Định típ phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: Human Leukocyte Antigen) bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học 111 ĐỊNH TÍP PHỨC HỢP KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI (HLA: HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN) BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI Mai Phương Thảo*, Lê Gia Hoàng Linh**, Nguyễn Thế Vinh**, Hoàng Anh Vũ**, Đỗ Đức Minh** TÓM TẮT Mục tiêu: Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: human leukocyte antigen) là phức hợp các protein màng tế bào đóng vai trò quan trọng trong điều hòa miễn dịch. Định típ HLA rất cần thiết cho việc ghép tạng cũng như ghép tế bào gốc. Giải trình tự thế hệ mới là một công cụ hiện đại giúp định típ HLA dễ dàng, nhanh chóng và dần trở thành xu hướng trên toàn thế giới. Đối tượng và phương pháp: 66 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu được định típ HLA bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới kết hợp với phân tích sinh tin học trên phần mềm Assign Trusight HLA v2,0. Kết quả: Chúng tôi đã định típ HLA lớp I và lớp II của 66 đối tương tham gia nghiên cứu bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới và thu thập được phân bố các kiều gen HLA phổ biến ở người Việt Nam. Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới là một kỹ thuật định típ HLA chính xác, nhanh chóng, hiệu quả và tiết kiệm chi phí. Từ khóa: phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA), giải trình tự thế hệ mới, phản ứng PCR ABSTRACT HUMAN LEUKOCYTE ANTIGEN (HLA) TYPING BY NEXT GENERATION SEQUENCING Mai Phuong Thao, Le Gia Hoang Linh, Nguyen The Vinh, Hoang Anh Vu, Đo Đuc Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 23 ‐ No 3‐ 2019: 111‐116 Objectives: Human leukocyte antigen (HLA), a cell-surface protein complex, is responsible for the regulation of the immune system. HLA typing is necessary step in stem cell and organ transplantation. Next generation sequencing (NGS) is a modern tool that makes HLA typing fast, simple and becoming global trend. Material - Methods: HLA complex from 66 objects participated in the study were sequenced by next generation sequencing. Data later were analyzed with Assign Trusight HLA v2.0 software. Results: HLA class I and II of 66 objects were typed and the distribution of common HLA variants in Kinh Vietnamese people were obtained. Conclusion: HLA typing by NGS is accurate, fast and cost-saving. Keywords: human leukocyte antigen (HLA), next generation sequencing (NGS), polymerase chain reaction (PCR) ĐẶT VẤN ĐỀ Các gen mã hóa cho hệ thống phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA) được chia thành 3 lớp chính, trong đó chủ yếu là lớp I (HLA‐A, HLA‐B và HLA‐C) và lớp II (HLA‐ DRB1 và HLA‐DQB1) tham gia vào quá trình tương tác giữa mảnh ghép và kí chủ. HLA lớp I hiện diện trên bề mặt hầu hết các tế bào có nhân trong cơ thể với mức độ biểu hiện khác nhau có nhiệm vụ chính là trình diện các peptide nội bào của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm virus hoặc các tế bào khiếm khuyết, bất thường cho các tế bào lympho T CD8 thông qua thụ thể tế bào T (TCR: T cell receptor) dẫn đến hiệu quả cuối cùng là phá hủy tế bào này (thường thông qua cơ chế *Bộ môn Sinh lý học – Khoa Y – Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh **Trung tâm Y sinh học phân tử ‐ Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS.BS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: ducminh@ump.edu.vn Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 112 gây độc tế bào). Trong khi đó, HLA lớp II thường biểu hiện giới hạn ở các tế bào đã được hoạt hóa miễn dịch, bao gồm tế bào B và các tế bào trình diện kháng nguyên khác (APC: antigen‐ presenting cells) với nhiệm vụ trình diện các peptide ngoại lai từ các tác nhân gây bệnh cho tế bào lympho T CD4 và sau đó các tế bào T này sẽ hoạt hóa các tế bào B và sản sinh ra hàng loạt các kháng thể trung hòa tác nhân gây bệnh. Đến nay, trên 12.000 biến thể HLA lớp I và trên 4.000 biến thể HLA lớp II đã được ghi nhận và số lượng này dự kiến sẽ tăng dần trong tương lai, trong số này, một số gen HLA có thể có hàng trăm alen, chẳng hạn như HLA‐B27. Tuy có vai trò hết sức quan trọng trong qúa trình cấy ghép nhưng kỹ thuật định típ HLA hiện tại ở Việt Nam vẫn dùng phương pháp khuếch đại DNA bằng chuỗi mồi đặc hiệu (SSP‐PCR: sequence‐ specific primer polymerase chain reaction và SSO‐PCR: sequence‐specific oligonucleotide polymerase chain reaction). Hai kỹ thuật này có nguyên lý tương tự nhau và đã được phát minh vào khoảng 20 năm trước. Trong phản ứng SSP‐ PCR, các bộ mồi (primer) được thiết kế sẵn để nhận diện các vùng đa hình ở các locus HLA, các típ HLA sau đó sẽ được xác định bằng cách điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose, phương pháp này chỉ cho độ phân giải của HLA ở mức 2 chữ số. Phương pháp SSO‐PCR hiện đại hơn, có độ phân giải cao hơn đạt mức 4 chữ số, cũng dựa trên nền tảng thực hiện phản ứng PCR bằng bộ mồi được thiết kế sẵn, nhưng sau đó sản phẩm PCR sẽ không được phân tích trên thạch agarose mà sẽ được chuyển lên một màng lai, tại đó một bộ các phân tử đầu dò oligonucleotide có gắn chất chỉ thị sẽ được lai với sản phẩm PCR và sau đó típ HLA sẽ được xác định dựa vào các chất chỉ thị gắn trên các đầu dò. Các kỹ thuật định típ HLA này còn nhiều nhược điểm: Độ phân giải thấp (2 ‐ 4 chữ số); Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO‐PCR chỉ xác định được 1 locus HLA); Không phát hiện hoặc dễ nhầm lẫn trong các trường hợp bệnh nhân mang các alen HLA hiếm, mới; Ngày càng có nhiều các alen HLA mới được phát hiện, do đó các bộ kit này cần được cập nhật liên tục. Trong khi đó, trên thế giới, việc định típ HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định trình tự nucleotid bằng phương pháp Sanger hoặc giải trình tự thế hệ mới (SBT: sequence based HLA typing) với độ phân giải có thể chấp nhận trên lâm sàng là 4 chữ số, đây được xem là phương pháp chính xác và đáng tin cậy nhất hiện nay và là tiêu chuẩn vàng trong việc xác định HLA ở các trung tâm cấy ghép lớn(6). Có 2 phương pháp giải trình tự để định típ HLA là giải trình tự Sanger truyền thống và giải trình tự thế hệ mới. Có rất nhiều kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới đã được áp dụng để định típ HLA với các độ chính xác và sai lệch khác nhau. Theo thống kê tại Hội nghị thế giới lần thứ 16 về HLA vào năm 2013, nền tảng giải trình tự của hệ thống Illumina được xem là ưu việt nhất trong việc định típ HLA với tỉ lệ sai sót vào khoảng 0,32%, tốt nhất nếu so sánh với các nền tảng kỹ thuật khác như 454 GS (Roche), Ion Torrent PGM và Pacific Biosciences có tỉ lệ sai sót lần lượt là 1,2%, 1,71% và 14,1%(1); vì vậy, chúng tôi quyết định chọn nền tảng kỹ thuật của Illumina để thực hiện trong nghiên cứu này. Hiện nay tại Việt Nam, các công trình nghiên cứu về HLA đại đa số đều dừng ở mức độ phân giải thấp và sử dụng phương pháp SSO‐PCR(2,8). Do đó, thông qua nghiên cứu này, chúng tôi muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình xác định phức hợp HLA bằng phương pháp giải trình tự nhằm khắc phục các nhược điểm của phương pháp PCR truyền thống. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Chúng tôi tiến hành định típ HLA các locus A, B, C, DRB1 và DQB1 cho 66 đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu. Tất cả các đối tượng tham gia nghiên cứu đều là người Kinh và chưa từng được cấy ghép tế bào gốc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học 113 tạo máu trước đây. Phương pháp nghiên cứu Tách chiết Genomic DNA Máu toàn phần của đối tượng tham gia nghiên cứu sẽ được thu nhận và lưu trữ bằng ống chống đông EDTA. DNA từ mẫu máu được tách chiết bằng bộ kit QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất. Tạo thư viện cho giải trình tự thế hệ mới: các bước được thực hiện bằng bộ kit HLA Trusight (Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất Tạo các amplicon HLA bằng phản ứng long‐ range PCR với bộ mồi theo điều kiện của nhà cung cấp. Tinh sạch sản phẩm PCR; Đồng nhất các amplicon HLA; Phân đoạn sản phẩm PCR thành các đoạn DNA có chiều dài từ 300 ‐ 500bp; Hợp nhất mẫu và tinh sạch sản phẩm sau phản ứng phân cắt; PCR khuếch đại mẫu và gắn adapter và vùng nhận diện (index) cho các mẫu; Tinh sạch sản phẩm PCR; Hợp nhất thư viện cuối cùng; Kiểm tra lại thư viện đạt chuẩn bằng Qubit và pha loãng tới nồng độ phù hợp để chạy máy. Phương pháp giải trình tự các gen phức hợp HLA bằng máy giải trình tự thế hệ mới MiniSeq Nạp mẫu thư viện và tiến hành chạy với bộ chip MiniSeq Mid Output Reagent (300‐cycles) (Illumina, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Khai báo các thông số cần thiết để máy có thể nhận diện được các mẫu giải trình tự. Tiến hành chạy máy trong 20 ‐ 24 giờ. Phương pháp phân tích kết quả giải trình tự các gen phức hợp HLA bằng máy giải trình tự thế hệ mới MiniSeq Nhập file kết quả từ máy giải trình tự MiniSeq. Phần mềm HLA Trusight (Illumina, Mỹ) sẽ tự động so sánh kết quả giải trình tự thu được với các trình tự chuẩn từ ngân hàng dữ liệu IMGT/HLA phiên bản 3.23.0.1 cập nhật ngày 19.01.2016. Phần mềm xuất kết quả định típ HLA cho các mẫu tương ứng. Phương pháp so sánh, thống kê, xử lý số liệu Số liệu sau khi thu nhận được phân tích, đánh giá bằng phần mềm Excel 2010. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tạo thư viện cho giải trình tự thế hệ mới Phản ứng long range PCR Phản ứng long range PCR với bộ mồi và quy trình thực hiện theo các điều kiện của nhà sản xuất, sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch sẽ được điện di trên thạch agarose 0.8% cho kết quả phù hợp với kết quả dự kiến ban đầu về kích thước các đoạn DNA được khuếch đại tại các locus HLA, cụ thể như sau: A: 4,1 kb B: 2,8 kb C: 4,2 kb DPA1: 10,3 kb DPB1: 9,7 kb DQA1: 7.3 kb DRB: 4.6 kb DQB1: 7.1 kb Hình 1: Kết quả điện di các sản phẩm long range PCR Kiểm tra mẫu bằng Bioanalyzer để cho thấy sự phân bố và kích thước DNA Sau bước hợp nhất thư viện, sản phẩm cho thấy có độ phân bố các đoạn DNA phù hợp Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 114 với khuyến cáo của nhà sản xuất. Nồng độ sản phẩm cuối cùng được đo bằng máy Qbit và dựa vào đó để pha loãng mẫu xuống nồng độ DNA cuối cùng đạt được trước khi chạy máy giải trình tự theo khuyến cáo của nhà sản xuất là 1,5 – 1,8 pM. Hình 2: Phân bố kích thước DNA của mẫu bằng phương pháp đo Bioanalyzer Chạy máy giải trình tự MiniSeq 66 mẫu được tiến hành giải trình tự các locus HLA trong 3 lần chạy giải trình tự. Mật độ tạo cụm (cluster density) trên flow cell trong các lần chạy lần lượt là: 216 k/mm2, 218 k/mm2, 215 k/mm2. Các thông số của mỗi lần chạy máy đều đạt mức cho phép với Q30 score > 80%, độ sâu trung bình đạt mức xấp xỉ 250X và độ sâu tối thiểu đạt mức 150X. Dưới đây các thông số tổng hợp của các lần chạy máy Hình 3: Độ sâu tối thiểu của các locus HLA Hình 4: Độ sâu trung bình của các locus HLA Hình 5: Chỉ số Q30 của các locus HLA Sử dụng phần mềm HLA Assign Trusight để phân tích các kết quả Kết quả phân bố tần suất các alen HLA được tóm tắt trong bảng sau. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 Nghiên cứu Y học 115 Bảng 1: Tần suất các alell HLA lớp 1 trong dân số nghiên cứu (N=66) A B C Alell Tần suất (%) Alell Tần suất (%) Alell Tần suất (%) 01:01:01 0,8 07:02:01 0,8 01:02:01 14,5 02:01:01 3,0 07:05:01 6,8 03:02:02 7,6 02:03:01 8,3 08:01:01 0,8 03:03:01 4,6 02:03:02 0,8 13:01:01 3,8 03:04:01 8,4 02:06:01 3,8 13:02:01 1,5 03:17 0,8 02:07:01 9,1 15:01:01 1,5 04:01:01 5,3 03:02:01 0,8 15:02:01 12,1 04:03:01 9,9 11:01:01 23,5 15:11:01 0,8 04:82 0,8 11:02:01 1,5 15:12 1,5 06:02:01 2,3 24:02:01 15,2 15:25:01 6.8 07:01:01 0,8 24:03:01 0,8 15:27:01 0,8 07:02:01 18,3 24:07:01 3,0 15:35 0,8 07:04:01 1,5 24:10:01 0,8 18:01:01 1,5 07:06 0,8 24:20 1,5 18:02 0,8 08:01:01 13,0 26:01:01 3,0 27:06 1,5 08:03:01 0,8 29:01:01 8,3 35:01:01 1,5 12:02:02 0,8 30:01:01 0,8 35:03:01 0,8 14:02:01 2,3 31:01:02 0,8 35:05:01 3,0 15:02:01 0,8 32:01:01 0,8 37:01:01 0,8 15:05:02 6,9 33:01:01 0,8 38:02:01 6.8 33:03:01 9,8 39:01:01 0,8 34:01:01 1,5 40:01:02 7,6 68:01:02 0,8 40:06:01 3,0 74:02:01 0,8 44:03:02 1,5 46:01:01 9,8 48:01:01 0,8 51:01:01 3,0 51:02:01 0,8 52:01:01 0,8 54:01:01 1,5 55:02:01 3,0 55:18 0,8 56:01:01 2,3 56:04 1,5 57:01:01 0,8 58:01:01 7,6 Bảng 2: Tần suất các alell HLA lớp 2 trong dân số nghiên cứu (N=66) DRB1 DQB1 Alell Tần suất (%) Alell Tần suất (%) 03:01:01 8.3 02:01:01 7.6 04:01:01 0.8 02:02:01 2.3 04:03:01 0.8 03:01:01 27.3 04:05:01 8.3 03:02:01 2.3 04:06:01 1.5 03:02:02 0.8 DRB1 DQB1 Alell Tần suất (%) Alell Tần suất (%) 07:01:01 3,8 03:03:02 11,4 08:03:01 0,8 03:03:05 0,8 08:03:02 5,3 04:01:01 6,1 09:01:02 12,1 04:02:01 1,5 10:01:01 8,3 05:01:01 9,8 11:01:01 1,5 05:01:03 0,8 11:06:01 2,3 05:01:12 0,8 11:129 0,8 05:02:01 12,1 12:02:01 22,7 05:02:02 1,5 13:01:01 0,8 05:03:01 2,3 13:02:01 0,8 05:03:02 0,8 13:12:01 2,3 05:03:11 0,8 14:04:01 0,8 05:18 1,5 14:05:01 0,8 06:01:01 7,6 14:18 0,8 06:02:01 0,8 14:54:01 0,8 06:03:01 0,8 15:01:01 2,3 06:09:01 0,8 15:02:01 8,3 16:02:01 5,3 BÀN LUẬN Các kết quả nghiên cứu tại Việt Nam trước đây về khảo sát tần suất các alen HLA đều được tiến hành bằng phương pháp SSO‐PCR và cho độ phân giải 4 chữ số. Kết quả của nhóm nghiên cứu chúng tôi cũng cho thấy mức độ tương đồng về các allel HLA lưu hành trong dân số người Kinh Việt Nam như: A*11:01, A*24:02, A*33:03; B*15:02, B*46:01, B*38:02; C*01:02, C*07:02, C*08:01; DRB1*12:02, DRB1*09:01; DRB1*15:02, DQB1*03:01, DQB1*03:03, DQB1*05:01(2,8). Như dự đoán ban đầu của nhóm nghiên cứu, khi thực hiện định típ HLA với độ phân giải cao bằng phương pháp giải trình tự thế hệ mới, chúng tôi đạt được những ưu điểm sau so với phương pháp SSO‐PCR cũ: Độ phân giải cao: như trong nghiên cứu trước đó của Hoa và cs(2), chúng ta thấy độ phân giải chỉ dừng ở mức allel DQB1*05:01, DQB1*05:02, DQB1*05:03 còn trong nghiên cứu của chúng tôi, độ phân giải này được chỉ định rõ lần lượt là 05:01:01, 05:01:03, 05:01:12, 05:02:01, 05:02:02, 05:03:01, 05:03:02, 05:03:11; Phát