Đồ án Các phương pháp định lượng các cấu tử hương của dịch nước nho sau lên men

LÔØI CAÙM ÔN Trong hoïc kì II naêm hoïc naøy, vieäc laøm Ñoà aùn moân hoïc Coâng ngheä Thöïc phaåm ñaõ giuùp cho chuùng em ngaøy moät tröôûng thaønh hôn trong kó naêng laøm vieäc ñoäc laäp vaø laøm vieäc nhoùm. Ñeå hoaøn thaønh ñoà aùn naøy, em ñaõ ñöôïc söï giuùp ñôõ vaø höôùng daãn cuûa nhieàu thaày coâ trong boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm vaø baïn beø. Em xin chaân thaønh caùm ôn ñeán coâ Toân Nöõ Minh Nguyeät ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo cho em trong thôøi gian laøm Ñoà aùn moân hoïc naøy. Do thôøi gian vaø khaû naêng coù haïn neân ñoà aùn naøy coøn nhieàu sai soùt, mong quyù thaày coâ vaø baïn beø chæ baûo vaø goùp yù theâm ñeå em coù theå ngaøy caøng hoaøn thieän ñöôïc nhöõng maûng kieán thöùc veà Coâng ngheä Thöïc phaåm. LÔØI MÔÛ ÑAÀU Röôïu vang laø moät trong nhöõng saûn phaåm leân men coù lòch söû laâu ñôøi nhaát. Noù ñöôïc öa thích taïi nhieàu nôi treân theá giôùi bôûi höông vò heát söùc ñaëc tröng, ñem laïi caûm giaùc saûng khoaùi vaø söùc khoûe cho ngöôøi söû duïng. Höông vò ñöôïc xem laø moät trong nhöõng yeáu toá quan troïng nhaát quyeát ñònh ñeán ñaëc ñieåm vaø chaát löôïng röôïu vang. Theo nghieân cöùu cuûa caùc nhaø khoa hoïc thì höông vò cuûa röôïu vang laø söï toång hôïp cuûa hôn 800 hôïp chaát deã bay hôi thuoäc caùc nhoùm nhö: röôïu, esterr, acid höõu cô, phenol, thiol, monoterpen vaø nor-isoprenoid. Chuùng ñöôïc taïo thaønh töø quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men vaø phaûn öùng giöõa caùc hôïp chaát hoùa hoïc trong quaù trình taøng tröõ röôïu vang. Caùc caáu töû höông trong dòch nöôùc nho sau leân men seõ goùp phaàn quyeát ñònh ñeán höông vò röôïu vang thaønh phaåm. Tuøy loaïi röôïu vang saûn xuaát maø thaønh phaàn cuûa caùc caáu töû höông cuûa dòch nöôùc nho leân men seõ khaùc nhau. Vì vaäy, vieäc ñònh löôïng caùc caáu töû höông laø voâ cuøng quan troïng ñeå xaùc ñònh chaát löôïng vaø ñieàu chænh thaønh phaàn caáu töû höông theo mong muoán, vaø nhöõng phöông phaùp ñònh löôïng cuõng goùp phaàn khoâng nhoû vaøo vieäc nghieân cöùu cuûa caùc ñeà taøi lieân quan ñeán nöôùc nho sau naøy. Nhieäm vuï chính cuûa ñoà aùn “Caùc phöông phaùp ñònh löôïng caùc caáu töû höông cuûa dòch nöôùc nho sau leân men” laø tìm hieåu veà caùc phöông phaùp taùch chieát cuõng nhö ñònh löôïng caùc caáu töû höông coù haøm löôïng khaùc nhau trong dòch nho sau leân men. TOÅNG QUAN VEÀ DÒCH NHO LEÂN MEN VAØ CAÙC CAÁU TÖÛ HÖÔNG TRONG DÒCH NHO SAU LEÂN MEN TOÅNG QUAN VEÀ DÒCH NHO SAU LEÂN MEN Nho Leân men nöôùc nho laø moät phaàn trong quy trình saûn xuaát röôïu vang. Trong soá caùc loaïi quaû, nho laø nguyeân lieäu lyù töôûng nhaát ñeå saûn xuaát röôïu vang. Nho öa ñaát ít chua vaø khí haäu khoâ, nhieàu naéng. Vuøng ñaát Khaùnh Hoøa, Ninh Thuaän, Bình Thuaän laø nhöõng vuøng nho môùi vaø ñang phaùt trieån. [3] Vôùi röôïu vang, nho laø nguyeân lieäu thích hôïp nhaát vì [3]: Töø nho cho röôïu vang chaát löôïng toát nhaát, höông vò eâm dòu, haøi hoøa Thaøng phaàn dòch quaû nho raát thích hôïp cho leân men vaø thaønh phaàn röôïu thaønh phaåm nhieàu chaát dinh döôõng. Baûng 1.1: Thaønh phaàn cuûa dòch nho thoâng thöôøng [71] Hôïp chaát % trong dòch nho Nöôùc 75,0 Ñöôøng (fructose, glucose vaø moät ít saccharose) 22,0 Alcohols (ethanol vaø haøm löôïng veát cuûa terpenes, glycerols vaø röôïu baäc cao) 0,1 Acid höõu cô (tartaric, malic vaø moät ít lactic, succinic, oxalic,…) 0,9 Khoaùng (potassium, calcium vaø moät ít sodium, magnesium, iron,…) 0,5 Phenols (caùc flavonoid nhö laø caùc chaát maøu cuøng vôùi caùc nonflavonoid nhö laø cinnamic acid vaø vanillin) 0,3 Caùc hôïp chaát chöùa nitô (protein, amino acid, humin, amide, ammonia,…) 0,2 Caùc hôïp chaát höông (caùc esterr nhö laø ethyl caproate, ethyl butyrate,…) Veát TOÅNG 100,0 Phaân loaïi Nho thuoäc giôùi Plantae, ngaønh Magnoliophyta, lôùp Magnoliopsida, boä Vitales, hoï Vitaceae, chi Vitis. Trong ñoù, theo nghieân cöùu vaø thöïc teá saûn xuaát, loaøi Vitis vnifera ñöôïc cho laø thích hôïp nhaát ñeå saûn xuaát röôïu vang vì: noù chöùa haøm löôïng chaát dinh döôõng cao cho söï phaùt trieån cuûa naám men, chöùa haøm löôïng acid ñuû cao ñeå öùc cheá caùc vi sinh vaät daïi, haøm löôïng ñöôøng thích hôïp cho leân men, vaø cuoái cuøng laø coù theå taïo höông vò phuø hôïp [75,76] Nho coù hai loaïi: nho ñoû ñeå saûn xuaát röôïu vang ñoû vaø nho xanh ñeå saûn xuaát röôïu vang traéng.[1,3] Nho traéng: traùi nho khi chín voû khoâng coù maøu hoaëc maøu vaøng luïc nhaït. Nho ñoû: traùi nho khi chín voû coù maøu ñoû – tím ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau a) b) Hình 1.1: Nho xanh (a) vaø nho ñoû (b) Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa nho Ñöôøng Thoâng thöôøng dòch nho ñeå saûn xuaát röôïu vang chöùa 16 – 26% (w/v) ñöôøng. Trong nho khoâ vaø trong nho thu hoaïch treã, haøm löôïng ñöôøng coù theå leân tôùi treân 30% (w/v). Dòch nho coâ ñaëc vôùi haøm löôïng ñöôøng 35oBx ñöôïc söû duïng ñeå saûn xuaát röôïu vang coù haøm löôïng coàn cao. Haøm löôïng ñöôøng cao coù theå aûnh höôûng ñeán khaû naêng leân men cuûa naám men [40]. Dòch nho tröôùc khi leân men thöôøng chöùa tyû leä caân baèng cuûa glucose vaø fructose. Trong suoát quaù trình leân men, taát caû caùc chuûng Saccharomyces cerevisiae ñeàu öu tieân söû duïng glucose hôn laø fructose. Haøm löôïng ethanol cao coù taùc ñoäng öùc cheá maïnh söï söû duïng fructose hôn laø glucose. Trong khi ñoù, boå sung nitô vaøo dòch nho seõ kích thích söï söû duïng fructose hôn laø glucose [9,15,61]. Nitô Caùc hôïp chaát nitô raát caàn cho söï phaùt trieån vaø trao ñoåi chaát cuûa naám men. Trong soá caùc chaát dinh döôõng maø naám men coù theå söû duïng ñöôïc trong suoát quaù trình leân men dòch nho, veà soá löôïng, nitô laø thaønh phaàn quan troïng thöù hai sau caùc hôïp chaát carbon. Coù nhieàu hôïp chaát chöùa nitô coù maët trong dòch nho, vôùi haøm löôïng thay ñoåi töø 60 – 2400mg/L [27]. Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng söû duïng caùc nguoàn nitô khaùc nhau ñeå phaùt trieån, nhöng khoâng phaûi taát caû caùc nguoàn nitô ñeàu hoã trôï phaùt trieån toát nhö nhau. Caùc nguoàn nitô toát laø ammonium, glutamine vaø asparagine, trong khi ñoù proline vaø urea ñöôïc xem nhö laø nhöõng nguoàn nitô keùm chaát löôïng [27]. Taát caû caùc hôïp chaát chöùa nitô tích luõy trong dòch nho bò bieán ñoåi thaønh moät trong hai saûn phaåm cuoái laø ammonium hoaëc glutamat. Glutamat cuøng vôùi glutamine ñoùng moät vai troø quan troïng trong quaù trình trao ñoåi nitô cuûa naám men. Töø 2 amino acid naøy taát caû caùc hôïp chaát chöùa nitô trong teá baøo ñöôïc taïo ra [27]. Acid höõu cô Trong nho vaø röôïu vang, 6 acid chieám thaønh phaàn chính laø acid tartaric, acid malic, acid citric, acid lactic, acid succinic vaø acid acetic. Trong ñoù, acid acetic laø hôïp chaát deã bay hôi coøn caùc acid khaùc laø acid khoâng bay hôi. Ñoä phaân ly cuûa caùc acid naøy giaûm theo thöù töï sau: acid citric, acid tartaric, acid malic, acid succinic, acid lactic, vaø acid acetic. Baûng 1.2: Thaønh phaàn caùc moät soá acid höõu cô chính trong dòch nho ñoû vaø röôïu vang ñoû [62] Acid höõu cô Dòch nho ñoû Röôïu vang ñoû Acid citric Acid tartaric Acid malic Acid succinic Acid lactic Acid acetic 0,25 – 0,35g/L 4,07 – 7,65g/L 1,99 – 2,91g/L Raát ít Raát ít Raát ít 0,17 – 0,40g/L 2,60` – 5,7g/L 0,06 – 3,13g/L 0,48 – 1,22g/L 0,07 – 4,89g/L 0,30 – 1,44g/L SO2 Sulfur dioxide ñöôïc söû duïng roäng raõi trong röôïu vang nhö laø moät chaát choáng oxy hoùa, taùc nhaân khaùng khuaån vaø ñoàng thôøi cuõng laø taùc nhaân cho vieäc choïn loïc caùc loaøi hoaëc chuûng coù theå phaùt trieån vaø ñoùng goùp vaøo quaù trình leân men. Trong röôïu vang, SO2 toàn taïi ôû 2 daïng: töï do vaø lieân keát. Nhöng chæ SO2 töï do môùi coù tính khöû vaø dieät khuaån. Maëc duø vaäy, moät vaøi daïng SO2 lieân keát coù theå chuyeån hoùa thaønh SO2 töï do vaø coù theå buø laïi cho löôïng SO2 bò giaûm trong quaù trình leân men. Vì theá, SO2 laø moät thoâng soá quan troïng aûnh höôûng ñeán ñoäng hoïc quaù trình leân men vaø chaát löôïng röôïu vang [14,24]. Beân caïnh ñoù, SO2 coøn coù aûnh höôûng xaáu ñeán quaù trình leân men röôïu vang: daãn tôùi keùo daøi thôøi gian leân men hoaëc quaù trình leân men keát thuùc khi haøm löôïng ñöôøng soùt coøn cao, vaø aûnh höôûng ñeán tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang [6,24]. Tannin Trong caùc thaäp kyû qua, thaønh phaàn polyphenolic ñöôïc quan taâm do noù aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quan cuûa röôïu vang (maøu saéc vaø muøi vò) vaø caùc giaù trò dinh döôõng khaùc (theo quan ñieåm veà y hoïc, tannin ñöôïc xem laø chaát choáng oxi hoùa, choáng khoái u vaø beänh maïch vaønh). Tannin coù ôû 2 daïng laø tannin ngöng tuï vaø tannin thuûy phaân [75]: Tannin thuûy phaân: coù nguoàn goác töø caùc acid phenolic nhö laø acid gallic vaø acid ellagic. Tannin ngöng tuï: laø polymer cuûa flavan-3-ol (epicatechin, catechin vaø gallocatechin) vaø flavan-3,4-diol. Tannin coù ôû trong nho vaø röôïu vang chuû yeáu laø caùc tannin ngöng tuï [75]. Tannin coù theå ñöôïc theâm vaøo röôïu vang döôùi daïng acid tannic ñeå phaûn öùng vaø keát tuûa vôùi protein vaø ñeå caûi thieän ñoä trong cuûa röôïu vang. Trong suoát quaù trình uû, söï thay ñoåi haøm löôïng tannin ngöng tuï seõ aûnh höôûng ñeán maøu saéc vaø tính chaát caûm quan cuûa röôïu vang, vaø khi ñoù, khoái löôïng phaân töû cuûa tannin coù theå taêng leân [75]. Naám men söû duïng ñeå leân men dòch nho Naám men laø vi sinh vaät quan troïng, kieåm soaùt quaù trình leân men coàn trong saûn xuaát röôïu vang. Naám men trong quaù trình leân men röôïu vang coù theå coù töø 3 nguoàn goác khaùc nhau: beà maët traùi nho, beà maët thieát bò vaø töø canh tröôøng ñöôïc caáy vaøo. Thaønh phaàn vaø chaát löôïng cuûa röôïu vang coù lieân quan chaët cheõ ñeán naám men. Trong quaù trình leân men, beân caïnh caùc saûn phaåm chính laø ethanol vaø CO2, naám men taïo thaønh nhieàu saûn phaåm phuï, ví duï nhö glycerol, acid acetic, acid succinic vaø ñaëc bieät laø caùc hôïp chaát höông, goùp phaàn ñaùng keå vaøo chaát löôïng cuûa röôïu vang.[3,58,59] Caùc naám men thöôøng gaëp Gioáng naám men thöôøng söû duïng nhaát trong saûn xuaát vang laø saccharomyces. Chuùng coù baøo töû trong nang thöôøng laø 1-4 baøo töû, coù khi leân ñeán 8. Teá baøo cuûa chuùng coù hình daùng khaùc nhau nhö troøn, oval, elip. Chuùng sinh saûn baèng caùch naûy choài, söû duïng ñöôøng trong quaù trình hoâ haáp vaø leân men, khoâng söû duïng ñöôïc muoái nitrat. Gioáng saccharomyces coù tôùi 18 loaøi , nhöng chæ coù 7 loaøi thöôøng gaëp trong nöôùc quaû.[3] Moät soá naám men thöôøng gaëp nhaát trong saûn xuaát röôïu vang [3,27]: Saccharomyces cerevisiae: Naám men naøy phoå bieán trong quaù trình leân men nöôùc quaû vaø chieám tôùi 80% trong toång soá saccharomyces coù trong nöôùc quaû khi leân men. Khaû naêng keát laéng cuûa noù phuï thuoäc vaøo töøng noøi: caùc teá baøo daïng buïi hay daïng boâng. Nguoàn dinh döôõng carbon cuûa chuûng naøy laø ñöôøng, coàn, vaø acid höõu cô, nhöõng taùc nhaân sinh tröôûng laø acid pantotenic, biotin, thiamin, vaø piridoxin. Ña soá caùc teá baøo cuûa chuûng naøy hình oval, kích thöôùc (3-8)x (5-12) m, sinh saûn theo caùch naûy choài vaø taïo thaønh baøo töû. S.cerevisiae sinh ra enzym invertase coù khaû naêng chuyeån ñöôøng saccharose thaønh glucose vaø fructose, vì vaäy trong leân men ta coù theå boå sung loaïi ñöôøng naøy vaøo dòch quaû. Haøm löôïng röôïu ñöôïc taïo thaønh bình thöôøng ñoái vôùi nhieàu noøi cuûa naám men naøy chæ ñaït 8-10% theå tích Ngoaøi S.cerevisiae, ñoâi khi ngöôøi ta coøn söû duïng caùc chuûng naám men khaùc nhö S.uvarum, S. chevalieri, S. oviformis, Henseniaspora apiculate … Caùc tieâu chuaån löïa choïn naám men [3,27] Coù löïc leân men cao ñoái vôùi nöôùc quaû, söû duïng ñöôøng cho leân men gaàn nhö laø hoaøn toaøn, keát laéng toát, laøm trong dòch röôïu nhanh, chòu ñöôïc ñoä röôïu cao vaø ñoä acid cuûa moâi tröôøng, cuõng nhö caùc chaát saùt truøng, chòu aùp suaát thaåm thaáu toát, sinh khoái taïo thaønh vöøa phaûi, taïo cho röôïu vò thôm ngon thanh khieát. Taïo thaønh ít sulphite, thiol, ít acid deã bay hôi vaø röôïu baäc cao, hoaït tính esterrase thaáp Coù tính oån ñònh cao veà maët di truyeàn, khaû naêng chòu sulphite cao, ít lieân keát vôùi sulphite, ít taïo boït, coù khaû naêng keát boâng, keát laéng caën nhanh, nhu caàu nitô thaáp Caùc saûn phaåm taïo thaønh trong quaù trình leân men dòch nho Saûn phaåm taïo thaønh do quaù trình trao ñoåi chaát cuûa naám men Ñaây laø nhöõng chaát do naám men taïo ra trong quaù trình soáng vaø ñöôïc giaûi phoùng vaøo moâi tröôøng. Moät soá chaát naøy laø saûn phaåm trao ñoåi chaát cuûa naám men raát ñaùng ñöôïc quan taâm ñoái vôùi röôïu vang, ñaëc bieät chuùng taïo ra höông ñöôïm vaø vò dòu eâm cuûa vang. [3,6] Trong leân men coù hai saûn phaåm chính taïo thaønh laø ethanol vaø CO2. Ngoaøi ra coøn coù caùc saûn phaåm phuï laø caùc chaát thöù caáp hay laø caùc saûn phaåm baäc 2. Caùc saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh töø protein hay acid amin vôùi caùc chaát phaân giaûi trung gian cuûa ñöôøng taïo thaønh caùc loaïi röôïu baäc cao. Ngoaøi ra coøn coù glycerin, acid succinic, acetaldehyde, acid acetic, aicid propionic, acid lactic, acid citric, acetoin, diacethyl, ester.