Đồ án Các phương pháp tách chiết butanol

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU Do sự gia tăng liên tục giá thành của dầu thô-nguồn năng lượng chính trên thế giới hiện nay, rất nhiều đề tài nghiên cứu gần đây quan tâm đến việc phát triển các nguồn nhiên liệu mới có giá trị về mặt kinh tế và môi trường. Có thể nói nhiên liệu sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy tiềm năng hứa hẹn thay thế cho nguồn xăng dầu sắp cạn kiệt trong tương lai, đặc biệt là những nhiên liệu được sản xuất thông qua quá trình lên men từ các nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình là butanol. Hiện nay butanol thương mại được sản xuất chủ yếu từ con đường hóa dầu nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có rất nhiều triển vọng. Quá trình lên men sản xuất butanol hay còn gọi là quá trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) được thực hiện bởi giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt là loài Acetobutylicum (Lin và Blaschek, 1983). Loài vi sinh vật này được xem là lâu đời nhất trong nghành công nghiệp lên men kỵ khí bắt buộc. Nó được xếp ở vị trí thứ hai chỉ sau lên men ethanol từ nấm men Saccharomyces cerevisiae ở quy mô sản xuất. Quá trình lên men ABE được thực hiện rộng rãi trong công nghiệp đến nửa đầu thế kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ trên toàn thế giới của butanol được sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008). Tuy nhiên, với sự ra đời của Thế chiến thứ hai và sự phát triển leo thang của ngành công nghiệp hóa dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần. Đến năm 1960, hiệu quả thấp của quá trình lên men ABE so ngành công nghiệp hóa dầu cùng với các chi phí cao hơn khi sử dụng các nguồn carbohydrate làm cơ chất dẫn tới kết quả là việc đã xoá bỏ hoàn toàn các hoạt động công nghiệp từ quá trình lên men này. Tuy nhiên, khi giá dầu bắt đầu tăng từ đầu những năm 1970 do "cuộc khủng hoảng dầu thô" cùng với sự suy giảm dần về nguồn dầu và hơn nữa là sự thúc đẩy xã hội trên toàn thế giới nhận thức về các vấn đề môi trường đang trong tình trạng cấp cứu, đã làm cho con người quan tâm đến ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008). Kể từ đó, những nỗ lực nghiên cứu đáng kể về quá trình lên men ABE sản xuất butanol đã được thực hiện trong nhiều lĩnh vực, cụ thể là trong ngành công nghệ vi sinh vật, tạo ra các chủng đột biến mới nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi các điều kiện lên men nhằm cải thiện năng suất thấp và nồng độ butanol trong dịch lên men. Giống như trong mọi quá trình sinh học khác, quá trình lên men ABE thể hiện một số hạn chế về kinh tế và khả năng cạnh tranh so với các quá trình sản xuất bằng phương pháp hóa học tinh khiết. Những bất lợi chính trong trường hợp này liên quan đến con đường trao đổi chất khá phức tạp bởi các vi khuẩn sản xuất butanol. Trong một chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric, propionic và acetic trước hết được sinh tổng hợp bởi C. acetobutylicum (acidogenesis) trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của tế bào. Khi vi sinh vật bước vào giai đoạn ổn định sẽ bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol và ethanol theo tỷ lệ 3:6:1 tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.). Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis sang solventogenesis được điều khiển bằng cách thay đổi hoặc làm giảm pH ( 2 gl-1) (Gottschalk và Morris, 1981; Gottwald và Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984). Tuy nhiên, quá trình lên men trong thực tế khá phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao (Chauvatcharin et al., 1998). Trong quá trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp trong môi trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung là khá thấp thường khoảng 15% (w / w) và hiếm khi vượt quá 25% (w / w). Ngoài ra, việc sinh tổng hợp butanol còn bị giới hạn bởi nhiều yếu tố ức chế khác, trong đó butanol là yếu tố chính gây ức chế ngược lên sự tăng trưởng của tế bào làm ngừng quá trình lên men. Trong thực tế, vi khuẩn khó có thể duy trì hoạt tính khi nồng độ butanol trong dịch lên men xấp xỉ 10 gl-1. Kết quả là nồng độ butanol trong dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13 gl-1. Do đó, việc sản xuất butanol từ quá trình lên men ABE truyền thống cho hiệu quả kinh tế rất thấp. (Maddox, 1989). Nội dung bài viết này sẽ giới thiệu chung về butanol cũng như các ứng dụng của nó trong thực tiễn. Dựa trên các nghiên cứu gần đây về quá trình lên men tĩnh sản xuất butanol sẽ trình bày một số chủng Clostridium đã được phân lập có khả năng sinh tổng hợp và chịu được nồng độ butanol cao. Giới thiệu các nguồn cơ chất khác nhau mà vi sinh vật có thể sử dụng để lên men cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo butanol, qua đó có thể so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol. Trình bày một số kết quả nghiên cứu đạt được khi lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định trên một số chất mang. Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men cũng sẽ được giới thiệu trong bài viết này. CHƯƠNG 2: BUTANOL 2.1. Giới thiệu chung Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) còn được gọi là rượu butylic, n-butanol hoặc methylolpropane, là một rượu gồm 4 cacbon có công thức phân tử C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1). Butanol là một chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng, có mùi thơm như chuối hương và có mùi cồn mạnh. Khi tiếp xúc trực tiếp nó có thể gây kích ứng mắt và da.Hơi của nó có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng và có khả năng gây mê khi hít phải ở nồng độ cao.Butanol hầu như hòa tan hoàn toànvới các dung môi hữu cơ phổ biến, nhưng lại ít hòa tan trong nước (Lee và cộng sự, 2008a). Hình 1: Cấu trúc không gian của butanol Bảng 1: Tính chất vật lý của n- butanol Khối lượng phân tử 74.12 g mol-1 Dạng tồn tại Dung dịch lỏng màu vàng Tỷ trọng 0.810– 0.812 Nhiệt độ nóng chảy −90 °C, 183 K, -130 °F Nhiệt độ sôi 118 °C, 391 K, 244 °F Độ tan trong nước 9.0 ml/100 ml (7.7 g/100 ml ở 20°C) Nhiệt độ đánh lửa 35–37 oC Nhiệt độ tự bốc cháy 343–345 oC Flash point 25–29 oC Nhiệt hóa hơi 43.8 kJ mol-1 Nhiệt đốt cháy 198.2 kJ mol-1 Áp suất hơi ở 20oC 0.63 kPa 2.2. Ứng dụng của butanol trong thực tiễn Một trong những ứng dụng ưu việt lớn của biobutanol (butanol sinh học) là được sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu chính cho các động cơ. Trong khi ethanol đã nhận được rất nhiều sự quan tâm như là một nguồn nhiên liệu hỗ trợ bởi nhiều lý do (Hansen et al., 2005 và Niven, 2005) thì butanol lại cho thấy nó có thể là một lựa chọn tốt hơnso với ethanol vì có các tính chất hóa học và vật lý phù hợp. Bảng 2: Bảng so sánh tính chất của butanol với xăng và ethanol Tính chất Butanol Xăng Ethanol Nhiệt độ sôi (oC) 117–118 27–221 78 Tỷ trọng ở 20°C (g/ml) 0.8098 0.7–0.8 0.7851 Khả năng tan trong 100g nước Không tan Không tan Tan Mật độ năng lượng (MJ.l-1) 27–29.2 32 19.6 Nhiệt bay hơi (MJ/kg) 0.43 0.36 0.92 Nhiệt dung riêng (kJ/kmol.ºK) 178 160–300 112.3 Chỉ số Octane 96 91–99 129 Độ nhớt (10-3 Pa.s) 2.593 0.24–0.32 1.078 Theo Shapovalop và Ashkinazi, (2008) và Dürre, (2007) butanol thể hiện nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với ethanol trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu, cụ thể: Giá trị năng lượng của butanol là 29.2 MJ/L trong khi giá trị năng lượng của ethanol chỉ là 19.6 MJ/L và của xăng là 32 MJ/L thì năng lượng của butanol đã nhiều hơn ethanol khoảng 25%. Dựa vào áp suất hơi có thể thấy butanol sử dụng an toàn hơn so với ethanol do butanol ít bay hơi hơn ethanol và xăng. Butanol ít gây ăn mòn hơn so với ethanol, không ảnh hưởngđến các thiết bị chứa đựng như bể chứa, đường ống, máy bơm… khi sử dụng lâu dài. Khả năng hòa tan thấp trong nước của butanol cho phép nó có thể được pha trong xăng dầu ở nồng độ cao hơn bất kì loại nhiên liệu sinh học nào mà không sợ bị tách pha làm xuất hiện nước, trong khi ethanol chỉ có thể được pha thêm vào xăng khoảng 25% vàchỉ được giữ trong một thời gian ngắn để sử dụng. Áp suất hơi của butanol (4 mmHg ở 20°C) là thấp hơn so với ethanol 11 lần (45 mmHg ở 20°C) cho phép nó có thể pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan tâm đến sự bay hơi. Trong quá trình đốt cháy, butanol không thải ra bất kì hợp chất khí nào chứa sulphur và các oxit nitơ, đây là một ưu điểm vượt trội về môi trường so với các nguồn nhiên liệu khác. Với những ưu điểm trên cùng với một nguồn cơ chất phong phú có thể được sử dụng trong quá trình lên men ABE, biobutanol sẽ là một tiềm năng lớn trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu đang cạn kiệt và góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính. Bên cạnh vai trò là nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực sự là một hóa chất quan trọng được sử dụng với lượng lớn trong các ngành công nghiệp. Gần một nửa sản lượng butanol được sản xuất trên toàn thế giới được sử dụng làm dung môi ở dạng butyl acrylate và este methacrylate trong sản xuất các loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an toàn, chất tẩy rửa. Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol như butyl ete glycol, butylacetate,amin butyl,nhựa amin và chất dẻo. Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm như nước hoa, các sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và được dùng cho việc sản xuất các loại thuốc kháng sinh, vitamin và hormone. CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT BUTANOL – CLOSTRIDIUM 3.1. Đặc điểm hình thái Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes. Đây là những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi. Đại diện tiêu biểu đó là loài Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích thước khác nhau từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000). Clostridium acetobutylicum là vi khuẩn Gram dương khi đang phát triển trong giai đoạn logarite trong canh trường,và chuyển thành Gram âm khi bước sang giai đoạn ổn định và sinh bào tử, lên men dị dưỡng, di động bằng roi. Trong quá trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt và tích trữ các hạt, một polysaccharide cung cấp nguồn carbon và năng lượng trong giai đoạn solventogenesis. Bào tử được hình thành có dạng bầu dục. Các vi sinh vật thuộc giống Clostridium lên men thường được xếp thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc tính sinh hóa và di truyền của chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum, C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, và C. saccharoperbutylacetonicum. Hai loài được biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội là C. acetobutylicum và C. beijerinckii (trước đây gọi là C. butylicum) và hầu hết các tài liệu nghiên cứu về lên men ABE đều dựa trên hai loài này. Hình 2: Hình ảnh của C.acetobutylicum và C.beijerinckii trên kính hiển vi điện tử (SEM) 3.2. Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Clostridium 3.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng Nguồn Carbon: Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ các loài thuộc giống Clostridium đều bắt nguồn từ cơ chất là carbohydrate. Nhóm vi sinh vật này có khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng rất đa dạng, có thể sử dụng gần như hoàn toàn các loại đường như glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose và sử dụng một phần các đường xylose, galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose vẫn là loại đường tốt nhất cho Clostridium sử dụng. Nguồn Nitơ: Nitơ là thành phần quan trọng của protein và enzyme, có thể được cung cấp vào môi trường nhân giống và lên men cho vi sinh vật sử dụng dưới dạng các muối NH4+ và NO3- hay các hợp chất hữu cơ phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu nành… Việc bổ sung nitơ là cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, tuy nhiên nếu bổ sung quá nhiều có thể làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm. Khoáng: Sự phát triển tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các muối khoáng trong môi trường như Mg2+, Fe2+, Mn2+ và K+ . Chúng được cung cấp dưới dạng các muối như MgSO4, MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 và K2HPO4;…Nếu nồng độ của Mg2+ và Mn2+ trong môi trường quá cao sẽ gây ức chế đến sự sinh trưởng của tế bào. Yếu tố sinh trưởng: Cũng giống như các loài vi khuẩn khác, quá trình sinh trưởng và phát triển của Clostridium đòi hỏi cung cấp một số yếu tố sinh trưởng như biotin, thiamine hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố này hiện diện trong môi trường ở nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, nhưng ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình lên men. Các loại môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy và nhân giống vi khuẩn Clostridium: Môi trường P2: là môi trường tối ưu cho tất cả các loài của Clostidium phát triển, được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men với các nồng độ glucose khác nhau. Thành phần Hàm lượng (g/L) Glucose 60 MgSO4.7H2O 20 MnSO4.H2O 1 FeSO4.7H2O 1 KCl 1 KH2PO4 50 K2HPO4 50 Ammonium acetate 220 p-aminobenzoic acid 0.1 Thiamin 0.1 Biotin 0.001 Dịch trích nấm men 1 Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS): Thành phần Hàm lượng (g/L) Sucrose 60 Na2SO4 0.18 K2HPO4 3.48 Dịch trích nấm men 5.0 Biotin 0.01 p-aminobenzoic acid 0.01 Tryptone 1.0 Antifoam C 0.5 ml Môi trường CAB: là môi trường được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum Thành phần Hàm lượng (g/L) Glucose 50 Dịch trích nấm men 4 Tryptone 1 K2HPO4 0.7 KH2PO4 0.7 DL-asparagine 0.5 MgSO4.7H2O 0.1 MnSO4.H2O 0.1 NaCl 0.1 FeSO4.7H2O 0.015 resazuin 0.002 3.2.2. Điều kiện nuôi Nhiệt độ hoạt động của Clostridium nằm trong khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào từng loài mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối thích nằm trong khoảng 35-37 oC, trong khi đó đối với loài Clostridium beijerinckii lại là 31-32 oC và Clostridium saccharobutylicum là 30 oC. Đa số các quá trình nhân giống và lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum đều được duy trì ở 35 oC. pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tạo sản phẩm của Clostridium. Khoảng pH tối thích của các loài thuộc giống Clostridium nằm trong khoảng từ 5.0-6.5, bất kì một sự thay đổi nào làm giảm pH dưới 4.5 đều có khả năng gây ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn. Đa số các môi trường ban đầu đều được chỉnh về pH=6.5, tuy nhiên cùng với quá trình sinh trưởng thì vi khuẩn lại sinh ra các hợp chất như axit butyric, propionic và acetic làm giảm pH môi trường. Vì vậy, cần kiểm soát và điều chỉnh pH trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn. 3.3. Các loài vi sinh vật được dùng trong sản xuất butanol Như đã giới thiệu ở trên, các loài có khả năng sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn loài chính là: Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. saccharobutylicum và Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Clostridium acetobutylicum là loài có đặc tính di truyền khác biệt nhất và ít liên quan đến ba loài còn lại. Những chủng thuộc loài này phát triển tốt trên các môi trường cơ chất từ dịch thủy phân tinh bột nên được sử dụng phổ biến ở quy mô công nghiệp để sản xuất dung môi. Clostridium acetobutylicum là loài được nghiên cứu trong sản xuất dung môi nhiều nhất, nhiều chủng được phát triển từ loài này cho khả năng tổng hợp butanol khá cao. Cho đến nay, một trong số những kết quả lên men tốt nhất là từ chủng C. acetobutylicum PCSIR-10 có khả năng kháng butanol, sử dụng cơ chất là rỉ đường mía được thực hiện bởi Syed (1994). Theo đó, tổng nồng độ dung môi đạt được là 19.2 g/L với hiệu suất là 34%. Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C. saccharobutylicum và C. saccharoperbutylacetonicum. Cả ba được biết đến như là các vi sinh vật saccharolytic-sử dụng các loại đường làm cơ chất lên men và hầu hết các chủng lên men đường ở quy mô công nghiệp đều thuộc loài C. beijerinckii. Mặc dù C.acetobutylicum được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất dung môi nhưng C. beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm và có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. C. beijerinckii có một khoảng pH tối thích rộng trong việc sinh trưởng và tạo dung môi. Bên cạnh đó C. beijerinckii là một đối tượng tiềm năng trong việc ứng dụng các kĩ thuật chuyển gene nhằm tạo ra các chủng có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn carbohydrate (Ezeji, et al., 2004). Với C. beijerinckii, người ta cho rằng các chủng này có khả năng chịu được tác động của acid ở nồng độ cao nên thích hợp trong các quá trình lên men liên tục hơn so với các chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov và các cộng sự, 2006). Trong nghiên cứu của Ezeji và các cộng sự (2004), chủng C. beijerinckii BA101 sử dụng rất linh hoạt nhiều nguồn cơ chất khác nhau và cho nồng độ dung môi đạt từ 14.8-26.1 g/L với năng suất từ 37-50%. Có khá ít nghiên cứu về hai loài C. saccharobutylicum và C. saccharoperbutylacetonicum được sử dụng để lên men ABE. Shaheen và cộng sự (2000) đã tập hợp những chủng đã được sử dụng để lên men và nhận thấy rằng chúng phát triển tốt hơn trên môi trường glucose và rỉ đường mía so với trên môi trường dịch ngô. Kết quả lên men tốt nhất được thực hiện trên chủng C. saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S), khi sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men là 6.5%. Nồng độ trung bình đạt 19.6g/L với hiệu suất 30%. Bảng 3: So sánh khả năng lên men của một số chủng đã được phân lập Chủng Môi trường/cơ chất ( 6% đường lên men) Nồng độ các dung môi (g/L) Hiệu suất ( % ) Năng suất ( g/L.h ) A:B:E C. acetobutylicum PCSIR-10b Rỉ đường 19.2 34.0 0.42 1.8:95.3:2.9 PCSIR-5b Rỉ đường 15.2 30.0 0.24 5.3:79:15.7 ATCC 4259a Rỉ đường 9.5 15.8 - - ATCC 824a Rỉ đường 7.8 13.0 - - ATCC 824d Glucose 20.6 42.0 0.58 20.6:66.5:26.2 C. beijerinckii BA 101c Glucose 24.2 42.0 0.34 17.8:81:1.2 BA 101c Rỉ đường 22.8 39.0 0.19 18.4:80.3:1.3 NCP P260a Rỉ đường* 