, Nelson và Griffin quan sát và cho thấy rằng enzym invertase của nấm men (EC.3.2.1.2.6) khi hấp thụ vào than có khả năng thủy phân đƣờng saccharose. Sau đó trên thế giới xuất hiện nhiều báo cáo về khả năng cố định enzym bằng liên kết đồng hóa trị trên chất mang. Trƣớc năm 1953 chƣa có một nghiên cứu nào về enzym không hòa tan đƣợc ứng dụng vào thực tế. - Năm 1953, Grubhofer và Schleith đã cố định đƣợc một số enzym nhƣ carboxy peptidase, diastase, pepsin và ribonuclease trên polyaminostyrene bằng liên kết đồng hóa trị và các nghiên cứu trên mới bắt đầu thử nghiệm ứng dụng qui mô pilot. - Năm 1954, Chang đã tạo ra đƣợc các vi tiểu cầu bán thấm có gắn enzym để chống lại dị ứng khi đƣa enzym vào cơ thể. - Năm 1963, Bernfeld và Wan đã thí nghiệm thành công việc nhốt các enzym nhƣ amylase, trypsin, papain, ribonuclease vào gel polyacrylamide. - Năm 1964, Quiociio và Richards đã mô tả phƣơng pháp liên kết chéo cố định carboxy peptidase A với glutaraldehyde. Cũng trong năm này Chang đã triển khai phƣơng pháp tạo vi nang để nhốt enzym carbonic anhydrase. - Năm 1969, Wilson đã xây dựng thành công xƣởng thực nghiệm để sản xuất glucose bằng glucoamylase cố định. - Năm 1969, Chibata và những ngƣời cộng tác ở công ty Tanabe Seiyaku – Nhật đã là những ngƣời đầu tiên thực hiện thành công việc áp dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. Theo phƣơng pháp cố định enzym của các tác giả ngƣời Nhật, enzym aminoacylase của nấm sợi đã đƣợc gắn vào DEAE-sephadex thông qua liên kết ion và sử dụng chúng cho các quá trình thủy phân. - Năm 1970, Mosbach đã tiến hành cố định ba loại enzym: -galactosidase, hexokinase, glucophosphatase bằng liên kết cộng hóa trị với các hạt sephadex. - Năm 1971, Gregoriadis đã triển khai liposome có chứa amyloglucosidase. - Năm 1973, Chibata và các cộng tác viên cũng là những ngƣời đầu tiên thành công trong việc cố định tế bào vi sinh vật để sản xuất L-aspartate từ ammonium fumarate bằng gel acrylamid. Tế bào E.coli chứa trong gel có hoạt tính aspartate rất cao. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 2 ~ - Đến năm 1987, bằng công nghệ ứng dụng enzym glucoisomerase cố định, đã tiến hành sản xuất siro fructose từ glucose theo qui mô công nghiệp. Cho đến nay có khoảng 4,5 triệu tấn siro fructose đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp enzym cố định. - Ngoài sản phẩm trên, enzym cố định còn đƣợc ứng dụng nhiều trong công nghệ lên men, chống ô nhiễm môi trƣờng và cả trong y học. 1.2. Sơ lƣợc về enzym cố định 1.2.1. Định nghĩa [1] Enzym cố định có thể hiểu theo 2 nghĩa: - Nghĩa hẹp: enzym không hòa tan là enzym đƣợc đƣa vào những pha riêng rẽ, pha này có thể tách riêng với môi trƣờng dung dịch phản ứng. Pha enzym không hòa tan trong nƣớc và đƣợc gắn với các polymer ƣa nƣớc có trọng lƣợng phân tử lớn. - Nghĩa rộng: các chất xúc tác cố định là các enzym, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Nhƣ vậy, theo nghĩa rộng, enzym không hòa tan bao gồm cả enzym đƣợc cố định vào một chất mang, cả enzym có trong tế bào sống, chúng đƣợc cố định trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần. - Enzym không hòa tan hay enzym cố định thƣờng là những enzym hòa tan đƣợc gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzym từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan. 1.2.2. Đặc điểm của enzym cố định [1] Enzym cố định có đặc điểm nhƣ sau: - Hoạt tính của enzym cố định thƣờng nhỏ hơn hoạt tính của enzym tự do cùng loại. Sở dĩ có sự thay đổi hoạt tính riêng của enzym cố định là do những nguyên nhân sau:  Do ảnh hƣởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có sự khác biệt với điện tích của enzym thì khi gắn enzym vào chất mang, cấu trúc không gian của enzym có sự thay đổi ở mức độ nhất định. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà sự kết hợp giữa enzym và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cùng giảm.  Do enzym bị nhốt vào mạng lƣới hoặc bị liên kết bởi chất mang khiến cho sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất bị kém đi. - Enzym cố định hoàn toàn tuân theo định luật Michaelis – Menten nhƣng có một số sai khác nhất định:  Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzym và chất mang. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 3 ~  Xảy ra hiện tƣợng cản trở khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm giảm tốc độ phản ứng. - Enzym cố định thƣờng có tính bền nhiệt hơn enzym tự do nhờ có tác dụng che chở của chất mang. - Enzym cố định thƣờng có pH tối ƣu không trùng với enzym tự do cùng loại. - Enzym cố định do có chất mang che chắn nên đƣợc bảo vệ tốt hơn enzym tự do. - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần và dễ dàng tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzym cố định cao hơn enzym tự do. 1.2.3. Ƣu nhƣợc điểm của enzym cố định [1] Ưu điểm: - Enzym cố định có thể tái sử dụng nhiều lần trong thời gian dài. - Enzym cố định không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzym, do đó nó không gây ảnh hƣởng xấu đến chất lƣợng sản phẩm, hay nói cách khác chúng ta không tốn chi phí cho việc tách enzym ra khỏi sản phẩm. - Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang – enzym ra khỏi dung dịch cơ chất. - Enzym cố định tƣơng đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn enzym tự do. - Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phƣơng pháp liên tục. Nhược điểm: - Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzym. - Trong đa số trƣờng hợp, enzym có thể bị giảm hoạt mất hoạt tính sau quá trình cố định. - Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với những lợi ích mà enzym cố định mang lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố định enzym cũng nhƣ ứng dụng enzym cố định vào sản xuất công nghiệp. 1.2.4. Các phƣơng pháp cố định enzym [1] Các phƣơng pháp cố định enzym đƣợc chia thành 2 nhóm: hóa học và vật lý. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 4 ~ Bảng 1.1: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố định enzyme [1] Phƣơng pháp hóa học Phƣơng pháp Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị Liên kết giữa enzym và chất mang là liên kết bền, do đó hạn chế tối đa sự mất mát enzym trong quá trình phản ứng. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định. Phƣơng pháp gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị Tạo đƣợc liên kết rất bền trƣớc các tác nhân pH, nhiệt độ… Thƣờng đƣợc dùng phối hợp với các phƣơng pháp khác. Chi phí cao, thao tác thực hiên tƣơng đối phức tạp. Hoạt tính enzym có thể bị giảm do những biến đổi về cấu trúc của enzym trong quá trình cố định. Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp Ƣu điểm Nhƣợc điểm Phƣơng pháp gắn enzym lên chất mang bằng tác nhân vật lý Thao tác thực hiện đơn giản. Điều kiện tiến hành cố định enzym ôn hòa nên không làm mất hoạt tính của enzym trong quá trình cố định. Có khả năng tái sử dụng chất mang. Do lực tƣơng tác giữa enzym và chất mang yếu nên dễ xảy ra hiện tƣợng nhả hấp phụ trong quá trình sử dụng enzym cố định do khuấy trộn hay do thay đổi nhiệt độ, pH của môi trƣờng. Phƣơng pháp nhốt enzym Thao tác đơn giản. Không đòi hỏi phải có các nhóm tạo liên kết nên phù hợp với nhiều loại enzym. Hiệu quả cố định enzym cao. Có thể cố định đồng thời nhiều enzym. Chỉ thích hợp cho phản ứng với cơ chất có khối lƣợng phân tử nhỏ. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 5 ~ Phương pháp hóa học: - Gắn enzym lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trị. - Gắn các phân tử enzym lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trị. Phương pháp vật lý: - Hấp phụ enzym lên chất mang bằng liên kết vật lý nhƣ sau: lực mao quản, liên kết ion, lực Van der Walls…. - Phƣơng pháp nhốt enzym trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể. 1.2.5. Vật liệu cố định [1] Vật liệu và phƣơng pháp cố định là hai yếu tố có tính chất quyết định đến hiệu quả của quá trình cố định enzym. Trong đó, không có đặc điểm, tính chất của vật liệu cố định nào thích hợp cho tất cả các loại enzym và cũng không có enzym nào thích hợp với tất cả các loại vật liệu cố định. Vật liệu cố định enzym và tế bào có thể chia làm hai loại: vật liệu vô cơ và vật liệu hữu cơ. Vật liệu vô cơ: - Đặc điểm: chất mang vô cơ bền với các tác động bên ngoài, không bị vi sinh vật ăn mòn, phân hủy, nhƣng việc gắn với enzym thƣờng khó khăn hơn. - Một số chất mang vô cơ thông dụng nhƣ: thủy tinh xốp, các oxid kim loại nhƣ oxid nhôm, oxid mangan, oxid magie, silicagel… Vật liệu hữu cơ: - Đặc điểm: chất mang hữu cơ thƣờng có các nhóm hoạt động hóa học nhƣ: -NH2, - COOH, -OH, -SH,… nên dễ kết gắn với enzym nhƣng độ bền với tác động của môi trƣờng không cao, đặc biệt các polymer sinh học rất dễ bị vi sinh vật xâm nhập và tấn công.  Các polymer tự nhiên: - Tinh bột là vật liệu phong phú rẻ tiền. Tinh bột dùng để đóng mạch, diethanolamin tinh bột đã đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym nhƣ lipase, glucoisomerase, trypsin, amylase. Nhƣợc điểm của tinh bột là độ trƣơng kém, thiếu các nhóm chức năng nên khả năng cố định và hoạt tính enzym còn thấp. Tinh bột thƣờng đƣợc ghép copolymer với các vinyl monomer ƣa nƣớc nhƣ acrylamide, acrylic acid để cải thiện tính chất cơ lý, độ trƣơng nở và tạo các nhóm chức năng trên bề mặt. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 6 ~ - Cellulose và dẫn xuất của cellulose là CM-cellulose, DEAE-cellulose, nitrocellulose… là những vật liệu rẻ hơn so với agarose nhƣng lại không đồng nhất, thƣờng chỉ sử dụng ở dạng sợi, và dạng tinh thể (microcrystalline). Cellulose là vật liệu đƣợc nghiên cứu cố định enzym đầu tiên, các quy trình cố định trên vật liệu này đƣợc nghiên cứu khá hoàn chỉnh. Cellulose thƣờng đƣợc dùng để hấp thụ, liên kết ion, liên kết cộng hóa trị với enzym hoặc nhốt trong gel. - Chitin là hợp chất đƣợc Braconnot phân lập từ năm 1811 và Odier đặt tên là chitin từ năm 1823. Chitin là một polymer sinh học có nhiều triển vọng trong nghiên cứu và ứng dụng làm vật liệu cố định enzym và tế bào. Chitin là một polymer sinh học rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose. - Chitin có cấu trúc tƣơng tự cellulose, là một polymer của các gốc 2-acetoamide-2- deoxy-β-D-glucoza, liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside. Chitin có trong thành phần cấu trúc vỏ của côn trùng, vỏ tôm cua, sò, vách tế bào sinh vật,…Chitin là một vật liệu có chứa nhóm chức –OH và cho liên kết với enzym, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một polymer kỵ nƣớc, độ trƣơng thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzym trên chitin, chủ yếu bằng phƣơng pháp hấp thụ và liên kết công hóa trị qua cầu nối glutaraldehyde. Chitin đƣợc tìm thấy trong thành tế bào của nấm sợi. Nó là chất hữu cơ chiếm lƣợng lớn để hình thành nên lớp vỏ ngoài của động vật không xƣơng sống (côn trùng, giáp xác…). Về mặt cấu trúc, chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt hóa học duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin đƣợc thay thế cho nhóm hydroxyl (-OH) ở cellulose. - Chitosan là dẫn xuất của chitin khi đƣợc deacetyl hóa trong kiềm mạnh. Chitosan dễ tạo màng, tạo hạt, có cấu trúc siêu lỗ, có nhóm - NH2. Chitosan có thể cố định enzym bằng phƣơng pháp hấp phụ, phƣơng pháp cộng hóa trị, hoặc nhốt enzym trong gel chitosan. Chitosan không tan trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ nhƣ acid formic, acid dipic, acid acetic. Chitosan là một polymer sinh học có trọng lƣợng phân tử cao, có các nhóm amin hoạt động, các nhóm hydroxyl có thể tham gia phản ứng hóa học. - Anginate, carrageenan, cả hai vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl2 dùng để nhốt tế bào, enzym. - Chất mang protein thƣờng là gelatin, keratin, albumin,… thƣờng có khả năng dễ tạo màng, tạo hạt, nhốt enzym trong khuôn gel với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde; nhƣợc điểm của nhóm này là thƣờng kém bền, dễ bị nhiễm khuẩn. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 7 ~  Các polymer tổng hợp: - Các polymer tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất mang cố định enzym nhƣ polyacrylamide, polyester, polyvinylalcohol, polyvinylacetate, polyacrylic, polyhydroxyethylacrylate, polystyrene,… - Ƣu điểm chung của các polymer tổng hợp này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trƣơng tốt, một số polymer có thể điều chỉnh kích thƣớc siêu lỗ. - Nhƣợc điểm là một số polymer có giá thành cao, khả năng tƣơng hợp sinh học kém, không thể phân hủy trong môi trƣờng tự nhiên nên gây ô nhiễm môi trƣờng. 1.2.6. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự cố định enzyme [1] Ảnh hưởng của chất mang - Các tính chất lý học của chất mang nhƣ tính hòa tan, tính bền cơ hóa, diện tích, tính háo nƣớc và kỵ nƣớc,…đều có ảnh hƣởng nhất định đến lƣợng enzym đƣợc liên kết, đến tính bền và hoạt tính sinh học của các chất dẫn xuất enzym không tan. - Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hƣởng đến khả năng tạo thành dẫn xuất enzym và tới khả năng chất mang hấp phụ không đặc trƣng các chất từ môi trƣờng phản ứng. - Sự định vị enzym giúp cho dẫn xuất enzym không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzym tan. - Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzym trong các dung môi, làm đứt nối liên kết hydro và liên kết kỵ nƣớc Ảnh hưởng của pH - Khi lực ion thấp thì nồng độ H+ gần chất mang tích điện âm cao hơn, còn gần chất mang tích điện dƣơng cao hơn trong dung dịch. Kết quả là pH tối ƣu của enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện âm sẽ chuyển dịch sang pH kiềm so với enzym hòa tan, trái lại nếu enzym liên kết đồng hóa trị với chất mang tích điện dƣơng thì pH tối ƣu sẽ chuyển dịch sang phía pH acid. - Khi lực ion lớn thì điện tích của chất mang đƣợc trung hòa bởi các ion trái dấu và pH tối ƣu của enzym cố định gần giống enzym hòa tan. Ảnh hưởng của enzyme - Theo Poltorak, một trong những nguyên nhân làm giảm hoạt độ của enzym cố định là sự tƣơng tác protein-protein giữa các phân tử enzym đã đƣợc liên kết. - Trong mọi trƣờng hợp đều thấy hoạt độ riêng của chế phẩm bị giảm đi cùng với sự tăng lƣợng enzym đƣợc kết hợp trên một đơn vị diện tích chất mang. Chương 1: Tổng quan Đồ án môn học ~ 8 ~ Ảnh hưởng của phương pháp cố định - Khi cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí, các enzym ít bị thay đổi cấu trúc không gian do đó ít ảnh hƣởng đến hoạt tính. Nhƣng do phƣơng pháp này sử dụng các liên kết yếu nhƣ liên kết kị nƣớc, liên kết hydro,… nên enzym dễ bị giải hấp phụ. - Khi cố định bằng phƣơng pháp liên kết cộng hóa trị sẽ có độ ổn định cao khi sử dụng dƣới các điều kiện nhƣ nhiệt độ, pH, có khả năng chống chịu cao đối với sự ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ và các tác nhân vật lí khác. Tuy nhiên, liên kết cộng hóa trị sẽ làm thay đổi mạnh mẽ cấu trúc không gian của enzym nên hoạt tính của enzym cố định thƣờng bị giảm đi đáng kể. - Khi cố định bằng phƣơng pháp bao gói, quá trình hoạt động của enzym phụ thuộc vào hai yếu tố chính là kích thƣớc chất mang polyme và trọng lƣợng của phân tử cơ chất. Hai yếu tố này sẽ làm giảm tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác. Hơn nữa, cùng với hoạt tính xúc tác cao của enzym sẽ làm xuất hiện gradient nồng độ của cơ chất và sản phẩm của dung dịch và chất mang chứa enzym cố định. Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần để ý khi thiết lập quy mô của quá trình. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 9 ~ Chƣơng 2: ỨNG DỤNG CỦA ENZYM CỐ ĐỊNH 2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm 2.1.1. Enzym β-galactosidase 2.1.1.1. Giới thiệu về enzym β-galactosidase [2] Enzym β-galactosidase (EC.3.2.1.23) là một lactase thủy phân đƣờng lactose thành các monomer là glucose và galactose. Việc sử dụng β-galactosidase để thủy phân lactose trong sữa và whey là một trong những ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và các sản phẩm từ sữa. Enzym này có thể đƣợc sử dụng dƣới dạng hòa tan hoặc dạng cố định nhƣng dạng hòa tan chỉ có thể sử dụng trong qui trình sản xuất gián đoạn, còn dạng cố định có lợi thế hơn là có thể sử dụng tốt cho cả hai qui trình sản xuất gián đoạn và liên tục. Mặc dù hầu hết các ngành công nghiệp vẫn thủy phân lactose với enzym tự do, nhƣng việc sử dụng enzym β-galactosidase cố định là một lĩnh vực đáng quan tâm vì những tiềm năng của nó. 2.1.1.2. Nguồn thu nhận enzym β-galactosidase [2] Enzym β-galactosidase có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ vi sinh vật, thực vật, và động vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym đƣợc thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự khác nhau rõ rệt. Enzym thu nhận từ nguồn thực vật và động vật có giá trị kinh tế thấp, nhƣng thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ƣu thế nhƣ dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, năng suất thu nhận sản phẩm cao. Một số vi sinh vật đƣợc xem là nguồn thu nhận tiềm năng của loại enzym này. Bacteria: Alicyclobacillus acidocaldarius subsp, Rittmannii Arthrobacter sp, Bacillus acidocaldarius, B. circulans, B. coagulans, B. subtilis, B. megaterum, B. stearothermophilus, Bacteriodes polypragmatus, Bifidobacterium bifidum, B.infantis, Clostridium acetobutylicum, C.thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans,E. cloaceae, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus,L. helviticus, L. kefiranofaciens, L. lactis, L. sporogenes, L. themophilus, L. delbrueckii, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, P. pento, Propioionibacterium shermanii, Pseudomonas fluorescens, Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophius, Sulfolobus solfatarius, Thermoanaerobacter sp.,Thermus rubus, T. aquaticus, Trichoderma reesei, Vibrio cholera, Xanthomonas campestris. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 10 ~ Fungi: Alternaria alternate, A. palmi, Aspergillus foelidis, A. fonsecaeus, A. fonsecaeus, A. Carbonarius, A. Oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F. oxysporum, Mucor meihei, M. pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, P. chrysogenum, P. expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Scopulariapsis sp, Streptomyces violaceus. Yeast: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, S. lactis, S. fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K.marxianus. 2.1.1.3. Các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase [2] Phương pháp hấp phụ vật lý Các chất vô cơ nhƣ nhôm, silic, thủy tinh xốp, đất sét, bentonite,… chất hữu cơ nhƣ cellulose, tinh bột, than hoạt tính, nhựa trao đổi ion,… đƣợc sử dụng làm chất mang hấp phụ trong cố định enzym. Hơn nữa có thể xử lí thêm với glutaraldehyde để tăng sự ổn định. Enzym β-galactosidase từ K. fragilis và K. lactis đƣợc cố định trên chitosan có hoạt độ riêng 0.9–2.2 U/mg trọng lƣợng khô của tế bào. Hoạt tính của enzym đƣợc cố định từ K. fragilis thì cao hơn nhƣng độ ổn định của enzym cố định từ A. oryzae thì cao hơn 5-14 lần tùy thuộc vào phƣơng pháp cố định. Khi dùng phƣơng pháp hấp phụ ngƣời ta nhận thấy hoạt tính cao nhất thu đƣợc khi dùng enzym từ nấm men với chất mang là Ostsorb-DEAE. Hơn nữa, sự cố định tối đa đạt đƣợc ở pH 5.5 và kết quả tối ƣu thu đƣợc khi có mặt dung dịch đệm citrate/phosphate trong suốt quá trình cố định β-galactosidase từ E. coli bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí trên chromosorb-W. Một thiết bị phản ứng mới chứa β-galactosidase từ B. circulans đƣợc cố định trên màng có gờ làm từ PVC và silica đƣợc sử dụng để thủy phân lactose trong sữa gầy. Việc cố định β-galactosidase từ Bullera singularis trên hạt Chitopearl BCW 3510 (970 GU/g nhựa) bằng phƣơng pháp hấp phụ đơn giản cũng đƣợc thực hiện. Các nghiên cứu về động học của enzym β-galactosidase từ Kluyveromces marxianus (Saccharomyces) lactis đƣợc cố định trên những chất mang khác nhau nhƣ nhôm và silica đã cho thấy rằng hoạt tính của enzym cố định phụ vào bản chất hóa học tự nhiên và cấu trúc vật lí của chất mang. Khi kích thƣớc lỗ của các hạt chất mang tăng thì hoạt tính của enzym giảm mạnh. Sự cố định β- galactosidase từ Thermus sp. diễn ra rất nhanh trên PEI-Sepabeads và DEAE-Agarose. Tuy nhiên, độ mạnh hấp phụ thì cao hơn trong trƣờng hợp của PEI- Sepabeads. Enzym β-galactosidase từ B. stearothermophilus chịu nhiệt đƣợc cố định trên chitosan sử dụng Tris (hydroxymethyl) phosphine (THP) và glutaraldehyde dùng để thủy phân đƣờng lactose trong sữa. Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính của enzym β-galactosidase đƣợc cố định Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 11 ~ trên THP thì vƣợt trội hơn so với enzym tự do và enzym đƣợc cố định bằng glutaraldehyde. Enzym β-galactosidase đƣợc cố định trên THP cho thấy hoạt tính cao hơn enzym tự do khi có mặt ion Ca2+ và ổn định trong suốt thời gian bảo quản ở 4oC trong 6 tuần, trong khi enzym tự do bị mất 31% hoạt tính trong cùng điều kiện. Hai phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm là phƣơng pháp “Response surfacemethodology” (RSM) và “Centre composite design” (CCD) đƣợc dùng để tối ƣu sự cố định enzym β-galactosidase từ Pisum sativum trên hai vật liệu khung mạng: Sephadex G-75 và hạt chitosan. Hiệu suất cố định đạt đƣợc 75.66% và 75.19% tƣơng ứng với Sephadex G-75 và chitosan. Enzym β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên một chất mang rẻ tiền concanavalin A-cellulose. Chế phẩm β-galactosidase đƣợc hấp phụ và liên kết chéo bằng Concanavalin A-cellulose, giúp giữ lại 78% hoạt tính ban đầu. Nhiệt độ tối ƣu của enzym cố định tăng từ 50oC lên 60oC. Enzym cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ và liên kết chéo giữ đƣợc 93% hoạt tính sau 1 tháng bảo quản trong khi enzym tự nhiên chỉ giữ đƣợc 63% hoạt tính. Phương pháp bao gói Khung mạng sử dụng để cố định thƣờng đƣợc làm từ các nguyên liệu nhƣ Ca-alginate, agar, k-carragenin, polyacrylamide và collagen. Tuy nhiên, một vài khung mạng rắn nhƣ than hoạt tính, ceramic,… cũng có thể dùng để cố định. Các loại màng dùng để nhốt enzym đƣợc sử dụng phổ biến là nylon, cellulose, polysulfone, và polyacrylmide. Enzym β-galactosidase từ nấm sợi đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol có tính chịu nhiệt cao hơn enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50oC. Các tế bào K. bulgaricus có chứa enzym β-galactosidase đƣợc xử lí với glutaraldehyde đƣợc nhốt trong alginate sử dụng dung dịch BaCl2. Các hạt alginate thu đƣợc sau khi xử lí tiếp theo với polyethyleneimine thì đạt đƣợc độ ổn định cao. Enzym β-galactosidase của E. coli cũng đƣợc cố định trong gel polyacrylamide thông qua việc chuẩn bị các dẫn xuất liên kết chéo của enzym với bisimidoesters. Tế bào K. marxianus có chứa lactase hoạt động đƣợc nhốt trong gel calcium pectate (CPG) và trong gel calcium alginate (CAG) đƣợc làm cứng bằng polyethyleneimine và glutaraldehyde. Các tế bào đƣợc cố định trong CPG đã thủy phân hơn 80% lactose trong quá trình liên tục và bán liên tục. So sánh các phƣơng pháp cố định enzym β-galactosidase từ Thermus aquaticus cho thấy rằng việc cố định bằng liên kết chéo sau đó nhốt enzym trong hạt agarose có thể cho hiệu suất hoạt động tốt hơn. Việc nhốt enzym β-galactosidase từ A. oryzae trong gel polyvinyl alcohol lạnh xốp sẽ tăng cƣờng độ ổn định với nhiệt độ, pH, lực ion hơn so với Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 12 ~ enzym tự do. Khung dạng sợi đƣợc làm từ alginate và gelatin đƣợc bổ sung chất làm cứng là glutaraldehyde có thể giữ đƣợc 56% hoạt tính của enzym trong 35 ngày mà không có bất kì sự giảm hoạt tính. Ngƣời ta nhận thấy rằng chế phẩm β-galactosidase đƣợc liên kết chéo bằng canavalin A có thể thủy phân lactose vƣợt trội trong hàng loạt quá trình so với các chế phẩm khác vì chúng vẫn giữ đƣợc hoạt tính cao, cụ thể là giữ đƣợc 95% hoạt tính sau 7 lần sử dụng, và giữ đƣợc 93% hoạt tính sau 2 ngày bảo quản ở 4oC. Phương pháp liên kết cộng hóa trị Các phân tử enzym liên kết với chất mang thông qua các nhóm chức năng không nằm trong trung tâm hoạt động của enzym nhƣ amino, carboxyl, hydroxyl, và sulfydryl. Các nhóm chức năng trên chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa bằng cách sử dụng các chất hóa học nhƣ cyanogen bromide, carbodimide, và glutaraldehyde. Enzym từ A. oryzae đƣợc cố định trên bột nylon-6 và zeolite. Zeolite thì không lý tƣởng vì lƣợng liên kết tạo thành ít trong khi đó nylon-6 tạo ra đƣợc khung mạng ổn định. Các dẫn xuất thu đƣợc hoạt hóa bằng diazo hoặc bằng carbodiimide cho thấy hoạt tính cao nhất trong suốt quá trình cố định enzym trên thủy tinh xốp có phủ lớp glycophase. Enzym β-galactosidase từ E. coli đƣợc cố định trên gelatin sử dụng chất hoạt hóa là chromium (III) acetate và glutaraldehyde vẫn giữ đƣợc tƣơng ứng 25% và 22% hoạt tính. Enzym đƣợc cố định trên silica-alumina ổn định hơn enzym tự do ở pH acid. Các dẫn xuất β-galactosidase cố định cho thấy nhiều sự cải thiện nhƣng hoạt tính khác nhau sau khi đƣợc tạo điều kiện cho liên kết cộng hóa trị đa điểm bằng cách ủ trong dung dịch kiềm một thời gian dài, enzym đƣợc cố định trên Sepabeads-epoxy-boronic đƣợc xem là ổn định nhất. Dẫn xuất tốt nhất rất hoạt động trong việc thủy phân lactose thậm chí ở 70oC. Gần đây sự liên kết ngang của β-galactosidase trên các hạt từ tính có nguồn gốc khác nhau đƣợc thực hiện với sự có mặt của glutaraldehyde. Kết quả là hoạt tính của enzym cố định đƣợc tăng lên. Khi cố định β-galactosidase chịu nhiệt trên Sepabeads để thủy phân lactose ngƣời ta nhận thấy sự ức chế enzym do sản phẩm tạo ra giảm, điều này hữu dụng trong việc cải thiện hiệu suất hoạt động của enzym trong công nghiệp. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 13 ~ Bảng 2.1: Tóm tắt các phương pháp cố định enzym β-galactosidase Phƣơng pháp cố định Nguồn β-galactosidase Tác nhân cố định Hấp phụ vật lý K. fragilis and K. lactis A. oryzae E. coli B. circulans B. stearothermophilus A. niger K. fragilis K. lactis Chitosan Phenol-formaldehyde resin Chromosorb-W Polyvinyl chloride, Silica gel Chitosan Porous ceramic monolith Chitosan beads CPC-silica, agarose Bao gói K. bulgaricus E. coli A. oryzae Thermus aquaticus YT-1 Penicillium expansum F3 K. lactis Alginate using BaCl3 Polyacrylamide gel Nylon-6 and zeolite Agarose bead Calcium alginate Poly(vinylalcohol) hydrogel Liên kết cộng hóa trị L. bulgaricus S. anamensis E. coli K. latis A. niger A. oryzae Egg shells Calcium alginate Hen egg white Cotton fabric Magnetic polysiloxane- polyvinyl alcohol Silica 2.1.1.4. Ứng dụng của enzym β-galactosidase cố định 2.1.1.4.1. Thủy phân lactose trong sữa và lactoserum [2] Sữa đƣợc thủy phân lactose đƣợc sử dụng cho việc chế biến hƣơng liệu sữa, phô mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực phẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc. Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm tăng quá trình acid hóa, bởi vì thủy phân lactose thƣờng là bƣớc làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và hƣơng vị cho phó mat. Chất lƣợng của sữa đông lạnh và kem làm từ sữa cũng đƣợc cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó chống Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 14 ~ lại sự kết tinh đƣờng lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và làm giảm cấu trúc cát sạn. Thủy phân lactose trong whey là một ứng dụng quan trọng khác của β-galactosidase trong ngành công nghiệp chế biến sữa. Whey thủy phân và cô đặc hay whey thu đƣợc qua lọc màng có thể đƣợc sử dụng nhƣ chất tạo ngọt trong sản xuất siro rau quả đóng hợp và nƣớc giải khát. β-galactosidase từ nấm (Miles Chemie) đƣợc cố định trong gel polyvinyl alcohol đƣợc nhận thấy là bền nhiệt hơn so với enzym tự do, giữ đƣợc 70% hoạt tính sau 24h ở 50oC và 5% hoạt tính ở 60 oC. Thủy phân đƣợc 75% lactose trong 5-6h và mức độ chuyển đổi giảm 50% sau 30 lần sử dụng. Các nghiên cứu về thủy phân lactose sử dụng enzym cố định β- galactosidase (Aspergillus niger) trên nhựa phenol formaldehyde cho thấy nhiệt độ tối ƣu phụ thuộc vào thời gian thực hiện quá trình nhƣng không phụ thuộc vào nồng độ và sự chuyển đổi lactose. Enzym β-galactosidase từ A. niger thủy phân đƣợc 70% lactose trong sữa gầy ở 40oC trong 10 phút. Enzym β-galactosidase có nguồn gốc từ nấm cố định trên hydrogel đƣợc dùng để thủy phân whey, sau 7h thủy phân đƣợc 70-75% whey. Sự cố định enzym β-galactosidase từ A. niger trên silica gel đã đƣợc kích hoạt, kết quả là hầu hết các chế phẩm enzym cố định sử dụng silica gel đƣợc kích hoạt bằng TiCl3 và FeCl3 sẽ thủy phân đƣợc 81% đến 84% trong dung dịch chứa 4% lactose. Enzym β-galactosidase từ K. lactis đƣợc cố định trên CPC-silica (đã đƣợc silan hóa và kích hoạt với glutaraldehyde) và agarose (đƣợc kích hoạt bằng tác nhân cyanua) chuyển đổi đƣợc 90% lactose trong thiết bị phản ứng “packed bed minireactor”. β-galactosidase đƣợc nhốt trong gel đồng polymer hóa N-isopropylacrylamide và acrylamide có hiệu quả trong quá trình thủy phân lactose ở 5oC cho quá trình sản xuất sửa nghèo lactose. Mô hình động học sử dụng cho enzym β-galactosidase từ K. lactis cũng đƣợc khảo sát. Enzym cố định có thể hoạt động ở nhiệt độ thấp và áp dụng đƣợc cho sản xuất các sản phẩm sữa đông lạnh, ngăn chặn sự kết tinh của lactose, tăng khả năng tiêu hóa và tạo hƣơng vi cho sản phẩm sữa. Enzym β- galactosidase từ K. lactis cố định trên vải cotton sử dụng glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo đƣợc dùng để thủy phân lactose trong sữa nguyên kem và chuyển đổi đƣợc 95% lactose trong 2h trong thiết bị phản ứng gián đoạn, và khi đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị với polysiloxane-polyvinyl alcohol, sử dụng glutaraldehyde nhƣ là tác nhân liên kết chéo cho thấy độ hoạt động cao hơn và độ ổn định nhiệt cao hơn so với enzym hòa tan. Vì thế enzym này đƣợc sử dụng có hiệu quả trong thủy phân lactose từ sữa. β-galactosidases từ K. lactis cũng đƣợc cố định trên viên nang LentiKats polyvinylalcohol hydrogel dạng thấu kính đƣợc Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 15 ~ dụng để sản xuất D-galactose từ lactose (200 g. L−1) trong một quá trình gián đoạn vừa đƣờng hóa vừa lên men đồng thời. β-galactosidase từ A. oryzae cố định trên chất mang concanavalin A-cellulose đƣợc sử dụng để thủy phân liên tục lactose từ whey và sữa. Ngƣời ta nhận thấy rằng pH tối ƣu của enzym hòa tan và enzym cố định là 4.8 nhƣng nhiệt độ tối ƣu tăng từ 50oC lên 60oC đối với enzym cố định. Enzym cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn ở 60oC. Gần đây thiết bị phản ứng packed bed cùng với tế bào có tính thấm đƣợc nhốt trong alginate đƣợc sử dụng để thủy phân lactose trong sữa trong hệ thống liên tục, đạt hiệu suất 87.2%. β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định bằng 3 kĩ thuật khác nhau: hấp phụ trên celite, liên kết cộng hóa trị với chitosan, hoặc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo. Các chế phẩm enzym cũng đƣợc so sánh với nhau về hiệu suất cố định, đặc tính của enzym, độ ổn định, và hiệu quả tổng hợp oligosaccharide. Các enzym β-galactosidase đƣợc kết hợp lại với nhau bằng liên kết chéo đƣợc cho là có hiệu quả trong việc thủy phân lactose, đạt hiệu suất 78% trong 12h. β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên silica, hoạt tính cũng nhƣ độ ổn