[3,6] Glycerin: taïo thaønh trong leân men khi acetaldehyde lieân keát vôùi Natri bisulphite. Noù taïo thaønh maïnh meõ khi baét ñaàu leân men. Nhôø coù vò ngoït vaø saùnh nhö daàu, glycerin ñoùng vai troø nhaát ñònh trong vieäc taïo vò haøi hoøa cho röôïu vang. Bình thöôøng, haøm löôïng cuûa noù trong dòch nho sau leân men khoaûng 7-14g/L. Aceton vaø diacethyl: ñeàu aûnh höôûng ñeán chaát löôïng vang, maëc duø soá löôïng cuûa chuùng ñöôïc taïo ratrong vang khoâng lôùn laém. Acetoin 2-84 mg/L, diacethyl 0,1-1,8 mg/L. Diacethyl ôû noàng ñoä thaáp taïo cho vang coù muøi xaùc ñònh, nhöng lôùn hôn 1 mg/L seõ taïo cho vang muøi vò chua oxy hoùa. Nhöõng loaïi champagne vaø vang khoâ toát thöôøng diacethyl chæ ôû daïng veát. Vieäc taïo thaønh acetoin coù lieân quan ñeán quaù trình sulphite hoùa dòch quaû: dòch quaû khoâng sulphite hoùa cho haøm löôïng acetoin cao gaáp hai laàn dòch quaû ñaõ sulphite hoùa. Vieäc taïo thaønh hai chaát naøy phuï thuoäc vaøo noàng ñoä ñöôøng ban ñaàu: noàng ñoä caøng cao caøng tích tuï nhieàu diacethyl. Aldehyde: hay gaëp nhaát laø acetaldehyde, aldehyde propionic, butyric, valeric, enantic.. Caùc aldehyde naøy coù muøi raát gaét. Khi pha loaõng, tröø acetaldehyde, caùc alhehyde khaùc coù muøi deã chòu cuûa toâng muøi quaû töï nhieân. Acetaldehyde thöôøng tích tuï trong vang vôùi löôïng khaù nhoû. Caùc acid: caùc acid bay hôi thöôøng gaëp laø acid acetic, propionic, isobutyric, butyric, isovaleric, caproic, caprilic, valeric. Caùc loaïi acid deã bay hôi ñöôïc tích tuï chuû yeáu ôû giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình leân men. Acid acetic ñöôïc taïo thaønh nhanh choùng giai ñoaïn ñaàu, sau ñoù giaûm roõ reät trong giai ñoaïn cuoái laø do moät soá naám men coù theå duøng acid acetic laøm cô chaát dinh döôõng. Ngoaøi ra, trong vang coøn coù caùc acid khaùc nhö: acid lactic, citric, malic, cetoacid. Caùc ester: ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình leân men vaø ñoùng moät vai troø quan troïng trong vieäc hình thaønh höông vò cuûa vang. Caùc ester taïo thaønh raát phöùc taïp vaø khaùc nhau khi söû duïng caùc gioáng vaø loaøi naám men khaùc nhau. Trong caùc ester, ethyl acetat vöôït troäi nhaát veà haøm löôïng, noù coù muøi quaû töï nhieân, vaø ñaây laø moät trong nhöõng caáu töû taïo höông quan troïng nhaát. Ngöôõng caûm nhaän cuûa noù laø 180-200 mg/L, neáu thaáp hay cao hôn möùc naøy ñeàu aûnh höôûng tröïc tieáp tôùi vò cuûa vang, cao hôn seõ cho vò gaét, khoù chòu. Caùc ester thuoäc caû 2 nhoùm coù ñoä soâi cao vaø thaáp. Ñieàu kieän leân men chæ aûnh höôûng tôùi soá löôïng ester. Leân men ôû ñieàu kieän kò khí seõ taïo thaønh ester nhieàu gaáp 6 laàn so vôùi hieáu khí vaø 4 laàn so vôùi leân men döø thöøa CO2. Leân men ôû ñieàu kieän kò khí hay hieáu khí seõ daãn ñeán vieäc thay ñoåi noàng ñoä cuûa caùc ester coù ñoä soâi cao vaø laøm taêng noàng ñoä caùc ester coù ñoä soâi thaáp. Lipid: lipid coù trong vang coù theå töø 2 nguoàn laø quaû vaø chuûng loaøi naám men. Treân beà maët nho thöôøng phuû moät lôùp saùp vaø chaát saùp naøy seõ rôi vaøo dòch quaû. Caùc acid beùo thöôøng gaëp trong vang laø acid oleic, linoleic, stearic vaø palmitic Röôïu baäc cao: ñöôïc taïo thaønh töø quaù trình khöû amin hoaëc chuyeån amin cuûa caùc acid amin, tieáp nöõa laø khöû carbonyl cuûa caùc cetoacid vaø khöû caùc aldyhyde trong quaù trình leân men röôïu. Trong vang, ta thaáy coù caùc röôïu sau: methanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, isobutanol, n-pentanol, 2-methyl butanol, 3-methyl butanol, n-heanol, triptofol, phenyl ethylic. Haøm löôïng caùc röôïu naøy phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän leân men dòch nho. Trong ñieàu kieän dö oxi khoâng khí thì seõ taïo thaønh caùc röôïu baäc cao coù haøm löôïng lôùn hôn ñieàu kieän kò khí. Moät soá röôïu maïch voøng nhö triptofol, phenyl ethylic goùp phaàn taïo höông vò eâm dòu cho vang. Sulfuhydryl (-SH): laøm thay ñoåi theá oxi hoùa-khöû cuûa moâi tröôøng. Ñaây laø caùc hôïp chaát coù tính khöû cao, noù seõ giuùp baûo veä caùc caáu töû höông khoûi bò taùc duïng cuûa caùc chaát oxi hoùa. Caùc saûn phaåm taïo thaønh töø quaù trình töï phaân cuûa naám men Töï phaân laø söï phaân huûy caùc caáu töû teá baøo döôùi taùc duïng cuûa caùc enzym thuûy phaân cuûa chính baûn thaân teá baøo. Trong quaù trình töï phaân naøy, protein, hydrocarbon, nucleotide, lipid vaø caùc vaät chaát teá baøo khaùc seõ bò phaân huûy. Saûn phaåm seõ hoøa tan vaøo moâi tröôøng. Ñieàu kieän ñeå coù söï töï phaân laø teá baøo ñaõ cheát vaø vaãn coøn giöõ ñöôïc hoaït tính cuûa caùc enzym noäi baøo. [3] Nhieàu nhaø khoa hoïc ñaõ khaúng ñònh, quaù trình taøng tröõ dòch nho sau leân men hoaëc boå sung caùc saûn phaåm töï phaân cuûa naám men seõ laøm taêng chaát löôïng höông vò cuûa dòch nho sau leân men (cuõng nhö vang). Caùc saûn phaåm daïng naøy thöôøng laø caùc hôïp chaát chöùa Nitô vaø ñaëc bieät laø caùc vitamin nhoùm B, ñaëc bieät laø acid pantotenic-vitamin B3 vaø acid nicotinic- vitamin B5 (laø nhöõng chaát coù hoaït tính sinh hoïc cao, moät löôïng nhoû cuõng aûnh höôûng ñeán caùc quaù trình hoùa sinh laøm cho dòch nho sau leân men “chín” vaø hình thaønh höông vò cho saûn phaåm).[3] 1.2 CAÙC CAÁU TÖÛ HÖÔNG TRONG DÒCH NHO SAU LEÂN MEN 1.2.1 Phaân loaïi Tìm hieåu veà baûn chaát hoùa hoïc cuûa caùc caáu töû höông cuûa dòch nho sau leân men cuõng nhö röôïu vang, ngöôøi ta thöôøng quan taâm ñeán vieäc ñònh tính vaø ñònh löôïng chuùng. Caùc caáu töû höông coù haøm löôïng thay ñoåi trong moät khoaûng raát roäng (tuøy loaïi nho vaø vang) vaø haøm löôïng raát khaùc nhau. Vì vaäy, vieäc phaân tích ñònh löôïng chuùng cuõng khaù khoù khaên vaø phaûi coù chieán löôïc phaân tích hôïp lyù.[33,41,42,60,64] Moät trong caùc chieán löôïc phaân tích ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc uûng hoä laø phaân loaïi caùc caáu töû höông trong dòch nho sau leân men theo haøm löôïng goàm 3 nhoùm nhö sau [60]: Nhoùm 1: Bao goàm caùc caáu töû deã phaân tích, thöôøng laø nhöõng caáu töû coù haøm löôïng khaù cao (C>0,1 mg/L) nhö acetaldehyde, caùc röôïu baäc cao, acid beùo vaø moät soá ethyl ester. Caùc caáu töû naøy thöôøng ñöôïc phaân tích khaù ñôn giaûn: chuùng ñöôïc taùch khoûi hoãn hôïp qua moät böôùc taùch ñôn giaûn roài ñem chaïy saéc kí khí vôùi ñaàu doø FID Nhoùm 2: goàm caùc caáu töû coù khaû naêng phaân tích trung bình. Ñeå phaân tích chuùng, ngöôøi ta seõ taùch rieâng chuùng khoûi hoãn hôïp ñoàng thôøi laøm giaøu (taêng noàng ñoä) tröôùc khi phaân tích GC-MS. Caùc caáu töû naøy thöôøng naèm trong khoaûng noàng ñoä töø 0,1g/L ñeán 0,1 mg/L, goàm caùc caáu töû nhö caùc hôïp chaát phenol, lactone, daãn xuaát cuûa vanillin, moät soá ester haøm löôïng thaáp vaø moät soá hôïp chaát nor-isoprenoid (nhö damascenone vaø ionone) Nhoùm 3: goàm caùc hôïp chaát raát khoù phaân tích. Ñaây laø nhöõng hôïp chaát ít nhaïy vôùi phaân tích saéc kí vaø khoâng beàn hoùa hoïc, vaø thöôøng ôû noàng ñoä cöïc kì thaáp, goàm caùc hôïp chaát deã bay hôi chöùa löu huyønh, moät soá aldehyde, alkyl methoxypyrazine, furaneol vaø moät soá thiol thôm. Vieäc phaân tích caùc hôïp chaát naøy ñoøi hoûi nhöõng phöông phaùp taùch chieát ñaëc hieäu hoaëc phaûi taïo daãn xuaát tröôùc khi phaân tích saéc kí. Chieán löôïc phaân tích thöôøng thaáy cuûa caùc nhaø khoa hoïc laø xaùc ñònh haøm löôïng caùc caáu töû thuoäc nhoùm 1 vaø 2. Caùc caáu töû nhoùm 2 thöôøng ñöôïc phaân tích bôûi caùc phöông phaùp hieän ñaïi nhö “vi chieát” (microextraction) nhöng caùc phöông phaùp naøy thöôøng toán nhieàu thôøi gian phaân tích vaø caùc caáu töû phaân cöïc nhö vanillin thì khaû naêng taùch chieát khoâng cao [60]. Caùc caáu töû höông vaø nguoàn goác phaùt sinh Caùc caáu töû höông coù thaønh phaàn raát ña daïng vaø phöùc taïp veà caáu taïo hoùa hoïc. Do chuùng coù caùc nhoùm chöùc ñaëc bieät (nhö röôïu, aldehyde, acid…) neân tính chaát hoùa lyù raát khaùc nhau veà ñoä phaân cöïc, ñoä bay hôi vaø möùc ñoä taïo muøi vò. Trong quaù trình leân men röôïu, naám men vaø vi khuaån seõ giaûi phoùng ra haøng loaït caùc caáu töû deã bay hôi, chieám öu theá nhaát laø ethanol vaø glycerin, ngoaøi ra coøn coù caùc caáu töû höông thuoäc nhoùm aldehyde, röôïu baäc cao vaø ester. Trong caùc ester, ethyl acetat laø caáu töû chính vaø quan troïng nhaát goùp phaàn hình thaønh höông cuûa saûn phaåm, beân caïnh ñoù coøn coù caùc loaïi ester cuûa caùc röôïu baäc cao vaø caùc acid beùo maïch trung bình. Caùc ethyl ester cuûa acid beùo (ethyl decanoat, ethyl hexanoat, ethyl octanoat) vaø caùc röôïu baäc cao (röôïu isoamylic, valeric…) laø nhöõng hôïp chaát taïo höông quan troïng cuûa dòch nho leân men töø nho traéng. [6,26,31,42,44,49,64] Thaønh phaàn höông trong dòch nho sau leân men (cuõng nhö röôïu vang) phuï thuoäc vaøo raát nhieàu yeáu toá, nhöõng yeáu toá quan troïng nhaát laø gioáng nho, quy trình leân men dòch nho, vieäc taøng tröõ dòch nho sau leân men (neáu coù). Muøi vò cuûa dòch nöôùc nho sau leân men (cuõngnhö röôïu vang) raát ña daïng, vaø caùc caáu töû höông ñöôïc taïo ra töø 3 nguoàn khaùc nhau: caáu töû coù saün trong traùi nho, taïo ra nhôø quaù trình leân men vaø sinh ra trong quaù trình toàn tröõ. Beân caïnh caùc caáu töû höông voán coù cuûa nho, caùc caáu töû höông khaùc seõ ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình xöû lyù thoâng qua caùc phaûn öùng hoùa hoïc, hoùa sinh vaø caùc phaûn öùng do nhieät ñoä (baûng 1.3). Ngoaøi ra, caùc caáu töû höông taïo thaønh töø quaù trình leân men vaø taøng tröõ cuõng goùp phaàn taïo thaønh höông vò cuoái cuøng voâ cuøng ña daïnh cho dòch nho (cuõng nhö röôïu vang). [18,31,44,48,49] Caùc caáu töû höông taïo ra töø caùc hôïp chaát coù saün trong dòch nho: caùc hôïp chaát coù saün trong dòch nho laø nhöõng tieàn chaát taïo höông. Caùc quaù trình xöû lyù nguyeân lieäu seõ phaùt sinh nhöõng phaûn öùng hoùa sinh, oxi hoùa do enzym vaø nhieät ñoä taïo ra caùc caáu töû höông cho dòch nho. Caùc caáu töû höông taïo thaønh töø quaù trình leân men chính:Söï khaùc nhau chuû yeáu veà höông giöõa caùc loaïi röôïu laø do caùc röôïu baäc cao. Hôn nöõa, haøm löôïng ethyl lactat taïo thaønh laø do quaù trình leân men malolactic trong vang ñoû. Sau leân men malolatic, haøm löôïng ethyl lactat khoaûng 39- 168mg/L. Veà caùc röôïu baäc cao, haøm löôïng khoaûng 190-260 mg/L ñoái vôùi vang traéng vaø 370-650 mg/L ñoái vôùi vang ñoû. Haøm löôïng caùc röôïu baäc cao döôùi 300 mg/L seõ ñoùng goùp vaøo höông vò ñaëc tröng cuûa vang, nhöng neáu quaù 400 mg/L seõ taïo ra höông vò khoâng toát. Vôùi caùc caáu töû höông taïo thaønh töø leân men phuï: Caùc röôïu baäc cao vaø caùc ester nhö ethyl lactat, ethyl acetat, 2-phenyl ethanol laø nhöõng caáu töû höông quan troïng nhaát. Beân caïnh ñoù coù theå keå ñeán ethyl 4-hydroxy butyrat, diethyl succinat, monoethyl succinic… Höông cuûa caùc caáu töû Gaàn ñaây, moät soá nhaø khoa hoïc ñaõ nghieân cöùu höông cuûa töøng thaønh phaàn caáu töû trong röôïu vang. Baûng 1.4 theå hieän caùc ñôn muøi cuûa moät soá caáu töû höông chính coù trong dòch nho sau leân men (cuõng nhö röôïu vang) Baûng 1.3: Thaønh phaàn caùc caáu töû höông trong dòch nho sau leân men [44] Nguoàn goác phaùt sinh Nhoùm chaát Caùc chaát ñieån hình Caùc phaûn öùng hoùa sinh Hôïp chaát 6C Terpen Benzenoid Phenol Norisoprenoid Hexanol, cis-3-Hexenol, trans-2-hexenol furan linalool oxit, linalool, -terpineol, cis, tran-pyran linalool oxit, nerol, geraneol, geranic acid, p-methen-7,8 diol, caùc ñoàng phaân dimethyl-dihydroxy-octadien, dimethyl-dihydroxy-octadiol benzaldehyde, methyl salycilat, -methyl