Dinh dưỡng, tăng trưởng của vi khuẩn - Nguyễn Thị Ngọc Yến

3/3/2016 1 GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến 2 • Nắm được các nhu cầu dinh dưỡng và yếu tố tăng trưởng của vi khuẩn • Trình bày được biểu đồ tăng trưởng ở vi khuẩn • Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sự tăng trưởng • Kiểm soát sự tăng trưởng của vi khuẩn 3 Để tăng trưởng, vi khuẩn cần được cung cấp đầy đủ năng lượng, vật liệu xây dựng tb và điều kiện môi trường thích hợp: • Chất dinh dưỡng  Chất “thiết yếu” và chất “có ích”  Chất đa lượng và chất vi lượng  Yếu tố tăng trưởng • pH • ASTT • Thông khí 4 1. Carbon • ½ chất khô tb  Ý nghĩa hàng đầu trong sự sống VSV • Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp phụ tùy thuộc: • Thành phần và cấu tạo hóa học nguồn C: mức độ oxy hóa của nguyên tử C • Đặc điểm sinh lý VSV: VSV đồng hóa trực tiếp chất phân tử thấp, thủy phân chất cao phân tử • CO2: nguồn C duy nhất của VSV quang tổng hợp Phân loại VSV theo nguồn năng lượng và carbon: Vi sinh vật Nguồn C: CO2 Tự dưỡng Nguồn C: hữu cơ Dị dưỡng NL: Ánh sáng Quang tự dưỡng NL: Chất vô cơ Hóa tự dưỡng NL: Ánh sáng Quang dị dưỡng NL: Chất hữu cơ Hóa dị dưỡng 6 2. Nitơ • Nhu cầu thứ 2 trong tb • Cấu tạo protein, acid nucleic, peptidoglycan • VSV sử dụng N không chỉ phụ thuộc nguồn N, còn tùy tỉ lệ C:N trong môi trường • Nguồn N ở 2 dạng: vô cơ (muối nitrat, nitrit), hữu cơ (pepton, nước thịt,); N không khí: VSV cố định đạm 3. Phospho • Tổng hợp ADN, ARN, ATP, phospholipid • Nguồn P vô cơ dễ sử dụng (KH2PO4), hữu cơ: phức tạp, cần enzym thủy phân thành P tự do, đắt tiền 3/3/2016 2 7 4. Lưu huỳnh Cấu tạo aa và vitamin. Thường dùng MgSO4.7H2O 5. Kali Cấu tạo enzym tổng hợp protein, thường dùng KH2PO4 6. Magie Ổn định ribosom, cần cho hoạt động các enzym, thường dùng MgSO4.7H2O 7. Canxi Không thiết yếu, ổn định nhiệt nội bào tử, dùng CaCl2 8. Natri: dùng NaCl 9. Sắt: cần cho enzym hô hấp, dùng FeCl3, FeSO4 8 Cần với lượng nhỏ nhưng không thể thiếu đ/v VSV • Coban: cấu tạo vitB12 • Kẽm • Đồng • Mangan • Niken • Tungsteng, selen 9 • Là chất cần với lượng rất nhỏ, thiết yếu cho sự tăng trưởng của VK nhưng tb không tự tổng hợp được • Thường cung cấp dưới dạng • Vitamin: chức năng coenzym • Aa: cấu tạo protein • Purin và pyrimidin: tổng hợp acid nucleic • Nếu dùng nguyên liệu hữu cơ (pepton, cao men) thì đa số YTTT đã có sẵn, không cần bổ sung thêm 10 Dựa vào thành phần, chia thành • MT tổng hợp: TPHH xác định • MT tự nhiên: TPHH không xác định* Dựa vào bản chất MT • Lỏng: canh thang • Rắn: thạch • Bán rắn Dựa vào mục đích sử dụng, chia thành • MT cơ bản: đầy đủ cdd cho đa số VK tăng trưởng • MT chuyên chở: rất ít cdd VK sống mà ko phát triển* 11 • MT phong phú: MT cơ bản bổ sung thêm máu, dịch nấm men,..