định của enzym đã đƣợc thẩm định, và kết quả cố định tốt nhất thu đƣợc bằng cách sử dụng glutaraldehyde nhƣ chất hỗ trợ hoạt hóa và ổn định cho enzym. Trong các phƣơng pháp xử lí whey khác nhau (vi lọc, siêu lọc, xử lí nhiệt), siêu lọc đƣợc xem là phƣơng pháp tốt nhất đối với dung dịch cơ chất để cho vào thiết bị phản ứng. Bảng 2.2: Thủy phân lactose sử dụng các kỹ thuật cố định khác nhau Nguồn VSV Tác nhân cố định Hiệu suất thủy phân Thời gian thủy phân Fungal galactosidase E. coli K. lactis K. fragilis K. lactis Fungal β-galactosidase K. marxianus A. oryzae Bacillus stearothermophilus Polyvinyl-alcohol Polyacrylamide gel Thiosulfinate/thiosulfonae Cellulose beads Cotton fabric Hydrogels Calcium alginate Concanavalin A layered calcium alginate-starch hybrid Chitosan 75% 47% 85%–90% >90% 95% 70%–75% 84.8% 89% >80% 5-6 h 6 h 2.5 h 5 h 2 h 7 h 2.5 h 3 h 2 h Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 16 ~ 2.1.1.4.2. Tổng hợp Galacto-Oligosaccharides (GOSs) [2] Bên cạnh hoạt động thủy phân, enzym β-galactosidase còn có tác dụng chuyển nhóm bằng cách thủy phân và sản xuất ra nhiều oligosaccharide, các oligosaccharide tác dụng có lợi cho các vi sinh vật có ít trong đƣờng ruột. Hơn nữa, phản ứng chuyển nhóm có thể đƣợc dùng để gắn galactose vào hợp chất hóa học khác, kết quả tạo thành galacto-oligosaccharide. Do đó cho thấy tiềm năng trong việc sản xuất các thành phần thực phẩm, dƣợc phẩm, và các hợp chất có hoạt tính sinh học khác. Các điều kiện của phản ứng chuyển nhóm galactose nên có nồng độ lactose cao, nâng nhiệt độ và giảm hoạt độ nƣớc trong môi trƣờng phản ứng. Nhiệt độ, nồng độ cơ chất và nguồn gốc enzym đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp oligosaccharide. Tuy nhiên ảnh hƣởng của nồng độ lactose ban đầu thì lớn hơn. Nói chung với nồng độ lactose ban đầu càng cao thì càng nhiều galacto-oligosaccharide đƣợc tổng hợp. Nhiệt độ cao cũng có thể làm tăng hiệu suất tổng hợp oligosaccharide. Hiệu suất cao hơn ở nhiệt độ cao hơn là một lợi thế bổ sung khi tiến hành phản ứng ở nồng độ lactose ban đầu cao. Do đó, enzym β-galactosidase nên đƣợc ổn định ở nhiệt độ cao hàm lƣợng nƣớc thấp để làm cho hoạt động chuyển nhóm galactose tăng lên. Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide bằng β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc tối ƣu hóa bởi nồng độ lactose, enzym, tỉ lệ cơ chất. Trong quá trình sản xuất gián đoạn liên tiếp galacto-oligosaccharide, hiệu quả xúc tác tăng lên 190% đối với enzym tự do trong dung dịch, và 8500g galacto-oligosaccharide trên 1g enzym đƣợc sản xuất trong 10 đợt. Enzym β- galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên Fe3O4–chitosan cho kết quả hiệu suất tổng hợp galacto-oligosaccharide cao nhất là 15,5%. Việc tổng hợp galacto-oligosaccharide sử dụng β- galactosidase từ A. oryzae cố định trên polysiloxane-polyvinyl alcohol (mPOS-PVA) đã đƣợc thực hiện. Lƣợng galacto-oligosaccharide đạt đƣợc khoảng 26% (w/v) so với lƣợng đƣờng tổng, có khoảng 55% lactose đƣợc chuyển đổi từ dung dịch có nồng độ lactose là 50% (w/v) ở pH 4,5 và nhiệt độ 40oC. Trisaccharides chiếm hơn 81% tổng lƣợng GOS đƣợc sản xuất. Việc hình thành GOS không bị ảnh hƣởng đáng kể bởi nhiệt độ và pH. Hệ thống enzym cố định dùng polyethyleneimine, glutaraldehyde, và cotton đƣợc nghiên cứu và so sánh sự sản xuất galacto-oligosaccharide trong hệ thống siêu lọc enzym tự do và hệ thống sử dụng enzym cố định. Trong quá trinh cố định sử dụng kết hợp PEI và GA, ngƣời ta nhận thấy khoảng 50% đến 90% enzym bị hoạt hóa. Hệ thống enzym tự do và enzym cố định tƣơng đƣơng cho thấy quá trình sản xuất GOS rất giống nhau, xấp xỉ 22% (w/v) và 20% (w/v) trong thời gian khoảng 15 – 17 phút, và chuyển đổi đƣợc 50% lactose. β-galactosidase tinh khiết từ Bullera singularis ATCC 24193 đƣợc cố định trên hạt Chitopearl BCW 3510 đƣợc sử dụng cho phản ứng tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOSs) Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 17 ~ từ lactose trong thiết bị phản ứng packed bed, kết quả tổng hợp đƣợc 55% GOS với năng suất 4.4 g/(L-h) hoạt động trong 15 ngày. Năng suất GOS đạt cao nhất khi nồng độ lactose ban đầu là 27% (w/w), 50% lactose đƣợc chuyển đổi với nồng độ ban đầu là 500 g/L. Trisaccharides là một sản phẩm đƣợc tạo ra nhiều nhất, chiếm hơn 70% tổng lƣợng GOS đƣợc tạo ra. β-galactosidase từ A. oryzae đƣợc cố định trên hạt chitosan tạo ra lƣợng trisaccharides cao nhất (17,3% trong tổng lƣợng đƣờng), sử dụng 20% (w/v) lactose trong vong 2h so với đối với enzym tự do và 4,6 % đối với tập hợp enzym có liên kết chéo. 2.1.2. Enzym lipase 2.1.2.1. Giới thiệu về enzym lipase Lipase (EC 3.1.1.3) là một họ các enzym mà trong môi trƣờng tự nhiên chúng xúc tác cho các phản ứng thủy phân chất béo. Tuy nhiên, trong các điều kiện phản ứng phù hợp lipase còn cho thấy khả năng xúc tác các phản ứng ester hóa, chuyển ester và phản ứng alcoholysis [4]. Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzym đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzym lipase trong ngành công nghiệp dầu béo. Các phản ứng sử dụng enzym lipase mang lại nhiều lợi thế hơn các phản ứng hóa học thông thƣờng. Lipase có thể sử dụng một cách có hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa. Đây là đặc điểm quan trọng bởi vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh ra nhiều sản phẩm phụ. Do đó, việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại bỏ các hợp chất màu và các sản phẩm phụ bằng cách phƣơng pháp tốn kém năng lƣợng [3]. Tuy nhiên, việc ứng dụng enzym lipase vẫn còn nhiều trở ngại do chi phí cao. Vấn đề này có thể đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng enzym cố định, khi đó enzym lipase có thể đƣợc tái sử dụng dễ dàng và qui trình sản xuất có thể đƣợc vận hành liên tục [3]. 2.1.2.2. Nguồn thu nhận enzym lipase Enzym lipase thƣơng mại thƣờng đƣợc thu nhận từ động vật (tuyến tụy hoặc dạ dày của động vật nhai lại) hoặc từ nấm sợi nhƣ (Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., Rhizomucor spp., Mucor spp. or Candida spp…). Enzym lipase từ động vật có tính đặc hiệu cao trong việc giải phóng các acid béo ở vị trí số 1 và số 3 trong phân tử triglyceride, trong khi đó các lipase từ nguồn vi sinh vật có khả năng hoạt động và tính đặc hiệu rộng hơn [5]. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 18 ~ Bảng 2.3: Nguồn VSV thu nhận enzym lipase và tính chất enzyme lipase [6] Nguồn VSV Tính chất enzym Nhiệt độ tối ƣu pH tối ƣu Bacillus acidocaldarius 70 - Bacillus sp. 50 8.0-9.0 Bacillus strin 60 8.0 Bacillus stearothermophilus 68 - Bacillus thermocatenletus 60-70 8.0-9.0 Bacillus thermoleovorans 70-75 7.5 Geobacillus sp. 70 9.0 Pseudomonas sp. 65 9.6 Pseudomonas sp. 90 11.0 Pyrobaculum calidifontis 90 - Pyrococcus furiosus 100 - Pyrococcus horikoshii 97 5.6 Pyrococcus horikoshii 95 7.0 2.1.2.3. Các phƣơng pháp cố định enzym lipase Phương pháp hấp phụ vật lí Đây là phƣơng pháp đơn giản nhất liên quan đến sự tƣơng tác bề mặt thuận nghịch giữa enzym và chất mang. Lực liên kết chủ yếu là các tƣơng tác kỵ nƣớc. Phƣơng pháp này có ƣu điểm là chi phí thấp, quá trình thực hiện đơn giản và nhanh chóng; không có sự biến đổi về mặt hóa học enzym cũng nhƣ chất mang, đây là sự cố đinh thuận nghịch. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là sự giải hấp enzym ra khỏi chất mang, sự cản trở về mặt không gian của chất mang và sự hình thành các liên kết không đặc hiệu. Các vật liệu vô cơ nhƣ than hoạt tính, silica,… và vật liệu hữu cơ nhƣ các polymer tự nhiên hoạt tổng hợp có thể đƣợc dùng làm chất mang cố định enzym lipase [7]. Lipase đƣợc hấp phụ trên chất mang kỵ nƣớc rất ổn định đối với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ. Dẫn xuất enzym lipase từ C. antarctica B cố định trên Octadecyl– Sepabead giữ đƣợc 100% hoạt tính sau khi ủ trong 200h ở 50oC và pH 7.0. Ngoài ra, dẫn xuất này còn giữ đƣợc hoạt tính đầy đủ trong thời gian dài (200h) trong dung dịch 50% dioxane ở nhiệt độ 25oC ở pH 7.0. Mặc dù đƣợc cố định bằng phƣơng pháp hấp phụ vật lí đơn giản Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 19 ~ nhƣng các dẫn xuất enzym lipase này có tính ổn định nhiệt hơn các dẫn xuất đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị và các enzym tự do trong dung dịch [8]. Phương pháp liên kết cộng hóa trị Phƣơng pháp này dựa trên liên kết công hóa trị giữa chất mang và một vài nhóm chức năng của amino acid trên bề mặt của enzym. Chất mang thƣờng đƣợc hoạt hóa trƣớc bằng các hợp chất đặc biệt làm cho các nhóm chức năng trở nên ái điện tử mạnh, các nhóm này sau đó phản ứng với các nhóm ái nhân mạnh của enzym. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tạo đƣợc các liên kết bền vững và sự cố định đạt đƣợc sự ổn định cao. Nhƣợc điểm của phƣơng pháp này là chi phí cao và hiệu suất cố định thấp. Bên cạnh đó, cấu trúc và hoạt tính của enzym bị ảnh hƣởng mạnh bởi các liên kết cộng hóa trị [7]. Lipase đã đƣợc cố định thành công trên nhiều chất mang khác nhau nhƣ chitosan, agarose, và các polypeptide kỵ nƣớc sử dụng carbodiimide làm tác nhân hoạt hóa nhóm carboxyl của chất mang khi cố định enzym lipase từ C. rugosa. Ƣu điểm của carbodiimide là có khả năng hoạt hóa cao và độc tính thấp đối với enzym [9]. Nhóm carboxyl của -PGA (Poly(-glutamic acid)) đƣợc hoạt hóa bằng cách phản ứng với carbodiimide (N-(3-dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC). - PGA sau khi đƣợc hoạt hóa sẽ đƣợc cho vào dung dịch đệm có chứa lipase tự do. Việc cố định enzym lipase từ C. rugosa đƣợc thực hiện ở các thời gian và nhiệt độ khác nhau. Sau giai đoạn này enzym lipase cố định đƣợc làm lạnh khô trong máy sấy thăng hoa sau đó rửa lại vài lần bằng n-hexan. Điều kiện cố định tối ƣu đạt đƣợc ở nhiệt độ 13,3oC trong thời gian 2,3h và hoạt tính cao nhất đạt đƣợc là 1196 U/g-chất mang [9]. Lipase từ Candida Antarctica cũng đƣợc cố định trên agarose và chitosan, sử dụng các chất hoạt hóa glycidol, glutaraldehyde và epichlorohydrin. Khi dùng chất mang là agarose với chất hoạt hóa glycidol đạt đƣợc hoạt tính cao nhất là 845U/g gel trong sau 72h cố định. Khi sử dung chất mang là agarose và chitosan với chất hoạt hóa là glutaraldehyde thì hoạt tính cao nhất đạt đƣợc tƣơng ứng là 1209U/g gel và 2716U/g gel sau 5h cố định. Sự ổn định nhiệt tăng đáng kể khi so sánh với enzym hòa tan, gấp 20 lần khi sử dụng agarose- glyoxyl và gấp 18 lần khi sử dụng chitosan-glutaraldehyde và gấp 21 lần khi sử dụng agarose-glutaraldehyde. Dẫn xuất tốt nhất có độ ổn định gấp 58 lần so với enzym tự do, thu đƣợc khi cố định trên chitosan đƣợc hoạt hóa qua 2 bƣớc, sử dụng glycidol và glutaraldehyde, thời gian cố định là 72h. Mức độ ổn định của dẫn xuất cố định tăng lên theo thời gian cố định, điều này cho thấy liên kết cộng hóa trị đa điểm giữa chất mang và enzym đã thực sự xảy ra [10]. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 20 ~ Phương pháp bao gói Để cố định enzym bằng phƣơng pháp nhốt có thể dùng các polyme khác nhau ở dạng hạt nhƣ là agarose, alginate và chitosan. Agarose có độ trƣơng không mong muốn trong nên enzym dễ bị rửa trôi trong môi trƣờng phản ứng và polyme này không đƣợc sử dụng. Alginate và chitosan đƣợc chuẩn bị bằng cách gel hóa sử dụng calcium chloride hoặc sodium tripolyphosphate làm tác nhân liên kết chéo. Hiệu suất cố định với chitosan và alginate tƣơng ứng là 43% và 50%. Hoạt tính của alginate thì thấp 240 ± 33 and 220 ± 26 unit/ml so với chitosan là 1110±51 và 1150±11 unit/ml tƣơng ứng với hạt ƣớt và hạt đƣợc sấy đông khô. Do đó chitosan thƣờng đƣợc chọn làm chất mang cố định enzym lipase [11]. Lipase từ C. rugosa đƣợc cố định bằng cách trộn đều với dung dịch sodium alginate, ngay sau đó hỗn hợp dung dịch đƣợc nhỏ giọt vào dung dịch CaCl2 bằng vòi phun tia, khi đó Ca-alginate dạng hạt chứa enzym đƣợc hình thành. Gel đƣợc hình thành là do có sự liên kết chéo giữa Ca2+ và alginate, do đó nồng độ Ca2+ và alginate hai thông số quan trọng ảnh hƣởng đến sự cố định enzym lipase. Khi cố định nồng độ CaCl2 (50 mM), tăng nồng độ alginate (từ 1% lên 2%), tỉ lệ enzym và alginate là 1:8 thì phần trăm enzym đƣợc cố định sẽ tăng. Nếu cố định nồng độ alginate (1%) và tăng nồng độ CaCl2 (từ 50mM lên 300mM) thì phần trăm enzym đƣợc cố định dƣờng nhƣ không đổi. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ alginate thì hoạt độ riêng của enzym cố định sẽ giảm. Nồng độ của alginate có ảnh hƣởng nhiều đến tỉ lệ enzym đƣợc cố định và hoạt độ riêng của enzym hơn sự ảnh hƣởng của nồng độ CaCl2, do đó nồng độ alginate cần đƣợc tối ƣu hóa để hiệu suất cố định enzym đạt cao nhất [12]. 2.1.2.4. Ứng dụng enzym lipase cố định trong công nghệ thực phẩm 2.1.2.4.1. Ứng dụng lipase cố định tổng hợp các ester có hƣơng trái cây [13] Các ester có cấu tạo acid béo chuỗi ngắn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong việc tạo hƣơng cho các loại nƣớc ép trái cây, phô mai, bánh nƣớng, kẹo, đồ uống và kem. Hai ester tạo mùi loại này (n-butyl acetate và n-propyl acetate) đƣợc tổng hợp bằng enzym thông qua phản ứng chuyển ester của vinyl acetate với hai rƣợu tƣơng ứng là n-butanol và n-propanol. Hai ester này có mặt trong tự nhiên ở nhiều loại trái cây khác nhau nhƣ táo, dâu tây, lê,… Lipase từ Rhizopus oligosporus NRRL 5905 đƣợc cố định trên silica gel sử glutaraldehyde làm tác nhân liên kết chéo dùng để tổng hợp ester. Hiệu suất tạo thành n-butyl acetate và n-propyl acetate tƣơng ứng là 50% và 56% đạt đƣợc sau 24h ở nhiệt độ ở 30oC với nồng độ enzym là 25%(w/v). Enzym lipase cố định có thể đƣợc sử dụng trong 3 chu kỳ mà vẫn giữ đƣợc 100% hiệu suất tổng hợp ester. Giá tri Km và Vmax đƣợc xác định là 227mM và 322 µmol/(g.h) đối với n-butyl acetate và 222mM và 385 µmol/(g.h) đối với n-propyl acetate. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 21 ~ Trong phản ứng sử dụng xúc tác là enzym cố định, tồn tại hệ thống xúc tác hai pha do sự không hòa tan của enzym trong hỗn hợp phản ứng dẫn đến hạn chế sự truyền khối trong hệ thống phản ứng. Để quan sát ảnh hƣởng của sự hạn chế truyền khối ngƣời ta tiến hành thí nghiệm ở các tốc độ khuấy khác nhau từ 50 đến 300 rpm, qua đó nhận thấy hiệu suất tổng hợp đạt cao nhất khi tốc độ khuấy là 200 rpm. Để khảo sát ảnh hƣởng nồng độ enzym đối với việc tổng hợp ester ngƣời ta tiến hành phản ứng với nồng độ enzym từ 2.5% (w/v) (1.5U/ml) đến 30% (w/v) (18U/ml) và cố định các thông số khác của hỗn hợp phản ứng. Sau 24h phản ứng hiệu suất tổng hợp lần lƣợt là 50% và 56% tƣơng ứng với n-butyl acetate và n-propyl acetate với nồng độ enzym là 25% (w/v) (15 U/ml). Khi tăng lƣợng enzym thì tốc độ phản ứng không tăng thêm, điều này có thể giải thích là do thiếu cơ chất để kết hợp với trung tâm hoạt động và khó duy trì độ bền của hệ huyền phù chất xúc tác khi nồng độ enzym cao hơn. Sự ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc ban đầu đến hiệu suất phản ứng cũng đƣợc kiểm tra bằng cách thêm nƣớc từ 2%-20% (v/v) vào hỗn hợp phản ứng. Hiệu suất phản ứng cao nhất đạt đƣợc khi không có mặt nƣớc là 10% đối với n-butyl acetate và 13% đối với n-propyl acetate. Trong khi đó hiệu suất sẽ giảm khoảng 5% khi hàm lƣơng nƣớc là 20%. Khi tăng nhiệt độ từ 30oC lên 50oC thì tốc độ phản ứng tăng, qua giá trị 50oC thì tốc độ phản ứng giảm xuống. Với n-butyl acetate tốc độ phản ứng tăng từ 217 đến 410 µmol/(g.h) và tăng từ 298 đến 529 µmol/(g.h). 2.1.2.4.2. Ứng dụng enzyme lipase cố định để sản xuất liên tục monoacylglycerol từ olein dầu cọ [14] Monoacylglycerols (MAG) đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ là chất nhũ hóa trong các ngành công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm là chất tạo nhũ cho các loại bánh, sản phẩm sữa và các loại nƣớc sốt… Hiện nay, MAG đƣợc sản xuất trên qui mô công nghiệp bằng cách thủy phân liên tục chất béo ở nhiệt độ cao (220–250oC), sử dụng chất xúc tác vô cơ trong môi trƣờng khí Nitơ. Sản phẩm đƣợc sản xuất theo con đƣờng này có một số nhƣợc điểm. Một lƣợng glycerol bị hao phí do nhiệt độ phản ứng cao hơn 220oC, các sản phẩm phụ tạo gây màu sẫm và tạo mùi không mong muốn. Hơn nữa, hiệu suất tạo MAG là khá thấp. Quá trình chƣng cất phân đoạn phân tử là cần thiết vì MAG sử dụng trong công nghiệp thực phẩm cần độ tinh sạch cao, vì chúng có tính chất nhũ hóa tốt hơn các hỗn hợp các acylglycerol. Gần đây có nhiều phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu để sản xuất MAG bằng enzyme. Đây là quá trình thủy phân chọn lọc sử dụng enzyme 1,3-regiospecific lipase, sự ester hóa của các acid béo hoặc sự chuyển ester của ester của các acid béo với glycerol và quá trình glycerolysis của mỡ hoặc dầu. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 22 ~ Hiện nay, những bất lợi của việc sử dụng lipase để ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là giá cả của enzyme. Để vƣợt qua vấn đề này, lipase đƣợc sử dụng ở dạng cố định, vì phƣơng pháp này cho phép tái sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme, qua trình sản xuất liên tục cũng đƣợc thực hiện dễ dàng hơn. Phƣơng pháp cố định enzyme có thể đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp cố định vật lí hoặc hóa học trên bề mặt chất mang. Nhiều loại chất mang nhƣ calcium carbonate, Celite, nhựa trao đổi ion và Accurel đƣợc sử dụng để cố định enzyme lipase. Đặc biệt quá trình glycerolysis của dầu cọ sử dụng glycerol sử dụng lipase cố định đƣợc dùng để sản xuất MAG. Tuy nhiên, phản ứng đƣợc thực hiện trong thiết bị phản ứng gián đoạn có cánh khuấy sử dụng hệ thống pha rắn. Nhƣ vậy quá trinh sản xuất liên tục không đƣợc thực hiện. Trong các enzym lipase đƣợc có thể đƣợc sử dụng để sản xuất MAG thông qua quá trình glycerolysis của olein dầu cọ thì enzym lipase từ Pseudomonas sp. enzym có độ ổn định nhiệt cao và giá cả chấp nhận đƣợc nên đƣợc chọn để thực hiện quá trình cố định. Hơn nữa lipase đƣợc cố định trên những chất mang vô cơ và hữu cơ khác nhau và nhận thấy rằng các vật liệu tạo khung mạng kị nƣớc cho hoạt tính thủy phân dầu olive cao hơn. Accurel EP100 (<200 m) là chất mang phù hợp nhất để cố định lipase PS. Trong các enzym lipase có thể đƣợc sử dụng để sản xuất MAG thông qua quá trình glycerolysis của olein dầu cọ thì enzym lipase từ Pseudomonas sp. enzym có độ ổn định nhiệt cao và giá cả chấp nhận đƣợc nên đƣợc chọn để thực hiện quá trình cố định. Hơn nữa lipase đƣợc cố định trên những chất mang vô cơ và hữu cơ khác nhau và nhận thấy rằng các vật liệu tạo khung mạng kị nƣớc cho hoạt tính thủy phân dầu olive cao hơn. Accurel EP100 (<200 m) là chất mang phù hợp nhất để cố định lipase PS. Trong hệ thống gián đoạn, hỗn hợp cơ chất đƣợc trộn với enzyme tan hoặc enzyme cố định trong thiết bị khuấy từ với vận tốc 300 vòng/phút. Trong hệ thống liên tục, hỗn hợp cơ chất đƣợc khuấy với vận tốc 300 vòng/phút bằng thiết bị khuấy từ và đƣợc đƣa vào thiết bị PBR (packed-bed reactor) hoặc CSTR bằng bơm nhu động. Quá trình phản ứng đƣợc giữ ở nhiệt độ 45oC bởi dòng nƣớc lƣu thông. Đối với thiết bị PBR, enzyme cố định (1500 mg) đƣợc nén vào cột có vỏ áo (đƣờng kính trong 0.68 cm, dài 25.0 cm). Hỗn hợp cơ chất đƣợc trộn đều và đƣợc cho vào đỉnh của cột với lƣu lƣợng 0,02 ml/phút và sản phẩm đƣợc lấy ra ở đáy cột. Với thiết bị CSTR, enzyme lipase cố định đƣợc đặt vào một cái thùng hình trụ có vỏ áo (4.5 cm ID, 6.0 cm height) và đƣợc khuấy với tốc độ 300 vòng/phút. Sản phẩm đƣợc cho vào ở đỉnh với lƣu lƣợng 0.02 ml/phút và đƣợc lấy ra ở cửa đáy của thiết bị. Lipase đƣợc cố định trên Accurel giữ đƣợc hơn 90% hoạt tính sau 24h. Khi sản xuất MAG liên tục trong thiết bị phản ứng PBR thì năng suất là 1.05×10−2 g MAG/U.ngày và Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 23 ~ hiệu suất trung bình đạt đƣợc là 14,01%, giảm nhẹ khi tăng thời gian phản ứng với. Còn khi phản ứng thực hiện trong thiết bị CSTR thì hiệu suất trung bình và năng suất tƣơng ứng là 14.34% và 1.07 × 10−2 g MAG/U.ngày. 2.1.3. Enzym α-galactosidase (raffinase) 2.1.3.1. Giới thiệu về enzym α-galactosidase [15] α-D-Galactosidase (α-D-galactoside galactohydrolase EC 3.2.1.22) có mặt rộng rãi trong VSV, thực vật và động vật. Nhìn chung, α-galactosidase thủy phân và giải phóng galactose tự do từ galactosyl-sucrose oligosaccharide trong tự nhiên nhƣ raffinose và stachyose cũng nhƣ các α-galactoside khác nhƣ galactolipid và galactoprotein. Tuy nhiên, các loài động vật cũng nhƣ con ngƣời không có khả năng tổng hợp đầy đủ α-D-Galactosidase trong hệ thống đƣờng ruột để thủy phân α-galactoside, cụ thể là các oligo- saccharide thuộc họ Raffinose trong đậu nành cũng nhƣ các loài đậu khác. Vì thế, khi vào đến ruột già các galactose-oligosaccharide này sẽ bị các vi sinh vật tại đây lên men và gây ra chứng đầy hơi. Do đó, việc loại bỏ các oligosaccharide này trong đậu nành và các loại đậu khác sẽ làm tăng giá trị dinh dƣỡng cũng nhƣ khả năng tiêu thụ các sản phẩm đậu. 2.1.3.2. Nguồn thu nhận enzym α-galactosidase [15] Enzym α-galactosidase có thể đƣợc thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau nhƣ động vật, thực vật và vi sinh vật. Trong đó enzym thƣơng mại thƣờng đƣợc sản xuất từ hai nguồn: hạt cà phê còn xanh (green coffee bean) và Aspergillus niger. Ngoài ra, ngƣời ta cũng nghiên cứu thu nhận α-galactosidase từ các loài vi sinh vật nhƣ: Thermus sp. T2, Gibberella fujikuroi, Bacillus stearothermophilus, Streptomyces griseoloalbus, Streptomyces griseoloalbus, Penicillium sp., Talaromyces flavus, Thermomyces lanuginosus,… 2.1.3.3. Cách phƣơng pháp cố định enzym α-galactosidase Cố định α-galactosidase bằng phương pháp bao gói Enzym α-galactosidase từ Aspergillus oryzae đƣợc cố định theo phƣơng pháp Ates và Mehmetoglu. 