21.9 33.4 - - NCP P260a Rỉ đường 18.9 31.5 - - C. saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S)a Rỉ đường* 19.6 30.0 - - NCP P108a Rỉ đường* 18.6 28.6 - - NCP P258a Rỉ đường 18.3 30.5 - - C. saccharoperbutylacetonicum N1-504a Rỉ đường 15.6 26.0 - - *: 6.5% các loại đường có thể lên men a: Shaheen và cộng sự (2000) b: Syed (1994) c: Ezeji và cộng sự (2004) d: Roffler và cộng sự (1987) CHƯƠNG 4: QUÁ TRÌNH LÊN MEN ACETON-BUTANOL-ETHANOL 4.1. Sự trao đổi chất trong quá trình lên men của vi khuẩn Clostridium Trong quá trình lên men của Clostridium, hai giai đoạn sinh trưởng riêng biệt xảy ra: giai đoạn acidogenic và giai đoạn solventogenic. Giai đoạn acidogenic xảy ra đầu tiên, khi Clostridium thực hiện quá trình lên men butyrat điển hình và phát triển trên môi trường cơ chất là tinh bột hoặc đường. Các sản phẩm chính trong giai đoạn này là butyrat (butyric acid), acetate (acid acetic), carbon dioxide và hydrogen. Ethanol và acetone được hình thành với một lượng nhỏ. Việc sinh ra các hợp chất có tính acid đã làm giảm pH của môi trường lên men xuống thấp, có thể làm chết tế bào vi khuẩn. Để tránh bị tiêu diệt, vi khuẩn đã bắt đầu một sự thay đổi chuyển hóa diễn ra ở cuối giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân. Điều này cũng đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn acidogenic và bắt đầu giai đoạn solventogenic. Các acid bài tiết được sử dụng trong giai đoạn này và được chuyển đổi thành các sản phẩm trung tính, bao gồm aceton và butanol (theo tỷ lệ thông thường là 1:2). Sự chuyển đổi butyrate và acetate thành dung môi làm tăng pH trở lại, nghĩa là các tế bào có thể trở lại hoạt động trao đổi chất trong một thời gian dài hơn. Tuy nhiên, các dung môi này lại cũng gây ức chế các tế bào vi khuẩn, đặc biệt là butanol. Dung môi gây bất hoạt các protein màng tế bào và phá hủy các màng của tế bào, do đó có một giới hạn về nồng độ dung môi tối đa có thể đạt được trong quá trình lên men (khoảng 2% về khối lượng). Quá trình trao đổi chất diễn ra cụ thể theo sơ đồ như sau: Hình 3: Sơ đồ trao đổi chất trong quá trình lên men của Clostidium Quá trình tiền xử lý sinh khối chứa lignocellulosic hoặc thủy phân tinh bột được thực hiện nhờ các enzyme a-amylase, b-amylase, pullulanase, enzym glucoamylase, a-glucosidase do vi khuẩn tiết ra, (1,2). Sự thủy phân cellulose nhờ enzyme cellulase, b-glucosidase tạo ra glucose . Glucose được hấp thu bởi hệ enzyme phophotransferase (PTS) và chuyển đổi thành pyruvate theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas), (3,6). Sự thủy phân hemixenlulose tạo ra các đường xylose / arabinose được hấp thu, dưới tác dụng của enzyme transketolase-transaldolase tạo thành fructose 6-phosphate và glyceraldehydes 3-phosphate theo con đường EMP, (4,5). Sau đó pyruvate được ferrodoxin oxidoreductase chuyển hóa thành Acetyl-CoA, chất này sau đó được chuyển hóa thành Acetoacetyl- CoA nhờ enzyme thiolase, (7,10). Sự tạo thành acetate từ Acetyl-CoA được thực hiện nhờ các enzyme phosphate acetyltransferase và acetate kinase, (8) và tạo ethanol nhờ các enzyme là acetaldehyde dehydrogenase và ethanol dehydrogenase, (9). Dưới tác dụng của enzyme Acetoacetyl-CoA transferase, Acetoacetyl-CoA đươc chuyển hóa thành acetoacetic. Sự loại bỏ CO2 của acetoacetic khi được xúc tác bởi enzyme acetoacetic decaboxylase dẫn đến sự tạo thành acetone ở pH tối ưu vào khoảng 5.0. Sự tạo thành acetone qua acetoacetyl-CoA không tiêu thụ NADPH nên vi khuẩn chỉ có thể tạo acetone ở một mức độ giới hạn, (11). Từ nhánh acetoacetyl-CoA nhận H2 nhờ enzyme β- Hydroxibutiryl CoA hydrogenase tạo thành β- Hydroxibutiryl CoA . Sau đó loại H2O dưới tác dụng của enzyme crotanase tạo thành crotonyl-CoA. Nhờ enzyme butyryl-CoA hydrogenase chuyển thành Butyryl-CoA, (12). Butyryl-CoA chuyển nhóm Co-A tạo thành Butyric nhờ enzyme Butyric transferase, (13). Mặt khác butyryl-CoA vừa nhận H2 và đồng thời tách nhóm Co-A tạo thành Butyraldehit, chất này sau đó nhận H2 tạo thành butanol, (14). 4.2. Lên men của vi khuẩn tự do 4.2.1. Khả năng sử dụng các nguồn cơ chất trong lên men a. Khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn pentose và hexose Để khảo sát khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của Clostridium, Nasib Qureshi và các cộng sự (2006) đã thực hiện các quá trình lên men với các loại đường là glucose, xylose, arabinose, galactose sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P260. Trong thí nghiệm này, 60g mỗi loại đường trên sẽ được pha vào 1L môi trường P2 thực hiện lên men song song trong vòng 72h ở nhiệt độ 35oC. Kết quả thu được sau 72h lên men, canh trường đã tổng hợp được 21.37, 11.12, 10.09, và 15.18 g/L ABE tương ứng với các dịch lên men của glucose, xylose, galactose và arabinose (bảng 4). Bảng 4: Các thông số của quá trình lên men ABE trong 72h sử dụng các loại đường glucose, xylose, galactose và arabinose Glucose Xylose Galactose Arabinose Nồng độ ABE (g/L) 21.37 11.12 10.09 15.18 Nồng độ acid (g/L) 3.74 4.08 4.34 3.30 Sự tiêu thụ đường (g/L) 59.4 36.2 31.9 37.0 Hiệu suất 0.36 0.31 0.32 0.41 Nồng độ tế bào (g/L) 2.50 1.41 1.88 1.94 Năng suất tổng hợp ABE (g/L.h) 0.30 0.15 0.14 0.21 Trong suốt quá trình lên men, lượng glucose, xylose, galactose và arabinose được sử dụng tương ứng là 59.4, 36.2, 31.9 và 37.0 g/L. Mặc dù Clostridium acetobutylicum P260 có thể sử dụng được cả bốn loại đường nhưng kết quả đã cho thấy canh trường vi sinh vật đã sử dụng glucose nhiều hơn những loại đường khác. Glucose hầu như không còn trong dịch sau lên men, trong khi galactose được sử dụng ít nhất trong bốn loại đường (37.0 g/L). Tuy nhiên, hiệu suất lần lượt đạt 0.36, 0.31, 0.32 và 0.41 tương ứng của các dung dịch glucose, xylose, galactose và arabinose. Như vậy, arabinose dù không lên men được hoàn toàn nhưng lại cho hiệu suất sinh butanol cao nhất. Nồng độ tế bào vi sinh vật từ dịch lên men của glucose cũng cho kết quả cao nhất (2.50 g/L), điều này cho thấy glucose tạo môi trường thuận lợi nhất cho sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Để đánh giá tốc độ sử dụng glucose, xylose, galactose và arabinose trong quá trình lên men, Nasib Qureshi và các cộng sự đã thực hiện lên men hỗn hợp 15g mỗi loại đường trên pha trong 1L môi trường P2 ở 35oC. Kết quả được biểu diễn trên đồ thị hình 4: Hình 4: Quá trình lên men từ hỗn hợp chứa 15 g/L các loại đường glucose, xylose, galactose và arabinose sử dụng Clostridium acetobutylicum P260. (A): nồng độ sản phẩm của quá trình lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦) Acetone, (■): butanol, (▲): ethanol, (): acid acetic, (□): acid butylic. (B): nồng độ đường còn lại trong dịch lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦): glucose, (■): xylose, (▲): arabinose, (●): galactose. Hình 4B cho thấy, glucose được sử dụng nhanh hơn các loại đường còn lại, tất cả 15g glucose được sử dụng hết trong 35h lên men. Sự tiêu thụ arabinose ngừng lại sau 53h lên men và còn sót lại hơn 0.6 g/L. Quá trình sử dụng xylose và galactose diễn ra khá chậm, sau 70h lên men 8.7 g/L xylose và 9.4 g/L galactose vẫn chưa được sử dụng hết. Nồng độ ABE đạt được sau 70h lên men từ hỗn hợp đường trên là 16.25 g/L với nồng độ butanol đạt xấp xỉ 12 g/L, năng suất là 0.23g/L.h và hiệu suất là 0.40. Với những kết quả này cho thấy Clostridium acetobutylicum P260 tuy có thể sử dụng được nhiều loại đường khác nhau nhưng việc tiêu thụ các loại đường xylose và galactose diễn ra khá chậm, hàm lượng đường sót còn nhiều làm giảm nồng độ butanol. Phát triển các chủng mới từ loài Clostridium acetobutylicum có khả năng sử dụng đường xylose và galactose tương đương với glucose và arabinose sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong lên men. Một nghiên cứu khác trên loài Clostridium beijerincki, đã khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn khác nhau. Ezeji và cộng sự (2007) đã sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101 để lên men các loại đường glucose, xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose. Dịch lên men được chuẩn bị trong môi trường P2, 55g mỗi loại đường sẽ được pha vào 1L môi trường P2 ở 35oC không kiểm soát pH trong suốt quá trình lên men. Kết quả được biểu diễn trên hình 5: Hình 5: Nồng độ dung môi ABE đạt được khi lên men các đường đơn (55g/L: glucose, xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose) sử dụng Clostridium beijerinckii BA101. Quá trình lên men được thực hiện sau 60h thì Clostridium beijerinckii ngừng tạo sản phẩm. Nồng độ dung môi ABE đạt được cao nhất trong dịch lên men của cellobiose 19.1 g/L, đạt hiệu suất 0.35. Trong khi đó, dịch lên men từ glucose cho nồng độ dung môi cuối là 17.8 g/L đạt năng suất 0.30 g/L.h, nồng độ các acid trong dịch lên men chỉ còn 2.5 g/L. Năng suất tạo dung môi của các loại đường còn lại dao động trong khoảng 0.23-0.32 g/L.h. Galactose tiếp tục thể hiện là loại đường cho hiệu suất thấp khi được sử dụng để lên men ABE khi cho nồng độ dung môi thấp nhất. Nồng độ acid trong dịch lên men của galactose khá cao (>7 g/L), điều này cho thấy sự giảm khả năng hấp thu