benzenemethanol, benzylic, 2-phenyl ethanol, röôïu omovanilic, dihydro coniferylic 4-vinyl guaiacol, 4-vinyl phenol 3-hydroxy damascone, 3-oxo -ionol, 3,9-dihydroxy mega-5-en, vomifoliol Leân men sinh hoïc Ester vaø röôïu baäc cao Ethyl acetat, propanol, isobutanol, ethyl lactat, isoamylic Leân men phuï Röôïu Ester Acid Phenol Lacton Aldehyde Hexanol, cis-3 hexenol, butanol, benzylic, 2-phenyl ethanol, 4-methyl pentanol Isoamyl acetat, hexyl acetat, 2-phenyl ethyl acetat, ethyl hexanoat, ethyl decanoat, ethyl octanoat, isoamyl lactat, diethyl succinat, ethyl piruvat, ethyl-3-hydroxy butyrat, ethyl-4-hydroxy butyrat, diethyl malat, monoethyl-2-hydroxy glutarat, diethyl-2-hydroxy glutarat Butyric, isobutyric, isovaleric, hexanoic, octanoic, decanoic, 9-dodecanoic, monoethyl succinic 4-vinyl guaiacol butyrolacton Acetoin Baûng 1.4 Baûn chaát muøi cuûa caùc caáu töû höông trong dòch nho sau leân men [38] Hôïp chaát Höông Nhoùm Hôïp chaát Höông Nhoùm Geraneol 2-phenyl ethanol ionon Linalool Phenyl ethyl acetat Ethyl octanoat Isoamyl acetat Ethyl isobutyrat Ethyl hexanoat Hexyl acetate Ethyl cinnamat Ethyl 2-methyl butyrat Ethyl isovalerat 1-hexanol Diacethyl Geranium Hoa hoàng Violet Hoa hoàng Phaán hoa Taùo Chuoái Leâ Quaû Leâ Daâu Vieät quaát Daâu taèm Coû xanh Bô Caây coû Caây coû Caây coû Caây coû Caây coû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Hoa quaû Vi sinh Vi sinh Acid isovaleric Isoamylic Acid butyric Acetoin 3-hexen-1-ol Benzaldehyde Acid acetic Acid decanoic Sufur dioxit Ethyl acetat Acid octanoic Acetaldehyde Guaiacol p-cresol Phoâ mai Xaø phoøng Phoâ mai Cream Coû xanh Haïnh Giaám Xaø phoøng Löu huyønh Gum Oâi Sherry Goã Stable Vi sinh Thaûo moäc Vi sinh Vi sinh Thaûo moäc Thaûo moäc Haêng cay Hoùa hoïc Hoùa hoïc Hoùa hoïc Hoùa hoïc Hoùa hoïc Hoùa hoïc Hoùa hoïc CAÙC PHÖÔNG PHAÙP ÑÒNH LÖÔÏNG CAÁU TÖÛ HÖÔNG TRONG DÒCH NHO SAU LEÂN MEN Nhö ñaõ trình baøy ôû Chöông 1, caùc caáu töû höông laø nhöõng caáu töû deã bay hôi coù nhieät ñoä bay hôi vaø nhieät ñoä phaân huûy khaù thaáp. Maët khaùc, caùc caáu töû coù haøm löôïng laø raát khaùc nhau vaø dao ñoäng trong moät khoaûng lôùn (töø vaøi chuïc ng/L ñeán vaøi mg/L) vaø nhieàu caáu töû ôû daïng veát. Do vaäy, phöông phaùp phaân tích ñöôïc cho laø hieäu quaû nhaát vaø cuõng ñöôïc söû duïng gaàn nhö laø duy nhaát trong ñònh löôïng caùc caáu töû höông trong dòch nöôùc quaû laø phöông phaùp saéc kí khí (GC). Chöông naøy seõ trình baøy veà phöông phaùp phaân tích saéc kí khí vaø quan troïng hôn caû laø nhöõng phöông phaùp taùch chieát caáu töû höông tröôùc khi phaân tích GC. SAÉC KÍ KHÍ (GAS CHROMATOGRAPHY- GC) Khaùi nieäm vaø nguyeân taéc Saéc kyù laø phöông phaùp phaân tích caùc caáu töû coù trong hoãn hôïp döïa vaøo khaû naêng haáp phuï hay phaân boá khaùc nhau cuûa caùc caáu töû giöõa 2 pha: pha ñoäng vaø pha tónh. Saéc kyù khí (Gas Chromatography – GC) laø moät boä phaän cuûa kyõ thuaät phaân tích saéc kyù neân nguyeân taéc cuûa noù cuõng töông töï nhö caùc phöông phaùp phaân tích saéc kyù khaùc nhöng coù moät soá ñieåm khaùc bieät sau: Maãu phaân tích ôû traïng thaùi khí. Pha ñoäng: chaát khí hoaëc ôû daïng hôi. Pha tónh: coù theå goàm 2 loaïi: Pha tónh laø maøng moûng chaát loûng treân beà maët chaát haáp phuï raén: saéc kyù phaân boá hay coøn goïi laø saéc kyù khí – loûng. Pha tónh laø chaát haáp phuï raén: saéc kyù haáp phuï. Hieän nay saéc kyù khí söû duïng pha tónh laø chaát loûng ñöôïc aùp duïng nhieàu trong phaân tích thöïc phaåm. Caên cöù vaøo phoå saéc kyù ngöôøi ta ñònh löôïng ñöôïc caùc hôïp chaát bay hôi coù trong dung dòch maãu phaân tích. Vieäc nhaän bieát nhöõng hôïp chaát bay hôi coù trong dung dòch chieát ñöôïc thöïc hieän baèng caùch noái maùy saéc kyù vôùi maùy quang phoå khoái hoaëc quang phoå tia hoàng ngoaïi. Caáu taïo cuûa heä thoáng saéc kí khí [17,47,73] Hình 2.1: Sô ñoà caáu taïo heä thoáng saéc kí khí Boä phaän cung caáp khí mang: Boä phaän cung caáp khí mang laøm nhieäm vuï cung caáp khí mang cho heä thoáng. Hình 2.2 : Boä phaän cung caáp khí mang Khí ñöôïc löïa choïn laøm khí mang phaûi ñaùp öùng ñöôïc caùc yeâu caàu sau ñaây: Trô vôùi caáu töû khaûo saùt. Coù tyû khoái nhoû, nghóa laø ñoä nhôùt thaáp, ñeå laøm taêng vaän toác khí mang (vì ñoä giaûm aùp suaát qua coät taùch tyû leä vôùi ñoä nhôùt cuûa khí mang) Toàn taïi ôû daïng tinh khieát hay deã laøm cho tinh khieát. Khi xeùt quan heä giöõa chieàu cao ñóa lyù thuyeát H vaø vaän toác tuyeán tính cuûa doøng khí mang, loaïi khí mang naøo cho cöïc tieåu caøng traûi roäng caøng toát. Khi löïa choïn khí mang caàn chuù yù ñeán detector söû duïng, yeâu caàu taùch, söû duïng phoái hôïp caùc phöông thöùc khaùc. Moät soá loaïi khí mang thöôøng söû duïng trong saéc kyù khí: Khí H2: Trong phaân tích veát, khi söû duïng hydro thì pha tónh deã bò hoûng vaø trong saéc kyù ñieàu cheá caàn thieát phaûi laøm saïch vaø khoâ khí. Khí He: raát thích hôïp cho saéc kí khí nhieät ñoä cao. Khí Ar: do ñoä nhôùt cuûa Ar khaù cao, yeâu caàu veà daây daãn khi söû duïng noù khoâng gaëp khoù khaên laém. Khí Ar ngaøy caøng ñöôïc söû duïng nhieàu laøm khí mang. Khí N2: do khoâng nguy hieåm, giaù reû, deã daøng laøm tinh khieát neân noù ñöôïc söû duïng nhieàu trong saéc kí khí. Khoâng khí vaø O2: tröôùc khi söû duïng caàn phaûi saáy khoâ vì raát deã laãn nöôùc trong bôm ñöïng khí. Löu löôïng khí mang aûnh höôûng raát lôùn ñeán quaù trình taùch, do ñoù caàn ñieàu chænh vaän toác vaø aùp suaát khí mang qua coät heát söùc chaët cheõ. Boä phaän bôm maãu: Boä phaän bôm maãu duøng ñeå ñöa maãu caàn phaân tích vaøo coät saéc kí. Hình 2.3: Boä phaän tieâm maãu coù chia doøng Maãu daïng loûng ñöôïc bôm vaøo coät (baèng syringe) qua moät maøng cao su ñaëc bieät coù khaû naêng giöõ cho aùp suaát cuûa heä thoáng luoân oån ñònh goïi laø septum). Maãu tieâm vaøo, tröôùc khi vaøo ñeán coät phaûi ñaûm baûo ñöôïc hoùa khí hoaøn toaøn vaø phaûi ñi vaøo coät döôùi daïng moät daûi moûng. Vì vaäy, nhieät ñoä ôû boä phaän tieâm maãu thöôøng phaûi lôùn hôn nhieät ñoä bay hôi cuûa thaønh phaàn khoù bay hôi nhaát trong maãu ít nhaát laø 10oC, nhöng phaûi nhoû hôn nhieät ñoä laøm phaân huûy maãu. Ñoái vôùi maãu daïng khí, duøng heä thoáng ñaëc bieät ñeå ñöa maãu vaøo coät. Neáu maãu ôû daïng raén, caùch thoâng thöôøng laø hoøa tan maãu baèng dung moâi deã bay hôi vaø bôm vaøo coät nhö maãu loûng, nhöng hieän nay ñaõ phaùt minh ñöôïc boä laáy maãu raén tröïc tieáp. Löôïng maãu bôm vaøo coät coù theå dao ñoäng trong khoaûng 0,1 - 10ml ñoái vôùi maãu loûng, 0,5 – 10ml ñoái vôùi maãu khí. Khi söû duïng coät mao quaûn chæ caàn moät löôïng maãu raát nhoû, ñoâi khi khoâng theå ño ñöôïc moät caùch chính xaùc. Bôûi vaäy, trong tröôøng hôïp naøy ngöôøi ta thöôøng duøng theâm coät chia doøng (splitter). Ngoaøi ra, khi bôm maãu vaøo phaûi chuù yù sao cho maãu khoâng khueách taùn thaønh vuøng roäng maø taäp trung ôû ñaàu coät ôû dieän tích caøng nhoû caøng toát. Boä naïp maãu ñöôïc giöõ ôû nhieät ñoä thích hôïp theo chöông trình nhieät ñoä, thöôøng cao hôn nhieät ñoä hoùa hôi cuûa caáu töû moät ít. Vôùi caùc maùy hieän nay, haøng loaït maãu coù theå ñöôïc naïp vaøo maùy hoaøn toaøn töï ñoäng (autosampler) theo moät thöù töï ñaõ ñöôïc chöông trình hoùa tröôùc. Loø Loø laø buoàng ñieàu nhieät, coù taùc duïng gia nhieät, chuyeån maãu veà traïng thaùi khí. Thöôøng ñieàu chænh nhieät ñoä ôû boä phaän bôm maãu cao hôn moät chuùt so vôùi nhieät ñoä bay hôi cuûa maãu. Nhieät ñoä cuûa heä thoáng ñöôïc taêng daàn vaø giöõ coät oån ñònh nhieät trong quaù trình saéc kí. Coät saéc kí Coät saéc kí laø nôi xaûy ra qua trình taùch caùc caáu töû trong hoãn hôïp. Coät taùch saéc kyù phaûi thoûa maõn caùc yeâu caàu sau ñaây: Ñaûm baûo quaù trình trao ñoåi chaát giöõa pha ñoäng vaø pha tónh. Ñoä thaám cao, nghóa laø ñoä giaûm aùp suaát qua coät nhoû töông öùng vôùi moät toác ñoä khí mang nhaát ñònh. Taûi troïng cao. Laøm vieäc ôû nhieät ñoä cao vaø khoaûng nhieät ñoä söû duïng töông ñoái roäng. Trong kyõ thuaät phaân tích saéc kí khí ngöôøi ta söû duïng 2 loaïi coät: Coät nhoài Laøm baèng kim loaïi. Thöôøng coù ñöôøng kính coät lôùn (2-4 mm) nhöng chieàu daøi ngaén (1-6m). Chaát nhoài coät coù theå laø phaân cöïc hoaëc khoâng phaân cöïc. Pha tónh thöôøng ñöôïc gaén treân beà maët trong cuûa oáng nhôø moät phaûn öùng hoùa hoïc. Tính chaát cuûa pha tónh seõ quyeát ñònh tôùi thöù töï phaân tích cuûa caùc thaønh phaàn. Coät mao quaûn Laø moät oáng silic nung chaûy boïc ngoaøi baèng moät phim polimid chòu nhieät ñeán 370 – 400oC, hoaëc baèng moät lôùp nhoâm chòu nhieät ñeán 480oC. Khoâng coù chaát raén mang. Thaønh coät ñöôïc cheá taïo sao cho pha tónh coù theå traùng moät lôùp moûng ngay treân thaønh coät. Coù daïng hình xoaén. Ñöôøng kính nhoû nhöng chieàu daøi lôùn. Hieän nay, ngöôøi ta hay söû duïng coät mao quaûn thay cho coät nhoài. Vieäc cheá taïo ra coät mao quaûn ñöôïc xem laø moät phaùt minh quan troïng trong lónh vöïc saéc kyù. Nhôø trôû löïc doøng khí treân loaïi coät naøy giaûm ñaùng keå, ngöôøi ta coù theå taêng chieàu daøi coät leân raát lôùn (haøng traêm meùt) vaø do ñoù coät mao quaûn cho hieäu quaû taùch cao hôn nhieàu so vôùi coät nhoài. Baûng 2.2: Thoâng soá kyõ thuaät cuûa coät nhoài vaø coät mao quaûn Thoâng soá kyõ thuaät Coät nhoài Coät mao quaûn Chieàu daøi (m) 0,5 – 5 5 -100 ID (mm) 2 – 4 0,1 –0,7 Löu löôïng (ml/phuùt) 10 – 60 0,5 -15 Aùp suaát (PSI) 10 – 40 3 – 40 Toång soá ñóa 4000 250000 Söùc chöùa 10 mg/peak 100ng/peak Ñoä daøy cuûa film (mm) 1 -10 0,1 - 8 Hình 2.4: Coät saéc kyù (a) Coät nhoài (b) Coät mao quaûn Hình 2.5: Caáu taïo caùc loaïi coät saéc kyù Coù 2 loaïi coät mao quaûn chuû yeáu : Coät mao quaûn phim moûng PLOT, coù ñöôøng kính khoaûng 0,2 - 0,5mm; pha tónh ñöôïc taåm tröïc tieáp leân thaønh trong coät taïo thaønh lôùp phim moûng. Coät mao quaûn lôùp moûng WCOT, pha tónh laø moät lôùp moûng chaát haáp phuï tröïc tieáp leân thaønh mao quaûn. Hình 2.6: Caáu taïo cuûa coät mao quaûn lôùp moûng Trong saéc kyù khí-loûng, pha tónh loûng ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc taïo neân töông taùc caàn thieát ñeå caùc caáu töû ñöôïc taùch ra khoûi nhau. Qui taéc chung khi löïa choïn pha tónh laø caùc chaát gioáng nhau hoaø tan toát vaøo nhau. Ngoaøi ra, pha tónh khoâng ñöôïc phaûn öùng baát thuaän nghòch vôùi khí mang, chaát mang raén, vaø caùc caáu töû caàn taùch. Nhieät ñoä söû duïng toái ña cuûa pha tónh phaûi thaáp hôn ñieåm soâi khoaûng 70oC, sao cho aùp suaát hôi khoâng vöôït quaù 1 mmHg. Chaát mang raén Chaát raén mang trong saéc kyù khí – loûng thöôøng laø caùc chaát trô coù beà maët phaùt trieån nhöng ít loã xoáp ñeå khoâng xaûy ra hieän töôïng haáp phuï treân beà maët. Chaát mang thöôøng duøng laø diatomite. Ñeå taùch caùc chaát coù hoaït tính maïnh, coù theå duøng teflon laøm chaát mang. Ñoâi khi chaát mang coøn coù theå laøm töø boät thuûy tinh ôû daïng haït hình caàu raát mòn. Trong coät mao quaûn, thaønh mao quaûn ñoùng vai troø chaát mang (pha tónh ñöôïc cho tröïc tieáp leân thaønh mao quaûn). Chaát mang raén phaûi coù nhöõng ñaëc ñieåm sau: Trô, khoâng phaûn öùng vôùi pha tónh. Coù ñoä beàn cô hoïc, khoâng bò naùt vuïn khi nhoài vaøo coät. Coù ñoä beàn nhieät. Coù kích thöôùc ñoàng ñeàu vaø coù dieän tích beà maët lôùn (1-20m2/g). Pha tónh Trong saéc kí khí, pha tónh ñoùng vai troø chính trong vieäc taïo neân töông taùc caàn thieát ñeå caùc caáu töû ñöôïc taùch khoûi nhau. Pha tónh laø chaát loûng coù nhieät ñoä hoùa hôi cao, thuoäc loaïi dung moâi höõu cô, coù khaû naêng giöõ caùc caáu töû phaân tích ôû möùc ñoä khaùc nhau nhöng khoâng phaûn öùng hoùa hoïc vôùi chuùng. Noàng ñoä cuûa lôùp pha tónh gaén leân chaát mang phaûi ñuû lôùn sao cho chaát phaân tích khoâng keát hôïp vôùi chaát mang gaây khoù khaên cho vieäc taùch. Tuøy tính chaát phaân cöïc cuûa caùc caáu töû phaân tónh maø choïn pha tónh laø dung moâi phaân cöïc hay keùm phaân cöïc. Hieän nay coù raát nhieàu loaïi pha tónh ñöôïc söû duïng trong saéc kyù khí - loûng, tuy nhieân coù theå chia theo nhieàu nhoùm coù tính phaân cöïc cuûa phaân töû khaùc nhau: Nhoùm raát phaân cöïc: nöôùc, glycol, glycerin,… Nhoùm phaân cöïc: alcol maïch thaúng, acid beùo höõu cô, phenol,.. Nhoùm phaân cöïc vöøa phaûi: ete, ankanal, ester, amin baäc 3,.. Nhoùm ít phaân cöïc: hydrocacbon thôm, anken,.. Nhoùm khoâng phaân cöïc: ankan, sulfua,.. Ñaàu doø (detector) Coù raát nhieàu loaïi detector ñöôïc söû duïng trong phaân tích saéc kí khí. Tuøy vaøo ñoái töôïng phaân tích maø ta choïn loaïi detector söû duïng cho phuø hôïp. Trong saéc kyù, moät ñaàu doø lyù töôûng caàn coù caùc ñaëc ñieåm sau: Phaûi coù khaû naêng phaùt hieän chaát caàn phaân tích ngay khi noù ra khoûi coät. Ñuû nhaïy ñeå coù theå phaùt hieän caû khi chaát phaân tích coù haøm löôïng raát nhoû. Phaùt hieän phaûi ñaùp öùng vôùi söï thay ñoåi noàng ñoä ñeå coù theå ghi ñöôïc heát caùc muõi vaø caùc muõi khoâng bò bieán daïng, ñoä ñaùp öùng khoâng phuï thuoäc toác ñoä doøng. Ñaùp öùng tuyeán tính treân moät khoaûng noàng ñoä roäng. Ñaùp öùng gioáng nhau cho moïi loaïi hoùa chaát. OÅn ñònh vaø chính xaùc, ñöôøng neàn ít nhieãu, khoâng troâi. Nhieät ñoä söû duïng leân ñeán 400oC. Khoâng huûy maãu. Deã söû duïng. Moät soá loaïi ñaàu doø phoå bieán: Detector daãn nhieät (TCD) TCD caáu taïo döïa treân caùc ñieän trôû laøm baèng kim loaïi daãn nhieät raát toát : Au, Vonfram, Pt... Khi doøng khí mang ñi qua noù seõ laøm giaûm nhieät ñoä cuûa ñieän trôû. Möùc ñoä laøm giaûm nhieät ñoä seõ thay ñoåi söï coù maët cuûa caùc caáu töû phaân tích. TCD aùp duïng cho moïi ñoái töôïng phaân tích nhöng ñoä nhaïy khoâng cao. Noù chæ coù khaû naêng phaùt hieän maãu coù noàng ñoä > 5mg, thôøi gian phaân tích laâu hôn. Hình 2.6: Caáu taïo vaø nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa TCD Detector ion hoaù ngoïn löûa (FID): Ñaây laø moät ñaàu doù coù ñoä nhaïy cao, ñoä tuyeán tính töông ñoái roäng, khaù nhaïy neáu chaát höõu cô chöùa nhieàu CH. Hình 2.7: Caáu taïo vaø nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa FID Nguyeân lyù hoaït ñoäng cuûa ñaàu doø naøy laø seõ ñoát chaùy nhöõng chaát ra khoûi coät phaân tích baèng ngoïn löûa coù khí hydro ñang chaùy trong moâi tröôøng coù khoâng khí. Khi moät chaát höõu cô bò ñoát chaùy döôùi taùc duïng ngoïn löûa taïo ra bôûi söï ñoát chaùy hydro, coù söï taïo thaønh caùc goác CHn*, OH*, O2* ôû bieân ngoïn löûa. Caùc goác töï do phaûn öùng sinh ra CHO*: C* + OH* ® CHO* + e- Tín hieäu ghi nhaän döïa treân ion (CHO*) sinh ra. Ion sinh ra taïo doøng ñieän, ñöôïc khueách ñaïi vaø bieán ñoåi thaønh muõi saéc kyù. Soá löôïng ion taïo thaønh phuï thuoäc vaøo caùc yeáu toá sau: Tyû leä thaønh phaàn hydro/ khoâng khí. Nhieät ñoä ngoïn löûa. Caáu truùc cuûa caùc phaàn töû maãu caàn xaùc ñònh. Ñaëc ñieåm cuûa FID: Aùp duïng cho moïi ñoái töôïng phaân tích. Ñoä nhaïy cao gaáp 100 -1000 laàn TCD. Nhöôïc ñieåm: phaûi söû duïng theâm heä thoáng khí ñoát. Khoâng ñöôïc duøng cho caùc maãu coù chöùa caùc khí sau: SO2, CO2, hôi H2O, NxOy. Detector baét ñieän töû (ECD): Hình 2.8: Caáu taïo vaø nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa ECD Nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa ECD döïa treân ñaëc tính cuûa caùc chaát coù khaû naêng baét ñieän töû töï do trong pha khí. Ñaàu tieân, chuøm tia b do 63Ni taïo ra ion hoùa caùc phaân töû khí mang taïo thaønh caùc ion döông phaân töû khí mang vaø caùc ñieän töû töï do sô caáp. So vôùi caùc ñieän töû cuûa chuøm tia b thì caùc ñieän töû töï do naøy chaäm hôn haún. Chuùng ñöôïc gia toác nhôø ñieän tröôøng vaø chuyeån dòch veà anode taïo ra doøng ñieän neàn cuûa detector. Caùc nguyeân töû hoaëc phaân töû cuûa caùc chaát sau khi rôøi khoûi coät taùch ñöôïc ñöa thaúng vaøo buoàng ion cuøng vôùi khí mang. Tuøy theo aùi löïc ñieän töû cuûa caùc phaân töû naøy, caùc ñieän töû töï do sô caáp noùi treân seõ bò caùc phaân töû ñoù baét giöõ vaø taïo ra caùc ion aâm. Caùc ion aâm taïo ra seõ keát hôïp vôùi caùc ion döông cuûa phaân töû khí mang ñeå taïo thaønh caùc phaân töû trung hoøa. Nhö vaäy, do khaû naêng baét ñieän töû cuûa caùc chaát caàn phaân tích, ñieän töû bò laáy maát khoûi heä vaø doøng ñieän neàn bò giaûm ñi so vôùi luùc chæ coù khí mang tinh khieát ñi qua detector. Möùc ñoä suy giaûm doøng ñieän neàn trong luùc coù chaát ñi qua ñöôïc theå hieän baèng peak saéc kí cuûa chaát ñoù. Ñaàu doø naøy raát nhaïy ñoái vôùi caùc hôïp chaát coù chöùa caùc nhoùm chöùc hoaëc caùc ña lieân keát, ñaëc bieät caùc phaân töû coù chöùa caùc nguyeân töû halogen. Detectô quang phoå ngoïn löûa (FPD): Nguyeân taéc: ngoïn löûa hydro ñöôïc taïo ra baèng doøng khoâng khí troän laãn vôùi hoãn hôïp hydro – khí mang. Khí maãu cuoán theo khí mang, ñoát chaùy baèng ngoïn löûa hydro trong oáng phaùt ra aùnh saùng ôû moät böôùc soùng baát kì. Boä loïc caûn chæ cho aùnh saùng coù ñoä daøi soùng ñaëc thuø ñi qua. Ñeå ñaùp öùng khaû naêng phaân tích ñònh tính trong saéc kí khí, caàn phaûi ñaûm baûo söï oån ñònh ñuû lôùn caùc thoâng soá cuûa detector nhö nhieät ñoä detector, tyû leä giöõa khí ñoát vaø khí mang… FPD toû ra raát höõu hieäu trong vieäc phaân tích döôïc phaåm, dö löôïng caùc hôïp chaát carbamat vaø phosphat, caùc hôïp chaát coù chöùa N vaø P. Hình 2.9: Caáu taïo vaø nguyeân taéc hoaït ñoäng cuûa FPD Maùy ghi Maùy ghi laø nôi nhaän tín hieäu töø ñaàu doø, xöû lyù soá lieäu chuyeån thaønh daïng ñoà thò. Treân ñoà thò coù peak, moãi peak ñöôïc xaùc ñònh baèng thôøi gian löu Quy trình saéc kí khí [2,17,47,73] Maãu khaûo saùt daïng loûng hay khí ñöôïc bôm vaøo boä naïp maãu 2 (neáu maãu loûng seõ ñöôïc gia nhieät taïi ñaây ñeå chuyeån sang daïng khí), ñöôïc khí mang cung caáp töø heä thoáng 1 (bao goàm bình khí vaø boä ñieàu chænh löu löôïng) daãn vaøo heä thoáng coät taùch 3 naèm trong buoàng ñieàu nhieät. Sau khi ñöôïc taùch, caùc caáu töû laàn löôït ñi vaøo detector 4 vaø ñöôïc chuyeån thaønh tín hieäu ñieän. Tín hieäu naøy ñöôïc khueách ñaïi roài chuyeån sang boä ghi 5. ÔÛ caùc maùy hieän ñaïi, thay vì chuyeån sang boä ghi, tín hieäu seõ ñöôïc chuyeån sang tích phaân keá vaø maùy tính. Taïi ñaây, caùc tín hieäu ñöôïc xöû lyù vaø chuyeån sang boä phaän in keát quaû 6. Treân saéc ñoà nhaän ñöôïc ôû boä phaän in keát quaû 6 ta thu ñöôïc caùc tín hieäu öùng vôùi caùc caáu töû goïi laø peak vôùi thôøi gian löu tR cuûa peak laø ñaïi löôïng duøng ñeå ñònh tính, coøn dieän tích cuûa peak ñöôïc söû duïng ñeå ñònh löôïng. Hình 2.11: Quy trình saéc kí khí Hình 2.12: Hình daïng cuûa saéc kí ñoà t tR(A) tR(B) Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán keát quaû saéc kí [2,17] Toác ñoä doøng khí mang Caùc caáu töû maãu ñöôïc khí mang cuoán qua coät saéc kí. Do ñoù, toác ñoä di chuyeån cuûa caùc caáu töû seõ phuï thuoäc toác ñoä cuûa khí mang vaø seõ aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán ñoä ñoái xöùng cuûa muõi saéc kí. Trong saéc kí, coù hieän töôïng khueách taùn caùc caáu töû doïc theo coät vaø khueách taùn voøng veøo theo hình daïng chaát mang, ñoàng thôøi coù söï phaân boá cuûa caùc caáu töû trong pha tónh loûng. Do ñoù coù caân baèng phaân boá cuûa caùc caáu töû giöõa pha ñoäng vaø pha tónh. Söï phaân boá cuûa maãu giöõa pha ñoäng vaø pha tónh xaùc ñònh bôûi phöông trình Henry : Vaän toác di chuyeån cuûa caáu töû trong coät ñöôïc xaùc ñònh: Trong ñoù: Cl, Ck: noàng ñoä maãu trong pha tónh vaø pha ñoäng (mol/ml) K: Heä soá phaân boá Vl,Vk: theå tích pha tónh vaø theå tích töï do cuûa coät (ml) Q : Löu löôïng khí mang (ml/s) Vaän toác dòch chuyeån cuûa caáu töû tæ leä thuaän vôùi vaän toác cuûa khí mang vaø tæ leä nghòch vôùi K. Do ñoù, hai caáu töû coù heä soá phaân boá khaùc nhau seõ chuyeån ñoäng vôùi toác ñoä khaùc nhau vaø taùch rôøi nhau deã daøng khi ra khoûi coät. Theo phöông trình Henry: Cl= KCk K laø haèng soá thì muõi saéc kí coù daïng ñoái xöùng. K giaûm khi noàng ñoä taêng: laøm u taêng ñoät ngoät, muõi coù daïng doác hôn K taêng theo noàng ñoä laøm u giaûm ñoät ngoät, muõi coù daïng thoaûi hôn. Chieàu cao ñóa lyù thuyeát: Do caùc caân baèng phaân boá laàn löôït ñöôïc thieát laäp trong coät saéc kí neân coù theå xem coät ñöôïc chia laøm nhieàu vuøng nhoû, moãi vuøng töông ñöông vôùi moät maâm trong coät chöng caát phaân ñoaïn, ñöôïc goïi laø maâm lyù thuyeát. Khaû naêng taùch caøng lôùn khi soá ñóa lyù thuyeát caøng nhoû. Chieàu cao ñóa lyù thuyeát tính theo coâng thöùc cuûa Van Deemter nhö sau: HETP= = A+ Trong ñoù: HETP: chieàu cao ñóa lyù thuyeát : heä soá bieåu dieãn söï khoâng ñoàng ñeàu cuûa coät dp : ñöôøng kính haït raén mang : heä soá lieân heä ñeán söï khueách taùn voøng cuûa khí mang. Dk,Dl : heä soá khueách taùn phaân töû cuûa caáu töû khaûo saùt trong pha ñoäng vaø pha tónh df : beà daøy pha tónh loûng bao ngoaøi chaát raén mang u : vaän toác doøng khí mang K’ =K*F1/F2 vôùi F1,F2 laø theå tích pha tónh vaø ñoäng trong coät Hieäu suaát taùch caøng lôùn khi soá ñóa caøng lôùn hay H caøng nhoû. Ñeå giaûm H, ta coù theå thöïc hieän caùc giaûi phaùp: Giaûm A baèng caùch giaûm kích thöôùc haït, nhöng theo thöïc nghieäm thì neáu dp< 0,1 mm thì khoâng coøn khaû naêng laøm cho coät ñoàng ñeàu nöõa, do ñoù laøm heä soá taêng vaø laøm A taêng. Giaûm B baèng caùch giaûm Dk. Do ñoù phaûi duøng khí mang coù tæ khoái lôùn ñeå giaûm söï khueách taùn cuûa caáu töû vaøo töôùng ñoäng. Tuy nhieân neáu tæ khoái quaù lôùn thì ñoä daãn nhieät keùm laøm giaûm ñoä nhaïy cuûa maùy. Thöôøng ít khi giaûm B Giaûm C : heä soá naøy chöùa nhieàu thoâng soá do söï chuyeån ñoåi vaät chaát vaø nhöõng bieán ñoåi cuûa noù trong coät saéc kí. Coù theå giaûm C baèng caùch: Taêng K’: taêng Fl vaø giaûm Fk Giaûm df : giaûm beà daøy pha tónh, nhöng chæ coù theå giaûm ñeán moät giaù trò giôùi haïn naøo ñoù thoâi. CAÙC NGUYEÂN LYÙ CÔ BAÛN TAÙCH CAÁU TÖÛ HÖÔNG TRÖÔÙC KHI VAØO SAÉC KÍ KHÍ Haàu heát caùc caáu töû höông ñöôïc taùch ra döïa vaøo khaû naêng hoøa tan choïn loïc hoaëc ñoä bay hôi cuûa noù. Caùc caáu töû höông neáu deã bay hôi thì hieån nhieân laø ñoä bay hôi seõ ñöôïc söû duïng nhö laø nguyeân taéc cô baûn ñeå taùch chuùng töø thöïc phaåm. Maët khaùc, caùc caáu töû höông coù xu höôùng hoøa tan trong caùc dung moâi höõu cô hôn laø trong nöôùc, vaø chính ñaëc ñieåm naøy ñöôïc söû duïng ñeå thöïc hieän caùc quaù trình taùch baèng trích ly. [23,57] Taùch döïa vaøo khaû naêng hoøa tan [23] Nhö ñaõ ñeà caäp, caùc caáu töû höông coù xu höôùng öa beùo, deã tan trong caùc dung moâi höõu cô. Baûng 2.1 theå hieän khaû naêng tan trong caùc dung moâi höõu cô cuûa caùc caáu töû höông, ñöôïc theå hieän qua giaù trò Log P (log P laø logarit cuûa noàng ñoä phaân boá cuûa caáu töû trong daàu:nöôùc, ñöôïc thöïc hieän cuï theå vôùi heä octanol: nöôùc) Baûng 2.1: Söï phaân boá cuûa caùc caáu töû höông qua Log P vaø kow Teân chaát Log P Kow Teân chaát Log P Kow 2,3- butanedione Ethanol Furfuryl acohol 2-acethyl pyridine Acid propionic 2-pentanone 2-acethyl furan Furfural Ethyl acetat Methyl sulfide 2,6- dimethylpyrazine Acid butyric ethanethiol -1,34 -0,14 0,45 0,49 0,58 0,75 0,80 0,83 0,86 0,92 1,03 1,07 1,27 0,05 0,72 2,81 3,09 3,80 5,62 6,30 6,76 7,24 8,31 10,70 11,70 18,60 1-methyl pyrrole Phenol Hexanal Dimethyl trisulfide Benzothiazol 1-octen-3one 4-ethyl guaiacol 1-pentanethiol Eugenol 2,4-decandienal Anethol Etel decanoat Limonen 1,43 1,51 1,80 1,87 2,17 2,37 2,38 2,67 2,73 3,33 3,39 4,79 4,83 26,90 32,40 63,10 74,10 148,00 234,00 240,00 468,00 537,00 2138,00 2455,00 6465,00 6761,00 Qua Baûng 2.1, ta thaáy raát nhieàu caùc caáu töû höông phaân boá trong daàu nhieàu hôn haún trong nöôùc. Vì vaäy, phöông phaùp söû duïng dung moâi ñeå trích ly caáu töû höông töø thöïc phaåm laø raát hieäu quaû vaø laø giai ñoaïn chuaån bò toát cho caùc phaàn phaân tích tieáp theo. Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp: Caùc caáu töû höông khaùc nhau thì seõ coù heä soá phaân boá khaùc nhau, do ñoù chuùng seõ ñöôïc trích ly vôùi caùc tæ leä trích khaùc nhau. Deã thaáy raèng caùc caáu töû tan trong nöôùc nhieàu hôn nhö diacethyl thì seõ raát khoù trích coøn caùc chaát nhö eugenol thì trích ly raát hieäu quaû, ví duï ngöôøi ta tính tæ leä diacethyl vaø eugenol coøn laïi trong pha öa nöôùc sau khi söû duïng 100mL dung moâi höõu cô trích 1L dung dòch ban ñaàu thì keát quaû thu ñöôïc töông öùng laø 95,5% diacethyl vaø 4,1% eugenol coøn laïi trong pha öa nöôùc. Phöông phaùp söû duïng caùc dung moâi höõu cô ñeå trích ly, vì vaäy dung moâi cuõng trích ly caû lipid trong thöïc phaåm, goàm tryglyceride, phospholipid, saùp, caùc chaát taïo nhuõ, caùc vitamin tan trong daàu... Lipid seõ laøm giaûm hieäu quaû cuûa muïc ñích taùch caáu töû höông (laø taêng noàng ñoä caùc caáu töû) cuõng nhö gaây khoù khaên cho coâng vieäc saéc kí sau naøy. Tuy nhieân, vôùi caùc thöïc phaåm ít lipid (rau traùi, haàu heát caùc thöùc uoáng) thì ñaây laø moät phöông phaùp coù hieäu quaû cao cho vieäc chuaån bò maãu tröôùc khi ñi vaøo saéc kí. Phöông phaùp trích ly baèng dung moâi ñôn giaûn nhaát laø söû duïng pheãu trích ly. Vaø thöôøng thì ngöôøi ta thöïc hieän trích nhieàu caáp ñeå tieát kieäm theå tích dung moâi söû duïng. Hieäu quaû trích ly ñöôïc theå hieän qua bieåu thöùc: Phaàn khoâng ñöôïc trích = Trong ñoù: Vw : theå tích cuûa pha öa nöôùc Vo : theå tích cuûa dung moâi trích ly söû duïng Kow: heä soá phaân boá N : soá laàn trích ly Bieåu thöùc treân cho thaáy n caøng lôùn thì keát quaû thu ñöôïc cuûa phaàn khoâng ñöôïc trích seõ giaûm raát nhanh. Cuøng ví duï veà diaceyl vaø eugenol ôû treân, neáu ta trích 5 laàn, moãi laàn 20ml dung moâi thay vì trích 1 laàn 100ml thì keát quaû thu ñöôïc nhö sau: vôùi diacethyl thì 2 tröôøng hôïp cho keát quaû gaàn nhö nhau, trong khi ñoù vôùi eugenol thì khi trích 5 laàn, keát quaû thu ñöôïc laø 0,017%. Nhö vaäy, vôùi löôïng dung moâi vaø maãu cung caáp vöøa ñuû thì phöông phaùp trích ly nhieàu caáp cho khaû naêng thu hoài toát hôn nhieàu so vôùi phöông phaùp trích ly ñôn giaûn. Taùch döïa vaøo khaû naêng haáp phuï( sorptive extraction) [10,23,57,65] Hieän nay coù 2 phöông phaùp phoå bieán söû duïng nguyeân lyù treân, ñoù laø Solid-phase microextraction (SPME) vaø Stir bar sorptive extraction (SBSE). Nguyeân lyù taùch döïa vaøo khaû naêng haáp phuï, cuõng nhö trích ly baèng dung moâi döïa vaøo heä soá phaân boá cuûa caáu töû caàn taùch trong pha trích:pha nöôùc. Pha trích trong tröôøng hôïp naøy laø caùc chaát haáp phuï raén. Chaát haáp phuï thöôøng söû duïng nhaát laø Polydimethylsilosane (PDMS). Tæ leä thu hoài caáu töû caàn phaân tích ñöôïc tính theo coâng thöùc sau: Trong ñoù: mPDMS: khoái löôïng cuûa caáu töû caàn phaân tích trong pha trích kPDMS: heä soá phaân boá cuûa caáu töû trong pha trích vaø pha öa nöôùc. m0 : toång khoái löôïng cuûa caáu töû trong heä ban ñaàu. : tæ leä pha (Vnöôùc / Vpha chieát ) Hieäu quaû trích coù theå döï ñoaùn qua heä soá phaân boá cuûa caáu töû trong octanol:nöôùc. Coâng thöùc treân cho thaáy khoâng chæ coù Log P maø tæ leä pha cuõng aûnh höôûng ñeán hieäu quaû trích ly cuûa caáu töû caàn phaân tích. Giaù trò cuûa caøng lôùn thì tæ leä thu hoài cuûa caáu töû caàn phaân tích caøng lôùn. Vôùi phöông phaùp SPME thì vaán ñeà lôùn nhaát chính laø tæ leä pha coøn thaáp, vôùi coät PDMS 100m maø theå tích pha chæ ñaït ñeán 0,5 l. Ñieàu naøy seõ laøm cho tæ leä thu hoài laø khoâng cao vôùi nhöõng caáu töû coù kow 500. Theo baûng 2.1 ôû treân thì raát nhieàu caáu töû coù heä soá phaân boá thaáp (<500) vaø chuùng seõ thích hôïp vôùi phöông phaùp SBSE hôn laø SPME. Taùch döïa vaøo khaû naêng bay hôi [23] Noùi ñeán khaû naêng bay hôi cuûa caùc caáu töû höông laø noùi ñeán tæ leä cuûa caáu töû trong pha khí vaø trong thöïc phaåm khi ñaït traïng thaùi caân baèng (phöông phaùp Static headspace isolation) hoaëc ôû ñieàu kieän khoâng caân baèng (phöông phaùp Dynamic headspace isolation). Caû hai phöông phaùp treân ñeàu döïa treân cuøng moät nguyeân lyù laø caùc caáu töû höông seõ toàn taïi moät tæ leä haøm löôïng trong pha khí vaø ta seõ döïa vaøo haøm löôïng trong pha khí ñeå phaân tích. a.Trong ñieàu kieän caân baèng Khoái löôïng caáu töû höông trong pha khí ñöôïc xaùc ñònh baèng heä soá phaân boá (laø tæ leä cuûa caáu töû trong pha khí vaø trong thöïc phaåm) kgf. Heä soá naøy xaùc ñònh theo coâng thöùc: kgf = cg/cf cg, cf: laàn löôït laø noàng ñoä cuûa caáu töû trong pha khí vaø trong maãu thöïc phaåm ban ñaàu. Vì thöïc phaåm chöùa raát nhieàu caùc chaát hoøa tan khaùc nhau (ñöôøng ñôn, lipid, protein, nöôùc, khoaùng) neân vieäc xaùc ñònh heä soá phaân boá laø raát phöùc taïp. Ta coù theå döï ñoaùn noàng cuûa cuûa caáu töû höông trong pha khí ôû ñieàu kieän caân baèng khi coi thöïc phaåm laø heä nhuõ töông ñôn giaûn daàu vaø nöôùc. Noàng ñoä cuûa caáu töû trong pha khí coù theå tính: cg= kgc cc [(1-) +kdc] Trong ñoù: kgc: heä soá phaân boá cuûa caáu töû trong pha khí vaø pha lieân tuïc ôû ñieàu kieän caân baèng. cc: noàng ñoä cuûa caáu töû trong pha lieân tuïc. : tæ leä theå tích cuûa pha phaân taùn kdc: heä soá phaân boá cuûa caáu töû trong pha phaân taùn vaø pha lieân tuïc. Coâng thöùc thöùc treân cho thaáy vôùi nhöõng caáu töû höông coù heä soá phaân boá trong pha khí thaáp (khaû naêng hoøa tan cao, hoaëc aùp suaát hôi thaáp, khoái löôïng phaân töû lôùn) thì seõ khoâng thích hôïp vôùi phöông phaùp söû duïng caân baèng khí loûng naøy. Vaán ñeà seõ trôû neân phöùc taïp hôn nöõa khi coù söï töông taùc (lieân keát) giöõa caùc caáu töû höông vôùi caùc caáu töû khaùc trong thöïc phaåm. Trong caùc tröôøng hôïp ñoù, raát khoù döï ñoaùn cg. Ñoàng thôøi, caùc caáu töû höông ñeàu coù kgc vaø kdc raát khaùc nhau, ñieàu ñoù coù nghóa laø moái lieân heä cuûa caùc caáu töû trong thöïc phaåm vaø trong pha khí laø raát phöùc taïp vaø gaàn nhö khoâng theå döï ñoaùn. b. Taùch trong ñieàu kieän khoâng caân baèng (nonequilibrium isolation) Khaùc vôùi ñieàu kieän caân baèng, trong tröôøng hôïp naøy, tæ leä caáu töû höông trong pha khí seõ thay ñoåi. Vôùi phöông phaùp naøy, ngöôøi ta söû duïng moät doøng khí ñi qua maãu thöïc phaåm vaø loâi cuoán caùc caáu töû höông vaøo trong pha khí. Ñaây laø quaù trình truyeàn khoái qua beà maët tieáp xuùc pha loûng khí. Phöông trình sau bieåu thò quaù trình truyeàn khoái cuûa caáu töû höông: Trong ñoù: HD: heä soá truyeàn khoái dm/dt : toác ñoä truyeàn khoái vaøo pha khí De : heä soá khueách taùn cuûa caáu töû töï do trong nhuõ töông Agc : dieän tích beà maët tieáp xuùc pha. cei(t) vaø ce(t) : noàng ñoä caáu töû treân beà maët tieáp xuùc pha vaø trong heä nhuõ thöïc phaåm. Nhöõng trôû ngaïi chính cuûa nguyeân lyù taùch naøy laø söï coù maët cuûa nöôùc trong maãu thöïc phaåm. Trong haàu heát heä thöïc phaåm, caùc caáu töû höông thöôøng toàn taïi khoâng quaù 300 ppm, coøn nöôùc thì ngay caû caùc thöïc phaåm khoâ, haøm aåm cuõng treân 2%. Nhieät ñoä soâi cao cuûa nöôùc seõ gaây khoù khaên cho quaù trình laøm taêng noàng ñoä vaø phaân tích vì caùc caáu töû höông seõ bò toån thaát (do noàng ñoä thaáp vaø deã bay hôi hôn nöôùc). Chính vì vaäy, haàu heát caùc phöông phaùp taùch trong ñieàu kieän khoâng coù caân baèng seõ coù söï keát hôïp theâm caùc phöông phaùp loaïi boû nöôùc khoûi thöïc phaåm trong quaù trình taùch. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP TAÙCH CHIEÁT TRÖÔÙC KHI SAÉC KÍ ÑÒNH LÖÔÏNG CAÁU TÖÛ HÖÔNG TRONG DÒCH NHO SAU LEÂN MEN Caùc caáu töû höông luoân coù thaønh phaàn vaø haøm löôïng raát khaùc nhau trong caùc hoãn hôïp khaùc nhau. Chuùng cuõng raát khaùc nhau veà caùc tính chaát vaät lyù, hoùa lyù nhö ñoä phaân cöïc, ñoä bay hôi, khaû naêng hoøa tan. Trong dòch nho sau leân men, coù moät löôïng lôùn trong ñoù laø nöôùc vaø coàn, ñaây laø caùc caáu töû aùi nöôùc, phaân cöïc. Trong khi ñoù, pha tónh cuûa GC cuõng nhö caùc dung moâi taùch chieát ñeàu khoâng phaân cöïc hay phaân cöïc thaáp.Vì vaäy, tröôùc khi phaân tích saéc kí khí (GC), ngöôøi ta phaûi tieán haønh taùch chieát, laøm giaøu caùc caáu töû höông ñeå thu ñöôïc moät hoãn hôïp coù caùc caáu töû coù ñoä phaân cöïc phuø hôïp vôùi coät saéc kí. Ñeå phaân tích ñöôïc haøm löôïng cuûa caùc caáu töû höông khaùc nhau moät caùch chính xaùc, ngöôøi ta caàn söû duïng nhöõng phöông phaùp, dung moâi, pha tónh khaùc nhau. Sau ñaây, em xin trình baøy 5 phöông phaùp cô baûn vaø thoâng duïng nhaát ñeå taùch chieát vaø laøm giaøu caùc caáu töû höông trong dòch nho sau leân men noùi rieâng vaø trong caùc hoãn hôïp loûng noùi chung. Ñoù laø caùc phöông phaùp sau: Phöông phaùp Vi chieát pha raén (SPME) Phöông phaùp Chöng caát vaø trích ly ñoàng thôøi (SDE) Phöông phaùp Chieát loûng-loûng (LLE) Phöông phaùp Chieát pha raén (SPE) Phöông phaùp Chieát nhôø haáp phuï cuûa thanh khuaáy töø (SBSE) Phöông phaùp Vi chieát pha raén (Solid-phase microextraction -SPME) Giôùi thieäu [21,35,47,57] SPME laø moät kó thuaät laøm taêng noàng ñoä caùc hôïp chaát höõu cô deã bay hôi maø khoâng caàn söû duïng baát cöù moät dung moâi trích ly naøo. Nguyeân lyù taùch cuûa kó thuaät naøy laø do söï phaân boá cuûa caùc caáu töû höõu cô giöõa pha loûng (hay pha khí) vaø moät pha laø moät lôùp polymer moûng (lôùp naøy ñöôïc phuû beân ngoaøi cuûa coät silicagel trong thieát bò SPME). Kó thuaät naøy ñöôïc phaùt minh bôûi hai nhaø khoa hoïc Berlardi vaø Pawliszyn khi hai oâng tieán haønh phaân tích caùc hôïp chaát hoùa hoïc trong moâi tröôøng. Caøng veà sau naøy, kó thuaät treân ñöôïc ñaùnh giaù laø raát phuø hôïp ñeå phaân tích caùc caáu töû höông vaø caùc hôïp chaát deã bay hôi. Kó thuaät SPME coù theå ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích caùc caáu töû raát ña daïng trong caû theå raén, loûng vaø khí. Ñaây laø kó thuaät döïa treân nguyeân lyù caân baèng giöõa hai pha, vaø ñeå phaân tích ñònh löôïng chính xaùc thì quaù trình taùch caáu töû töø pha naøy sang pha kia phaûi ñöôïc ñieàu khieån voâ cuøng nghieâm ngaët. Moãi caáu töû caàn phaân tích ñeàu coù söï khaùc nhau veà ñoä phaân cöïc, ñoä bay hôi, heä soá phaân boá trong pha nöôùc vaø pha “daàu”, theå tích trong maãu vaø trong khoâng gian headspace, toác ñoä dòch chuyeån khi khuaáy troän... Quaù trình thöïc hieän kó thuaät SPME khoâng caàn söï hoã trôï cuûa caùc dung moâi höõu cô vaø cuõng caàn khoâng gia nhieät maãu neân söï hình thaønh caùc caáu töû thöù caáp khoâng mong muoán cuõng giaûm ñaùng keå. Thieát bò SPME [10,57] Hình 2.13 döôùi ñaây moâ taû thieát bò SPME ñöôïc saûn xuaát bôûi coâng ty Supelco. Ngaøy nay, ngöôøi ta ñaõ saûn xuaát caùc thieát bò coù nguyeân lyù töông töï nhöng coù theå tieán haønh bôm maãu töï ñoäng. Hình 2.13: Caáu taïo thieát bò SPME [57] Thieát bò coù daïng moät oáng tieâm (syringe) coù piston gaén loø xo vaø moät boä phaän chöùa (barrel) cho pheùp piston dòch chuyeån, thay ñoåi vò trí trong quaù trình taùch caáu töû hay khi giaûi haáp phuï. Trong boä phaän chöùa coøn coù moät “kim tieâm” (needle) baèng theùp khoâng ræ, vaø beân trong “kim tieâm” ñoù laø moät oáng cuõng baèng theùp khoâng ræ ñöôïc gaén chaët vôùi coät laøm baèng silicagel. Phaàn döôùi cuûa coät ñöôïc boïc beân ngoaøi baèng moät lôùp pha tónh. Pha tónh naøy chính laø taùc nhaân haáp phuï ñeå taùch caùc caáu töû höông ñi ra khoûi dung dòch ban ñaàu. Chöùc naêng cuûa “kim tieâm” laø ñeå ñaâm xuyeân qua vaùch ngaên giöõa boä phaän chöùa maãu vaø boä phaän tieâm maãu vaøo thieát bò GC, ñoàng thôøi noù coøn duøng ñeå baûo veä coät silicagel khoâng bò vôõ trong khi löu giöõ vaø söû duïng. Coät SPME thöôøng ñöôïc bao beân ngoaøi moät lôùp polymer coù beà daøy xaùc ñònh, coù theå laø loaïi khoâng phaân cöïc nhö Polydimethyl Silosane (PDMS) hay phaân cöïc hôn nhö Carbowax. Ngöôøi ta coù theå keát hôïp caùc loaïi polymer vôùi nhau (Carboxen, PDMS, carbowax, polymer cuûa diphenylbenzen) ñeå taïo ra caùc pha tónh coù nhöõng ñaëc tính rieâng duøng ñeå taùch caùc loaïi hôïp chaát deã bay hôi ñaëc tröng. Trong haàu heát caùc pheùp phaân tích, ngöôøi ta thöôøng söû duïng PDMS coù beà daøy 100m. Neáu caàn thieát phaûi ñaït traïng thaùi caân baèng haáp phuï sôùm hôn thì ngöôøi ta coù theå duøng pha tónh PDMS coù beà daøy nhoû hôn (30m), coøn beà daøy 7m thích hôïp vôùi nhöõng maãu chöùa caùc caáu töû coù nhieät ñoä bay hôi cao hoaëc khi caàn phaûi giaûi haáp phuï ôû nhieät ñoä cao tröôùc khi vaøo saéc kí khí. Pha tónh coù coù beà daøy lôùn hôn thích hôïp vôùi nhöõng heä caàn ñaït caân baèng haáp phuï trong thôøi gian daøi, nhöng nhöõng coät naøy seõ nhaïy hôn vaø haáp phuï ñöôïc caû caùc caáu töû coù khoái löôïng phaân töû lôùn. Cô cheá thöïc hieän quaù trình taùch caáu töû cuûa SPME [35,57,65,70] Quaù trình thöïc hieän taùch caùc caáu töû höông deã bay hôi ñöôïc minh hoïa trong hình döôùi ñaây: Hình 2.14: Cô cheá taùch caáu töû baèng SPME [70] Maãu seõ ñöôïc chöùa trong boä phaän chöùa maãu phuø hôïp. Tröôùc khi tieán haønh phaân tích, coät phaûi ñöôïc laøm saïch bôûi vì pha tónh coù theå haáp phuï caùc chaát trong khoâng khí tröôùc ñoù vaø seõ taïo ra caùc peak laï khi saéc kí. Neáu laáy maãu tröïc tieáp, “kim tieâm” seõ ñaâm xuyeân qua vaùch ngaên vaø coät seõ bò ñaåy nhoâ ra ngoaøi “kim tieâm” vaø ñi vaøo dung dòch maãu. Caùc caáu töû höông seõ haáp phuï leân beà maët pha tónh PDMS. Neáu taùch chieát maãu baèng nguyeân lyù headspace (headspace laø phaàn khoâng gian ngay treân maãu trong boä phaän chöùa maãu), coät chæ nhoâ ra ngoaøi “kim tieâm” nhöng khoâng ñi vaøo dung dòch maø chæ naèm trong phaàn khoâng gian ngay treân maãu. Caùc caáu töû höông trong khoâng gian headspace seõ haáp phuï leân beà maët pha tónh. Caû 2 caùch laáy maãu seõ hieäu quaû hôn neáu boå sung moät löôïng muoái aên vaøo dung dòch tröôùc khi laáy maãu. Löôïng muoái naøy seõ ñieàu chænh