4 ml dung dịch sodium alginate (3.75%) đƣợc trộn với 1 ml dung dịch enzym để tạo thành một dung dịch đồng nhất chứa 3% alginate. Hỗn hợp sau đó đƣợc tạo giọt bằng cách nhỏ giọt bằng kiêm tiêm vô trùng vào dung dịch CaCl2 0,2M ở 4 oC để tạo hạt. Các hạt này đƣợc làm cứng trong dung dịch CaCl2 trong 2h. Các hạt hình cầu tạo thành đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất và đƣợc bảo quản trong dung dịch đệm acetate 0,2M (pH 4.8) ở 4oC. Glutaraldehyde đƣợc sử dụng làm tác nhân liên kết chéo để cố định enzym α-galactosidase. Hạt calcium alginate đƣợc xử lí trong 3 phút trong 5ml với 1% glutaraldehyde. Các hạt đƣợc Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 24 ~ lọc và rửa bằng nƣớc vô trùng sau đó bảo quản ở 4oC cho đến khi đem ra sử dụng. Enzym α- galactosidase đƣợc cố định trong gel alginate 3% bị mất 54,5% hoạt tính so với enzym tự do. Kmax và Vmax của enzym cố định với cơ chất là raffinose là 5.5mM và 0.15Uml −1 . Nhiệt độ tối ƣu của enzym cố định là 57oC và pH tối ƣu là 4,5. Enzym hòa tan giữ đƣợc 92% và 88% hoạt tính sau 8h và 12h, trong khi đó enzym cố đinh giữ đƣợc 94% và 92% [15]. Enzym α-galactosidase từ G. fujikuroi đƣợc cố định trong gel polyacrylamide theo phƣơng pháp của Thanunkul et al. 712,5 mg acrylamide và 37,5 mg N,N‟-methylene- bisacrylamide đƣợc thêm vào 10ml dung dịch enzym α-galactosidase thô. Sau đó, dung dịch đƣợc bài khí chân không và thêm 20 mg ammonium persulphate và 50 ml TEMED (NNN‟N‟-tetramethy-lethylene diamine). Sau khi polymer hóa các hạt gel thu đƣợc có chứa enzym α-galactosidase đƣợc cho qua rây 1000 µm và đƣợc rửa vài lần bằng nƣớc sạch. pH tối ƣu của enzym α-galactosidase hòa tan là 5,8, trong khi đó pH tối ƣu của enzym cố định nằm trong khoảng 5,2-5,6. Trong khoảng pH 4,0 và 6,3 enzym cố định và enzym hòa tan có hoạt tính là 90%. Hoạt tính của enzym tự do giảm về zero ở nhiệt độ 65oC, nhƣng ở nhiệt độ đó enzym cố định có hoạt tính là 50%. Nhiệt độ tối ƣu của hầu hết enzym α-galactosidase trong khoảng 37oC và 40oC. Sau 24h, enzym tự do và enzym cố định giữ đƣợc 44% và 36% hoạt tính, nhƣng sau 3 ngày thì enzym tự do chỉ giữ đƣợc 6% hoạt tính ban đầu và enzym cố định giữ đƣợc 17% hoạt tính ban đầu [16]. Cố định α-galactosidase bằng phương pháp liên kết cộng hóa trị Enzym hexameric α-galactosidase từ Thermus sp. chủng T2 (khối lƣợng phân tử 320 kDa) có hoạt tính cao trong một dãy điều kiện hoạt động rộng nhƣ pH 5.0-10.0, nhiệt độ tối ƣu xung quanh giá trị 70oC ở pH 7.0, điểm đẳng điện là 5.5 và số lƣợng phân tử Lys trên một tiểu đơn vị là 10 [17]. Liên kết cộng hóa trị đa điểm là kỹ thuật cố định đồng thời vị trí tƣơng đối một vài nhóm của enzym sử dụng chất mang rắn có các nhóm hoạt hóa và sử dụng các tác nhân liên kết chéo, điều này sẽ tăng cƣờng đáng kể tính ổn định của enzym. Các cách thức cố định có thể đáp ứng cho yêu cầu tạo thành các liên kết cộng hóa trị đa điểm: Glyoxyl agarose: đƣợc cho là một phƣơng pháp hữu ích trong việc tạo các liên kết cộng hóa trị đa điểm. Chất mang này sẽ cố định protein trực tiếp bằng ít nhất 2 điểm do sự ổn định thấp của các dạng liên kết imine giữa aldehyde và amine. Theo phƣơng pháp này, tốc độ cố định phụ thuộc vào mật độ của aldehyde trên bề mặt chất mang và mật độ Lys trên bề mặt enzym. Vì thế các phân tử enzym đƣợc cố định bằng liên kết cộng hóa trị đa điểm trƣớc hết ở các khu vực có mật độ Lys cao [17]. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 25 ~ Glutaraldehyde: là một hoạt chất mà có thể sử dụng trong nhiều phƣơng pháp khác nhau: sử dụng tiền hoạt hóa chất mang và diễn ra quá trình trao đổi ion của enzym, hoặc hấp phụ enzym trên chất mang đƣợc amin hóa và xử lí thêm enzym đã đƣợc hấp phụ với glutaraldehyde để tạo liên kết chéo giữa enzym và chất mang. Trong cả hai trƣờng hợp, cuối cùng enzym sẽ đƣợc gắn trên chất mang bởi nhóm Lys trên hầu hết các bề mặt đƣợc tích điện âm bởi vì bƣớc đầu tiên đã có sự trao đổi ion [17]. Chất mang có chứa nhóm epoxy: những chất mang này có thể phản ứng với nhiều nhóm khác nhau trên chất mang nhƣ amino, thiol, hydroxyl, imidazole, carboxylic. Tuy nhiên do khả năng phản ứng của enzym trên những chất mang này thấp nên cơ chế của quá trình cố định thông qua 2 bƣớc: trƣớc tiên là sự hấp phụ enzym trên chất mang, sau đó là sự phản ứng cộng hóa trị giữa các nhóm trên các chất mang và các nhóm epoxy trên chất mang đƣợc hấp phụ enzym [17]. Một lƣợng khoảng 10g chất mang khác nhau (Sepabeads®-EC-EP, Sepabeads®- aminoepoxy-ECHFA, glyoxyl-agarose, MANAE-agarose or MANAE-agarose preactivated with glutaraldehyde) ở dạng huyền phù trong 20ml dung dịch đệm potassium phosphate 25mM có pH 7.0 chứa 3 IU/ml enzym α-galactosidase. Trong trƣờng hợp Sepabeads®-EC- EP, enzym đƣợc ủ trong dung dịch đệm sodium phosphate 1M có pH 7.0 và khi sử dụng chất mang glyoxyl quá trình đƣợc thực hiện trong dung dịch đệm sodium carbonate 100mM có pH 10.05. Trong mọi trƣờng hợp, hệ huyền phù đƣợc khuấy nhẹ ở 25oC. Các dẫn xuất ổn định hầu hết thu đƣợc bằng cách cố định enzyme trên glutaraldehyde- agarose, và các chế phẩm enzym có hoạt tính rất cao (95%). Trong khi đó, các dẫn xuất thu đƣợc bằng cách sử dụng amino-epoxide-Sepabead thì có hoạt tính thấp hơn 10% [17]. Việc cố định α-galactosidase sử dụng glutaraldehyde và chất mang đƣợc amin hóa có thể xảy ra theo hai cách. Cách thứ nhất là sử dụng chất mang đƣợc amin hóa và đã đƣợc tiền hoạt hóa với glutaraldehyde. Cách thứ hai, trƣớc hết là hấp phụ enzym lên chất mang đã đƣợc amin hóa và sau đó xử lí với glutaraldehyde. Với cách thứ nhất, enzym chỉ trao đổi ion với chất mang, cuối cùng sẽ đƣợc xử lí với glutaraldehyde 0.5% (v/v) thì độ ổn định thu đƣợc cao hơn phƣơng pháp thứ hai. Trong khi đó, ở phƣơng pháp thứ hai, quá trình hấp phụ diễn ra nhanh và giữ đƣợc 90% hoạt tính, nhƣng việc xử lí với glutaraldehyde 0.5% sẽ không ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzyme [17]. Nhiệt độ tối ƣu của enzym tự do là 65oC ở pH 7.0, trong khi đó nhiệt độ tối ƣu của enzym cố định là 70oC. Ở 80oC, chế phẩm tối ƣu có hoạt tính còn lại gấp 2 lần hoạt tính còn lại của enzym hòa tan (72% so với 40%). Điều này cho thấy độ ổn định nhiệt của enzym cố Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 26 ~ định cao hơn enzym hòa tan. Mặt khác, pH tối ƣu của enzym hầu nhƣ không thay đổi sau khi cố định, pH tối ƣu ở 25oC là 4-5 [17]. 2.1.3.4. Ứng dụng của enzym riffinase cố định Các loại đậu đóng vai trò quan trọng trong chế độ ăn truyền thống của nhiều vùng trên thế giới do thực tế chúng có ít chất béo và là nguồn protein, xơ và các vi chất dinh dƣỡng tuyệt vời. Nguồn isoflavone trong đậu nành cũng nhận đƣợc sự chú ý với vai trò tiềm năng trong việc điều trị ung thƣ và loãng xƣơng. Hơn nữa, sữa đậu nành đƣợc xem là nguồn thay thế chi phí thấp cho sữa bò ở các nƣớc đang phát triển nhƣ là sự bổ sung các chất dinh dƣỡng không dung nạp lactose cho trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Tuy nhiên, các sản phẩm thực phẩm làm từ đậu có chứa nhiều yếu tố kháng dinh dƣỡng, một trong số đó là họ đƣờng Raffinose oligo- saccharide. Niêm mạc ruột của con ngƣời và dạ dày của các loài động vật thiếu enzym α- galactosidase cần thiết cho sự thủy phân các oligo-saccharide này. Vì thế, khi vào đến ruột già các oligo-saccharide này sẽ bị các vi sinh vật ở đây lên men và gây ra chứng đầy hơi. Do đó, việc loại bỏ các oligo-saccharide từ thực phẩm làm từ đậu nành là một yếu tố quan trọng trong việc cải thiện giá trị dinh dƣỡng của chúng. Việc thủy phân họ đƣờng raffinose có thể đƣợc tiến hành trong thiết bị phản ứng gián đoạn hay liên tục [15]. Trong thiết bị phản ứng gián đoạn, ngƣời ta tiến hành ủ enzym α-galactosidase cố định từ Aspergillus oryzae trên chất mang calcium alginate và sữa đậu nành trong thời gian khác nhau là 2, 4, 8 và 12h, cho kết quả thủy phân oligo-saccharide tƣơng ứng là 74%, 78%, 79% và 81%. Với kết quả đó ta thấy hiệu suất thủy phân trong 2h là 74% trong khi đó việc kéo dài thời gian không làm tăng đáng kể hiệu suất [15]. Quá trình loại bỏ oligo-saccharide liên tục đƣợc tiến hành trong thiết bị “fluidized bed reactor”. Ở 50oC, hiệu suất thủy phân oligo-saccharide là 90%, 78%, 74%, 52% và 35% tƣơng ứng với tốc độ dòng chảy là 40, 80, 120, 160 và 200ml.h-1. Những kết quả này cho thấy rằng với tốc độ dòng là 40ml.h-1 thì hiệu suất thủy phân đạt cao nhất là 90%. Qua đó cho thấy tốc độ dòng chảy tối ƣu là một trong những thông số quan trọng ảnh hƣởng đến hiệu quả hoạt động của thiết bị “fluidized bed reactor” [15]. Ngoài ra, enzym α-galactosidase còn đƣợc thu nhận từ G. fujikuroi và M. vinacea và đƣợc cố định trên gel polyacrylamide cho việc loại bỏ các oligo-saccharide từ đậu nành. pH của sửa đậu nành là 6.2-6.4. pH tối ƣu của α-galactosidase cố định từ G. fujikuroi là 5.2-5.6 và giữ đƣợc 90% hoạt tính ở pH 6.4. Trong khi đó pH tối ƣu của α-galactosidase cố định từ M. vinacea là 4.0-4.5, vì thế phải hạ thấp pH khi tiến hành phản ứng, nhƣng khi ở pH thấp thì Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 27 ~ làm cho protein trong sữa đậu nành bị kết tủa và làm cho sữa có vị chua. Do đó, α- galactosidase cố định từ G. fujikuroi là sự lựa chọn tốt hơn trong việc xử lí sữa đậu nành [16]. 