để VK “kén ăn” phát triển* • MT phân biệt: có đặc tính giúp khuẩn lạc VK cần khảo sát có hình thức riêng biệt, dễ quan sát* • MT chọn lọc: ngăn chặn hầu hết VK trừ VK khảo sát* • MT xác định tính chất sinh hóa: phát hiện hoạt tính enzym của VK thuần chủng* 12 Một số định nghĩa • Sự tăng trưởng tb*: gia tăng số lượng tb/ sinh khối tb • Tốc độ tăng trưởng: sự thay đổi số tb/ sinh khối tb trong 1 đơn vị thời gian • Thời gian thế hệ: thời gian để số tế bào nhân đôi • Tăng trưởng lũy thừa: sự tăng trưởng có số tế bào tăng gấp đôi ở mỗi giai đoạn  đường biểu diễn logarit 10 là đường thẳng* 3/3/2016 3 13 Tính thời gian thế hệ trong tăng trưởng lũy thừa* N = No.2 n logN = logNo + nlog2 n = logN - logNo log2 n = logN - logNo 0.301 n = 3.3.logN/No G = t/n = t 3.3.logN/No -P: Số tb cuối cùng -Po: Số tb ban đầu -t: Thgian tăng trưởng lũy thừa -n: Số thế hệ trong gđ lũy thừa -G: Thời gian thế hệ 14 Nuôi cấy VK trong môi trường lỏng, bình kín thì Đường cong tăng trưởng* như hình: 15 1. Pha tiềm ẩn • VK thích ứng dần với MT mới, tích lũy cdd cho gđ phân chia; dân số không tăng • Cấy VK đang tăng trưởng lũy thừa vào cùng loại MT, trong cùng đk nuôi cấy bỏ qua pha tiềm ẩn 2. Pha lũy thừa • Số lượng tb tăng theo cấp số nhân đến khi cạn kiệt cdd thiết yếu/MT hoặc sản phẩm thải đạt đủ mức kiềm chế • Tb có trạng thái khỏe mạnh nhất  lý tưởng để nghiên cứu về enzym hoặc các thành phần khác 16 3. Pha ổn định • Số tb sinh ra = số tb chết đi 4. Pha suy thoái • Số tb chết đi > số tb sinh mới • Sau khi đa số tb chết, tỷ suất chết giảm mạnh: một ít tb tiếp tục sống sót 1 thời gian dài nhờ cdd từ tb chết thải ra MT 17 Xác định toàn phần vi khuẩn  Đếm tổng số tế bào bằng buồng đếm*  Đo trọng lượng tế bào*  Đo độ đục*  Nhược: (1) Không phân biệt sống – chết (2) Không chính xác, nhất là mật độ tb thấp Xác định vk sống  Đếm sống bằng pp trải đĩa*  Xác định sản phẩm của vk  Nhiệt độ  pH  Áp suất thẩm thấu  Oxy 3/3/2016 4 19 Nhiệt độ Tốc độ tăng trưởng Các PƯ enzym tăng Nhiệt độ tối ưu NĐ tối thiểu Màng bị tạo gel, quá trình vận chuyển chậm, tăng trưởng ko diễn ra NĐ tối đa Protein biến tính, màng tb bị phá hỏng, ly giải Các PƯ enzym cao nhất 20 •Nhóm ưa lạnh: To~15oC, Tmax~20 oC •Nhóm trung bình •Nhóm ưa nhiệt: To~45oC •Nhóm ưa nhiệt cao: To~80oC 21 2 5 9 11 VSV ưa trung tính VSV ưa acid (H. pylori) VSV ưa kiềm V. cholerae, Bacillus 22 Phân loại VSV theo nhu cầu oxy Nhóm Mối