löïc ion trong dung dòch vaø do ñoù seõ caûi thieän traïng thaùi caân baèng haáp phuï. Coù theå söû duïng theâm caùnh khuaáy ñeå ruùt ngaén thôøi gian ñaït traïng thaùi caân baèng. Sau thôøi gian laáy maãu thích hôïp (töø 1-20 phuùt), coät seõ ñöôïc ruùt vaøo trong “kim tieâm” vaø “kim tieâm” seõ ñöôïc thaùo taùch rôøi khoûi vaùch ngaên vaø seõ ñöôïc gaén vaøo boä phaän bôm maãu cuûa thieát bò chaïy saéc kí khí. Caùc caáu töû seõ ñöôïc giaûi haáp phuï baèng nhieät nhôø nhieät cung caáp töø boä phaän tieâm maãu vaø sau ñoù seõ ñöôïc ñöa vaøo coät saéc kí khí. Vì SPME laø kó thuaät laøm taêng noàng ñoä caùc caáu töû caàn phaân tích neân caàn phaûi chænh tæ leä chia doøng ôû boä phaän tieâm maãu thaáp hôn (10:1) ñeå quaù trình laøm taêng noàng ñoä caáu töû khoâng bò laõng phí. Phöông phaùp khoâng chia doøng thöôøng seõ ñöa nhieàu caáu töû caàn phaân tích hôn vaøo coät vaø thöôøng aùp duïng cho nhöõng phöông tröôøng hôïp caàn ñoä nhaïy cao. Moãi loaïi coät ñeàu coù möùc ñoä phuø hôïp khaùc nhau ñoái vôùi caùc caáu töû khaùc nhau. Nhìn chung thì coät vôùi chaát mang khoâng phaân cöïc seõ thu hoài toát caùc caáu töû höông hôn. Coät Polyacrylat seõ nhaïy khi phaân tích coàn, phenol, aldehyde hôn laø caùc ester vaø hydrocacbon. Baûng 2.2: So saùnh hieäu quaû taùch caáu töû höông trong maãu chöùa 10ppm baèng phöông phaùp Headspace SPME cuûa coät PDMS 100m vaø coät Polyacrylat 85m [57] Caáu töû Coät PDMS Coät Polyacrylat Ethyl acetate n-Butanol Hexanal cis-3-Hexenol Benzaldehyde Ethyl caproate Limonene Linalool Eugenol -Ionone dimethyl sulfide Pyrrolidine Pyridine 4 1 54 6 22 320 1410 117 32 530 7 7 11 3,1 3,3 48,1 19,5 59 320 1410 117 32 530 6,3 7 3,7 Töø baûng treân, ta thaáy coät Polyacrylat taùch toát caùc caáu töû coù nhoùm chöùc röôïu (butanol, cis-3-hexenol, linalool), benzaldehyde, caùc hôïp chaát phenol nhö eugenol ; trong khi ñoù ñoái vôùi caùc caáu töû thuoäc nhoùm ester (ethyl acetat, ethyl caproat), hydrocacbon vaø pyridin thì khaû naêng taùch keùm hôn. Caùc yeáu toá aûnh höôûng trong SPME [35,36,57,70] Pha tónh Chaát mang söû duïng laøm chaát haáp phuï trong coät SPME bao goàm moät hoaëc hai loaïi polymer (nhö PDMS, PA, carboxen-PDMS, PDMS-polydivinylbenzen, carbowax- DVB). Nguyeân taéc laøm giaøu caáu töû nhö ñaõ trình baøy ôû treân, ñoù laø nguyeân taéc haáp phuï. Beà daøy lôùp chaát mang PDMS thöôøng laø 7m, 30m, 100m ; PA laø 85m; carboxen-PDMS laø 75m; PDMS-DVB laø 65m. Yeâu caàu cuûa pha tónh: Ñoä phaân cöïc cuûa pha tónh phaûi gaàn vôùi ñoä phaân cöïc cuûa caáu töû caàn taùch. Pha tónh phaûi chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän nhieät ñoä cao, pH, muoái... PDMS laø moät trong caùc pha tónh khoâng phaân cöïc chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän khaéc nghieät nhaát vaø coät PDMS coù khaû naêng haáp phuï vaø giaûi haáp phuï nhieàu laàn. Khi caàn phaân tích caùc caáu töû coù ñoä phaân cöïc thaáp thì coù theå söû duïng coät PA. Beà daøy cuûa pha tónh cuûa caùc loaïi pha tónh ñöôïc ñöa ra nhö treân laø do tính toaùn döïa vaøo yeâu caàu veà ñoä nhaïy vaø toác ñoä haáp phuï: Beà daøy 100m thöôøng ñöôïc söû duïng khi caàn ñoä nhaïy cao vaø ít quan taâm ñeán thôøi gian, Beà daøy 7m söû duïng khi caàn thôøi gian ngaén vaø khoâng caàn quaù nhaïy (tröôøng hôïp noàng ñoä caáu töû caàn phaân tích ñuû cao). Phöông phaùp taùch chieát Phöông phaùp Headspace (HS) thöôøng ñöôïc khuyeán caùo söû duïng khi coù theå vì khi ñoù seõ laøm giaûm taûi troïng cuûa coät (khoâng phaûi haáp thuï nhöõng chaát cao phaân töû nhö protein), vì vaäy maø tuoåi thoï cuûa coät cuõng cao hôn. Maët khaùc, phöông phaùp HS cuõng traùnh ñöôïc tính thuaän nghòch trong haáp phuï neân tính chính xaùc cuõng cao hôn. Caùc caáu töû coù phaân töû khoái döôùi 200, hay coù caáu truùc khoâng coù nhöõng nhoùm taïo lieân keát hydro (-OH,-NH2...) raát phuø hôïp cho phöông phaùp HS vì chuùng thöôøng coù aùp suaát hôi cao. Phöông phaùp thöïc hieän SPME tröïc tieáp trong pha loûng (direct SPME) thöôøng söû duïng khi phöông phaùp HS cho caùc peak quaù nhoû. Söï khuaáy ñaûo Thôøi gian ñeå ñaït traïng thaùi caân baèng haáp phuï seõ ruùt ngaén neáu ta tieán haønh khuaáy maãu. Caùc phöông phaùp khuaáy thöôøng söû duïng laø khuaáy töø, khuaáy cô hoïc, khuaáy nhôø vaøo chuyeån ñoäng cuûa coät SPME, hoaëc khuaáy nhôø sieâu aâm. Theå tích maãu (Vw) vaø theå tích phaàn HS (Vh) Vôùi phöông phaùp Headspace SPME: Löôïng caáu töû taùch ñöôïc seõ caøng nhieàu khi Vw caøng lôùn (trong möùc giôùi haïn), ñoàng thôøi Vh neân nhoû ñoái vôùi nhöõng caáu töû bay hôi toát. Phöông phaùp Direct SPME: Vw khoâng aûnh höôûng ñeán toác ñoä taùch caáu töû. Ñeán nay ngöôøi ta vaãn chöa tìm hieåu ñöôïc aûnh höôûng cuûa Vw vaø Vh ñeán thôøi gian taùch caáu töû. Tuy nhieân, caùc nhaø khoa hoïc khuyeán caùo neân söû duïng Vh lôùn hôn Vw chöøng 20 laàn. Thôøi gian taùch caáu töû baèng haáp phuï (te) Thôøi gian te ñöôïc xaùc ñònh töø khi ñöa coät vaøo ñeå haáp phuï cho ñeán khi khoâng coøn thaáy peak naøo xuaát hieän theâm. Thôøi gian thí nghieäm caøng gaàn vôùi te thì caøng toát vì nhö theá thì seõ giaûm ñöôïc nhöõng sai soá trong quaù trình thí nghieäm vaø khi ñoù ñoä nhaïy seõ laø cöïc ñaïi. te trong SPME thöôøng ngaén hôn trong caùc phöông phaùp khaùc Nhieät ñoä Theo nhieät doäng hoïc thì haèng soá caân baèng Kfw (laø tæ leä giöõa noàng ñoä caân baèng cuûa caáu töû trong coät haáp phuï vaø noàng ñoä caân baèng cuûa caáu töû trong maãu) giaûm khi nhieät ñoä giaûm. Nhieät ñoä aûnh höôûng nhieàu nhaát ñeán phöông phaùp Direct SPME: heä soá khueách taùn caøng taêng khi ñoä nhôùt giaûm (ñoä nhôùt thaáp khi nhieät ñoä caøng cao) nhöng khi ñoù thì ñoä nhaïy seõ giaûm. Vôùi HS SPME, Kfh (haèng soá caân baèng giöõa pha tónh vaø headspace) vaø Khw (haèng soá caân baèng giöõa headspace vaø pha loûng cuûa maãu) laàn löôït seõ taêng vaø giaûm theo vieäc taêng nhieät ñoä. Vaø theo [70] , vieäc taêng nhieät ñoä seõ laøm giaûm tính nhaïy cuûa phöông phaùp taùch SPME döïa vaøo caân baèng, tuy nhieân, toác ñoä taùch maãu seõ taêng. Khw caøng lôùn thì caùc caáu töû coù ñoä bay hôi thaáp seõ taùch hieäu quaû hôn. Ngoaøi ra, do vieäc truyeàn nhieät keùm trong HS neân nhieät ñoä cuûa coät haáp phuï seõ thaáp hôn nhieät ñoä cuûa maãu neân löôïng caáu töû caàn taùch seõ haáp phuï chaäm daàn theo thôøi gian. Nhìn chung, vôùi moãi dung dòch, coät haáp phuï vaø loaïi caáu töû caàn taùch, nhieät ñoä toái thích thöôøng ñöôïc xaùc ñònh baèng thöïc nghieäm. Ñieàu kieän giaûi haáp phuï Thôøi gian giaûi haáp phuï caøng ngaén caøng toát, vì vaäy nhieät ñoä cao nhaát maø khoâng laøm phaù huûy coät haáp phuï vaø caùc caáu töû phaân tích thöôøng ñöôïc löïa choïn laø nhieät ñoä giaûi haáp phuï. Vôùi coät PDMS, nhieät ñoä giaûi haáp phuï laø 340oC (7m), 280oC (30 vaø 100m); coät PDMS-DVB thöôøng laø 270oC; coät PA thöôøng laø 320oC; coät carboxen-PDMS laø 265oC. Caùc giaù trò nhieät ñoä naøy thu ñöôïc chuû yeáu laø töø caùc keát quaû thöïc nghieäm. So saùnh phöông phaùp SPME vaø phöông phaùp bôm maãu tröïc tieáp Ñeå so saùnh, ta thöïc hieän thí nghieäm sau: laáy 0,5ml dung dòch, giöõ oån ñònh ôû 55oC khoâng khuaáy ñaûo, khoâng boå sung muoái. Sau moät thôøi gian thích hôïp ñeå ñaït traïng thaùi caân baèng loûng khí, coät SPME ñöôïc ñöa vaøo ñeå haáp phuï caáu töû ñaõ boác hôi treân beà maët dung dòch trong 10 phuùt (phöông phaùp Headspace SPME) tröôùc khi ñem ñi saéc kí khí vôùi ñaàu doø FID. Dieän tích peak moãi caáu töû trong moãi tröôøng hôïp ñöôïc chuaån hoùa vôùi n-butanol ñöôïc trích töø coät PDMS. [57] Baûng 2.2: So saùnh dieän tích peak cuûa caùc phöông phaùp taùch caáu töû höông [57] Chaát Bôm maãu tröïc tieáp SPME laáy maãu tröïc tieáp daïng dung dòch Headspace SPME Ethyl acetate Ethyl butyrate Limonene Ethyl caproate 3-Hexenyl acetate cis-3-Hexenol Benzaldehyde Linalool Diethyl succinate Neral 2-Methylbutyric acid Anethole Caproic acid Ethyl vanillin 4,4 5,0 6.4 4.3 4.3 4.9 5.5 4.5 3.4 2.9 2.6 4.8 3.2 3,3 0,2 2,6 1.2 6.9 7.8 0.3 1.1 1.1 <0,1 7.0 0,1 14,1 0.1<0,1 1.2 11,5 2.6 8.4 12.0 2.1 6.0 6.0 <0,1 5.9 <0,1 5,0 <0,1 <0,1 Töø baûng 2.2, ta thaáy phöông phaùp SPME ñeàu cho caùc dieän tích peak nhoû hôn phöông phaùp bôm maãu tröïc tieáp. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích laø do quaù trình haáp phuï chæ taùch ñöôïc moät phaàn caùc caáu töû caàn phaân tích. Do vaäy, SPME khoâng phaùt hieän ra caùc caáu töû coù haøm löôïng quaù beù nhö diethyl succinate, acid Caproic, ethyl vanilin… vaø phöông phaùp taùch chieát naøy thöôøng ñöôïc öùng duïng nhaát khi phaân tích caùc caáu töû coù haøm löôïng töông ñoái cao (C>0,1mg/L) Öu vaø nhöôïc ñieåm cuûa SPME [35,57,70] a. Öu ñieåm Caùc öu ñieåm chính cuûa SPME laø khoâng caàn duøng dung moâi trích ly, deã thöïc hieän, caàn ít thieát bò hôn caùc phöông phaùp khaùc, thôøi gian tieán haønh ngaén, deã töï ñoäng hoùa, vaø coù ñoä nhaïy cao. Phöông phaùp SPME coù theå söû duïng ñeå taùch caùc caáu töû coù ñoä bay hôi thaáp laãn caùc caáu töû coù ñoä bay hôi cao. b. Nhöôïc ñieåm Quaù trình taùch caáu töû cuûa SPME dieãn ra chaäm hôn haún caùc phöông phaùp khaùc (Liquid-liquid extraction, Solid-phase extraction vôùi coät nhoài). Thôøi gian taùch caáu töû chaäm, löôïng caáu töû taùch ñöôïc laø nhoû laøm cho ñoä nhaïy cuûa moät soá caáu töû coù haøm löôïng thaáp laø khoâng ñaït yeâu caàu. Phöông phaùp taùch tröïc tieáp (nhuùng coät vaøo dung dòch) seõ laøm baån dung dòch caàn phaân tích. Thôøi gian giaûi haáp phuï cuõng laâu hôn caùc phöông phaùp khaùc (SPE). Thöôøng thôøi gian giaûi haáp laø 12-20 phuùt, vaø do ñoù thôøi gian saéc kí cuõng daøi hôn. Coät haáp phuï sau moãi laàn söû duïng caàn phaûi toán thôøi gian ñeå veä sinh coät. SPME chæ thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå taùch caùc caáu töû coù haøm löôïng töông ñoái cao, >0,1 mg/L. Moät nhöôïc ñieåm aûnh höôûng lôùn ñeán chi phí thöïc hieän ñoù laø phöông phaùp treân chæ thöïc hieän giaùn ñoaïn. ÖÙng duïng trong ñịnh löôïng caáu töû höông cuûa dòch nho sau leân men.[47] Phöông phaùp SPME ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi trong ñònh löôïng caùc caáu töû höông trong dòch nöôùc nho sau leân men, nhaát laø caùc caáu töû höông coù haøm löôïng cao (>0,1mg/L) nhö ethyl acetat, methanol vaø caùc röôïu baäc cao khaùc (butanol-1, butanol-2, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1, isobutanol, 1-propanol). Phaàn naøy seõ trình baøy vieäc ñònh löôïng caáu töû höông trong dòch nho sau leân men söû duïng phöông phaùp xöû lyù maãu HS-SPME. Nguyeân lieäu Caùc chất sử dụng để nội chuẩn bao goàm ethyl acetat, methanol, butanol-2, propanol-1, isobutanol, butanol-1, 2-methyl butanol-1, 3-methyl butanol-1. Caùc dung dịch chuẩn sau đều được chuẩn bị trong hỗn hợp ethanol- nước (13%) vaø ñöôïc bảo quản ở 5oC: 1,32g/L ethyl acetat; 4g/L methanol 0,55g/L butanol-2 ;0,55g/L propanol-1; 0,88g/L isobutanol; 0,66g/L butanol-1 ; 1,10 g/L 2-methyl butanol-1; 3,30g/L 3- methyl butanol-1 Dung dòch ñeå noäi chuaån goàm 4-methyl pentanol-2 (1,6g/L) ; 2-methyl-3-buten-2-ol (28,8g/L); 2,3-butadione (56,0g/L) ñöôïc pha trong ethanol. Dung dòch A duøng ñeå ñònh tính vaø xaùc ñònh tính khaû thi cuûa SPME: 11g/L acid tartaric, ethanol 13%, NaOH ñeå chænh pH veà 3,4. Laáy 4 ml dung dòch treân pha theâm 2,3 g NaCl, cho theâm 1ml caùc dung dòch chuaån, 50l dung dòch noäi chuaån. Coät haáp phuï Coù theå söû duïng caùc loaïi coät vôùi caùc pha tónh khaùc nhau nhö: coät PDMS 100m (PDMS-100), PDMS-7, Polydimethylsilosane-divinylbenzen 65m (PDMS-DVB), Polyacrylat 85m (PA) vaø coät Carbowax- divinylbenzen 65m (CW-DVB). Giai ñoaïn taùch chieát SPME Caùc dung dòch sau khi ñöôïc chuaån bò seõ ñem ñò chaïy SPME vôùi caùc ñieàu kieän sau: laéc 10phuùt vôùi toác ñoä 200 voøng/phuùt. Thôøi gian haáp phuï 20 phuùt vaø giaûi haáp phuï trong 2 phuùt ôû 250oC. Chaïy saéc kí Heä thoáng saéc kí ñöôïc chuaån bò nhö sau: söû duïng maùy saéc kí 3400 GC, ñaàu doø FID, nhieät ñoä ñaàu doø 300oC, tæ leä chia doøng 1/20; coät saéc kí mao quaûn CP Wax 57CB (50m x 0,25mm I.D; daøy 0,2m), nhieät ñoä injector 250oC . Chöông trình chaïy: 50oC trong 4 phuùt, taêng 8oC/phuùt ñeán 180oC, sau ñoù duy trì 5 phuùt. Khí mang laø Heli, aùp löïc 20psi. Keát quaû Theo [2], taùc giaû ñaõ thöïc hieän moät loaït caùc thí nghieäm vaø ñöa ra caùc keát quaû sau: Coät toát nhaát söû duïng trong tröôøng hôïp naøy laø coät CW- DVB Ño dieän tích peak caùc caáu töû theo thôøi gian taùch SPME, keát quaû thu ñöôïc laø: sau 5 phuùt taùch, dieän tích peak haàu nhö