2.2. Ứng dụng trong phân tích 2.2.1. Tổng quan về cảm biến sinh học (biosensor) 2.2.1.1. Giới thiệu về cảm biến sinh học [18] Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lƣợng hoặc bán định lƣợng đặc trƣng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi (International Union of Pure and Applied Chemistry). Cảm biến sinh học là thiết bị sử dụng các tác nhân sinh học nhƣ enzym, các kháng thể,... để phát hiện, đo đạc hoặc phân tích hoá chất. Do vậy cấu tạo của cảm biến sinh học bao gồm 3 thành phần cơ bản: thành phần hoá học, thành phần sinh học và thành phần vật lý. Hình 2.1: Mô hình biosensor 2.2.1.2. Lịch sử phát triển cảm biến sinh học [18] Giáo sƣ Leyland D.Clark đƣợc biết nhƣ là ngƣời đi tiên phong trong lĩnh vực cảm biến sinh học. Năm 1956, ông công bố bài báo đầu tiên về điện cực oxy hoá. Những năm tiếp theo ông tiếp tục thực hiện rất nhiều thí nghiệm nhằm cố gắng mở rộng khả năng hoạt động của cảm biến nhƣ phát hiện đƣợc thêm nhiều tác nhân, nâng cao độ chính xác của cảm biến. Vào năm 1962, tại hội nghị New York Academy of Science, ông đã thuyết trình một bài về cảm biến sinh học: “To make electrochemical sensors (pH, polarographic, potentiometric or conductometric) more intelligent by adding enzyme transducers as membrane enclosed sandwiches”. Cảm biến sinh học theo mô hình của D.Clark bao gồm điện cực oxy hóa, trên đó có màng giữ enzyme glucose oxidase cố định. Khi mật độ glucose trong môi trƣờng phản ứng Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 28 ~ giảm thì mật độ chất oxi hóa trên bề mặt điện cực cũng giảm một cách tƣơng ứng. Dựa trên sự thay đổi đó, Clark đã phát hiện ra sự thay đổi của nồng độ glucose trong môi trƣờng cần kiểm tra. Những năm tiếp theo, nhóm của Guilbault và Montalvo lần đầu tiên công bố chi tiết về chế tạo thành công cảm biến sinh học dựa trên điện cực chứa enzyme đo điện thế, một cảm biến đo nồng độ urê bằng điện cực chọn lọc ion NH4 + , có gắn màng cố định urease. Urea HCO - 3 + NH + 4 Năm 1975, Lubber và Opitz đã mô tả một cảm biến sợi quang (fiber-optic sensor) gắn các chất chỉ thị dùng để đo nồng độ CO2 và O2. Cũng vào năm 1975, một số vi khuẩn cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ những thành phần sinh học trên các điện cực vi sinh để đo nồng độ cồn. Năm 1975, công ty Yellow Springs Instrument (Ohio) lần đầu tiên biến ý tƣởng của Clark thành hiện thực thông qua việc thƣơng mại hóa các cảm biến sinh học. Sản phẩm đầu tiên là thiết bị phân tích glucose dựa trên hydrogen peroxide và đó cũng là cột mốc đầu tiên đánh dấu sự xuất hiện của các cảm biến sinh học trong đời sống. β- D- Glucose + O2 D – Gluconic acid + H2O2 Vào năm 1982, Shichiri và các đồng nghiệp đã báo cáo và mô tả về cảm biến “glucose in vivo”, là loại cảm biến dạng kim đầu tiên cho các xét nghiệm dƣới da. Cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học và công nghệ, đặc biệt là các ngành công nghệ vật liệu nano và công nghệ thông tin, cảm biến sinh học cũng đạt đƣợc những tiến bộ vƣợt bậc, hứa hẹn đƣa ra những vi thiết bị nhằm xác định nhanh, chính xác các loại vi khuẩn, virus gây bệnh. Các thiết bị này cũng có thể dò tìm hay phân tích lƣợng mẫu rất nhỏ (cỡ vài nM) với độ tin cậy cao. 2.2.1.3. Phân loại [19] Cảm biến sinh học có thể đƣợc phân loại dựa vào thành phần sinh học hoặc thành phần chuyển đổi của chúng. Thành phần sinh học của chúng bao gồm enzym, kháng thể, vi sinh vật, mô sinh học và bào quan. - Khi sự liên kết giữa yếu tố cảm biến và chất cần phân tích là biến cố đƣợc phát hiện (detected event) thì đƣợc gọi là cảm biến ái lực (affinity sensor). - Khi có sự tƣơng tác giữa yếu tố sinh học và chất cần phân tích và đi kèm hoặc theo sau đó là sự thay đổi nồng độ của cơ chất hoặc sản phẩm thì đƣợc gọi là cảm biến trao đổi chất (metabolism sensor). Glucose oxidase Urease Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 29 ~ - Khi tính hiệu đƣợc tạo ra sau sự liên kết của chất cần phân tích và yếu tố sinh học nhƣng không có sự thay đổi hóa học của yếu tố sinh học thì cảm biến đó đƣợc gọi là cảm biến xúc tác (catalytic sensor). 2.2.1.4. Các yếu tố sinh học 2.2.1.4.1. Enzym [19] Nhƣ đã biết enzym là protein có hoạt tính xúc tác cao và đặc hiệu cao đối với cơ chất. Chúng đƣợc sử dụng để kiểm soát và phân tích nồng độ của nhiều chất cần phân tích khác nhau. Các chế phẩm enzym có sẵn trên thị trƣờng với độ tinh khiết cao là điều kiện thuận lợi cho việc sản xuất các cảm biến sinh học dùng enzym cố định. Bên cạnh đó, hạn chế chính của các enzyme là pH, lực ion, các chất kìm hãm, nhiệt độ sẽ ảnh hƣởng đến hoạt tính của enzym. Hầu hết các enzym sẽ mất hoạt tính khi nhiệt độ trên 60oC. Các enzym sử dụng để chế tạo biosensor là các enzym oxy hóa, sử dụng oxy hòa tan và sản xuất ra hydrogen peroxide . Enzym đƣợc cố định trên bộ chuyển đổi (transducer) bằng phƣơng pháp hấp phụ, liên kết cộng hóa trị, phƣơng pháp bao gói trong khuôn gel, trong các polymer phát sinh điện hóa (electrochemically generated polymer), trong màng lipid kép (bilipid membrane) hoặc dung dịch bên trong màng chọn lọc. Enzym thƣờng đƣợc ghép thành đôi với bộ chuyển đổi điện hóa hoặc bộ chuyển đổi sợi quang học. 2.2.1.4.2. Kháng thể [19] Kháng thể có bản chất là các glycoprotein, do các tế bào lympho B cũng nhƣ các tƣơng bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất. Nhiều kháng thể đã đƣợc thƣơng mại hóa và đƣợc sử dụng rộng rãi trong xét nghiệm miễn dịch. Các kháng thể đƣợc cố định trên bề mặt bộ chuyển đổi theo phƣơng pháp liên kết cộng hóa trị sử dụng các nhóm chức nhƣ amino, carboxyl, aldehyde hoặc sulfhydryl. Các mặt hạn chế khi sử dụng kháng thể cũng giống nhƣ khi sử dụng enzym. Hơn nữa muốn tái tạo và phục hồi bề mặt bộ chuyển đổi cần phải có các điều kiện nhƣ pH thấp, lực ion lớn, chất làm sạch,… Ƣu điểm của các cảm biến kháng thể là khả năng phân tích nhanh hơn các xét nghiệm miễn dịch truyền thống. Cảm biến miễn dịch thƣờng sử dụng bộ chuyển đổi quang học hay âm học. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 30 ~ 2.2.1.4.3. Vi sinh vật [19] Việc sử dụng vi sinh vật nhƣ là yếu tố sinh học trong thiết bị cảm biến sinh học dựa trên quá trình trao đổi chất của chúng. Trong hầu hết trƣờng hợp, ngƣời ta sẽ đo sự thay đổi điện hóa học khi tế bào sử dụng oxy hoặc CO2. Tế bào vi sinh vật có lợi thế rẻ hơn so với enzym và kháng thể, có thể ổn định hơn và có thể đƣợc sử dụng trong các phản ứng phức hợp có sự tham gia của enzym và các cofactor. Tuy nhiên, phƣơng pháp này có tính chọn lọc kém hơn so với phƣơng pháp sử dung enzym, có thời gian đáp ứng, thời gian phục hồi dài hơn và đòi hỏi phải thƣờng xuyên tiến hành hiệu chỉnh. Chất mang thƣờng dùng để cố định là nylon, màng cellulose nitrate, hoặc acetyl cellulose. 2.2.1.5. Bộ chuyển đổi (transducer) 2.2.1.5.1. Chuyển đổi điện hóa [19] Bộ chuyển đổi dòng điện và bộ chuyển đổi điện áp đƣợc dùng phổ biến trong thiết bị cảm biển sinh học kiểu điện hóa. Hầu hết, các điện cực đƣợc làm bằng kim loại nhƣ bạch kim, vàng, bạc, thép không gỉ và các vật liệu bằng carbon. Những vật liệu này phải trơ ở điện thế mà phản ứng điện hóa xảy ra. 2.2.1.5.2. Chuyển đổi quang [19] Chuyển đổi quang là chuyển đổi hoạt động dựa trên các hiệu ứng nhƣ: hấp thụ ánh sáng nhìn thấy và tia UV; phát xạ huỳnh quang và lân quang; bio–luminiscence; chemi– luminiscence… Bộ chuyển đổi quang học là loại đầu dò mà trên đỉnh đƣợc cố định enzym và một chất màu (thƣờng là huỳnh quang). Những loại đầu dò này chứa ít nhất hai sợi quang. Một sợi đƣợc nối với một nguồn sáng có thể phát ra một dãy các bƣớc sóng khác nhau, một sợi đƣợc nối với một diot quang để phát hiện sự thay đổi mật độ quang ở một bƣớc sóng thích hợp. 2.2.1.5.3. Chuyển đổi nhiệt [19] Hoạt động dựa trên hiện tƣợng thay đổi entanpi khi hình thành hoặc phá vỡ các liên kết hóa học trong các phản ứng của enzyme. Bộ chuyển đổi này có ƣu điểm hoạt động tốt với tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, dạng chuyển đổi này có tính chọn lọc thấp. 2.2.1.5.4. Chuyển đổi bằng tinh thể áp điện (piezoelectric) [19] Chuyển đổi hoạt động dựa trên nguyên lý: tinh thể sẽ thay đổi tần số dao động khi lực tác dụng lên nó thay đổi. Chuyển đổi dạng này có ƣu điểm là độ nhạy cao (cỡ picogam), thời gian phản ứng nhanh, khả năng cơ động cao, có thể sử dụng đo đạc trong môi trƣờng lỏng và khí. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 31 ~ 2.2.2. Cảm biến sinh học sử dụng L-glutamate oxidase và L-glutamate dehydrogenase cố định dùng để phân tích monosodium glutamate trong thực phẩm 2.2.2.1. Giới thiệu [20] Glutamate là một amino acid đƣợc xác định là một nguồn năng lƣợng và nguồn Nitơ quan trọng cho các tế bào nhân thật và tế bào các loài động vật có vú. Nó hoạt động nhƣ là một chất dẫn truyền các kích thích thần kinh trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và đƣợc cho là chịu trách nhiệm cho một số quá trình nhƣ là học tập, trí nhớ, sự phát triển của hệ thần kinh. Việc tăng mức độ glutamate trong dịch não tủy đƣợc cho là nguyên nhân của các chứng rối loạn thần kinh nhƣ bệnh đột quỵ, bệnh Alzheimer‟s và bệnh Parkinson‟s. Ngoài ra, monosodium glutamate đƣợc sử dụng phổ biến làm chất tăng cƣờng hƣơng vi trong thực phẩm. Do đó, việc phát triển thiết bị đo lƣờng hàm lƣợng glutamate một cách nhanh chóng và đáng tin cậy là vấn đề quan trọng cần xem xét và nghiên cứu. Một vài kỹ thuật nhƣ khối phổ, điện mao dẫn, microdialysis và cảm biến sinh học đã đƣợc phát triển để phân tích glutamate. Trong số các phƣơng pháp đó, cảm biến sinh học là phƣơng pháp đƣợc quan tâm và phát triển nhanh nhất. Một vài loại cảm biến sinh học sử dụng bộ chuyển đổi dòng điện đã đƣợc chế tạo để phát hiện glutamate trong các ứng dụng khác nhau nhƣ trong chế biến thực phẩm, trong tế bào đƣợc nuôi cấy, trong dịch não ngoại bào (extracellular brain fluid). Các cảm biến sinh học này có độ nhạy và khả năng chọn lọc cao, nhƣng cần có các bƣớc xây dựng và phức hợp để chuẩn bị các điện cực enzym. Không giống với các cảm biến sinh học dạng chuyển đổi dòng điện, cảm biến sinh học loại chuyển đổi quang học đƣợc chế tạo đơn giản hơn, dễ sử dụng và phát hiện tại chỗ. 2.2.2.2. Phƣơng pháp thí nghiệm 2.2.2.2.1. Các hóa chất sử dụng [20] Enzym L-glutamate oxidase (L-GLOD) (EC 1.4.3.11, 63U/mg protein từ Streptomuces sp.), enzym L-glutamate dehydrogenase (L-GLDH) ((EC 1.4.1.3, 452U/mg protein từ Proteus sp.), NADPH, màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4 µm), dung dịch đệm và các loại dung dịch khác… 2.2.2.2.2. Sự cố định enzym [20] Ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm phosphate saline (PBS, pH 7.0) có chứa đồng thời cả hai enzym. Enzym L-GLOD và L-GLDH đƣợc trộn và sau đó đƣợc tạo liên kết chéo với màng polycarbonate. 