và chuyển hóa các acid của vi khuẩn trong dịch lên men của galactose, từ đó làm giảm nồng độ dung môi ABE cuối. Để đánh giá khả năng lên men hỗn hợp các loại đường khác nhau của Clostridium beijerinckii, Ezeji và cộng sự đã thực hiện quá trình lên men hỗn hợp đường gồm glucose, mannose, arabinose và xylose bổ sung vào dịch lên men với tỉ lệ tương ứng là 5:1:2:4. Sau 84h lên men (khi quá trình lên men dừng lại), nồng độ dung môi ABE đạt được là 17.9 g/L với nồng độ butanol đạt tối đa là 13.9 g/L ( hình 6). Mặc dù lượng butanol và tổng lượng ABE được tạo ra xấp xỉ như trong quá trình lên men từ đường glucose nhưng thời gian lên men lại dài hơn ( 84h so với 60h của glucose), do đó dẫn tới kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tương đối thấp (0.21 g/L.h). Hình 6: Lên men ABE từ hỗn hợp đường glucose, mannose, arabinose và xylose với tỉ lệ 5:1:2:4 bởi Clostridium beijerinckii BA101. (A): nồng độ các sản phẩm đạt được trong suốt quá trình lên men. (B): nồng độ các loại đường còn lại. HAc: acid acetic, HBu: acid butylic, HAB: tổng acid acetic vả acid butylic. Trong suốt quá trình lên men, nồng độ các acid trong dịch lên men tương đối thấp (hình 6A), điều này cho thấy quá trình lên men cho hiệu quả tốt. Tất cả các loại đường được sử dụng đồng thời trong suốt quá trình lên men mặc dù tốc độ sử dụng là khác nhau (hình 6B). Khả năng sử dụng đường glucose nhanh tiếp tục được thể hiện ở loài Clostridium beijerinckii, điều này cho thấy glucose là cơ chất ưa thích trong quá trình trao đổi chất của hầu hết các loài. Khi nồng độ glucose dần cạn kiệt, loại đường tiếp theo được Clostridium beijerinckii sử dụng nhiều hơn là xylose. Có thể sắp xếp thứ tự ưu tiên sử dụng các loại đường trong hỗn hợp của Clostridium beijerinckii theo thứ tự là glucose > xylose > arabinose > mannose. Kết thúc quá trình lên men, nồng độ các loại đường còn lại không được sử dụng trong dịch lên men là 0 g/L glucose, 4.0 g/L xylose, 3.3 g/L arabinose và 1.7 g/L mannose. Như vậy, sự khác nhau về khả năng sử dụng các loại đường giữa hai loài C.acetobutylicum và C.beijerincki đã được ghi nhận: sau glucose thì C.acetobutylicum thể hiện khả năng sử dụng đường arabinose tốt hơn nhiều so với đường xylose. Để so sánh rõ hơn về khả năng sử dụng đường glucose và đường pentose (xylose) trên loài Clostridium beijerinckii, N. Qureshi và cộng sự (2008) đã tiến hành hai thí nghiệm lên men. Chủng C.beijerinckii BA101 được sử dụng, hai môi trường lên men lần lượt chứa 25 g/L glucose và 25 g/L xylose. Sau 60 giờ lên men, tất cả đường glucose đã được sử dụng và tạo ra 9.9 ± 0.4 g/L ABE trong đó có 6.1 g/L butanol. Nồng độ acetone và ethanol lần lượt là 3.9 và 0.4 g/L. Năng suất đạt được là 0.17 ± 0.006 g/L.h và hiệu suất là 0.39 ± 0.025. Trong khi đó quá trình lên men từ đường xylose cho nồng độ ABE đạt 9.6 ± 0.4 g/L với năng suất trong 60 giờ lên men đạt 0.16 ± 0.01 g/L.h và hiệu suất là 0.39 ± 0.011. Hình 7: Nồng độ các sản phẩm thu được trong quá trình lên men ABE từ chủng C.beijerinckii BA101, (A): Glucose, (B): Xylose Kết quả lên men đã cho thấy nồng độ ABE thu được từ glucose và xylose xấp xỉ bằng nhau, N. Qureshi và cộng sự đã kết luận khả năng sử dụng đường xylose của C.beijerinckii là tương đương so với glucose. Những kết quả trên cho thấy các loài Clostridium đều có khả năng sử dụng đa dạng nhiều loại đường khác nhau (hexose và pentose) đặc biệt phát triển rất tốt trên cơ chất là đường glucose. Trên môi trường là hỗn hợp nhiều loại đường khác nhau, Clostridium cũng cho thấy khả năng lên men khá tốt. Điều này chứng tỏ việc sử dụng các nguồn phế phẩm nông nghiệp có chứa sinh khối lignocellulosic (biomass) làm cơ chất cho quá trình lên men ABE là khả thi. Khi thủy phân các nguồn sinh khối chứa lignocellulosic sẽ cho ra hỗn hợp nhiều loại đường, việc thủy phân có thể tách riêng hoặc thực hiện đồng thời với quá trình lên men. Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên các nguồn cơ chất khác nhau với mục đích làm giảm chi phí cho quá trình lên men tổng hợp butanol. Việc xử lý các nguồn biomass trước khi sử dụng làm dịch lên men là khá phức tạp, có thể ảnh hưởng và làm giảm nồng độ dung môi đạt được. Vì vậy, việc tối ưu hóa các điều kiện lên men với từng loại cơ chất để đạt hiệu quả cao nhất là tương đối phức tạp. b. Lên men từ bột sắn (cassava flour CF) Trong một nghiên cứu của Leonardo và cộng sự (2010), bột sắn được sử dụng làm cơ chất cho quá trình lên men sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101. Bột sắn sẽ được xử lý bằng hai phương pháp sử dụng enzyme (a-amylase và b-glucoamylase)và acid (HCl). Bột sắn được pha vào nước cất thành dung dịch huyền phù ở các nồng độ 60, 80 g/L. Với phương pháp xử lý bằng acid (CT: acid chemical treatment), dung dịch HCl 1M được bổ sung vào dung dịch CF đến khi pH đạt 1.5. Quá trình thủy phân thực hiện trong 2h ở nhiệt độ 121oC, sau đó được làm lạnh đến 4oC để ngừng quá trình thủy phân. Với phương pháp xử lý bằng enzyme (E1), CaCl2 (1g/L) được bổ sung vào dung dịch huyền phù để đạt 40 mgCa/L, điều chỉnh pH đến 6.5 bằng NaOH 1M. a-amylase được bổ sung vào ( 1ml/kg bột) và thực hiện quá trình hồ hóa ở 93oC trong 2h. Sau đó, bổ sung b-glucoamylase (1.7 ml/kg bột) thực hiện quá trình dịch hóa ở 60oC, tốc độ khuấy đảo 150 rpm trong 1h. Cuối cùng hỗn hợp được đưa về 40oC giữ trong 39h trước khi lên men. Quá trình lên men được thực hiện ở các nhiệt độ 35 và 40oC với nồng độ CF là 60 và 80 g/L. Kết quả thu được thể hiện trong bảng 5: Bảng 5: Kết quả lên men ABE của chủng Clostridium beijerinckii BA101 trên cơ chất bột sắn ở các điều kiện khác nhau. Nhiệt độ (oC) Nồng độ CF (g/L) Phương pháp thủy phân Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Acetone (g/L) Tổng lượng dung môi (g/L) 35 60 CT 21.87 14.58 0.01 36.46 40 60 CT 26.73 1.70 7.19 35.62 35 80 CT 27.54 20.25 0.01 47.80 40 80 CT 17.82 6.32 0.01 24.15 35 60 ET 12.53 2.75 0.01 13.29 40 60 ET 31.59 10.21 2.69 44.49 35 80 ET 19.44 8.91 0.01 28.36 40 80 ET 22.68 2.84 8.14 33.66 35 60 CT 19.44 1.54 6.87 27.85 40 60 CT 25.92 3.56 11.85 41.33 35 80 CT 20.25 9.72 8.69 38.66 40 80 CT 18.63 0.01 5.14 23.78 35 60 ET 16.20 12.15 0.01 28.36 40 60 ET 24.30 7.70 0.01 32.01 35 80 ET 11.34 0.01 8.69 20.04 40 80 ET 18.63 0.01 7.51 26.15 Trung bình 20.81 6.39 4.18 31.38 Như vậy, với kết quả thu được từ bảng 5, nồng độ butanol đạt được cao nhất là 31.59 g/L ứng với quá trình lên men ở 40oC sử dụng nồng độ CF là 60g/L xử lý bằng enzyme. Nồng độ butanol đạt được thấp nhất là 11.34 g/L khi lên men ở 25oC, nồng độ CF là 80 g/L xử lý bằng enzyme. Kết quả này chứng tỏ, quá trình xử lý cơ chất trước khi lên men cũng như nồng độ cơ chất ban đầu sử dụng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp butanol của vi khuẩn. Khi thủy phân bằng phương pháp acid, các tạp chất lẫn trong dung dịch HCl có thể gây ức chế khả năng hoạt động của vi khuẩn làm giảm hiệu suất tổng hợp butanol. Nồng độ butanol trung bình đạt 20.81 g/L sau 96h lên men, tốc độ sinh tổng hợp butanol tương ứng là 0.22 g/L.h. c. Lên men từ Xơ bắp ( corn fiber) Xơ bắp là phụ phẩm từ trái bắp, không có giá trị về mặt kinh tế được sử dụng làm thức ăn gia súc. Tuy nhiên trong xơ bắp chứa tới 60-70 % các thành phần carbohydrate, 30% trong số đó là arabinoxylan hoặc hemicellulose. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng xơ bắp như là nguồn cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Trong nghiên cứu của N. Qureshi và cộng sự (2008) sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101, xơ bắp trước khi lên men được thủy phân bằng hai phương pháp sử dụng enzyme và acid sulfuric. Các tác giả đã so sánh khả năng tổng hợp butanol từ dịch thủy phân của hai phương pháp trên. Kết quả thu được từ quá trình lên men dịch thủy phân bằng acid sulfuric ( nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 29.8 g/L; glucose chiếm 4.3 g/L) cho bởi bảng sau: Bảng 6: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ xơ bắp được thủy phân bằng acid sulfuric. Thời gian (h) Nồng độ tế bào (g/L) Acetone (g/L) Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Tổng ABE (g/L) 0 0.02 - - - - 24 0.58 0.0 0.1 0.1 0.2 54 0.75 0.2 1.4 0.1 1.7 72 0.60 0.1 1.0 0.2 1.3 96 0.31 0.1 0.9 0.2 1.2 Nồng độ tế bào đạt được tối đa trong dịch lên men là 0.75 g/L ứng với lượng ABE đạt được là 1.7 ± 0.2 g/L. Kết quả trên cho thấy vi khuẩn bị ức chế mạnh bởi một số sản phẩm của quá trình thủy phân làm tế bào không thể phát triển. Việc sử dụng acid để thủy phân đã tạo ra nhiều yếu tố gây ức chế lên canh trường. Trong khi đó, quá trình lên men từ dịch thủy phân xơ bắp được thủy phân bằng enzyme cho kết quả tốt hơn. Nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 25 g/L. Sau 72 giờ lên men 24.6 g/L đường đã được sử dụng. Hình 8: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ dịch thủy phân xơ bắp bằng enzyme. Tổng nồng độ ABE đạt được là 8.6 ± 1.0 g/L trong đó butanol đạt 6.5 g/L tương ứng với tốc độ sinh tổng hợp 0.1 ± 0.011 g/L.h và hiệu suất 0.35. Kết quả đã cho thấy phương pháp thủy phân xơ bắp bằng enzyme đã hạn chế các chất