khoâng thay ñoåi Vôùi caùc caáu töû coù noàng ñoä cao, theå tích pha loûng söû duïng haàu nhö khoâng aûnh höôûng ñeán dieän tích peak. Ñieàu naøy coù theå ñöôïc giaûi thích laø caùc caáu töû coù noàng ñoä cao seõ nhanh choùng laøm baõo hoøa pha hôi. Quaù trình taùch SPME seõ khoâng bò aûnh höôûng bôûi noàng ñoä sacharose trong röôïu vang. Dieän tích peak cuûa caùc caáu töû khoâng bò aûnh höôûng bôûi noàng ñoä ethanol trong röôïu. Thöïc hieän chaïy dung dòch A ñeå xaùc ñònh tính khaû thi cuûa SPME, keát quaû thu ñöôïc laø caùc giaù trò t-value ñeàu thaáp hôn giaù trò tôùi haïn, coù nghóa laø söû duïng SPME seõ xaùc ñònh noàng ñoä caáu töû höông thu ñöôïc keát quaû gaàn baèng noàng ñoä thöïc. Töø ñoù, cuõng xaùc ñònh ñöôïc caùc chaát noäi chuaån caàn söû duïng ñeå tính noàng ñoä cuûa caùc caáu töû höông. Baûng 2.3: Caùc chaát noäi chuaån phuø hôïp cho caùc caáu töû höông Caáu töû höông Chaát noäi chuaån Ethyl acetat Methanol Butanol-2 Propanol-1 Iso butanol Butanol-1 2-methyl butanol-1 3-methyl-butanol-1 2-methyl-3-buten-2-ol 2,3-butaodione 4-methyl-2-pentanol 2-methyl-3-buten-2-ol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol 4-methyl-2-pentanol Noàng ñoä caùc caáu töû höông: Baûng 2.4: Noàng ñoä moät soá caáu töû höông chính cuûa caùc loaïi röôïu Canary Island (mg/L) Caáu töû höông Trung bình Ñoä leäch chuaån Min Max Ethyl acetat Methanol Butanol-2 Propanol-1 Iso butanol Butanol-1 2-methyl butanol-1 3-methyl-butanol-1 156,7 103,3 30,1 55,6 40,2 186,8 227,1 312,8 33,9 30,3 8,9 18,4 12,1 57,3 68,3 74,3 115,8 62,3 20,0 30,6 19,9 111,4 131,3 187,6 225,5 158,4 46,2 85,7 56,0 289,5 344,7 421,9 Phöông phaùp chöng caát loâi cuoán hôi nöôùc vaø trích ly ñoàng thôøi (Simultaneous steam distillation /extraction – SDE) Giôùi thieäu SDE (chöng caát loâi cuoán hôi nöôùc vaø taùch chieát ñoàng thôøi) laø moät trong nhöõng phöông phaùp coù töø laâu ñôøi vaø ñöôïc söû duïng phoå bieán nhaát ñeå taùch chieát caùc caáu töû deã bay hôi. Phöông phaùp naøy ñöôïc phaùt minh bôûi 2 nhaø khoa hoïc Likens vaø Nickerson, nhöng ngöôøi nghieân cöùu nhieàu vaø ñöa ra nhieàu caùch thöùc ñoåi môùi trong vieäc tieán haønh phaân tích laø nhaø khoa hoïc Chaintreau. [23] Vieäc phaân tích caùc caáu töû höông luoân ñoøi hoûi vieäc phaûi taùch chieát caùc phaân ñoaïn deã bay hôi töø hoãn hôïp ban ñaàu roài sau ñoù môùi ñem ñi phaân tích saéc kí khí. Phöông phaùp bôm maãu tröïc tieáp vaøo thieát bò GC sau khi xöû lyù dung moâi (nhö phöông phaùp LLE, phöông phaùp duøng chaát loûng sieâu tôùi haïn) coù theå gaây nhieãm baãn injector vaø laøm aûnh höôûng ñeán khaû naêng laøm giaøu cuûa caùc caáu töû. Phöông phaùp chöng caát chaân khoâng tröïc tieáp thì khaù röôøm raø vaø toán nhieàu thôøi gian vì söû duïng löôïng maãu khaù lôùn vaø phaûi qua nhieàu giai ñoaïn khaùc nhau. Töø khi hai nhaø khoa hoïc Likens vaø Nickerson ñöa ra nguyeân taéc cuûa phöông phaùp SDE 1964, phöông phaùp naøy ngaøy caøng trôû neân phoå bieán, nhaát laø khi phaân tích trong caùc phoøng thí nghieäm. Tieáp böôùc Likens vaø Nickerson, laàn löôït caùc nhaø khoa hoïc nhö Godefroot, Sandra, Verzele… ñaõ nghieân cöùu caùc böôùc phaùt trieån cuûa phöông phaùp nhaèm ruùt ngaén thôøi gian taùch chieát vaø thieát bò nhoû goïn hôn. [39] Nguyeân taéc taùch chieát [55] SDE laø moät trong nhöõng kó thuaät khaù ñôn giaûn vaø phuø hôïp vôùi caùc maãu daïng loûng. Ñaây laø quaù trình taùch chieát coù söï keát hôïp cuûa hai hieän töôïng hoùa lyù : chöng caát loâi cuoán hôi nöôùc vaø taùch chieát baèng dung moâi. Nguyeân taéc taùch chieát baèng dung moâi seõ ñöôïc nhaéc ñeán nhieàu hôn trong phaàn 2.3.3.3 veà phöông phaùp taùch chieát baèng dung moâi. Hieäu quaû taùch chieát caùc caáu töû phuï thuoäc vaøo tính chaát vaät lyù cuûa chuùng trong hoãn hôïp phaân tích, thieát bò söû duïng vaø phöông phaùp chöng caát. Nguyeân lyù chung laø caùc caáu töû höông kò nöôùc caàn phaân tích seõ ñöôïc trích töø pha öa nöôùc cuûa maãu sang moät dung moâi höõu cô khoâng tan laãn trong nöôùc, do söï phaân boá cuûa caáu töû caàn phaân tích trong 2 pha, ñaëc tröng baèng heä soá phaân boá Kow ôû ñieàu kieän caân baèng: Kow= Cio/ Ciw Cio: noàng ñoä caáu töû caàn phaân tích ôû ñieàu kieän caân baèng trong dung moâi trích Ciw: noàng ñoä caáu töû caàn phaân tích ôû ñieàu kieän caân baèng trong pha ban ñaàu Nguyeân taéc chöng caát loâi cuoán hôi nöôùc thöôøng söû duïng cho caùc caáu töû khoù bay hôi hôn. Quaù trình bay hôi cuûa maãu xaûy ra nhôø söï caáp hôi nöôùc lieân tuïc cho maãu hoaëc töï taïo ra hôi nöôùc baèng caùch gia nhieät cho hoãn hôïp maãu vaø nöôùc tôùi moät nhieät ñoä ñuû cao. Khi ñoù, caùc caáu töû ít tan trong nöôùc seõ bò cuoán theo doøng hôi nöôùc ñeán boä phaän ngöng tuï neân chuùng ñöôïc taùch ra khoûi nhöõng phaân ñoaïn khoâng bay hôi. Thieát bò SDE Hình 2.15: caáu taïo thieát bò taùch chieát SDE [23] Thieát bò SDE coù caáu taïo nhö hình sau, goàm: Moät bình chöùa maãu vaø moät bình chöùa dung moâi taùch chieát ñeàu ñöôïc gia nhieät ñeán nhieät ñoä soâi nhôø vaøo thieát bò gia nhieät voû aùo. Phaàn khoâng gian phía treân hai bình caàu coù chöùa moät heä thoáng sinh haøn laøm laïnh ñeå ngöng tuï caùc caáu töû sau khi bay hôi xuoáng moät heä thoáng oáng coù caáu taïo sao cho möïc chaát loûng daâng ñeán moät moät möùc naøo ñoù seõ chaûy traøn veà caùc bình chöùa maãu vaø dung moâi ban ñaàu. Phaàn khoâng gian phía treân hai bình caàu seõ ñöôïc thoâng vôùi heä thoáng bôm chaân khoâng ñeå taïo ñoä chaân khoâng thích hôïp cho toaøn boä heä thoáng taùch chieát. [23] Quaù trình taùch chieát baèng SDE Quaù trình thöïc hieän SDE nhö sau: maãu phaân tích ñöôïc ñöa vaøo bình coù coå coù dung tích 500ml- 5l. Löôïng maãu chöùa chöøng moät nöûa dung tích bình. Neân thöïc hieän khuaáy ñaûo neáu maãu laø huyeàn phuø ñaëc ñeå traùnh vieäc bôm bò taéc ngheõn. Tröôùc khi tieán haønh chöng caát, pH cuûa maãu ñöôïc ño tröôùc vaø coù theå ñieàu chænh neáu caàn thieát. Nhieät ñöôïc caáp cho maãu nhôø lôùp voû aùo gia nhieät. Dung moâi taùch chieát thöôøng chöùa trong bình caàu coù coå theå tích 10-50ml vaø cuõng ñöôïc gia nhieät. Raát nhieàu dung moâi coù theå söû duïng ñeå taùch chieát nhö : hexan, diethyl ete, methylen chloride, hoãn hôïp pentan vaø diethyl ete… [57] Quaù trình chöng loâi cuoán hôi nöôùc vaø taùch chieát ñoàng thôøi dieãn ra nhö sau: maãu coù chöùa nöôùc caát ñöôïc gia nhieät ñeán nhieät ñoä soâi, hôi nöôùc boác maïnh loâi cuoán caùc caáu töû höông ít tan trong nöôùc boác hôi leân, ñoàng thôøi ôû bình chöùa dung moâi cuõng ñöôïc gia nhieät vaø dung moâi cuõng ñöôïc boác hôi vaø hoøa troän vôùi phaàn hôi cuûa maãu. Hoãn hôïp naøy sau ñoù seõ ñöôïc ngöng tuï trong oáng sinh haøn, luùc naøy caùc caáu töû höông seõ ñöôïc chieát sang dung moâi. Sau khi ngöng tuï, phaàn loûng ñöôïc taùch laøm hai pha, pha treân chöùa dung moâi vaø caùc caáu töû höông deã bay hôi, pha döôùi laø nöôùc. Möïc chaát loûng cuûa pha treân sau ñoù seõ daàn chaûy traøn veà bình caàu chöùa dung moâi ban ñaàu, coøn nöôùc ôû döôùi cuõng chaûy veà bình chöùa maãu ban ñaàu. Quaù trình naøy dieãn ra khaù chaäm, khoaûng 1-3h. Sau ñoù, phaàn dung moâi chöùa caùc caáu töû caàn phaân tích seõ ñöôïc laøm khoâ vôùi taùc nhaân laø caùc haït Na2SO4 roài sau ñoù ñöôïc laøm giaøu baèng caùch chöng caát nheï vaø chaäm. [57] Tuy nhieân, nhöôïc ñieåm lôùn nhaát cuûa SDE laø nhieät ñoä cuûa nöôùc soâi khaù cao (105oC) sinh ra moät soá caáu töû thöù caáp khoâng mong muoán. Ñeå giaûm nhieät ñoä cuûa noài chöng, moät soá taùc giaû ñaõ ñöa ra phöông phaùp tieán haønh ôû aùp suaát chaân khoâng. Picardi, Issenberg, Seifert vaø King ñaõ coá gaéng duy trì nhieät ñoä maãu chöøng 45-50oC. [63] Khi chöng caát ôû aùp suaát thöôøng, caùc loaïi nguyeân lieäu maãu chöùa amino acid (nhö dòch nho) thì phaûn öùng Maillard raát deã dieãn ra vaø laøm cho keát quaû phaân tích trôû neân khoâng ñaùng tin caäy nöõa. Theo nhö nghieân cöùu trong [63], caùc taùc giaû ñaõ laøm thí nghieäm vaø ñöa ra keát luaän: trong ñieàu kieän chaân khoâng, phaûn öùng treân ñöôïc haïn cheá raát nhieàu, tæ leä thu hoài caùc caáu töû cuõng khaù toát vaø hieäu quaû ñònh löôïng seõ taêng so vôùi heä thoáng vaän haønh trong ñieàu kieän aùp suaát thöôøng. Hieäu quaû naøy seõ coøn ñöôïc caûi thieän hôn nöõa khi keùo daøi thôøi gian chaïy maãu (do trong ñieàu kieän chaân khoâng thì gaàn nhö khoâng coù söï phaân huûy do nhieät) [23,39] Vaán ñeà hieän nay khi söû duïng phöông phaùp SDE laø phaûi ñöa ra thieát bò deã söû duïng trong vieäc taùch chieát caùc caáu töû deã bay hôi maø khoâng bò thaát thoaùt, thöïc hieän trong nhieät ñoä phoøng, vôùi thôøi gian hôïp lyù.[39] Öu- nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp SDE a. Öu ñieåm Phöông phaùp naøy phoå bieán ôû choã caùc caáu töû deã bay hôi coù ñieåm soâi trung bình vaø cao thì thu hoài toát, ñoàng thôøi dung moâi loûng duøng trích ly cuõng deã kieám vaø khoâng ñaét. [23,32] Beân caïnh ñoù, SDE coù nhöõng öu ñieåm noåi baät sau: [57] Chæ qua moät giai ñoaïn maø thöïc hieän ñöôïc caû vieäc taùch chieát caùc caáu töû deã bay hôi vaø laøm giaøu (taêng noàng ñoä cuûa chuùng) Theå tích dung moâi yeâu caàu laø thaáp Tæ leä thu hoài caùc caáu töû deã bay hôi laø khaù cao Heä thoáng laøm vieäc döôùi ñieàu kieän aùp suaát chaân khoâng neân seõ goùp phaàn laøm giaûm söï phaân huyû caùc caáu töû döôùi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä. Do löôïng maãu söû duïng nhieàu neân phaân tích baèng phöông phaùp SDE cuõng thu ñöôïc soá löôïng caùc caáu töû höông ña daïng hôn caùc phöông phaùp khaùc [31] Coù theå ñem ñi phaân tích GC ngay sau khi taùch chieát SDE maø khoâng caàn qua böôùc laøm saïch maãu. Ngoaøi ra, dòch thu ñöôïc sau taùch chieát seõ hoaøn toaøn khoâng chöùa caùc caáu töû khoâng bay hôi khoâng mong muoán. [63] b. Nhöôïc ñieåm [31,39] Nhöôïc ñieåm deã thaáy nhaát cuûa SDE laø löôïng maãu söû duïng ñeå phaân tích laø lôùn hôn haún nhöõng phöông phaùp phaân tích khaùc (thöôøng treân 50ml). Ñieàu naøy laøm cho vieäc phaân tích toán chi phí khaù nhieàu veà nguyeân lieäu. Beân caïnh ñoù, ñaây laø phöông phaùp thöïc hieän khaù laâu, toán thôøi gian hôn haún nhöõng phöông phaùp phaân tích khaùc (thöôøng maát töø 3-4h trôû leân) Maët khaùc, phöông phaùp SDE naøy phaûi toán theâm chi phí vì söû duïng theâm dung moâi vaø nhieät löôïng khi taùch chieát. Nhöôïc ñieåm lôùn nhaát cuûa SDE laø khi thöïc hieän ôû nhieät ñoä vaø aùp suaát thöôøng, do nhieät ñoä cuûa nöôùc soâi khaù cao (105oC) neân seõ coù phaûn öùng phaân huûy sinh ra moät soá caáu töû thöù caáp khoâng mong muoán. Trong moät soá tröôøng hôïp, ngöôøi ta coù söû duïng theâm caùc chaát choáng oxi hoaù ñeå giaûm thieåu vieäc phaân huûy caùc caáu töû do phaûn öùng oxi hoùa döôùi taùc ñoäng cuûa nhieät ñoä cao. Do nhöõng lyù do treân, phöông phaùp naøy ít khi söû duïng cho caùc maãu coù caùc caáu töû nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä (ôû nhieät ñoä cao seõ xuùc taùc xaûy ra nhöõng phaûn öùng Maillard, oxi hoùa, chuyeån vò…). [39] Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình taùch chieát SDE Moãi giai ñoaïn cuûa quaù trình taùch chieát ñeàu coù aûnh höôûng ñeán thaønh phaàn vaø tæ leä caùc caáu töû trong hoãn hôïp sau taùch chieát . Caùc yeáu toá aûnh höôûng bao goàm ñoä bay hôi cuûa caùc caáu töû khi chöng caát loâi cuoán, khaû naêng hoaø tan cuûa hoãn hôïp sau chöng caát trong quaù trình chieát baèng dung moâi, vaø laïi laø ñoä bay hôi trong quaù trình coâ ñaëc hoãn hôïp, loaïi bôùt dung moâi [23] Dung moâi taùch chieát Nhöõng dung moâi coù ñieåm soâi thaáp nhö diclometan, pentan, diethyl ete thöôøng ñöôïc söû duïng trong phöông phaùp SDE vì chuùng coù khaû naêng taùch chieát raát toát (coù heä soá phaân boá cuûa caùc caáu töû Kow cao), ñöôïc taùch röûa nhanh choùng trong quaù trình GC vaø chuùng deã boác hôi khi tieán haønh laøm giaøu caùc caáu töû caàn phaân tích. Trong ñieàu kieän aùp suaát chaân khoâng, caùc dung moâi treân ngöng tuï ôû nhieät ñoä raát thaáp (-40oC). Caùc dung moâi coù ñieåm soâi gaàn vôùi nöôùc seõ laøm cho caùc caáu töû bò thaát thoaùt ñi nhieàu, laøm vieäc phaân tích khoâng coøn chính xaùc. Vôùi phöông phaùp SDE thöïc hieän trong ñieàu kieän chaân khoâng, coù theå söû duïng caùc dung moâi söû duïng coù nhieät ñoä soâi cao hôn nhö diclometan vaø hexan. Tuy vaäy, caùc dung moâi söû duïng trong phöông phaùp naøy seõ deã daøng loaïi ra khoûi hoãn hôïp ôû ngay nhieät ñoä phoøng baèng caùch cho moät doøng khí nitô di chuyeån nheï qua maãu trong thôøi gian ngaén. Tröôøng hôïp naøy, caùc loaïi ankan thöôøng ñöôïc söû duïng vaø thích hôïp hôn caùc dung moâi nhö Toluen vì ít gaây muøi hôn. [39] Baûng 2.5: Thoâng soá cuûa moät soá dung moâi taùch chieát trong SDE [39] Dung moâi Ñieåm soâi (oC) Ñoä chaân khoâng (mbar) Nhieät ñoä maãu (oC) Nhieät ñoä dung moâi (oC) Muøi dung moâi Iso-octan Heptan 2-Pentanon Toluen Hexan Octan 99 99 102 111 69 125 49 35 31 37 115 20 37 30 31 37 115 20 20 17 17 26 22 26 Yeáu Yeáu Khoù chòu Khoù chòu Yeáu Yeáu Thôøi gian taùch chieát Moät yeáu toá aûnh höôûng quan troïng khaùc laø thôøi gian taùch chieát. Neáu thöïc hieän ôû aùp suaát thöôøng, thôøi gian taùch chieát caøng daøi thì caùc caáu töû caàn phaân tích caøng deã bò phaân huûy. Trong ñieàu kieän chaân khoâng, khi ñaõ chænh aùp suaát vaø nhieät ñoä hôïp lyù, thôøi gian caøng daøi thì taùch chieát ñöôïc caøng nhieàu. Nhìn chung, tuøy baûn chaát cuûa caáu töû caàn phaân tích maø ta löïa choïn thôøi gian taùch chieát cho phuø hôïp.