20µl dung dịch glutaraldehyde và 25µl bovine serum albumin (BSA) đƣợc sử dụng để nâng cao hiệu suất và sự ổn định cho cảm biến. Hỗn hợp enzym đƣợc chuẩn bị với những hàm lƣợng khác nhau với L-GLDH (35–143.2U) và L-GLOD đƣợc giữ cố định Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 32 ~ ở giá trị 25U. Sau đó, 10 µl đƣợc sử dụng để cố định. Màng polycarbonate sau khi cố định đƣợc rửa sạch vài lần dung dịch PBS để loại glutaraldehyde dƣ thừa và các enzym không tạo liên kết với màng. Màng chứa enzym đƣợc bảo quản ở 4oC trong dung dịch PBS chứa trong các túi polypropylene kín khí. 2.2.2.2.3. Điện cực [20] Điện cực với đƣờng kính 1cm sử dụng dung dịch KCl là chất điện phân, điện cực dƣơng làm bằng bạc, điện cực âm làm bằng vàng. Điện cực oxy đƣợc phủ bởi một lớp polypropylene kị nƣớc (để bảo vệ điện cực trong nƣớc) chỉ cho khí thấm qua và một lớp enzym trên màng polycarbonate (kích thƣớc lỗ 0.4µm) đƣợc gắn trên điện cực bằng hệ thống “push cap”. Để phân tích, ngƣời ta sử dụng dung dịch đệm bảo hòa không khí với nồng độ oxy 7–8 ppm ở 25oC. Dung dịch đệm đƣợc loại oxy bằng dung dịch sodium sulfite. . Hình 2.2: Mô hình cảm biến sinh học phân tích MSG dùng L-GLOD–L-GLDH cố định 2.2.2.2.4. Thử nghiệm [20] Đầu dò đƣợc phân cực trong khoảng 30-40 phút mỗi lần trƣớc khi sử dụng. Việc thử nghiệm bắt đầu bằng cách thêm MSG ở các nồng độ khác nhau. Lƣợng oxy tiêu thụ đƣợc đo sau mỗi 2 phút. Để khôi phục lại độ bảo hòa oxy 100%, màng cố định enzym đƣợc rửa vài lần với PBS trƣớc khi tiến hành lần thử nghiệm tiếp theo. Sự khuếch tán oxy từ không khí làm giảm hiệu quả của quá trình thử nghiệm khi thực hiện với enzym trong dung dịch, để khắc phục vấn đề này ngƣời ta tiến hành thử nghiệm trong thiết bị phản ứng kín khí bằng thủy tinh (12mL). Ngƣời ta tiến hành thí nghiệm trong ba trƣờng hợp với các nồng độ MSG khác nhau: - : Không tái sinh cơ chất trong sự vắng mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. - :Có tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH - :Có tái sinh cơ chất trong sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 33 ~ Ngƣời ta cũng đã tiến hành tối ƣu nồng độ của NADPH và ammonium và nhận thấy giá trị đáp ứng cho sự ổn định cao nhất là 2mM NADPH và 10mM ammonium. Hình 2.3: Đường hiệu chỉnh vận tốc tiêu thụ Oxy theo nồng độ MSG của cặp L-GLOD–L- GLDH cố định trong cảm biến sinh học 2.2.2.2.5. Quá trình phản ứng [20] L-glutamate + H2O α-Ketoglutarate + NH3 (1) Phản ứng (1) xảy ra khi có mặt của MSG, quá trình tái sinh cơ chất không xảy ra khi không có mặt của NADPH, do NADPH hoạt động nhƣ là cofactor của L-GLDH. 0.1mg/L là nồng độ giới hạn có thể phát hiện của phƣơng trình (1). (2) Với sự có mặt của 2mM NADPH và MSG thì cả hai enzym cùng hoạt động và MSG đƣợc tái sinh nhƣ trong phản ứng (2). MSG đƣợc chuyển đổi thành α-ketoglutarate trong phản ứng thứ nhất và là cơ chất của phản ứng thứ (2). Việc bổ sung NADPH vào môi trƣờng phản ứng tạo điều kiện cho L- GLDH thực hiện phản ứng nghịch. Việc nhận biết L- glutamate cung cấp một sự khuếch đại và giới hạn phát hiện đƣợc xác định là 0.04mg/L. Sự khuếch đại tín hiệu cao hơn đƣợc nhận thấy khi có mặt của ammonium-một sản phẩm phụ của phản ứng (1) và giới hạn nồng độ phát hiện là 0.02mg/L. 2.2.2.2.6. Cấu hình nhiệt độ và pH [20] Cảm biến có thể hoạt động tốt trong khoảng pH 4-10 (pH dung dịch đệm citrate- phosphate: 4, 5, 6; của sodium phosphate: 7,8; của glycine–NaOH: 9, 10) đƣợc đo khi nồng L-GLOD Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 34 ~ độ của dung dịch MSG là 1.2mg/L với sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. pH tối ƣu của cảm biến là 7.0 ở nhiệt độ 25±2 oC, trong khi đó pH tối ƣu của GLDH khoảng 8.25 và pH tối ƣu của GLOD khoảng 8.0 Cảm biến cũng có thể hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ (13±2 đến 55±2 oC) đƣợc đo ở nồng độ MSG là 1.2mg/L. Cảm biến hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 25±2 oC, sau giá trị này cảm biến bị mất hoạt tính do bị vô hoạt bởi nhiệt độ. Hình 2.4: pH ở nhiệt độ 25 ± 2 ◦C có mặt 2mM NADPH và 10mM ammonium với nồng độ MSG 1.2mg/L Hình 2.5: Nhiệt độ ở pH 7.0 với nồng độ MSG 12mg/dL 2.2.2.2.7. Xác định giá trị Km và Vmax [20] Giá trị Km xác định cho cặp L-GLOD-LGLDH cũng giống nhƣ cho một mình L- GLOD. Vận tốc ban đầu của phản ứng là hàm số của nồng độ cơ chất theo động học „Michaelis-Menten‟. Km và Vmax đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lineweaver-Burk. Giá trị Km biểu kiến đƣợc xác định là 0.4451mM với sự có mặt của 2mM NADPH và 10mM ammonium. Vmax xác định đƣợc trong cùng điều kiện trên là 3.07mg/(L.min). Giá trị Km và Vmax biểu kiến trong điều kiện không tái sinh cơ chất (chỉ có L-GLOD hoạt động) tƣơng ứng là 1.9222mM và 13.245mg/(Lmin) so với Km của L-GLOD ở dạng tự do là 0.21mM. Vì thế, khi cặp L-GLOD-LGLDH đƣợc sử dụng thì giá trị Km tăng xấp xỉ 2 Chương 2: Ứng dụng Đồ án môn học ~ 35 ~ lần, khi sử dụng chỉ một mình L-GLOD thì giá trị Km tăng hơn 9 lần. Giá trị Km cao hơn thu đƣợc khi cố định enzym là do ái lực của enzym với cơ chất giảm, cũng có thể là do sự cản trở trung tâm hoạt động của enzym trong quá trình cố định. 2.2.2.2.8. Sự ổn định của màng cố định [20] Sự ổn định của màng đƣợc phân tích trong chu kì 60 ngày. Màng chứa enzym đƣợc bảo quản trong dung dịch đệm phosphate 0.2M, pH 7.0, nhiệt độ 4oC trong túi polypropylene kín khí. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện mỗi 3 ngày một lần với 0.8mg/L MSG. Màng chứa cặp enzym L-GLOD–L-GLDH vẫn giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu sau 30 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 35U và 39 ngày ứng với GLOD= 25U; GLDH= 143.2U với sự hiện diện của 2mM NADPH và 10mM ammonium. Trong khi đó, màng chỉ cố định enzym L- GLOD (25U) giữ đƣợc 80% hoạt tính ban đầu thậm chí sau 48 ngày Hình 2.6: Hoạt tính của enzym cố định trên cảm biến sinh học trong thời gian 60 ngày: L- GLOD 25U–L-GLDH 143.2U; L-GLOD 25U–L-GLDH 35U; L-GLOD 25U Trong những nghiên cứu gần đây, ngƣời ta nhận thấy rằng một lƣợng nhỏ GLDH không duy trì đƣợc hoạt tính của enzym, điều này có thể là sự vô hoạt hoặc rò rỉ enzym. Sự ổn định của biosensor trong quá trình bảo quản cao nhất khi hoạt độ của GLDH là 143.2U và của GLOD là 25U. Tài liệu tham khảo Đồ án môn học ~ 36 ~ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Wolfgang Aehale, Enzymes in Industry, Copyright © 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co.KGa, Weinheim. 2. Parmjit S. Panesar, Shweta Kumari, and Reeba Panesar, Potential Applications of Immobilized β-Galactosidase in Food Processing Industries, SAGE-Hindawi Access to Research, Enzyme Research, Volume 2010, Article ID 473137, 16 pages. 3. M.L. Foresti, M.L. Ferreira, Chitosan-immobilized lipases for the catalysis of fatty acid esterifications, Enzyme and Microbial Technology 40 (2007) 769–777. 4. Yin Hoon Chew, Lee Suan Chua, Kian Kai Cheng, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz, Chew Tin Lee, Kinetic study on the hydrolysis of palm olein using immobilized lipase, Biochemical Engineering Journal 39 (2008) 516–520. 5. K.N. Kilcawley, M.G. Wilkinson,P.F.Fox, Determination of key enzyme activities in commercial peptidase and lipase preparations from microbial or animal sources, Enzyme and Microbial Technology 31 (2002) 310–320. 6. G.D. Haki, S.K. Rakshit, Developments in industrially important thermostable enzymes: a review, Bioresource Technology 89 (2003) 17–34. 7. V . Ramachandra Murty*, Jayadev Bhat, and P. K. A. Muniswaran , Hydrolysis of Oils by Using Immobilized Lipase Enzyme: A Review, Biotechnol. Bioprocess Eng. 2002, 7: 57-66. 8. José M. Palomo, Gloria Muñoz, Gloria Fernández-Lorente, Cesar Mateo, Roberto Fernández-Lafuente∗, José M. Guisán1, Interfacial adsorption of lipases on very hydrophobic support (octadecyl–Sepabeads) immobilization, hyperactivation and stabilization of the open form of lipases, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 19–20 (2002) 279–286. 9. S.-W. Chang, J.-F. Shaw, K.-H. Yang, S.-F. Chang, C.-J. Shieh, Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(c-glutamic acid) by RSM, Bioresource Technology 99 (2008) 2800–2805. 10. Dasciana S. Rodrigues, Adriano A. Mendes, Wellington S. Adriano, Luciana R.B. Goncalves,Raquel. L.C. Giordano, Multipoint covalent immobilization of microbial lipas on chitosan and agarose activated by different methods, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 51 (2008) 100–109. Tài liệu tham khảo Đồ án môn học ~ 37 ~ 11. Seema S.Betigeri, Steven H.Neau, Immobilization of lipase using hydrophilic polymers in the form of hydrogel beads, Biomaterials 23 (2002) 3627–3636. 12. Keehoon Won, Sangbum Kim, Kwang-Je Kim, Hong Woo Park, Sang-Jin Moon, Optimization of lipase entrapment in Ca-alginate gel beads, Process Biochemistry 40 (2005) 2149–2154. 13. Paramita Mahapatra, Annapurna Kumari, Vijay Kumar Garlapati, Rintu Banerjee, Ahindra Nag, Enzymatic synthesis of fruit flavor esters by immobilized lipase from Rhizopus oligosporus optimized with response surface methodology, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 14. Wiphum Kaewthong, Sarote Sirisansaneeyakul, Poonsuk Prasertsan, Aran H-Kittikun, Continuous production of monoacylglycerols by glycerolysis of palm olein with immobilized lipase, Process Biochemistry 40 (2005) 1525–1530. 15. S.J. Prashanth, V.H. Mulimani, Soymilk oligosaccharide hydrolysis by Aspergillus oryzae-galactosidase immobilized in calcium alginate, Process Biochemistry 40 (2005) 1199–1205. 16. S. Thippeswamy, V.H. Mulimani, Enzymic degradation of raffinose family oligosaccharides in soymilk by immobilized a-galactosidase from Gibberella fujikuroi, Process Biochemistry 38 (2002) 635/640. 17. Miguel Filho, Benevides C. Pessela, Cesar Mateo, Alfonso V. Carrascosa, Roberto Fernandez-Lafuente, Jose M. Guis´ an, Immobilization–stabilization of an -galactosidase from Thermus sp. strain T2 by covalent immobilization on highly activated supports: Selection of the optimal immobilization strategy, Enzyme and Microbial Technology 42 (2008) 265–271. 18. Saraju P.Mohanty and Elias Kougianos ,Biosensors: A tutorial review. 19. Jose ´ I. Reyes De Corcuera, Ralph P. Cavalieri, Biosensors, Washington State University, Pullman, Washington, U.S.A. 20. Anjan Kumar Basu, Parimal Chattopadhyay, Utpal Roychudhuri, Runu Chakraborty, Glutamate optical biosensor based on the immobilization of glutamate dehydrogenase in titanium dioxide sol–gel matrix, , Department of Food Technology and Biochemical Engineering, Jadavpur University, Kolkata 700032, India.