liên hệ với oxy Hiếu khí Bắt buộc Cần Tùy ý Không cần nhưng tăng trưởng tốt hơn nếu có oxy Vi hiếu khí Cần nhưng mới mức thấp hơn trong không khí Kỵ khí Bắt buộc Có hại hoặc chết Chịu đc kk Không cần và tăng trưởng tốt hơn nếu không có oxy 23 Sản phẩm của hô hấp là các dạng độc tính cao của oxy như: superoxid (O2-), hydroxyl (OH*), H2O2 có khả năng oxy hóa các chất hữu cơ/ tb  VSV có enzym phân hủy oxy độc: catalase, peroxidase, superoxid dismutase* Ý nghĩa trong nuôi cấy VSV* • VSV hiếu khí: lắc, khuấy, sục khí tiệt trùng vào MT • VSV kỵ khí: khử oxy trong MT như thioglycolat, cho khí tiêu oxy vào bình 24  Môi trường hoạt tính nước thấp: VSV lấy nước bằng cách tăng nồng độ chất tan nội bào 3/3/2016 5 25 Một số khái niệm  Sự vô trùng (Sterility) / Sự vô khuẩn (Aseptic)  Tiệt trùng (Sterilisation) / Sát trùng (Antiseptic) / Tẩy trùng (Disinfection)  Chất kìm khuẩn (Bacteriostatic agent) / Chất diệt khuẩn (Bacteriocidal agent)  Sự nhiễm trùng (Contamination)  Vệ sinh (Sanitation) 26  Nhiệt ẩm có áp suất*: 121oC, 1.1 kg/cm2. Dùng cho sản phẩm y tế, dụng cụ, MT nuôi cấy  Nhiệt ẩm không áp suất: 62.8oC/30ph hoặc 71.7oC/15ph (PP Pasteur)*  Nhiệt khô: 180oC/2h. Thủy tinh, bột, dầu (lò sấy)  Tia tử ngoại: không khí, bề mặt  Tia phóng xạ: chỉ khâu, đồ nhựa dùng 1 lần*  Lọc*: dung dịch (màng cellulose 0.45, 0.22μm) hoặc không khí (lọc HEPA) 27  Dung môi hữu cơ  Kim loại nặng  Phenol và dẫn xuất  Halogen  Chất tẩy  Chất tác động bề mặt 28 Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tẩy trùng  Thời gian  Nhiệt độ  pH  Loại VSV  Nồng độ chất tẩy trùng  Môi trường xung quanh 29  Tác nhân chọn lọc trên VSV, ít ảnh hưởng đến tb chủ  Kháng sinh: chất nguồn gốc tự nhiên/ tổng hợp, tác động tại chỗ/ hệ thống, hiệu quả kìm khuẩn/ diệt khuẩn Đích tác động của kháng sinh Kháng sinh Ức chế tổng hợp thành tế bào β-lactam (penicillin, cephalosporin) Ức chế tổng hợp màng tế bào Polymycin Kháng nấm (Amphotericin B, Nystatin) Ức chế tổng hợp acid nucleic Quinolon, Rifampicin 5-nitroimidazol Ức chế tổng hợp protein Aminoglycosid, Tetracyclin, Spectinomycin Chloramphenicol, Erythromycin GV: Nguyễn Thị Ngọc Yến 3/3/2016 6 31 Sự trao đổi chất nhằm cung cấp:  Vật liệu để xây dựng cơ thể  Năng lượng ở dạng thích hợp cho tb. Quan trọng nhất là NL ở dạng ATP, xem như “tiền tệ năng lượng” cho các PƯ trao đổi NL của tb Đường phân CT Krebs Chuỗi chuyền điện tử O2 H2O MT có oxy C a rb o h y d ra t NO3 N2 SO4 H2S CHC MT ko có oxy MT ko có oxy Hô hấp hiếu khí (OXH hoàn toàn) Hô hấp kỵ khí Lên men (OXH không hoàn toàn) Hỗn hợp acid Hỗn hợp acetoin