[63] Nhieät ñoä Nhieät ñoä cuûa caùc hoãn hôïp ñaït ñöôïc khi gia nhieät cuõng ñoùng vai troø raát quan troïng. Nhìn chung, caàn gia nhieät ñeán nhieät ñoä bay hôi cuûa dung moâi (bình chöùa dung moâi) vaø nhieät ñoä bay hôi cuûa nöôùc (bình chöùa maãu). Nhieät ñoä soâi cuûa nöôùc coù theå laøm phaân huûy moät soá caáu töû höông, vì vaäy ngöôøi ta coù xu höôùng thöïc hieän taùch chieát trong ñieàu kieän chaân khoâng. [39,63] Caùc yeáu toá khaùc Ngoaøi caùc yeáu toá keå treân, coøn haøng loaït caùc yeáu toá aûnh höôûng tröïc tieáp vaø giaùn tieáp ñeán quaù trình nhö theå tích maãu vaø dung moâi, toác ñoä laøm laïnh, khoaûng caùch giöõa hai möùc chaûy traøn… Nhìn chung, vôùi moãi loaïi maãu khaùc nhau, ngöôøi ta thöôøng thí nghieäm ñeå ruùt ra caùc thoâng soá phaân tích toái öu nhaát.[31,39,63 So saùnh SDE vôùi nhöõng phöông phaùp taùch chieát khaùc So saùnh SDE vôùi SBSE Phöông phaùp SDE thöôøng duøng trong phaân tích caùc caáu töû höông coù haøm löôïng trung bình vaø cao, vì noù coù ñoä nhaïy keùm hôn caùc phöông phaùp SBSE, SPE. Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc khaúng ñònh trong caùc nghieân cöùu cuûa caùc nhaø khoa hoïc thoâng qua soá löôïng caáu töû höông phaân tích ñöôïc vaø noàng ñoä cuûa caùc caáu töû ñoù. Ñieàu naøy theå hieän raát roõ ôû baûng sau: caùc caáu töû coù haøm löôïng trung bình vaø cao seõ phaân tích toát baèng SDE, coøn caùc caáu töû coù haøm löôïng thaáp hôn thì thích hôïp khi phaân tích baèng SBSE.[16] Baûng 2.6: Keát quaû phaân tích cuûa moät dung dòch caùc chaát höõu cô nhaèm so saùnh 2 phöông phaùp SDE vaø SBSE [16] Caáu töû Thôøi gian löu (phuùt) Phöông phaùp taùch chieát Noàng ñoä (g/L) 2-methyl-1-buten 2-methyl-2-buten Diethyl ete Carbon disulphite Aceton 1,2 diclomethylen 2-Butanon n-propyl acetat Tetraclomethylen Cloroform Methyl metacrylat Toluen Decamethyl cyclopentasilosan Styren Hydroxy aceton Diaceton acid 1,49 1,51 1,54 2,06 2,15 2,41 3,32 4,74 4,98 5,08 5,51 6,48 13,46 15,48 17,34 20,03 SDE SDE SDE SBSE SDE SDE SBSE SBSE SDE SDE SBSE SBSE SBSE SBSE SBSE SBSE 0,7 25 6,2 0,4 4951 75 0,01 0,11 2,7 130 0,07 0,11 1,1 0,04 0,05 0,08 So saùnh SDE vôùi SPME Cuøng vôùi caùc phöông phaùp khaùc nhö LLE, SPE, LLE thì SDE cuõng laø moät trong nhöõng phöông phaùp taùch chieát vaø laøm giaøu caùc caáu töû caàn phaân tích tröôùc khi phaân tích GC ñeå traùnh vieäc caùc caáu töû khoâng mong muoán laøm nhieãu tín hieäu. SPME laø moät trong nhöõng phöông phaùp phaân tích khaù môùi söû duïng cô cheá haáp phuï vaø giaûi haáp phuï ñeå taùch chieát vaø laøm giaøu caùc caáu töû. [25,30] Qua nhieàu thí nghieäm nghieân cöùu vaø so saùnh, caùc nhaø khoa hoïc daàn ñaõ ñöa ra ñöôïc keát luaän raèng SDE coù theå taùch chieát ñöôïc caùc caáu töû coù phaân töû löôïng cao vaø ñoä bay hôi thaáp toát hôn laø SPME. Tuy laø toaøn dieän hôn veà maët aáy nhöng vì laø moät phöông phaùp truyeàn thoáng, SDE coù ñoä nhaïy khoâng cao baèng SPME (laø moät phöông phaùp haáp phuï vaø giaûi haáp phuï) do trong quaù trình chöng loâi cuoán ôû nhieät ñoä cao, caùc phaûn öùng phaân huûy raát deã xaûy ra laøm thay ñoåi thaønh phaàn caùc caáu töû caàn phaân tích. Trong khi ñoù, vieäc taùch chieát caùc caáu töû naøy ñöôïc thöïc hieän raát deã daøng baèng caùch haáp phuï ôû thieát bò SPME. [30] Maët khaùc, SDE ñöôïc xem laø phöông phaùp coù ñoä laëp laïi khaù cao vaø toát hôn SPME neân noù thöôøng ñöôïc öu tieân khi phaân tích caùc caáu töû ít bò nhaïy caûm do nhieät ñoä. Nhöôïc ñieåm lôùn nhaát cuûa SDE so vôùi SPME laø thôøi gian taùch chieát daøi, söû duïng dung moâi ñeå taùch neân coù khaû naêng bò nhieãm baån, vaø phöông phaùp naøy thöôøng chæ thích hôïp cho caùc phoøng thí nghieäm.[25,30] ÖÙng duïng SDE vaøo phaân tích ñònh löôïng caùc caáu töû höông trong dòch nho sau leân men [31] Nhö ñaõ ñeà caäp ôû treân, trong dòch nho sau leân men cuõng nhö röôïu vang, caùc thaønh phaàn caáu töû taïo höông laø raát phöùc taïp. Haøm löôïng cuûa caùc caáu töû höông laø raát khaùc nhau vaø thöôøng laø raát nhoû, coù theå chæ ôû möùc ng/L. Caùc caáu töû coù tính chaát raát khaùc nhau veà ñoä phaân cöïc, ñoä bay hôi do chuùng coù nhöõng nhoùm chöùc ñaëc tröng (-OH, -CHO, -COOH) Phaàn naøy seõ trình baøy veà vieäc söû duïng phöông phaùp SDE, so saùnh keát quaû phaân tích vôùi phöông phaùp HS-SPME ñoái vôùi loaïi röôïu vang Cava. Chuaån bò maãu Söû duïng 3 maãu röôïu Cava ñöôïc saûn xuaát töø cuøng moät nhaø maùy röôïu vang. Nhöõng boä phaän chöùa maãu chöùa 200ml röôïu vang vaø phaàn khoâng gian headspace chöùa ñaày khí carbonic. Tröôùc khi phaân tích, moãi maãu ñeàu ñöôïc boå sung 2,5 mg/L 2-octanol nhö laø chaát noäi chuaån. Hoùa chaát söû duïng Caùc chaát chuaån ñeàu ñöôïc chuaån bò vaø boå sung vaøo dung dòch ethanol vôùi moät haøm löôïng hôïp lyù ñeå taïo thaønh moät dung dòch chuaån ñeå phaân tích Phöông phaùp taùch chieát SDE: 50 ml maãu röôïu Cava ñöôïc ñöa vaøo bình coù coå 250ml ñaõ chöùa saün 100ml nöôùc caát. Moät bình khaùc chöùa 5ml hoãn hôïp dung moâi pentan vaø diclometan (tæ leä 3:1). Hai bình ñöôïc laép vaøo thieát bò SDE (daïng Likens- Nickerson). Caû maãu vaø dung moâi ñeàu ñöôïc gia nhieät ñeán nhieät ñoä soâi cuûa chuùng. Ñieàu kieän nhieät ñoä treân ñöôïc duy trì trong 4h. Dung dòch polyethylenglycol ñöôïc söû duïng nhö laø moâi chaát laïnh ñeå ngöng tuï caùc caáu töû deã bay hôi caàn phaân tích. Dòch trích ñöôïc seõ ñöôïc thu nhaän ôû nhieät ñoä phoøng, sau ñoù ñöôïc ñem ñi laøm khoâ nhôø boät Na2SO4 vaø cuoái cuøng ñöôïc laøm giaøu baèng caùch loaïi dung moâi nhôø vaøo khí Nitô. HS-SPME: 2ml röôïu vang ñöôïc ñaët vaøo boä phaän chöùa maãu. Trong boä phaän naøy coù trang bò thieát bò khuaáy töø. Sau ñoù maãu ñöôïc duy trì ôû 35oC trong voøng 30 phuùt. Coät SPME ñöôïc hoaït hoùa baèng caùch ñöa vaøo boä phaän tieâm maãu cuûa thieát bò GC ôû nhieät ñoä 280oC trong 30 phuùt. Sau ñoù, coät SPME ñöôïc ñöa vaøo khoaûng khoâng gian headspace cuûa maãu trong voøng 30 phuùt. Sau thôøi gian naøy, coät ñöôïc laáy ra vaø ñöôïc ñöa vaøo boä phaän tieâm maãu vaø ñöôïc giaûi haáp phuï trong 5 phuùt. Coät söû duïng laø coät 20mm, ñöôïc phuû moät lôùp 50/30m DVB-CAR-PDMS. Phaân tích saéc kyù Söû duïng thieát bò GC supercowax (Supelco, Myõ), coät söû duïng laø coät mao quaûn vôùi pha tónh laø polyethylenglycol 30m x 0,25mm x 0,25m. Chöông trình nhieät ñoä taêng daàn töø 40-250oC nhö sau: 40oC trong 10 phuùt, taêng töø 40-200oC vôùi toác ñoä 2oC/phuùt, duy trì ôû 200oC trong 1 phuùt, taêng töø 200-250oC vôùi toác ñoä 2oC/ phuùt, vaø cuoái cuøng duy trì ôû 250oC trong 10 phuùt. Söû duïng khí trô laø doøng khí Heli vôùi vaän toác 1ml/phuùt. 1l dòch chieát töø phöông phaùp SDE ñöôïc bôm vaøo injector vôùi cheá ñoä khoâng chia doøng. Keát quaû phaân tích Caùc caáu töû ñöôïc ñònh tính döïa vaøo keát quaû chaïy khoái phoå MS. Danh saùch caùc caáu töû höông phaân tích bôûi 2 phöông phaùp treân theo nhö baûng sau, thöù töï caùc caáu töû döïa vaøo thöù töï röûa giaûi. Baûng 2.7: Caùc caáu töû höông cuûa röôïu vang Cava ñöôïc phaân tích bôûi SDE vaø SPME Hôïp chaát SDE SPME Hôïp chaát SDE SPME 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 Ethyl propanoat Ethyl isobutyrat Butyraldehyde Ethyl butyrat Propanol Ethyl-2-methyl butanoat Ethyl isovalerat Isobutylic Valeraldehyde Isovaleraldehyde Hexanal Isoamyl acetat Methyl hexanoat Butanol 1-penten-3-ol Limonen Isoamylic Ethyl hexanoat Isopropyl disulphite Hexanal Pentanol Hexyl acetat 2-octanon Ethyl 3-hexanoat Octanal Isohexanol 2-penten-1-ol 1-pentanol Heptanal Ethyl 2-hexenoat 2-methyl-1-pentanol Ethyl lactat Hexanol 3-hexenol 3ethoxy1-propanol Cis 3-hexenol Methyl octanoat Ethyl octanoat Heptanol Fufural 2-ethyl hexen-1-ol 2-acethyl furan + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 5758 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 Vitispiran1 Vitispiran2 Methylthiophen-3-on Nonanal Ethyl propionat 1-octanol butyrolactone 5-methyl fufural Diethyl malonat Methyl decanoat Ethyl 2 –furancarboxylat Ethyl decanoat Isoamyl octanoat Diethyl succinat Ethyl 9-decenoat Terpen Terpineol Terpen Terpen TDN Undecanal Terpen 1-decanol 2-phenyl ethyl actetat Ethyl dodecanoat Benzylic Acid hexanoic 2-phenyl ethanol Isopropyl myristat Methyl tetradecanoat Lilial Ethyl tetradodecanoat Acid octanoic p-vinyl guaiacol Methyl hexadecanoat Terpen-Amyl cinnamaldehyde Ethyl hexadecanoat Acid decanoic Methyl octadecenoat Acid tetradecanoic Acid hexadecanoic + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Döôùi ñaây laø saéc kí ñoà khi phaân tích baèng SDE vaø SPME: Hình 2.16: Saéc kí ñoà phaân tích caùc caáu töû höông röôïu vang baèng 2 phöông phaùp SPME vaø SDE Löôïng maãu söû duïng khi phaân tích SDE vaø SPME laàn löôït laø 50ml vaø 2ml. Do ñoù maø phöông phaùp SDE cuõng cho saéc kí ñoà roäng hôn. SDE toán nhieàu thôøi gian hôn vaø toán dung moâi ñeå taùch chieát, nhöng cuõng döïa vaøo dung moâi ñoù maø coù theå taùch vaø phaân tích ñöôïc moät soá caáu töû coù tính phaân cöïc. Coøn phöông phaùp SPME ñöôïc tieán haønh nhanh hôn nhöng coù haïn cheá veà khaû naêng phaân tích caùc caáu töû coù tính phaân cöïc cao. Töø GC-MS, maùy seõ cho keát quaû saéc kí ñoà vaø haøm löôïng caùc caáu töû caàn phaân tích. Phöông phaùp chieát loûng-loûng (Liquid-liquid extraction -LLE) Giôùi thieäu LLE laø moät trong nhöõng phöông phaùp laâu ñôøi vaø quan troïng nhaát trong kó thuaät taùch chieát vaø laøm giaøu caáu töû. Taùch chieát vaø laøm giaøu thöôøng laø nhöõng quaù trình phuï vaø hoã trôï cho caùc phöông phaùp phaân tích (GC, HPLC) khi caùc phöông phaùp bôm maãu tröïc tieáp khoâng theå thöïc hieän ñöôïc vì ñoä nhaïy quaù thaáp hoaëc moät soá caáu töû coù noàng ñoä quaù cao laøm nhieãu caùc caáu töû caàn phaân tích. Chính vì vaäy, caùc kó thuaät taùch chieát ñaõ ngaøy caøng phaùt trieån maïnh nhaèm phuïc vuï cho vieäc phaân tích ñònh tính vaø ñònh löôïng chính xaùc hôn.[74] LLE laø moät trong nhöõng phöông phaùp truyeàn thoáng phoå bieán nhaát duøng ñeå taùch chieát caùc hôïp chaát höõu cô. Hai pha loûng khoâng tan laãn vaøo nhau ñöôïc troän vôùi nhau trong pheãu chieát vaø ñöôïc laéc ñeàu trong moät thôøi gian nhaát ñònh roài sau ñoù ñeå oån ñònh ñeå xaûy ra söï taùch pha. Ñeå traùnh vieäc taïo nhuõ giöõa hai pha loûng, ngöôøi ta thöôøng boå sung moät löôïng muoái NaCl vaø coù theå thöïc hieän ly taâm neáu caàn thieát.Sau thôøi gian oån ñònh pha, hai pha ñöôïc thu hoài rieâng vaø ñem ñi phaân tích.[35] Thieát bò LLE Hình 2.17: Caáu taïo thieát bò LLE [51] T: nhiệt kế, V: van, M: motor, S: syringe Thieát bò LLE laø loaïi thieát bò truyeàn thoáng, coù caáu taïo khaù ñôn giaûn: gồm moät boä phaän chöùa pha loûng ñöôïc laøm baèng theùp khoâng ræ, coù motor gaén vôùi thanh khuaáy, ngoaøi ra coù theâm nhieät keá ñeå ño nhieät ñoä luùc caàn thieát. [51] Cô cheá taùch caáu töû höông baèng LLE [57,67,68] Caùc caáu töû höông kò nöôùc caàn phaân tích seõ ñöôïc trích töø pha öa nöôùc cuûa maãu sang moät dung moâi höõu cô khoâng tan laãn trong nöôùc. Raát nhieàu caùc dung moâi höõu cô thöôøng ñöôïc söû duïng nhö pentan, hexan, diethyl ete, cloroform... Cô cheá taùch chuû yeáu cuûa LLE laø do söï phaân boá cuûa caáu töû caàn phaân tích trong 2 pha, ñaëc tröng baèng heä soá phaân boá Kow ôû ñieàu kieän caân baèng : Kow= Cio/ Ciw Cio: noàng ñoä caáu töû caàn phaân tích ôû ñieàu kieän caân baèng trong dung moâi trích Ciw: noàng ñoä caáu töû caàn phaân tích ôû ñieàu kieän caân baèng trong pha loûng Ñeå quaù trình LLE coù hieäu quaû, caùc caáu töû caàn phaân tích caàn coù aùi löïc lôùn vôùi dung moâi chieát vaø do ñoù