hiện một số allel mới chưa được mô tả: A*24:20, A*31:01:01, A*31:01:02, A*32:01:01, Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 23 * Số 3 * 2019 116 A*33:01:01, B*07:02:01, B*15:11:01, B*15:12, B*15:35, B*37:01:01, B*40:06:01, B*55:18, C*03:17, C*07:06, C*03:04:01, C*08:03:01, C*07:02:01, C*08:01:01, DRB1*11:06:01, DRB1*13:12:01, DRB1*14:18, DRB1*14:54:01, DQB1*02:02:01, DQB1*03:03:02, DQB1*03:03:05, DQB1*06:09:01; Do đặc điểm dân số tương đồng của các đối tượng dân số Châu Á nên tần suất lưu hành của các allel phổ biến có những nét tương tự. Có thể thấy trong dân số Châu Á các allel phổ biến là A*24:02, A*11:01; C*01:02, C*07:02; DRB1*09:01; DQB1*03:01, DQB1*03:03(3,4,5,7). Tuy nhiên, khi so sánh các allel có tính đa hình cao như HLA‐B hoặc HLA‐DRB1, ta có thể thấy chủng tộc người Kinh Việt Nam có nhiều nét tương đồng với các dân số lân cận như người Thái hoặc người Hán Trung Quốc, trong khi đó người Hàn Quốc lại có nhiều nét tương đồng với người Nhật Bản hơn(3,4,5,7). KẾT LUẬN Định típ HLA độ phân giải cao bằng phương pháp giải trình tự gen là xu hướng mới trong tiếp cận định típ HLA phục vụ cho cấy ghép ở người. Quy trình định típ HLA bằng phương pháp giải trình tự ổn định, có tính lặp lại cao và có thể chuyển giao. Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi xác định được tần suất các alell HLA lớp I và II phổ biến lưu hành trên đối tượng tham gia nghiên cứu, làm tiền đề cho việc xây dựng ngân hàng tế bào gốc tuỷ xương sau này. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng xác định được một số biến thể HLA chưa từng được tìm thấy trước đây trong các nghiên cứu về HLA trên quần thể người Việt Nam như A*24:20; B*07:02, B*55:18; C*03:17 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. De Santis D, Dinauer D, Duke J et al (2013). 16IHIW HLA typing by NGS: Workshop review. Int J Immunogenet, 40(1):72–76. 2. Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K et al (2008). HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐ DRB1 and ‐DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam. Tissue Antigens, 71(2):127–134. 3. Ikeda N, Kojima H, Nishikawa M et al (2015). Determination of HLA‐A, ‐C, ‐B, ‐DRB1 allele and haplotype frequency in Japanese population based on family study. Tissue Antigens, 85(4):252–259. 4. Lee KW, Oh DH, Lee C, Yang SY (2005). Allelic and haplotypic diversity of HLA‐A, ‐B, ‐C, ‐DRB1, and ‐DQB1 genes in the Korean population. Tissue Antigens, 65(5):437–447. 5. Nakkam N, Konyoung P, Kanjanawart S, Saksit N, Kongpan T, Khaeso K, Khunarkornsiri U, Dornsena A, Tassaneeyakul W, Tassaneeyakul W (2018). HLA Pharmacogenetic Markers of Drug Hypersensitivity in a Thai Population. Front Genet, doi: 10.3389/fgene.2018.00277. 6. Saber W, Opie S, Rizzo JD, Zhang M‐J, Horowitz MM, Schriber J (2012). Outcomes after matched unrelated donor versus identical sibling hematopoietic cell transplantation in adults with acute myelogenous leukemia. Blood, 119(17): 3908–3916. 7. Shen Y, Cao D, Li Y et al (2014). Distribution of HLA‐A, ‐B, and ‐ C Alleles and HLA/KIR Combinations in Han Population in China. J Immunol Res, doi: 10.1155/2014/565296. 8. Vu‐Trieu A, Djoulah S, Tran‐Thi C, Ngyuyen‐Thanh T et al (1997). HLA‐DR and ‐DQB1 DNA polymorphisms in a Vietnamese Kinh population from Hanoi. Eur J Immunogenetics Off J Br Soc Histocompat Immunogenetics, 24(5):345–356. Ngày nhận bài báo: 08/11/2018 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 04/12/2018 Ngày bài báo được đăng: 10/03/2019