ức chế so với phương pháp thủy phân bằng acid. Nồng độ tế bào đạt được trong dịch lên men là 1.65 ± 0.40 g/L. Hàm lượng đường sót chỉ còn 0.4 g/L cho thấy sơ bắp được thủy phân bằng enzyme là nguồn cơ chất tiềm năng cho sản xuất butanol ở quy mô lớn. Trong một nghiên cứu khác của Xin-Liang Li và cộng sự (2006), xylan lấy từ xơ bắp ( corn fiber xylan) được tiến hành đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chủng C.acetobutylicum P260. Mục đích của nghiên cứu là xác định khả năng tự thủy phân các hợp chất carbohydrate phức tạp thành đường đơn của C.acetobutylicum.Thí nghiện tiến hành với môi trường ban đầu chứa 60 g xylan trong 1 lít môi trường P2, lên men ở 35oC. Tuy nhiên, quá trình lên men đã không diễn ra, canh trường vi sinh vật không phát triển và không tổng hợp được bất cứ dung môi nào. Điều này chứng tỏ C.acetobutylicum không có khả năng thủy phân xylan. Xin-Liang Li và cộng sự (2006) tiếp tục quá trình lên men như trên có bổ sung 0.5 ml enzyme xylanase hỗ trợ cho quá trình thủy phân. Kết quả cho thấy vẫn không có sự phát triển của tế bào trong canh trường, điều này được giải thích là do enzyme thủy phân xylan không đủ nhanh và đủ lớn để vi sinh vật sử dụng. Thí nghiệm tiếp theo, 5 g/L xylose được bổ sung vào môi trường trên nhằm cung cấp cơ chất cho vi sinh vật có thể sống sót trong quá trình xylanase thủy phân xylan trong môi trường. Kết quả là vi khuẩn đã phát triển và tổng hợp được 9.6 g/L ABE (hình 9). Hình 9: Nồng độ các sản phẩm đạt được trong quá trình lên men ABE chứa 60 g/L xylan + 5g xylose + 0.5ml xylanase. c. Lên men từ dịch bo bo ( sweet sorghum juice) A.Areesirisuk và cộng sự (2010) đã sử dụng dịch đường lấy từ việc thủy phân thân cây bo bo làm cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol. Hạt và thân cây của bo bo có thể được sử dụng để sản xuất đường, ethanol, syrup, nhiên liệu, giấy…(Rajvanshi và Nimbkar, 2005). Mục đích nghiên cứu của A.Areesirisuk và cộng sự (2010) là khảo sát khả năng phát triển và tổng hợp butanol của C.beijerinckii JCM 1390 từ dịch bo bo mà không cần bổ sung thêm các nguồn dinh dưỡng từ đường đơn khác. Dịch thủy phân từ thân cây bo bo sẽ được ly tâm, bổ sung vào môi trường P2 điều chỉnh pH về 6.0 bằng dung dịch NaOH 1.0M. Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị lên men yếm khí 2-L chứa 1500ml dịch lên men ở 37oC. Các thông số trong suốt quá trình lên men được biểu diễn trên đồ thị hình 10: Hình 10: Các thông số của quá trình lên men từ dịch bo bo do chủng C.beijerinckii JCM 1390 thực hiện. Từ đồ thị có thể thấy sau 60 giờ lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi khuẩn bắt đầu giảm dần, sau 80 giờ thì quá trình lên men gần như không còn xảy ra. pH trong suốt quá trình lên men có sự thay đổi không đáng kể, điều này chứng tỏ các acid sinh ra trong giai đoạn acidogenesis đã được vi khuẩn chuyển hóa thành dung môi. Nồng độ các sản phẩm đạt được sau quá trình lên men được biểu diễn trên hình 11: Hình 11: Nồng độ dung môi trong suốt quá trình lên men dịch bo bo của C.beijerinckii JCM 1390 Như vậy nồng độ butanol đạt được sau 60 giờ lên men là 8.0 g/L và tối đa là 8.8 g/L sau 120 giờ lên men, hiệu suất đạt 0.30. Như vậy so với kết quả từ nghiên cứu của N. Qureshi và cộng sự (2008) trên cơ chất là dịch thủy phân xơ bắp ( nồng độ butanol đạt được sau 60 giờ lên men là 6.5 g/L, hiệu suất 0.35), dịch bo bo có khả năng cho nồng độ butanol cao hơn. Tuy nhiên, hàm lượng đường sót trong dịch sau lên men của bo bo lại khá cao làm cho hiệu suất sinh tổng hợp sản phẩm giảm đáng kể. Tốc độ tổng hợp dung môi chỉ đạt 0.09 g/L.h. d. Lên men từ bã nho (grape pomace) Bã nho là một phế phẩm trong các ngành công nghiệp sản xuất rượu vang, cứ 100 kg nho sẽ cho khoảng 18-20 kg bã nho sau quá trình ép lấy dịch. Ngoài các ứng dụng trong thực tiễn khá phổ biến để sản xuất acid tartaric, trích ly chất màu anthocyan, làm thức ăn gia súc… bã nho còn chứa một lượng đường sót khá lớn 7.81-10.81 % w/w (Hang và Woodams 2008) có thể được sử dụng làm cơ chất cho các quá trình lên men từ vi sinh vật. Laurent Law (2010) đã tiến hành nghiên cứu khả năng lên men tổng hợp butanol từ bã nho lấy từ giống nho trắng Chardonnay sử dụng giống vi khuẩn Clostridium acetobutylicum P262. Để chuẩn bị cho dịch lên men, bã nho sẽ được pha vào nước cất theo tỷ lệ 12.5% w/v, bổ sung dung dịch đệm kali phosphate 1M. Toàn bộ môi trường sẽ được thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Quá trình lên men sẽ được thực hiện ở 35oC, pH môi trường ban đầu 5.5. Hình 12: Nồng độ đường và nồng độ tế bào trong quá trình lên men từ bã nho sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P262 Có thể thấy trong 24 giờ đầu của quá trình lên men, khả năng sử dụng cơ chất của vi sinh vật còn tương đối thấp, nồng độ tế bào tăng không đáng kể. Có thể đây là quá trình thích nghi với môi trường của vi khuẩn, canh trường chưa bước vào giai đoạn sinh trưởng. Tuy nhiên, trong 48 giờ lên men tiếp theo, tốc độ sử dụng cơ chất của vi khuẩn tăng rất nhanh. Sau 72 giờ lên men, 97.6% hàm lượng đường trong dịch lên men đã được sử dụng, nồng độ tế bào tăng đều trong 72 giờ lên men và đạt nồng độ 0.81 g/L. Như vậy, Clostridium acetobutylicum P262 phát triển khá tốt trên môi trường lên men từ bã nho, nồng độ đường sót còn lại khá thấp ( 2.4%). Nồng độ dung môi đạt được trong quá trình lên men được biểu diễn trên hình 13: Hình 13: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men bã nho sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P262 Tốc độ sinh tổng hợp các acid acetic và butylic trong 24 giờ đầu lên men tăng khá cao 0.59 g/L.h, chứng tỏ canh trường đang trong giai đoạn acidogenesis chủ yếu tổng hợp acid. Sau đó nồng độ các acid giảm nhanh trong 48 giờ tiếp theo, nghĩa là canh trường đã bước sang giai đoạn solventogenesis, vi khuẩn bắt đầu sử dụng các acid sinh ra trong giai đoạn trước để tổng hợp nên dung môi. Nồng độ các dung môi đạt được trong suốt quá trình lên men được tóm tắt trong bảng sau: Bảng 7: Nồng độ các dung môi đạt được trong quá trình lên men từ bã nho Thời gian lên men (h) pH Acetone (g/L) Butanol (g/L) Ethanol (g/L) Acid Acetic (g/L) Acid butylic (g/L) Nồng độ tế bào (g/L) 0 5.49 0 0 0 0 0 0.59 24 5.06 0 0.53 1.55 6.13 3.39 0.65 48 4.67 0.87 2.99 0.93 5.7 2.98 0.80 72 4.75 2.83 5.96 0.51 3.03 2.49 0.81 Sau 24 giờ lên men, acetone và butanol mới bắt đầu được hình thành và đạt nồng độ lần lượt là 2.83 và 5.96 g/L sau 72 giờ lên men. Như vậy tỷ lệ nồng độ các dung môi là 6:3:1 (butanol:acetone:ethanol), kết quả này tương tự với kết quả đạt được trong nghiên cứu của Jones và Woods (1986). Tổng nồng độ dung môi đạt được là 9.08 g/L, hiệu suất và tốc độ tổng hợp sản phẩm lần lượt là 0.36 g/g và 0.16 g/L.h. Hiệu suất đạt được khá cao gần bằng với hiệu suất đạt được khi lên men bằng đường glucose ( 0.40 g/g) theo Nasib Qureshi và các cộng sự (2006). Kết quả này đã chứng minh bã nho là một nguồn cơ chất đầy tiềm năng cho quá trình lên men sản xuất butanol. Bảng 8: Bảng tổng hợp một số nghiên cứu thực hiện trên các chất mang khác có nguồn gốc tự nhiên Cơ chất Chủng vi sinh vật Nồng độ ABE (g/L) Hiệu suất (g/g) Năng suất (g/L.h) Thực hiện Gỗ thông C. acetobutylicum P262 17.6 0.36 0.73 Parekh et al.(1988) Cây hoàn diệp ( Aspen) C. acetobutylicum P262 20.1–24.6 0.31–0.34 0.84–1.03 Parekh et al.(1988) Xác mía C. saccharoperbutylacetonicum ATCC 27022 18.1 0.33 0.30 Soni et al. (1982) Vỏ lúa gạo C. saccharoperbutylacetonicum ATCC 27022 13.0 0.28 0.15 Soni et al. (1982) Vỏ lúa mì C. acetobutylicum IFP 921 17.7 0.18 0.47 Marchalet al. (1984) Rơm từ thân bắp C. acetobutylicum P262 25.8 0.34 1.08 Parekh et al.(1988) 4.2.2. Điều kiện lên men a. pH pH ban đầu của môi trường lên men phụ thuộc nhiều vào pH tối thích của chủng vi sinh vật sử dụng để tổng hợp butanol. Các thí nghiệm được thực hiện bằng cách điều chỉnh về pH tối thích và không kiểm soát trong suốt quá trình lên men. Các loài Clostridium có khả năng hoạt động tốt trong khoảng pH từ 5.0-6.5. Với mỗi loài nhất định cần tiến hành lên men ở một giá trị pH ban đầu xác định nhằm đạt được hiệu suất tổng hợp cao nhất. Trong nghiên cứu của Shamsudin và cộng sự (2006), loài C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4 được sử dụng để lên men tạo butanol. Thí nghiệm tiến hành ở các giá trị pH ban đầu khác nhau của môi trường lên men nhằm xác định giá trị pH tối ưu của loài này. Môi trường sử dụng là môi trường TYA chứa 40 g glucose, pH được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1M. Kết quả đạt được trên hình 14: Hình 14: Ảnh hưởng của pH lên nồng độ dung môi (♦), hiệu suất (◊) và tốc độ sinh tổng hợp (○) butanol của chủng C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4. Từ kết quả trên có thể thấy rõ pH tối thích của loài C.Saccharoperbutylacetonicum trong quá trình lên men là 6.0. Trong khi tại pH là 5.5 lại cho hiệu suất tổng hợp thấp nhất. Trong nghiên cứu của Madihah (2002) cũng cho kết quả tương tự khi pH ban đầu của dịch lên men từ loài C.Saccharoperbutylacetonicum cho hiệu suất cao nhất. Để so sánh các quá trình lên men được thực hiện bằng cách chỉ điều chỉnh pH ban đầu một lần và duy trì pH ổn định trong suốt quá trình lên men. George và Chen (1983) đã sử dụng chủng C.beijerinckii VPI 13436 tiến hành lên men trên môi trường TYS. Thí nghiệm được tiến hành ở pH ban đầu là 6.8, sử dụng dung dịch KOH 8N để điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men. Hình 15: Khả năng tổng hợp dung môi của C.beijerinckii VPI 13436 trên môi trường TYS không kiểm soát pH và duy trì pH ở 6.8. butanol (▲), acetate (○), butyrate (), mật độ tế bào (●) Trong môi trường không kiểm soát pH, vi sinh vật bắt đầu sinh tổng hợp dung môi sau 5 giờ lên men khi pH môi trường đạt 4.5-4.6, nồng độ butanol bắt đầu tăng nhanh sau 10 giờ lên men và đạt tối đa 100 đến 120 mM butanol sau 120 giờ lên men ( không hiển thị trên hình). Trong khi đó ở môi trường được duy trì pH ở 6.8, có thể tổng hợp dung môi sau 2 giờ lên men và nồng độ butanol đạt tối đa là 90 mM sau 120 giờ lên men. Việc kiểm soát pH của môi trường lên men đã làm giảm khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn, trong khi đó nồng độ của các acid (acetate) trong dịch lên men lại tăng liên tục. Như vậy việc duy trì pH cố định trong môi trường lên men không có nhiều ý nghĩa, do đó hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện ở các giá trị pH tối thích ban đầu của vi sinh vật và không điều chỉnh trong suốt quá trình lên men. b. Nhiệt độ Tương tự như điều kiện về pH, giá trị nhiệt độ lên men sẽ phục thuộc nhiều vào chủng vi sinh vất sử dụng. Tùy vào từng loài có nhiệt độ tối thích khác nhau mà ta sẽ lựa chọn nhiệt độ lên men thích hợp. Khoảng nhệt độ tối thích của các loài Clostridium nằm trong vùng từ 30-40oC, nhiều thí nghiệm trên các loài Clostridium acetobutylicum và C. beijerinckii đều thực hiện ở nhiệt độ trung bình là 35oC. Shamsudin và cộng sự (2006) nghiên cứu trên loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại cho thấy khả năng tổng hợp butanol cao nhất ở 30oC. Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng lên men tổng hợp dung môi của C.Saccharoperbutylacetonicum. Ở 30oC, khả năng tổng hợp dung môi của vi khuẩn đạt cao nhất (15g/L). Trong khi đó, ở 40oC hầu như vi khuẩn đều bị ức chế làm mất khả năng tổng hợp dung môi. Như vậy có thể thấy, yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất lên men tổng hợp dung môi, cần kiểm soát và duy trì ổn định nhiệt độ trong suốt quá trình lên men. c. Nồng độ các muối trong môi trường tổng hợp Ngoài các đường pentose và hexose là cơ chất chính được Clostridium sử dụng để lên men tổng hợp butanol, môi trường lên men còn chứa nhiều loại muối khoáng (Fe2+, Mn2+, K+, Mg2+, NH4+..) giúp cho vi sinh vật có thể sinh trưởng và tạo sản phẩm. Nhiều nghiên cứu cho thấy nồng độ các muối ban đầu trong môi trường lên men có thể ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và tổng hợp sản phẩm của vi khuẩn. F. Monot và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ các hợp chất của môi trường tổng hợp đến quá trình lên men ABE sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Các thí nghiệm được tiến hành bằng cách lần lượt thay đổi nồng độ ban đầu của các muối MgSO4, FeSO4, KCl, ammonium acetate trong môi trường tổng hợp. KCl: Để khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối KCl, các thí nghiệm được tiến hành với các nồng độ KCl ban đầu là 0, 3, 6, 9, 15, 30, 60, 120, 360, 600 mg/l và 1.2, 2, 4, 8, 12 g/l. Kết quả nồng độ dung môi thu được trong các thí nghiệm cho bởi bảng sau: Bảng 9: Ảnh hưởng của nồng độ KCl ban đầu tới quá trình lên men ABE. KCl Nồng độ (mg/l) Nồng độ tế bào* Butanol (g/l) Acetone (g/l) Ethanol (g/l) Tổng ABE (g/l) 0 0.8 0 0 0 0 3 0.59 0.48 - - 0.48 6 0.72 0.78 - - 0.78 9 0.88 4.22 1.39 0.23 5.84 15 1.28 4.26 1.28 0.25 5.79 30 1.88 4.26 1.05 0.28 5.59 60-600 2.60 4.32 1.03 0.50 5.85 0.6-8 (g/l) 2.94 4.72 0.81 0.48 6.01 12 3.10 3.89 0.90 0.37 5.16 *: Nồng độ tế bào tính theo mật độ quang. Kết quả trên cho thấy quá trình lên men ABE chịu ảnh hưởng khá lớn bởi nồng độ của muối K+. Nồng độ tế bào trong môi trường lên men tăng liên tục khi nồng muối tăng từ 0 đến 60 mg/l và giữ ổn định khi nồng độ muối tiếp tục tăng từ 60-600 mg/l. Nồng độ dung môi bắt đầu tăng nhanh khi nồng độ muối đạt 9 mg/l, trong khoảng nồng độ muối từ 0.6-8 g/l nồng độ dung môi vẫn duy trì không đổi 6.01 g/l. Khi nồng độ muối tăng cao 12 g/l đã gây sự ức chế làm giảm hiệu suất tổng hợp dung môi của vi khuẩn (nồng độ dung môi chỉ đạt 5.16 g/l). Ammonium acetate: Muối ammonium acetate được khảo sát ở các nồng độ 1.1, 2.2, 3.3, 4.4, 5.5, 6.6 g/l. Kết quả cho bởi bảng sau: Bảng 10: Ảnh hưởng của nồng độ ammonium acetate ban đầu tới quá trình lên men ABE. Ammonim acetate Nồng độ (g/l) Nồng độ tế bào Butanol (g/l) Acetone (g/l) Ethanol (g/l) Tổng ABE (g/l) 1.1 2.14 3.11 0.99 0.12 4.22 2.2 1.83 2.78 1.10 0.12 4.00 3.3 1.84 2.04 0.65 0.09 2.78 4.4 1.80 1.48 0.47 0.09 2.04 5.5 1.86 1.04 0.35 - 1.39 6.6 1.80 1.04 0.35 - 1.39 Kết quả cho thấy ammonium acetate có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Nồng độ ammonium acetate ở 1.1 g/l cho kết quả tốt hơn các nồng độ khác, ở nồng độ cao hơn hầu như vi sinh vật đều bị ức chế. Do đó việc tổng hợp dung môi cũng bị ảnh hưởng khi tăng nồng độ muối lên cao hơn 1.1 g/l. Tại nồng độ ammonium acetate 1.1 g/l tổng lượng dung môi cũng đạt khá thấp 4.22 g/l. MgSO4: Muối MgSO4 được khảo sát ở các nồng độ 0, 50, 100, 200, 350 và 500 mg/l. Kết quả cho bởi bảng sau: Bảng 11: Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 ban đầu tới quá trình lên men ABE. MgSO4 Nồng độ (mg/l) Nồng độ tế bào* Butanol (g/l) Acetone (g/l) Ethanol (g/l) Tổng ABE (g/l) 0 0.65 2.22 0.87 0.14 3.23 50-200 2.99 5.28 1.48 0.74 7.5 350-500 2.64 4.48 1.28 0.61 6.37 Có thể thấy rằng nồng độ tế bào vi sinh vật phụ thuộc khá nhiều vào sự hiện diện của Mg2+ trong dịch lên men. Khi không có mặt Mg2+ trong môi trường, sự sinh trưởng của vi khuẩn bị ức chế nhưng vẫn tổng hợp được dung môi với nồng độ khá thấp 3.23 g/l. Khi có mặt MgSO4 trong môi trường (50-200 mg/l), vi khuẩn phát triển rất tốt đồng thời khả năng tổng hợp dung môi cho hiệu suất cao nhất (7.5g/l). Có thể kết luận nồng độ muối MgSO4 tối ưu cho vi khuẩn phát triển nằm trong khoảng 50-200 mg/l. Khi tăng nồng độ lên 350-500 mg/l, tế bào vi khuẩn bắt đầu bị ức chế và khả năng tổng hợp dung môi cũng giảm rõ riệt (6.37 g/l). FeSO4: Sự hiện diện của Fe2+ trong môi trường lên men ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Khi môi trường tổng hợp chứa 1 mg FeSO4 trong 1L dung dịch, tế bào vi khuẩn phát triển khá tốt, vi khuẩn sử dụng hết cơ chất (glucose) và tổng hợp được 5.5 g/l dung môi. Không có sự khác biệt đáng kể về khả năng sinh trưởng cũng như tổng hợp sản phẩm khi tăng nồng độ FeSO4 từ 1-50 mg/l. Tuy nhiên, khi môi trường không được cung cấp FeSO4, sự phát triển của vi khuẩn bị yếu đi, tổng lượng dung môi chỉ đạt 2.08 g/l. d. Sự ức chế ngược của butanol trong quá trình lên men Trong quá trình lên men ABE, butanol được sinh ra với tỉ lệ cao nhất và được xem là sản phẩm chính của quá trình lên men. Tuy nhiên, butanol cũng như những alcohol khác đều có ảnh hưởng xấu đến thành của tế bào vi khuẩn. Ở nồng độ cao, butanol có thể ngăn chặn sự vận chuyển chất dinh dưỡng qua thành tế bào, phá hủy chức năng của thành tế bào. Trong nghiên cứu được thực hiện bởi Bowles và Ellefson (1985) để khảo sát ảnh hưởng của butanol đến khả năng sử dụng đường glucose của loài Clostridium acetobutylicum. Khả năng sử dụng đường của vi khuẩn được đánh giá thông qua số mg glucose được tiêu thụ trên mg protein từ tế bào vi khuẩn tại một thời điểm của quá trình lên men. Thí nghiệm được tiến hành ở các nồng độ butanol ban đầu lần lượt là 0, 139, 167, 208, 236, 278 mM. Hình 16: Ảnh hưởng của butanol lên khả năng sử dụng glucose của C. acetobutylicum. 0 mM butanol(●),139 mM butanol (○), 167 mM butanol (□), 208 mM butanol (■), 236 mM butanol (▲), 278 mM butanol () Kết quả đã cho thấy rõ sự ức chế của butanol lên khả năng sử dụng cơ chất của vi khuẩn. Nguyên nhân chính có thể là do butanol đã làm cho tế bào mất khả năng duy trì pH bên trong tế bào làm rối loạn chức năng phân giải cơ chất, các ATPase của màng tế bào bị ức chế, ATP nội bào giảm. Trong một nghiên cứu khác của Zhijie.S và Shijie.L (2010) tiến hành khảo sát ảnh hưởng của butanol đến khả năng lên men ABE của chủng C. acetobutylicum ATCC 824. Quá trình lên men ABE được thực hiện ở 37oC, nồng độ glucose ban đầu là 50 g/l, nồng độ butanol ban đầu trong dịch lên men lần lượt là 3, 6, 9, 12 g/l. Hình 17: Ảnh hưởng của nồng độ butanol lên quá trình lên men ABE sử dụng chủng C. acetobutylicum ATCC 824. HAB: tổng acid acetic và butylic. Từ kết quả trên có thể thấy nồng độ butanol ban đầu đã ảnh hưởng đến nồng độ các acid và dung môi trong dịch sau lên men. Khi nồng độ butanol ban đầu tăng lên, nồng độ các acid đã tăng lên và nồng độ dung môi lại giảm xuống. Khi nồng độ butanol ban đầu lớn hơn 6 g/l, vi khuẩn sử dụng glucose chủ yếu để tổng hợp acid làm cho hiệu suất tổng hợp các acid tăng mạnh và đạt cực đại 0.23 g/g trong khi hiệu suất tổng hợp butanol giảm nhanh chóng. Như vậy việc tăng nồng độ butanol đã ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật làm cho vi sinh vật trở về giai đoạn solventogenic chủ yếu sản sinh acid. Có thề thấy butanol có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình lên men, để đạt hiệu suất lên men cao cần có các biện pháp tách butanol ngay trong quá trình lên men giảm sự ức chế của butanol đến vi sinh vật. Các phương pháp tách butanol trong quá trình lên men nhằm nâng cao hiệu suất lên men sẽ được đề cập trong chương sau. 4.3. Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định trong lên men sản xuất butanol Trong những năm gần đây, kỹ thuật cố định tế bào trên chất mang ứng dụng trong các quá trình lên men đã được nghiên cứu rộng rãi. Ứng dụng tế bào vi khuẩn cố định trong lên men sản xuất butanol có thể mang lại nhiều ưu điểm vượt trội như: Chất mang đóng vai trò như một tác nhân bảo vệ tế bào chống lại các ảnh hưởng bất lợi từ môi trường như nồng độ cơ chất cao, sự thay đổi pH, nhiệt độ và làm giảm đi sự ức chế tế bào bởi sản phẩm cuối (butanol). Mật độ tế bào trên mỗi đơn vị thể tích của bình phản ứng sinh học cao hơn, từ đó dẫn đến năng suất thể tích cao hơn, rút ngắn thời gian lên men. Tăng khả năng sử dụng cơ chất và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm, từ đó cải thiện hiệu suất lên men. Có thể sử dụng cho quá trình sản xuất liên tục. Dễ dàng thu hồi sản phẩm, giảm bớt công đoạn phân riêng canh trường sau lên men, do đó giảm chi phí về thiết bị và năng lượng. Có thể tái sử dụng nấm men nhiều lần trong khi vẫn đảm bảo được hoạt tính sinh học ổn định. Những nghiên cứu về tế bào cố định trong lên men sản xuất butanol đều dựa trên hai kỹ thuật chính là hấp thụ và nhốt tế bào vi khuẩn Clostridium lên chất mang. R. Sallam và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu cố định tế bào C. acetobutylicum lên chất mang là Ca-alginate và than hoạt tính qua đó so sánh khả năng lên men sản xuất butanol của tế bào cố định và tế bào tự do. Sau 4 ngày lên men thu được kết quả sau: Bảng 12: Kết quả lên men từ tế bào tự do và cố định trên Ca-alginate và than hoạt tính Thời gian lên men (ngày) Nồng độ đường (kg/m3) Acetone (kg/m3) Butanol (kg/m3) Tự do 0.0 70.0 0.0 0.0 1.0 46.3 1.7 3.3 2.0 35.0 1.9 4.3 3.0 23.0 3.6 8.5 4.0 14.0 6.3 15.7 Cố định trên Ca-alginate 0.0 70.0 0.0 0.0 1.0 45.0 1.9 3.3 2.0 30.0 3.4 8.0 3.0 20.0 6.3 15.0 4.0 9.3 8.4 20.5 Cố định trên than hoạt tính 0.0 70.0 0.0 0.0 1.0 30.0 1.0 2.3 2.0 19.5 1.2 3.0 3.0 13.0 2.0 4.6 4.0 12.0 2.9 6.9 Kết quả từ bảng 12 cho thấy nồng độ cơ chất trong dịch lên men giảm nhanh chóng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Tế bào vi khuẩn được hấp thụ trên than hoạt tính có tốc độ sử dụng cơ chất cực đại đạt rsm= 100 kg/m3.ngày, trong khi của tế bào tự do và tế bào cố định trên Ca-alginate lần lượt là 50 và 80 kg/m3.ngày. Tuy nhiên, tế bào cố định trên Ca-alginate lại có khả năng tổng hợp butanol cao nhất 20.5 kg/m3 đạt hiệu suất 0.34. Trong khi tế bào cố định trên than hoạt tính lại cho khả năng tổng hợp butanol thấp hơn cả tế bào tự do (6.9 kg/m3 < 15.7 kg/m3). Như vậy, Ca-alginate thể hiện là một chất mang có nhiều ưu điểm vượt trội hơn so với than hoạt tính. Việc nhốt các tế bào vi khuẩn C. acetobutylicum trong gel alginate đã giúp cho các tế bào ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố ức chế từ môi trường hơn so với tế bào tự do làm tăng hiệu suất tổng hợp butanol. Trong một nghiên cứu khác của S. Shamsudin và cộng sự (2006) thực hiện cố định trên 5 loại chất mang khác nhau bao gồm : stainless steel scrubber, nylon scrubber, các hạt polyurethane có kích thước mao quản bằng nhau, các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều và fruit bunch fiber. Sử dụng chủng C.Saccharoperbutylacetonicum N1-4 để cố định, lên men trên môi trường TYS chứa 40 g glucose. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các loại chất mang khác nhau lên nồng độ dung môi thu được sau quá trình lên men, hiệu suất và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm trên môi trường lên men TYA ở 30oC. Kết quả thu được từ quá trình lên men thể hiện trên đồ thị sau: Hình 18: Nồng độ các sản phẩm thu được từ các quá trình lên men ABE sử dụng tế bào vi khuẩn cố định trên các loại chất mang. 1, stainless steel scrubber. 2, nylon scrubber. 3, các hạt polyurethane có kích thước mao quản giống nhau. 4, các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều. 5, fruit bunch fiber. 6, tế bào tự do. Tiến hành so sánh các quá trình lên men ABE thực hiện bởi tế bào vi khuẩn cố định với tế bào vi khuẩn tự do sau 24 giờ lên men. Kết qủa cho thấy tế bào vi khuẩn cố định trên các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều có khả năng tổng hợp dung môi cao nhất (26.679 g/l dung môi) sau 24 giờ lên men với 19.228 g/l butanol. Chất mang stainless steel scrubber cho kết quả lên men cao thứ hai với 16.243 g/l dung môi, tiếp theo là fruit bunch fiber với 15.650 g/l dung môi, các hạt polyurethane có kích thước mao quản giống nhau cho kết quả là 10.606 g/l dung môi và cuối cùng là nylon scrubber cho kết quả thấp nhất với 3.863 g/l. Tổng nồng độ acid thu được từ quá trình lên men sử dụng các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều cho kết quả thấp nhất với 1.373 g/l acetate và 0.235 g/l butyrate. Điều này hoàn toàn phù hợp khi quá trình lên men sử dụng các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều cho nồng độ dung môi cao nhất. Hiệu suất và tốc độ sinh tổng hợp dung môi của các quá trình lên men sử dụng tế bào cố định so với tế bào tự do được biểu diễn trên đồ thị hình 19: Hình 19: Hiệu suất và tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm sau 24 giờ lên men ABE ở 30oC trên môi trường TYA. 1, stainless steel scrubber. 2, nylon scrubber. 3, các hạt polyurethane có kích thước mao quản giống nhau. 4, các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều. 5, fruit bunch fiber. 6, tế bào tự do. Kết quả cho thấy tốc độ sinh tổng hợp dung môi đạt được từ 5 loại chất mang khác nhau lần lượt là 1.084, 0.648, 0.633, 0.406 và 0.122 g/l.h tương ứng của các hạt polyurethane có kích thước không đồng đều, stainless steel scrubber, fruit bunch fiber, các hạt polyurethane có kích thước giống nhau và nylon scrubber. Từ những kết quả trên, có thể kết luận rằng quá trình lên men từ tế bào vi khuẩn cố định trên chất mang là các hạt polyurethane có kích thước không đồng đều cho kết quả tốt nhất. So với quá trình lên men từ vi khuẩn tự do, các hạt polyurethane có kích thước không đồng đều đã giúp cho quá trình lên men có thể tăng hiệu suất gấp 1.9 lần và tăng tốc độ sinh tổng hợp dung môi hơn 3.9 lần. Điều này có được là do cấu tạo của các hạt polyurethane có cấu trúc xốp rỗng, bao gồm rất nhiều mao quản nhỏ có đường kính từ 20-900 mm (hình 20). Nhờ đó các tế bào vi khuẩn dễ dàng được nhốt trong các mao quản, có thể tiếp xúc và trao đổi chất dễ dàng với môi trường. Bên cạnh đó, polyurethane còn có nhiều ưu điểm hơn so với các loại chất mang khác như giá thanh rẻ, quá trình cố định đơn giản và nhanh chóng, không cần sử dụng thêm hóa chất hỗ trợ nào. Do đó, polyurethane thể hiện là một chất mang tiềm năng trong việc ứng dụng để cố định vi khuẩn sử dụng trong lên men ở quy mô công nghiệp. Hình 20: Cấu trúc mao quản của các hạt polyurethane có kích thước mao quản không đồng đều. CHƯƠNG 5: CÁC KĨ THUẬT PHÂN TÁCH BUTANOL TỪ DỊCH LÊN MEN Trong quá trình lên men sản xuất butanol ở quy mô công nghiệp, quá trình phân tách butanol từ dịch sau lên men là một quá trình phức tạp và tiêu tốn khá nhiều năng lượng. Chưng cất là phương pháp truyền thống được sử dụng để thu hồi butanol từ dịch sau lên men. Tuy nhiên, nồng độ nồng độ dung môi trong dịch sau lên men khá thấp trong khoảng từ 18-33 g/l trong đó butanol chỉ có khoảng 13-18 g/l. Ngoài nồng độ trong dịch lên men thấp, butanol còn có điểm sôi cao hơn so với nước (118oC). Tất cả những yếu tố trên làm cho quá trình chưng cất thu hồi butanol đòi hỏi phải tiêu tốn rất nhiều năng lượng, có thể chiếm tới 40% giá thành sản phẩm. Philips và Humphrey (1985) cho rằng nếu nồng độ butanol trong dịch sau lên men tăng từ 10 g/l lên 40 g/l thì quá trình tách chiết butanol bằng phương pháp chưng cất sẽ tiết kiệm nhiều chi phí. Theo đó, tại nồng độ 10 g/l butanol, tỷ lệ nhiên liệu dầu cần tiêu tốn để thu hồi 100% butanol là 1.5, trong khi tại nồng độ 40 g/l tỷ lệ này chỉ còn 0.25. Điều này cho thấy, chi phí sẽ được tiết kiệm rất nhiều nếu như nồng độ butanol trong dịch sau lên men tăng gấp ba. Để cải thiện hiệu suất thu hồi và giảm chi phí, nhiều kỹ thuất mới đã được nghiên cứu và ứng dụng như: gas stripping, pervaporation, hấp thụ, trích ly lỏng-lỏng và thẩm thấu ngược. Hình 21: Đồ thị so sánh năng lượng cấn thiết dùng trong các kỹ thuật tách chiết butanol. Thẩm thấu ngược được cho là phương pháp đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất tuy nhiên nó lại có nhược điểm khó khắc phục là dễ bị tắc nghẽn trong quá trình hoạt động. Quá trình trich ly lỏng-lỏng thể hiện tính chọn lọc cao và khả năng tách chiết khá tốt nhưng quá trình thực hiện lại tốn nhiều chi phí. Vì vậy, cần phân tích rõ những ưu và nhược điểm của từng phương pháp cụ thể để đạt được hiệu quả cao nhất. a. Gas stripping: là phương pháp đơn giản và hiệu quả để thu hồi butanol từ dịch lên men. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là sục khí qua môi trường lên men, khí sẽ lôi kéo dung môi trong dịch lên men đi vào thiết bị thu hồi dung môi. Khí sau khi được thu hồi lại tiếp tục dẫn vào bình lên men và tiếp tục quá trình đến khi cơ chất trong môi trường lên men được sử dụng hết. Việc áp dụng phương pháp gas stripping có thể giúp cho quá trình lên men ABE thực hiện ở nồng độ đường khá cao (Qureshi và Blaschek, 2001) và làm giảm sự ức chế của butanol đối với vi sinh vật trong quá trình lên men (Maddox và cộng sự, 1995). Trong nghiên cứu của Ezeji và cộng sự (2003), gas stripping được sử dụng để tách chiết dung môi trong quá trình lên men sử dụng chủng C. beijerinckii BA101. Kết thúc quá trình lên men, 161,7 g/l đường đã được vi sinh vật sử dụng và thu được 75.9 g/l dung môi. Trong một nghiên cứu khác của Ezeji và cộng sự (2004), quá trình lên men có bổ sung cơ chất được tích hợp với quá trình gas stripping nhằm làm giảm sự ức chế của nồng độ đường lên men cao và giúp tăng mật độ vi sinh vật trong canh trường lên men. Trong hệ thống lên men này, 500 g glucose được vi sinh vật tiêu thụ hết và 233 g dung môi được thu hồi. Hiệu suất quá trình lên men đạt 0.47 g/g với tốc độ thu hồi dung môi đạt 1,16 g/l.h. Hình 22: Sơ đồ hệ thống tách chiết butanol từ quá trình lên men ABE bằng phương pháp gas stripping. A: bơm điều chỉnh tốc độ khí vào bình lên men, B: bình lên men có thiết bị sục khí, C: thiết bị ngưng tụ, D: hơi ABE ngưng tụ ra, E: thiết bị làm mát. b. Trích ly lỏng-lỏng: là một phương pháp hiệu quả khác để tách dung môi từ dịch lên men. Phương pháp này sử dụng dung môi hữu cơ để tách chiết butanol từ dịch lên men. Ưu điểm của phương pháp là butanol có khả năng hòa tan rất tốt trong các dung môi hữu cơ hơn so với nước trong dịch lên men. Phương pháp trích ly lỏng-lỏng thường sử dụng dung môi là rượu decanol và oleyl (Evans và Wang, 1988). Trong các quá trình lên men tĩnh theo chu kỳ, phương pháp trích ly lỏng-lỏng thường được kết hợp với quá trình chưng cất để tách chiết các dung môi thành riêng biệt.Theo Korbinian Kraemer và cộng sự (2010) quá trình tách chiết sử dụng phương pháp kết hợp này được biểu diễn theo mô hình sau: Hình 23: Sơ đồ hệ thống tách chiết butanol từ dịch sau lên men ABE bằng phương pháp trích ly lỏng-lỏng kết hợp chưng cất. Theo sơ đồ này, nếu sử dụng oleyl alcohol làm dung môi trích ly thì lưu lượng dịch sau lên men đi vào cột trích ly có thể đạt 738 kg/h với 87.5% dung môi được trích ly. Tổng năng lượng tiêu tốn cho toàn bộ quá trình là 15MJ/kg butanol. Như vậy, so với năng lượng mà butanol có thể tạo ra (36 MJ/kg) thì quá trình tách chiết trên mang lại lợi ích khá lớn về mặt năng lượng. Tuy nhiên, phương pháp này sẽ có nhiều mặt hạn chế nếu áp dụng để tách dung môi từ quá trình lên men liên tục, dung môi trích ly có khả năng gây ức chế của đến tế bào vi sinh vật trong quá trình lên men và có thể tạo thành hệ nhũ tương trong dịch lên men hạn chế sự trao đổi chất của vi sinh vật. Những vấn đề này có thể được khắc phục nếu dịch lên men và dung môi trích ly được ngăn cách bởi một màng bán thấm để trao đổi butanol giữa hai pha, phương pháp này được gọi là perstraction (Ezeji và cộng sự, 2007) c. Pervaporation: có thể được xem là kỹ thuật tách chiết butanol từ dịch lên men tốt nhất so với các phương pháp đã nêu trên. Pervaporation thể hiện ưu điểm vượt trội về mặt không gây ảnh hưởng xấu đến vi sinh vật trong dịch lên men, chi phí cho quá trình tách chiết là khá thấp. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật này là sử dụng một màng membrane xốp, dịch lên men sẽ được tiếp xúc với một mặt của membrane, tạo chân không ở mặt đối diện. Dung môi sẽ đi qua membrane theo dòng permeate và chuyển thành pha hơi sau đó được ngưng tự để thu hồi. Hình 24: Nguyên lý tách cấu tử trong hỗn hợp của phương pháp pervaporation. Các loại membrane có thể được sử dụng trong kỹ thuật này có thể làm từ vật liệu rắn như silicalite–silicone, polypropylene, zeolite.. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn sử dụng membrane lỏng để tách chiết butanol, dung môi lỏng oleyl alcohol sẽ được giữ trong các mao quản của polypropylene hình thành nên loại membrane lỏng đặc biệt oleyl- polypropylene. Tính ổn định của màng, khả năng chọn lọc cao và lưu lượng dòng qua màng là những yếu tố quan trọng trong quá trình tách chiết butanol bằng phương pháp pervaporation. Trong một nghiên cứu của Matsumura và cộng sự (1988), sử dụng membrane lỏng oleyl- polypropylene để tách butanol từ dịch lên men ở nồng độ thấp. Kết quả cho thấy membrane oleyl- polypropylene thể hiện tính chọn lọc tốt hơn so với membrane bằng silicone. Nhu cầu về năng lượng ít hơn 10 lần so với phương pháp chưng cất. Tuy nhiên, tính ổn định của membrane lỏng oleyl- polypropylene lại tương đối thấp. Để phát triển một loại membrane có thể giữ được tính ổn định khi nâng cao mức độ chọn lọc của membrane, Qureshi và cộng sự (1999) đã nghiên cứu tổng hợp một loại membrane từ phức hợp silicon-silicalite. Hình 25: Sơ đồ quá trình lên men tĩnh có bổ sung cơ chất kết hợp quá trình tách chiết dung môi bằng phương pháp pervaporation sử dụng membrane silicon-silicalite. 1: bồn chứa nước thải, 2: bồn chứa cơ chất, 3: bồn lên men, 4: membrane, 5: bồn làm lạnh ngưng tụ, 6: bơm chân không. Khi kết hợp phương pháp pervaporation sử dụng membrane silicon-silicalite với quá trình lên men ABE sử dụng chủng C. beijerinckii BA101, Qureshi và cộng sự (1999) nhận thấy tổng nồng độ dung môi đạt được tăng gấp hai lần ( từ 24.2 g/l với quá trình lên men thường lên 51.5 g/l khi kết hợp với quá trình pervaporation). Tốc độ sinh tổng hợp dung môi tăng từ 0.35 lên 0.98 g/l.h, quá trình pervaporation đã không ảnh hưởng tới sự phát triển của C. beijerinckii BA101. Tính chọn lọc của membrane từ phức hợp silicon-silicalite cao gấp 2.2 lần so với membrane lỏng oleyl- polypropylene. Từ những kết quả trên cho thấy, khi kết hợp các phương pháp tách chiết dung môi từ dịch lên men đều ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp sản phẩm của vi khuẩn trong canh trường lên men.Khi dung môi được tách một phần ra khỏi môi trường trong quá trình lên men, sự ức chế của dung môi lên vi sinh vật giảm dần làm tăng khả năng hoạt động của vi khuẩn từ đó làm tăng hiệu suất của quá trình lên men. Tùy vào quy mô và các điều kiện từ quá trình lên men ABE, việc lựa chọn và sử dụng các phương pháp tách chiết dung môi sẽ mang lại hiệu quả cao hơn so với các quá trình lên men thông thường. Chương 6: Kết Luận Các nghiên cứu về quá trình lên men ABE đa số đều tập trung sử dụng hai loài vi khuẩn là Clostridium beijerinckii và Clostridium acetobutylicum. Các chủng đột biến từ hai loài này thể hiện ưu điểm vượt trội về khả năng sinh tổng hợp dung môi ở nồng độ cao. Cả hai loài đều lên men ở cùng nhiệt độ và pH tối thích tương ứng là 35oC và 5.5. Trong khi đó, loài C.Saccharoperbutylacetonicum lại lên men tốt nhất ở điều kiện 30oC và ph 6.0. Tuy nhiên khả năng sinh tổng hợp dung môi của C.Saccharoperbutylacetonicum lại kém xa so với hai loài C. acetobutylicum và C. beijerinckii. Khi sử dụng các loại đường pentose và hexose làm cơ chất cho quá trình lên men thì glucose thể hiện là cơ chất được ưa thích nhất của các loài Clostridium. Nồng độ dung môi cao nhất đạt được khi sử dụng glucose làm cơ chất của chủng C. acetobutylicum P260 là 21.37 g/l (hiệu suất 0.36), trong khi của chủng C. beijerinckii BA101 là 17.8 g/l (hiệu suất 0.30). Mức độ ưa thích các loại đường khác nhau của loài Clostridium beijerinckii theo thứ tự là glucose>xylose>arabinose>mannose và của loài Clostridium acetobutylicum là glucose>arabinose>xylose>galactose. Các nghiên cứu về sử dụng các nguồn cơ chất carbohydrate rẻ tiền có sẵn trong tự nhiên đã cho những kết quả khả quan. Quá trình lên men ABE từ bột sắn sử dụng chủng C. beijerinckii BA101 đã đạt được nồng độ butanol trong dịch lên men khá cao 20.81 g/l, tốc độ sinh tổng hợp butanol là 0.22 g/l.h. Ngoài ra, các nguồn cơ chất rẻ tiền khác như xơ bắp, bã nho, dịch thủy phân bo bo… cũng cho kết quả lên men khá tốt. Việc cố định tế bào vi khuẩn đã được nghiên cứu trên các loại chất mang khác nhau như: Ca-alginate, than hoạt tính, stainless steel scrubber, nylon scrubber, các hạt polyurethane, fruit bunch fiber… Trong đó, Ca-alginate và các hạt polyurethane thể hiện là những chất mang tốt, mang lại hiệu quả cao hơn so với quá trình lên men bằng vi khuẩn tự do. Kết hợp với các phương pháp tinh chiết dung môi từ dịch lên men, các quá trình lên men ABE đã cho hiệu suất cao hơn, giúp làm giảm sự ức chế của dung môi lên hoạt động của vi khuẩn. Có thể thấy quá trình lên men sản xuất butanol từ vi sinh vật đã được nghiên cứu khá nhiều và cho thấy tiềm năng lớn để ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp.