Đề tài Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ

MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 28 Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. 29 Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy 29 Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. 29 Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. 30 Bảng 3.1. Ảnh hưởng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu sau 4 tuần nuôi cấy. 33 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 35 Bảng 3.4. Ảnh hưởng ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy sau 8 tuần nuôi cấy 37 Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy 40 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Polianthes tuberose L. 13 Hình 2.1. Hoa Huệ Hương 26 Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 26 Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 2mg/l Kinetin 36 Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 4mg/l BA 39 Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA 41 Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA 41 Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA 42 Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9 g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA 42 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT MS: Murashige and Skoog, 1962 BA: Benzyl adenin IBA: Indol butyric acid α-NAA: α-naphtyl acetic acid 2,4-D: 2,4 diclorophenoxy acetic acid IAA: Indol acetic acid LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm. Hoa Huệ Hương được nhập vào nước ta từ rất lâu. Cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến tại vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập khá cao cho người trồng và chính là cây xóa đói giảm nghèo cho vùng chuyên canh loài cây này. Hiện nay, việc canh tác cây hoa Huệ thường chủ yếu được nhân giống bằng kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu là lấy củ trồng. Với phương pháp nhân giống này dễ lây lan các mầm bệnh có sẵn trong củ, đặc biệt là bệnh virus làm giảm năng suất và phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa này ngày càng thoái hóa. Trong những năm gần đây, bệnh hại trên cây hoa Huệ Hương xuất hiện nhiều, đặc biệt trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Tác nhân gây bệnh hiện vẫn chưa xác định được. Bệnh xuất hiện trên diện rộng làm ảnh hưởng đến năng suất và phẩm chất hoa. Bệnh không làm cho cây chết ngay nhưng làm cho chồi, củ, hoa kém phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập của nông dân. Các triệu chứng bệnh do virus được mô tả bởi Horner và Person (1988), Chen và Chang (1998) gần giống các biểu hiện ở cây hoa Huệ Hương ở Nam Trung Bộ. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để tạo nguồn giống sạch bệnh cung cấp cho nhân dân? Phương pháp nhân giống in vitro với rất nhiều ưu điểm, tạo được cây con trẻ hóa và sạch bệnh nên tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao, khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có của giống. Đồng thời hệ số nhân của phương pháp nhân giống này cao đáp ứng được nhu cầu về số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng được nhu cầu sản xuất trên quy mô rộng. Cho đến nay kĩ thuật nuôi cấy mô đã được nghiên cứu ứng dụng rất có hiệu quả trong việc nhân giống hàng loạt các loại cây trồng tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, khỏe mạnh cho năng suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất. 2. Mục đích nghiên cứu Xác định được ảnh hưởng của các chất đều hòa sinh trưởng thực vật lên quá trình phát sinh hình thái trong quy trình nhân giống cây hoa Huệ Hương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm cơ sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương, góp phần giải quyết những khó khăn của thực tiễn sản xuất hoa. 3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới của sản xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu khó khăn của thực tiễn, nhằm khắc phục hiện tượng chai bông trên cây hoa Huệ Hương, một giống hoa Huệ quý mang lại hiệu quả cao cho nông dân. Trên cơ sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ đã được tiến hành thử nghiệm. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Đề tài đã đưa ra được các minh chứng về tác động của phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu cây, tác động của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng phát sinh hình thái. Kết quả nghiên cứu đề tài có thể sử dụng nghiên cứu trong nuôi cấy mô tế bào cây hoa. Góp phần sản xuất cây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất cây hoa Huệ. 5. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến quá trình phát sinh hình thái của mầm ngủ trên củ hoa Huệ Hương. Sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA, 2,4-D, IAA. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nhân giống cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng và tái sinh chúng thành cây con. Nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào là phương pháp mới bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp nhân giống truyền thống. 1.2. Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, trên cơ sở những nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức là Schleiden và Schwamn cùng khởi xướng học thuyết tế bào. Học thuyết này cho rằng tế bào là đơn vị cấu trúc và chức năng của sinh vật, vì vậy có khả năng tồn tại độc lập. Gottlibe Haberlandt là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào. Theo ông mỗi tế bào của bất kỳ cơ thể nào đều mang toàn bộ hệ thống di truyền cần thiết và đầy đủ thông tin của sinh vật đó, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Ông tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng và các tế bào đã được biệt hóa về chức năng khác nhưng không thành công. Điều đó đã giảm sự tin tưởng của các nhà khoa học đối với phương pháp nuôi cấy mô tế bào trong thời gian dài. Đến năm 1922 học trò của Gottlibe Haberlandt là Kotte và Robbinss đã làm lại thí nghiệm của ông. Họ đã lấy đỉnh sinh trưởng của rễ cây hòa thảo nuôi cấy trong môi trường có khoáng, đường, đầu rễ đã sinh trưởng mạnh và tạo ra hệ rễ nhỏ và cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng chỉ tồn tại trong một thời gian mặc dù chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ 2 trong lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật khi White đã nuôi cấy thành công đầu tiên rễ cà chua trên môi trường lỏng có chứa đường, muối khoáng, dịch chiết nấm men. Các thí nghiệm tiếp theo ông thay thế dịch chiết nấm men bằng hỗn hợp 3 vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6). Sau đó ít lâu Went và Thimann tìm ra chất kích thích sinh trưởng đầu tiên là IAA. Năm năm sau Gautheret đã thông báo về sự tái sinh của cây cà rốt, đây cũng là lần đầu tiên sự phát triển của mô sẹo không bị giới hạn. Bằng cách thêm IAA vào môi trường nuôi cấy, ông có thể kích thích sự phát triển của mô đã biệt hóa trên vết cắt của bề mặt mẫu cấy vô trùng. Sau này người ta mới thấy rằng callus có thể trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn. Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng của nước dừa trên mô sẹo cà rốt. Trong thời gian này nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin được tổng hợp như naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-Diclophenoxyacetic acid (2,4D). Nhiều tác giả nhận thấy cùng với nước dừa, NAA và 2,4 D đã giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công ở nhiều đối tượng thực vật trước đó khó nuôi cấy. Năm 1955, Miller và Skoog đã xác định vai trò của chất kích thích sinh trưởng là 6-Furfuryl aminopurin (kinetin). Việc phát hiện ra chất kích thích sinh trưởng, vitamin và nước dừa là những bước tiến quan trọng trong giai đoạn thứ 2. Năm 1957, Miller và Skoog đã công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/kinetin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mô sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mô sẹo có khuynh hướng tạo rễ. Hiện nay, những kết quả này cũng được quan sát thấy trên nhiều loại cây khác nhau và đóng góp nhiều vào việc điều khiển quá trình sinh trưởng, phát triển và phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Miller và Skoog đã mở đầu cho giai đoạn thứ ba của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật. Những thành công trên là cơ sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báo thực vật trong sản xuất. Morel và Martin đã phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống sạch bệnh ở khoai lang và hoa lan. Chính hai nhà khoa học này đã mở đầu cho một hướng mới của nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là vi nhân giống. Từ những năm 1960, ngoài các hướng trên, nuôi cấy bao phấn và hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn và tế bào trần được phát triển mạnh. Các kỷ thuật lai soma bằng dung hợp tế bào trần và kỷ thuật chuyển gen được phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ 4 của nuôi cấy mô tế bào thực vật. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 1.3. Cơ sở lý luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng (totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh. Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là kết quả của các quá trình phân hóa và phản phân hóa. Tất cả các tế bào trong các cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh. Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hóa để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hóa tế bào. Còn quá trình phản phân hóa thì ngược lại với quá trình phân hóa, có nghĩa là tế bào đã phân hóa thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia. Bản chất của quá trình này là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Trong quá trình phát triển cá thể, ở từng thời điểm nhất định đều có một số gen nhất định được hoạt hóa cho ta tính trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc phân tử DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi nằm trong khối mô bình thường, tế bào luôn bị chi phối bởi các tế bào xung quanh. Khi tế bào được tách riêng rẽ, tác dụng ức chế của các tế bào xung quanh không còn nữa thì các gen được hoạt hóa và quá trình phân hóa sẽ xảy ra theo một quá trình định sẵn. 1.4. Ưu, nhược điểm của phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà những phương pháp nhân giống khác thường gặp. Sau đây là những ưu điểm chính : - Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao. - Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc. - Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao. - Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội). - Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen. - Có khả năng sản xuất quanh năm. - Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém. - Hệ số nhân giống cực kì cao (thường đạt được ở các loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36 - 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà. Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus. Limasset và Cornel (1945) đã chứng minh được rằng, nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus (Morel và Martin, 1952). Nguyên nhân của hiện tượng này là: - Đỉnh sinh trưởng không có hệ mô dẫn, làm cho virus và vi sinh vật không có khả năng thâm nhập. - Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin nên hàm lượng auxin khá cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus. - Quá trình phân chia của tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo sự phân chia của virus. Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt. Nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc cách mạng về hệ số nhân. Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nickell, 1973). Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi sau: - Mặc dù số lượng cây giống thu được có thể rất cao nhưng cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm. - Cây có thể có những đặc tính không mong muốn. - Khả năng tạo đột biến tăng. - Khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần. - Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt. Tuy vậy phương pháp nhân giống in vitro ngày càng được sử dụng rộng rãi để phục vụ cho những mục đích sau: - Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ, cây rau, cây hoa, cây cảnh và cây dược liệu thuộc nhóm cây than thảo. - Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quí hiếm của giống cây lâm nghiệp và gốc ghép trong nghề trồng cây ăn quả, cây cảnh thuộc nhóm than gỗ. - Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng và cách ly tái nhiễm kết hợp với làm sạch virus. - Bảo quản và lưu giữ các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loài giao phấn trong ngân hàng gen. 1.5. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kỹ thuật nuôi cấy in vitro có thể chia thành các bước sau: - Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, bộ phận cây) thích hợp. Nguyên liệu sử dụng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là bất cứ bộ phận nào của cây: các đoạn của rễ, thân, các phần của lá (cuống lá, phiến lá…), các cấu trúc của phôi như lá mầm, trụ trên, trụ dưới lá mầm, hạt phấn, noãn… thậm chí cả mẫu thân ngầm hay cơ quan dự trữ dưới mặt đất (củ, căn hành…) cũng được dùng cho nuôi cấy. - Khử trùng mẫu và tiến hành nuôi cấy. Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro được chọn từ những cá thể ưu tú của loài, khỏe và sạch bệnh, nhưng ít nhiều đều có nhiễm vi sinh vật và nấm tùy thuộc vào sự tiếp xúc của chúng với môi trường xung quanh. Có một số bộ phận như phôi trong hạt, mô trong quả, dòng lúa non… ít bị nhiễm vi sinh vật hơn các bộ phận khác, ngược lại các bộ phận nằm dưới mặt đất như rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn và nấm rất cao. Phương pháp thông dụng nhất hiện nay để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy là sử dụng các hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn và nấm. Khả năng tiêu diệt nấm và vi sinh vật của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy. Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 - 80% trong 30 giây, sau đó mới xử lý bằng dung dịch diệt khuẩn. Đối với những mẫu có bề mặt được bao phủ lớp sáp, muốn đạt được kết quả tốt nhất cần cho them vào dung dịch khử trùng vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì các chất này làm tăng tính bám dính của hóa chất khử trùng. Với các mẫu quá bẩn phải rửa kỹ bằng nước xà phòng và để dưới vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút sẽ có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy. Tác nhân khử trùng, ngoài tác dụng diệt vi sinh vật còn ảnh hưởng đến mô cấy vì vậy việc lực chọn loại hóa chất phải căn cứ vào mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của từng mẫu. Trong số các hóa chất hay được sử dụng để khử trùng thì Calcium hypoclorite và natri hypoclorite là hay được sử dụng hơn cả vì có tính độc thấp đối với mô được xử lý, không gây ức chế sinh trưởng và hiệu quả diệt khuẩn tốt. Nồng độ của Calcium hypoclorit và natri hypoclorit tương ứng thường là 5 - 15% và 0,5 - 2% trong thời gian 15 - 30 phút. Tuy nhiên, những chất này không bền nên trong thực tế HgCl2 cũng hay được dùng để thay thế. - Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển nuôi cấy theo định hướng. Thành công của phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện nuôi cấy. Nhu cầu dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu của các loài là không giống nhau, ngay cả giữa các bộ phận trong cùng một cơ thể cũng ít nhiều khác nhau. Sự lựa chọn môi trường nuôi cấy bao gồm cả chất lượng và số lượng hóa chất sử dụng đóng vai trò quyết định đối với bản thân sự phân hóa và chiều hướng phân hóa của tế bào. Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra : môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Linsmaer và Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây là những môi trường cơ bản và sẽ được cải tiến thành nhiều loại môi trường khác nhau phù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm. Trong số đó, môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật và chính Murashige (1974) đã dung môi trường này để nuôi cấy nhiều loài cây trồng. Thành phần chủ yếu của tất cả các loại môi trường gồm những nhóm chất sau : muối khoáng đa lượng và vi lượng (muối chloride, nitrate, sulphate, chất tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi… Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, thường được sử dụng với nồng độ từ 10-1 M đến 10-6 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu. Auxin được thêm vào môi trường nuôi cấy sẽ kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng và cường độ các quá trình sinh trưởng. Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, ngược lại ở hàm lượng cao sẽ phát động sự tạo mô sẹo. Các auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là IBA (indol butyric acid), α-NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indool acetic acid). Cytokinin là nhóm phytohormone dẫn xuất của adenine, có vai trò sinh lý tương tự nhau. Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, duy trì sự trẻ hóa các cơ quan, làm giảm ưu thế ngọn, kích thích sự phân hóa chồi từ mô sẹo nuôi cấy… Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ. Các cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy là kinetin, BAP (benzylaminopurin) với nồng độ 10-4 - 10-7 M. Nhiều tác giả đã tổng kết rằng sự biệt hóa cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin. Cân bằng tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích sự hình thành rễ, ngược lại nếu cân bằng này nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy sự tạo chồi. Ở tỷ lệ trung gian, mô sẹo được hình thành. Đây là nguyên tắc chung để điều khiển quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Các mô khác nhau có phản ứng không giống nhau. Vì vậy, với từng loại mô và từng giai đoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm được tổ hợp nồng độ auxin/cytokinin thích hợp có ý nghĩa quan trọng. - Đưa những cây tái sinh được trở lại điều kiện tự nhiên. Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện cây in vitro thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái di dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn. Quá trình thích nghi ở đây được hiểu là quá trình thay đổi đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây in vitro. Thời gian tối thiểu cho sự thích nghi là 2 - 3 tuần. 1.6. Các hướng nhân giống vô tính in vitro Khả năng thành công của nuôi cấy mô tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào. Tế bào càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu, khả năng nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy tế bào phôi thường cò triển vọng nhất rồi đến tế bào các đỉnh sinh trưởng đang ở trạng thái hoạt động (đỉnh ngọn, chóp rễ) và sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ nghỉ (chồi nách). Trong nhân giống in vitro, cây non có thể được tái sinh từ các điểm sinh trưởng có sẵn trong các bộ phận (phôi, đỉnh chồi, chồi nách) hoặc từ những mô có khả năng hình thành điểm sinh trưởng phụ. Có hai phương pháp tái sinh cây con: + Tái sinh trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn, chồi hay chồi nách. + Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo. Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm sinh trưởng đã tồn tại sẵn trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây. Các điểm sinh trưởng này bao gồm các tế bào phôi sinh chứa 2n nhiễm sắc thể đặc trưng cho loài. Cây con tạo ra theo con đường này hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được những tính trạng của cây mẹ. Trong hướng tái sinh gián tiếp, mẫu nuôi cấy không tái sinh thành cây ngay mà phát triển thành khối mô sẹo (callus). Có thể thấy ngay là hệ số nhân của hướng này vô cùng lớn. Từ một khối mô sẹo có thể tạo ra khối lượng lớn cây giống trong một thời gian ngắn thong qua kỹ thuật tạo phôi soma hoặc chế ra hạt giống nhân tạo. Nhiều cây tái sinh từ mô sẹo có thể rất khác với cây mẹ về mặt di truyền. Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong quá trình phát sinh và phát triển của mô sẹo, thường xuất hiện những tế bào đột biến mang số nhiễm sắc thể không giống với tế bào ban đầu hoặc chứa những đột biến gen do hiện tượng nội nguyên phân. Nội nguyên phân là hiện tượng nhân đôi nhiễm sắc thể không kèm theo sự phân bào trong thực tế và là hiện tượng tự nhiên trong cơ thể thực vật, nhưng tăng lên dưới ảnh hưởng của các thành phần của môi trường dinh dưỡng và điều kiện cũng như phướng pháp nuôi cấy, nhất là khi cấy chuyển nhiều lần. Đột biến tuy không có lợi cho việc duy trì nguyên trạng những đặc tính di truyền trong quá trình tạo giống nhưng lại chính là đối tượng tìm kiếm trong quá trình cải tạo giống. Ngoài việc cung cấp những đột biến tự nhiên, mô sẹo còn là đối tượng lý tưởng để tạo ra những đột biến nhân tạo bằng các tác nhân gây đột biến hoặc công nghệ gen. Vì vậy, trong nhân giống in vitro, để nhân nhanh những cá thể đã chọn lọc người ta thường tái sinh cây theo hướng trực tiếp, còn mục tiêu của tái sinh gián tiếp là tạo ra nhiều biến dị để phục vụ cho việc chọn lọc và cải tạo giống cây trồng. 1.7. Quy trình nhân giống in vitro Quy trình nhân giống được chia làm 5 giai đoạn: 1.7.1. Lấy mẫu và xử lý mẫu Đây là giai đoạn quan trọng quyết định vi nhân giống. Khả năng nhiễm bệnh của mẫu phụ thuộc vào cách lấy mẫu, xử lý mẫu trong điều kiện khử trùng. Mỗi cây đều có ngưỡng nhiệt độ và độ ẩm phù hợp khi bảo quản và xử lý mẫu. Với cây nhiệt đới và á nhiệt đới thì nhiệt độ 25oC, độ ẩm 75% là điều kiện giữ mẫu thích hợp, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp. 1.7.2. Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh các cơ quan từ mẫu nuôi cấy. Mẫu thường là chồi đỉnh, chồi nách hay lát cắt đốt thân tùy thuộc đối tượng và mục đích nghiên cứu. Quan trọng nhất là cần chú ý đến trạng thái sinh lý của mẫu. Khả năng thành công của nuôi cấy mô, tế bào phụ thuộc chủ yếu vào trạng thái tuổi của tế bào, càng gần trạng thái phôi sinh bao nhiêu thì nuôi cấy càng có khả năng thành công bấy nhiêu. Như vậy, tế bào phôi thường có triển vọng nhất rồi đến tế bào đỉnh sinh trưởng đang hoạt động (đỉnh ngọn, đầu rễ), sau đó là tế bào ở trạng thái ngủ (chồi nách). 1.7.3. Nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống. Môi trường ở giai đoạn này được bổ sung điều hòa sinh trưởng thực vật (cytokinin, auxin) tăng thời gian chiếu sáng lên 16 giờ/ngày, cường độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux. Ánh sáng tím là thành phần kích thích phân hóa mạnh, nhiệt độ thích hợp từ 20 - 30oC. 1.7.4. Tái sinh rễ Khi chồi đạt đến một kích thước nhất định, mẫu được chuyển sang môi trường tạo rễ. Môi trường này thường được bổ sung auxin (IBA, α-NAA, 2,4-D) ở liều lượng thích hợp. Tuy nhiên, ở một số cây như chuối thì sự hình thành rễ tốt hơn ở môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. 1.7.5. Đưa cây in vitro ra vườn ươm Ở giai đoạn này, cây được chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng. Vì vậy cần phải huấn luyện cho cây thích nghi với sự biến đổi của môi trường, đồng thời thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của cây con. 1.8. Sơ lược về đối tượng nghiên cứu 1.8.1. Nguồn gốc Cây hoa Huệ Hương có tên khoa học là Polianthes tuberose L. Đây là loài hoa cắt cành, thuộc nhóm cây thân thảo, cho hoa quanh năm, nở hoa vào ban đêm, có nguồn gốc chủ yếu từ Mexico và hiện đã có mặt ở nhiều nước trên thế giới. Loài hoa này đã được du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng phổ biến tại một số tỉnh thuộc vùng Nam Trung Bộ và Nam Bộ. 1.8.2. Phân loại Trong hệ thống phân loại thực vật học, cây hoa Huệ Hương là cây thuộc: - Ngành: Plantae (Thực vật) - Lớp: Monocotyledonae (Một lá mầm) - Bộ: Liliales (Hành) - Họ: Amarylidaceae (Thủy Tiên) - Chi: Polianthes - Loài: Polianthes tuberose L. Theo kết quả thống kê trên thế giới thì hiện tại ở Mexico có khoảng 12 loài hoa Huệ Hương. Hình 1.1. Polianthes tuberose L. Riêng ở Việt Nam hiện nay, dựa vào đặc điểm của hoa thì chia thành 2 giống, chủ yếu là huệ đơn và huệ kép. - Huệ đơn hay còn gọi là huệ xẻ: cây thấp, mảnh khảnh, cách hoa nhỏ, bông chỉ có một lớp cánh nhưng hương thơm rất đậm. - Huệ kép hay còn gọi là huệ tứ diện: cây cao, hoa dày và bông dài hơn huệ đơn nhưng hương thơm kém hơn. 1.8.3. Đặc điểm thực vật học 1.8.3.1. Thân Huệ thuộc cây thân thảo, thân hành hay còn gọi là thân giả được kết bởi các bẹ lá xếp chồng lên nhau, bẹ lá trước xếp phủ lên bẹ lá sau. Thân thẳng đứng không phân nhánh vươn lên thành ngồng hoa cao khoảng 0,8 - 1m. 1.8.3.2. Lá Cây hoa huệ có lá đơn mọc quanh gốc, xanh và dài, cuống lá gốc rộng và to thành hình như cái bao bao lấy củ, giữa phiến lá và bẹ lá không phân biệt rõ ràng. Chiều dài lá khoảng 20 - 30cm, bề rộng của lá từ 0,5 - 1cm. 1.8.3.3. Hoa Cây hoa huệ là cây cho hoa quanh năm, nhưng hoa nở chủ yếu vào mùa hè còn mùa đông tỷ lệ ra hoa ít, hoa nhỏ và bông nắng hơn. Hoa huệ có màu trắng, bao hoa hình phễu, thường tỏa hương vào ban đêm. Hoa có vị ngọt, hơi chát, thơm, không độc. Cành hoa thường dài, ở nách mỗi lá có 2 hoa màu trắng, có tràng đơn hay tràng kép, nhị gắn giữa ống, bầu dưới 3 ô. 1.8.3.4. Củ và rễ Cây huệ có bộ rễ chùm phát triển mạnh, rễ phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt 1-15cm. Có 2 loại rễ: rễ mọc từ củ mẹ ban đầu gọi là rễ sơ cấp và rễ mọc từ củ con gọi là rễ thứ cấp, củ huệ thực chất chính là thân ngầm của cây huệ. 1.8.4. Yêu cầu ngoại cảnh của cây hoa Huệ Hương 1.8.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ là yếu tố vật lý có ảnh hưởng lớn đến thời gian sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng phân hóa hoa của cây hoa Huệ Hương. Cây hoa Huệ Hương là cây ưa nhiệt độ mát mẻ (20 - 25oC), nhưng chịu nóng tốt, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa hè. Tuy vậy, khi nhiệt độ mùa hè quá cao kéo dài sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới khả năng sinh trưởng của cây, chất lượng hoa và nhất là sâu bệnh phá hại mạnh. Trước khi phân hóa hoa và lúc cây có 5 - 6 lá cần nhiệt độ mát mẻ (15 - 22oC) nếu không tỷ lệ nở hoa sẽ rất thấp và chất lượng hoa kém. 1.8.4.2. Ánh sáng Cây hoa Huệ Hương là cây ưa sáng mạnh. Giai đoạn đầu sau khi trồng, cây sống chủ yếu nhờ vào nguồn dinh dưỡng từ củ. Khi cây ra lá, cây sử dụng chất dinh dưỡng từ quá trình quang hợp. Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa nếu không cung cấp đủ ánh sáng thì tỷ lệ ra hoa thấp, hoa nhỏ. Ngoài ra, nếu thiếu ánh sáng cây hoa Huệ Hương rất dễ bị nhiễm bệnh. Trong điều kiện ngày ngắn, ánh sánh yếu thì ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng phát triển của cây. Cường độ ánh sánh cũng là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phân hóa mầm hoa. Nếu cường độ chiếu sáng dưới 3500 lux thì cường độ quang hợp và sự thoát hơi nước giảm, cây mọc vống, cành lá yếu. Do đó khi trồng ở vụ đông cần đảm bảo chế độ chiếu sáng phù hợp để tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân hóa mầm hoa, hoa tự dài đồng thời tăng chất lượng hoa. Số giờ chiếu sáng thích hợp cho cây hoa huệ sinh trưởng và phát triển tốt từ 12 - 16 giờ và cường độ ánh sáng khoảng 6000 lux. 1.8.4.3. Nước Cây hoa Huệ Hương là cây rễ củ nên khi nảy mầm cũng như quá trình sinh trưởng cần phải có đủ nước. Các giai đoạn sinh trưởng khác nhau thì có nhu cầu về nước khác nhau. Sau khi trồng vài ngày, rễ mầm nhú ra và phát triển thì yêu cầu đất xung quanh củ phải đủ ấm, vì vậy trước khi trồng nên tưới nước. Khi cây mọc nếu đất quá khô thì phải tưới nước ngay. Trong suốt thời kỳ sinh trưởng, cây hoa Huệ Hương cần rất nhiều nước, đặc biệt là ở giai đoạn có 3 - 7 lá, đây là thời kỳ cây có nhu cầu về nước lớn, nếu thiếu nước cây sẽ sinh trưởng chậm ảnh hưởng đến khả năng phân hóa của hoa. 1.8.4.4. Đất Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên bất cứ loại đất nào, tuy vậy cây chỉ sinh trưởng tốt, cho hoa đẹp trên loại đất hơi kiềm (pH = 6 - 7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt. Tuy vậy, cây hoa Huệ Hương không thích hợp ở nơi quá trũng, chua. Cây hoa Huệ Hương có thể trồng trên các loại đất có thành phần cơ giới sau: - Đất cát pha có độ tơi xốp cao, độ hổng lớn, thoáng khí, ngấm nước tốt nhưng có độ phì kém. Do đó, khi trồng hoa Huệ Hương trên loại đất này cần phải bón nhiều phân hữu cơ để bổ sung dinh dưỡng cho cây. - Đất thịt nhẹ, thoát nước tốt, giàu dinh dưỡng là loại đất trồng thích hợp đối với cây hoa Huệ Hương. Nếu đất quá ẩm, rễ rất dễ bị thối, vì thế vào mùa mưa cần chống úng, tháo nước kịp thời không để ruộng bị ngập úng. Mặc khác hoa Huệ Hương cũng là cây rất mẫn cảm với các loại muối kim loại nặng. Đặc biệt là loại đất có hàm lượng chì cao, rễ cây sinh trưởng kém, cây phát triển chậm và khả năng ra hoa kém. Chính vì vậy trước khi trồng hoa huệ cần chú ý đến các biện pháp canh tác đất. 1.8.5. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 1.8.5.1. Chuẩn bị giống Theo phương pháp canh tác truyền thống, cây huệ trồng bằng củ, vì vậy khi cây có nhiều lá úa vàng thì bới củ, tách nhẹ nhàng từng củ, chọn những củ có kích thước đạt tiêu chuẩn sau đó cắt bỏ lá và rễ tiến hành phơi nắng 2 - 3 ngày cho lá héo rồi đem bảo quản nơi thoáng mát, cao ráo, sau 2 - 3 tháng có thể đem trồng trở lại. Trong thời gian bảo quản nên thường xuyên kiểm tra tránh hiện tượng củ bị thối. Trong những năm gần đây, xuất hiện bệnh chai bông trên diện rộng, vì vậy để phòng trừ bệnh chai bông trên cây hoa Huệ Hương cần tiến hành các bước sau: - Không sử dụng củ bị nhiễm bệnh hoặc lấy củ từ những ruộng đã bị nhiễm bệnh trước đó làm củ giống. - Phơi củ trong vòng 1 - 1,5 tháng trước khi đem ra trồng. - Nên thay đổi chân đất sau mỗi vụ trồng hoặc luân canh cây hoa Huệ Hương với một loại cây trồng khác. - Khi phát hiện thấy có triệu chứng bệnh cần loại bỏ cây bệnh ra khỏi ruộng, phơi khô và đốt bỏ. Khi không có củ giống sạch bệnh, có thể chọn củ ở cây không có triệu chứng bệnh và tiến hành phơi nắng kĩ từ 1-1,5 tháng, sau đó xử lý củ với nước nóng khoảng 56 - 57oC. Quy trình xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng để phòng trừ bệnh chai bông gồm các bước sau: - Bước 1: Chuẩn bị củ Huệ Hương để xử lý. Sau khi thu hoạch, đem phơi củ trong 1 - 1,5 tháng, chọn những củ có đường kính từ 3 cm trở lên để xử lý. - Bước 2: Xử lý củ Huệ Hương bằng nước nóng. Đổ nước nóng và nước lạnh vào trong một thùng nhựa với tỷ lệ 6:5, rồi điều chỉnh để nhiệt độ nước trong thùng khoảng 56 - 57oC thì bắt đầu cho củ vào nước. Lượng nước xử lý cần gấp 6 - 7 lần lượng củ xử lý. Sau đó đậy nắp thùng khoảng 15 phút và lại chỉnh cho nước trở lại nhiệt độ 56 - 57oC bằng cách đổ thêm một ít nước sôi từ từ khuấy đều, và ngâm củ trong thùng đậy kín trong 15 phút nữa. - Bước 3: Sau khi xử lý xong, củ được rải đều và phơi khô trong 2 ngày sau rồi đem trồng ra ruộng. 1.8.5.2. Chuẩn bị đất Nên chọn nơi trảng nắng, luống trồng liên tiếp rộng khoảng 1,2 m và sâu 0,5m để có thể giữ nước tốt. Luống đất nên bố trí dọc theo hướng mặt trời để cây nhận ánh sáng tốt và đồng đều. Trước khi trồng nên bón phân lót và phun xịt các loại thuốc diệt nấm và mầm bệnh. 1.8.5.3. Chăm sóc Trong canh tác cây hoa Huệ Hương yếu cầu về nước rất là quan trọng, phải thường xuyên tưới nước đồng thời phải xớt đất và làm cỏ giúp cho bộ rễ phát triển tốt. Phân bón thường sử dụng để bón cho cây là hỗn hợp (Ure, lân và Kali), sau khi trồng được khoảng 2 - 3 năm cây hoa Huệ Hương bắt đầu bị thoái hóa: sinh trưởng chậm, cho hoa ít và chất lượng kém. Do đó phải nhổ lên phân loại củ và trồng lại trên một diện tích khác. Trong thời gian trồng và thu hoạch cần tiến hành trừ cỏ, xới đất, bón phân, tưới nước, phun thuốc…, thường xuyên để tránh lây lam nguồn sâu bệnh hại. Khi trừ cỏ phải tiến hành theo nguyên tắc trừ sớm, trừ khi cỏ còn non và trừ sạch, có thể trừ cỏ bằng tay hoặc bằng thuốc. Trong quá trình trồng, nên bón phân với số lượng ít và chia thành nhiều đợt như bón lót, bón thúc. Ngoài cách bón vào đất còn có thể phun lên lá để bổ sung dinh dưỡng, hỗ trợ cho quá trình ra hoa và chống rụng nụ hoa. Trong thời kì phân hóa mầm hoa cần bón thêm phân đạm, khi ra nụ và sau khi ra hoa cần bón thêm lân và kali. 1.8.6. Vấn đề sâu bệnh trên cây hoa Huệ Hương Trên cây hoa Huệ Hương, sâu thường gặp là rệp sáp, nhện đỏ và nhất là tuyến trùng. Bệnh gây hại trên cây hoa Huệ Hương được chia thành hai nhóm: - Nhóm bệnh không truyền nhiễm, do ngoại cảnh không phù hợp thường gặp nhất là thối xám, thối gốc, đốm lá, gỉ sắt… có thể phòng trị bằng các loại thuốc hóa học. - Nhóm bệnh truyền nhiễm chủ yếu là do vi sinh vật ký sinh gây ra bao gồm : vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm, mycoplasma, virus,… thường rất khó trị, nhất là bệnh do virus gây ra rất dễ lây lan và phát tán thành dịch, gây hại nghiêm trọng và truyền từ đời này sang đời khác, đặc biệt là ở nhóm cây nhân giống vô sinh (bằng củ) như cây huệ. Virus không thể phòng chống hay tiêu diệt bằng hóa chất như vi khuẩn, nấm,, sâu bệnh, cách duy nhất để loại bỏ virus là phải tách chúng ra khỏi cây bị bệnh, trả lại cho cây cuộc sống bình thường khỏe mạnh. Vì vậy, biện pháp làm sạch virus phải luôn được kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh. Sau khi trồng khoảng 1 tháng, ở cây hoa Huệ Hương thường bị nhện đỏ phá hại nặng trên lá, từ 3 - 4 tháng trở đi cây dễ bị rệp sáp phá hại nên có thể phòng trị bằng các loại thuốc sau : Nissorun, Kelthan 20 EC, Comite, Basudin 10H. Khoảng tháng 9 - 10, khi trời mưa kéo dài huệ dễ bị úng thối lá, thối củ thì có thể khắc phục hiện tượng này bằng các loại thuốc như: Anuil, Topsin, Ridomol… 1.8.7. Giá trị kinh tế Với đặc điểm sinh thái dễ thích nghi với vùng khí hậu nhiệt đới như ở nước ta đồng thời yêu cầu trồng và chăm sóc không quá khắt khe nên Huệ Hương được trồng khá phổ biến và đem lại thu nhập rất cao cho người dân. Trong những năm gần đây, cây hoa Huệ Hương đem lại thu nhập cao cho người dân các tỉnh phía Nam như Tiền Giang, Đồng Tháp… Đặc biệt, tại các tỉnh Nam Trung Bộ như Bình Định, Khánh Hòa, từ khu người dân mở rộng diện tích và nâng cao kỹ thuật canh tác, cây hoa huệ đã trở thành cây trồng chính, đem lại thu nhập cao và trở thành cây xóa đói giảm nghèo. Hiện nay, thu nhập từ cây hoa Huệ Hương ở đồng bằng song Cửu Long bình quân từ 150 - 200 triệu/ha và ở Nam Trung Bộ là 80 - 150 triệu/ha. Ngoài giá trị sử dụng thông thường như trên, gần đây người ta còn sử dụng một số bộ phận của cây làm thuốc chữa bệnh và chế ra các loại dầu thơm. Hiện nay, một số nghiên cứu về loài hoa này đã tìm ra một số thành phần hóa học có liên quan đến việc sản xuất ra các loại dầu thơm, nước hoa quý… được chiết xuất từ các bộ phận như hoa, sáp hoa… trong đó loại tinh dầu tuyệt đối thu được khi chiết xuất từ hoa như alcol benzil chiếm 0,7%, benzoat metal (4,5%), antranilat metal (8,0%), metilisoeugenol (10%), benzoate benzil (24%). Ngoài ra, n-alkan chiếm tỷ lệ không nhỏ tới 42% trong sáp hoa cũng là một thành phần hóa học quan trọng trong việc chế xuất các loại nước hoa, dầu thơm. Bên cạnh đó, cây hoa Huệ Hương còn có công dụng trong y học, bộ phận được sử dụng là củ. Trong tinh dầu củ huệ có chứa thành phần sapogenin, sapogenin bao gồm hecogenin, tigogenin là loại hợp chất được chiết xuất để bào chế ra một số loại thuốc quý. Từ lâu trong nhân gian người dân đã biết sử dụng cây hoa Huệ Hương để làm thuốc chữa một số bệnh đơn giản. Ở Ấn Độ người ta đã dùng củ phơi khô, tán thành bột để làm thuốc trị liệu, hoặc ở Vũng Tàu người dân nơi đây đã dùng củ để chữa bệnh sốt rét. Ở một số nơi, dân gian còn dùng củ để chữa bệnh hóc xương bằng cách đem giã nát củ, vắt lấy nước rồi nhỏ vào họng của người bị hóc xương sau 1 - 2 phút sẽ khỏi. 1.9. Tình hình sản xuất hoa huệ trong nước Du nhập vào nước ta từ rất lâu và được trồng rộng rãi trong cả nước, nhưng cây hoa Huệ Hương được trồng phổ biến hơn cả ở miền Nam và Nam Trung Bộ. Trong những năm gần đây, diện tích canh tác cây hoa Huệ Hương ngày càng được mở rộng và đem lại thu nhập cao cho người trồng. Theo thống kê hiện nay, trên địa bàn các tỉnh Đồng bằng song Cửu Long có diện tích trồng huệ lớn hơn cả. Trung bình các tỉnh có khoảng 500 - 1000 ha canh tác cây hoa Huệ Hương, khi thu hoạch có thể thu nhập từ 150 - 200 triệu/ha. Do cây này dễ trồng, chi phí đầu tư thấp, ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố thời tiết và đặc biệt hơn là hoa huệ cho thu hoạch tới 14 tháng/vụ nên trong điều kiện thuận lợi thường cho thu nhập cao. Trong những năm gần đây, trên địa bàn các tỉnh vùng Nam Trung Bộ bắt đầu đẩy mạnh canh tác cây hoa Huệ Hương, đặc biệt là ở Bình Định và Khánh Hòa. Ở Bình Định, cây hoa Huệ Hương dần trở thành cây trồng chính. Theo đánh giá của người dân nơi đây, trong điều kiện thuận lợi mỗi ha bình quân cho thu nhập trên 80 - 120 triệu đồng. Mặc dù vậy, hiện nay việc canh tác cây huệ đang gặp nhiều khó khăn, do bị sâu bệnh hại phá hoại nhiều, trong đó có một bệnh rất khó trị là bệnh chai bông. Hiện nay bệnh phá hoại rất mạnh, có thể làm giảm đến 60% năng suất cây trồng. Chính vì vậy, năng suất hoa Huệ Hương trên nhiều vùng có xu hướng không ổn định và chất lượng hoa thì giảm đáng kể. Hiện nay, bệnh chai bông đang là nguyên nhân chính làm cho giảm năng suất và phẩm chất hoa trên các vùng chuyên canh, đặc biệt ở Nam Trung Bộ và Nam Bộ. Triệu chứng bệnh thể hiện: - Trên lá: trước khi ra hoa, trên lá của cây con bị nhiễm bệnh thường xuất hiện các đường gân sọc màu nâu đỏ kéo dài từ bẹ lá đến chóp lá, lá có thể bị xoắn. - Trên bông: nếu bị nhiễm nặng, bông sẽ bị cai không trỗ được hoặc bông bị đen thui và khô, bẹ lá hầu như bị thâm màu nâu đỏ. - Trên thân: khi bị nhiễm bệnh, thân bị lùn, vỏ thân có những chai sần dày đặc. Theo phương pháp nhân giống truyền thống, đối với hoa Huệ Hương, nguồn vật liệu ban đầu để sản xuất hoa thương phẩm là củ giống, chất lượng củ giống đóng vai trò quan trọng, nó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và chất lượng của hoa sau này. Củ tái sinh theo phương pháp thông thường dựa trên nguyên lý chung là ở phía trong các nách lá có một chồi ngủ (chồi nách), các chồi này khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành chồi bên. Nhìn chung, phương pháp này đơn giản, dễ làm và chi phí đầu tư không cao nhưng có rất nhiều nhược điểm: hệ số nhân thấp, thường làm thoái hóa giống, gâu bệnh hàng loạt ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng hoa. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện đề tài - Phòng Công nghệ Sinh học thuộc Trung tâm nghiên cứu ứng dụng tiến bộ khoa học Công nghệ - Sở Khoa học và Công nghệ tỉnh Bình Định. 2.2. Đối tượng nghiên cứu - Phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. Hình 2.1. Hoa Huệ Hương Hình 2.2. Củ hoa Huệ Hương 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy Mẫu cấy được chọn là phần đỉnh của các mắt ngủ được lấy từ củ Huệ Hương. Các củ Huệ Hương có chứa mắt ngủ được thu hoạch, sau đó được làm sạch bề mặt mẫu vật bằng vòi nước chảy mạnh trong 15 phút để loại bỏ những nơi có bám đất cát. Củ Huệ Hương được ngâm trong bột giặt 30 phút rồi rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Sau đó tiến hành cắt củ thành lát mỏng có chứa các mắt ngủ. Sau đó rửa lại bằng nước cất và đem vào buồng cấy để khử trùng. Khử trùng mẫu trong buồng cấy bằng nước cất vô trùng 3 lần rồi rửa lại bằng cồn 70% trong 15 - 20 giây rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng lần 1. Sau đó tiến hành khử trùng mẫu theo các thí nghiệm để tìm ra chế độ khử trùng tốt. 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy khởi động Các mẫu sau khi khử trùng được cắt bằng dao chỉ lấy phần đỉnh mắt ngủ có kích thước từ 1 - 2mm. Sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tùy từng thí nghiệm. 2.3.3. Phương pháp nhân nhanh Chồi bất định hình thành có chiều cao khoảng 2 - 3cm cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. Các protocorm hình thành trong quá trình nuôi cấy khởi động mẫu và nhân nhanh chồi được tách ra rồi cấy vào môi trường nhân nhanh MS có bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng. 2.3.4. Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh Sau giai đoạn nhân nhanh, các chồi có chiều cao 4 - 5cm, có trạng thái sinh trưởng và phát triển bình thường được cấy vào môi trường ra rễ để tạo thành cây hoàn chỉnh. Môi trường ra rễ là môi trường MS có bổ sung các chất thuộc nhóm auxin và than hoạt tính. 2.3.5. Phương pháp ươm cây Các cây hoa Huệ Hương hoàn chỉnh trong bình được rửa sạch agar rồi trồng trên các giá thể khác nhau. Theo dõi các tỷ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây. 2.4. Bố trí thí nghiệm Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại từ 30 - 50 bình, mỗi bình cấy 1 - 3 mẫu tùy từng thí nghiệm. Thí nghiệm ngoài vườn ươm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 30 cây. - Môi trường nuôi cấy + Môi trường MS cơ bản (Murashige and Skoog, 1962) + Môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật, than hoạt tính với các nồng độ khác nhau tùy từng thí nghiệm. + Giá trị pH môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trước khi khử trùng: 5,8 - 6,0. + Môi trường nuôi cấy được hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1,1 atm trong 25 phút. - Điều kiện nuôi cấy + Các dụng cụ được sử dụng trong nuôi cấy: dao, kéo, banh được vô trùng bằng ngọn lửa đèn cồn. + Tủ cấy được vô trùng bằng đèn tử ngoại 20 - 30 phút. + Nhiệt độ phòng nuôi: 25oC ± 2 + Cường độ ánh sáng: 2000 lux + Độ ẩm: 70% + Thời gian chiếu sáng: 14h sáng/10h tối. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. - Môi trường cơ bản: MS + 30g/l saccharose + 9g/l agar + 2 mg/l BA. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) A0 7 A1 10 A2 12 A3 15 A4 17 A5 20 Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Nghiệm thức Ca(OCl)2 15% (phút) HgCl2 0,1% (phút) A0 0 15 A1 10 A2 20 A3 30 A4 40 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.4. Khảo sát ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) A0 0 A1 1 A2 2 A3 3 A4 4 A5 5 Sau khi thực hiện xong thí nghiệm 2.2 chúng tôi nhận ở nghiệm thức A4 (4mg/l BA) là tối ưu nhất đối với quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy, nên sử dụng BA ở nồng độ này để tiến hành khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác. Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Bảng 2.5. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Nghiệm thức Nồng độ auxin (mg/l) Nồng độ BA (mg/l) A0 0 4 A1 0,25 α-NAA A2 0,25 IAA A3 0,25 IBA A4 0,25 2,4D 2.5. Các chỉ tiêu theo dõi - Tỷ lệ mẫu bị nhiễm - Tỷ lệ mẫu sống sót - Tỷ lệ mẫu cảm ứng với môi trường - Tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái 2.6. Thu thập và xử lý số liệu Các số liệu phân tích được thực hiện trên máy vi tính theo chương trình Excel 2003 và phần mêm IRRISTAT 4.0 (2003). CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, phương pháp khử trùng mẫu cấy thông dụng nhất hiện nay là dùng các chất hóa học có hoạt tính diệt khuẩn như: calcium hypochloride (Ca(OCl)2 ), HgCl2, H2O2… Hiệu lực diệt nấm, diệt khuẩn của các chất này phụ thuộc vào thời gian xử lý, khả năng thâm nhập của chúng vào các kẽ, ngách lồi lõm trên bề mặt mô nuôi cấy và khả năng đẩy hết các bọt khí trên bề mặt mô nuôi cấy ra ngoài. Đối với cây hoa Huệ Hương, vật liệu đưa vào nuôi cấy là các mắt ngủ nằm dưới đất, nguồn nấm bệnh và vi khuẩn rất nhiều. Chính vì thế, tỷ lệ nhiễm vào mẫu rất cao. Xác định phương pháp khử trùng tối ưu nhất đối với mẫu nuôi cấy của cây hoa Huệ Hương là vấn đề quan trọng. Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. HgCl2 là hóa chất có tác dụng khử trùng mạnh, hiệu quả và đã được sử dụng phổ biến với hầu hết các mẫu trong nhân giống in vitro. Nếu sử dụng trong thời gian ngắn, tỷ lệ mẫu nhiễm cao, nếu kéo dài thời gian sử dụng dễ làm mẫu tổn thương và chết. Việc tìm ra thời gian khử trùng phù hợp cho đối tượng này quyết định đến thành công của quá trình nuôi cấy. Chính vì thế chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu quả khử trùng của HgCl2 ở các mức thời gian khác nhau. Sau 4 tuần theo dõi, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.1. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Thời gian khử trùng (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 7 84,17 15,83 A1 10 76,67 23,33 A2 12 72,50 27,50 A3 15 54,17 45,83 A4 17 71,67 28,33 A5 20 83,34 16,67 Từ bảng số liệu 3.1, chúng tôi nhận thấy: Sử dụng HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau cho hiệu quả khử trùng khác nhau. Do đặc thù của mắt ngủ của hoa Huệ Hương có độ sạch không cao nên thời gian khử trùng 7 phút (là thời gian tương đối dài với các đối tượng cây trồng khác) nhưng tỷ lệ mẫu nhiễm vẫn rất cao 84,17%, tỷ lệ mẫu sống chỉ đạt 15,83%, thấp nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Khi tăng thời gian khử trùng từ 7 phút lên 15 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 84,17% (nghiệm thức A0) xuống còn 54,17% (nghiệm thức A3) đồng thời tỷ lệ mẫu sống tăng dần. Tiếp tục tăng thời gian khử trùng lên 17 và 20 phút, lúc này tỷ lệ mẫu nhiễm ít tuy nhiên do thời gian khử trùng lâu, mẫu cấy bị tổn thương hóa nâu rồi chết, tăng từ 54,17% (nghiệm thức A3) tới 71,67% (nghiệm thức A4) và 83,34% (nghiệm thức A5), đồng thời tỷ lệ mẫu sống giảm dần từ 45,83% (nghiệm thức A3) xuống còn 28,33% (nghiệm thức A4) và 16,67% (nghiệm thức A5). Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A3 khử trùng trong 15 phút có tỷ lệ mẫu nhiễm tương đối thấp so với các nghiệm thức còn lại và tỷ lệ mẫu sống cao nhất đạt 45,83%. Đây là nghiệm thức có hiệu quả tốt nhất trong các nghiệm thức thí nghiệm. Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 1.1, chúng tôi nhận thấy HgCl2 0,1% có tác dụng tốt nhất khi khử trùng ở thời gian là 15 phút. Để nâng cao hiệu quả khử trùng, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15%. Ca(OCl)2 là một hóa chất có tác dụng khử trùng tốt và thường được dùng để khử trùng mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng chúng tôi thu được kết quả sau 4 tuần nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.2. Bảng 3.2. Ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy sau 4 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức HgCl2 0,1% (phút) Ca(OCl)2 (phút) Tỷ lệ mẫu nhiễm và chết (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) A0 15 0 53,34 46,67 A1 15 10 50,83 49,17 A2 15 20 41,67 58,33 A3 15 30 57,50 42,50 A4 15 40 79,17 20,83 Qua bảng số liệu 3.2, chúng tôi thấy: Khi khử trùng kết hợp với Ca(OCl)2 15% (nghiệm thức A1 đến A4) thì hiệu quả khử trùng tăng lên rõ rệt và tỷ lệ mẫu nhiễm giảm đáng kể so với trường hợp chỉ khử trùng bằng HgCl2 0,1% (nghiệm thức A0). Điều đó chứng tỏ Ca(OCl)2 cũng có hiệu quả cao khi khử trùng mẫu cấy củ hoa Huệ Hương. Ở nghiệm thức A0, tỷ lệ mẫu nhiễm là 53,34%, khi kết hợp với Ca(OCl)2 15% trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm xuống còn 41,67% (nghiệm thức A2). Khi tăng thời gian khử trùng Ca(OCl)2 15% tỷ lệ mẫu nhiễm giảm thấp nhưng tỷ lệ mẫu hóa nâu và chết tăng cao. Điều đó cho thấy Ca(OCl)2 15% có tác dụng tốt đến hiệu quả khử trùng, tuy vậy nếu sử dụng trong thời gian dài dễ làm mẫu tổn thương và chết nhiều. Khi xử lý Ca(OCl)2 15% trong 40 phút thì tỷ lệ mẫu chết cao 79,17% (nghiệm thức A4) vì vậy tỷ lệ mẫu sống thấp 20,82%. Trong các nghiệm thức thí nghiệm, nghiệm thức A2 xử lý Ca(OCl)2 15% trong 20 phút cho tỷ lệ mẫu nhiễm 41,67%, tỷ lệ mẫu sống 58,33%. Đây là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu sống sót cao nhất. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, để điều khiển sự phát sinh hình thái thực vật việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò đặc biệt quan trọng. Trong các chất điều tiết sinh trưởng, có hai nhóm chất được sử dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô là cytokynin và auxin. Tỷ lệ và hàm lượng hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng này có vai trò quan trọng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy theo hướng phát sinh cơ quan, phát sinh phôi soma hay tạo callus. Các chất thuộc nhóm auxin thì tác dụng kích thích tạo rễ và callus mạnh, còn các chất thuộc nhóm cytokynin thì có tác dụng kích thích tạo chồi. Cây hoa Huệ Hương là đối tượng mới trong nghiên cứu nuôi cấy mô ở nước ta. Hiện nay chỉ có một vài nghiên cứu bước đầu trên đối tượng này. Theo đó, các chất cytokinin: BA, kinetin... và các auxin: α-NAA, 2,4D, IAA... có hiệu quả kích thích sự phát sinh chồi từ phân sinh mô chồi cây hoa Huệ Hương. Trong thí nghiệm này chúng tôi tập trung nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ BA và kinetin, đồng thời nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kinetin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Ngoài tác dụng kích thích sự hình thành chồi, kinetin còn có tác dụng cải thiện chất lượng chồi trong quá trình nuôi cấy. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ của kinetin đến khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Sau 8 tuần theo dõi, kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 dưới đây. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ kinetin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 30,83 25,83 5,00 Phần lớn chồi tạo thành xanh, có chiều cao thấp. Protocorm nhỏ, màu xanh, hơi vàng A2 2 63,33 55,83 7,50 A3 3 54,17 46,67 7,50 A4 4 51,67 45,00 6,67 A5 5 47,50 39,17 8,33 Ghi chú : (-) không có Qua bảng số liệu 3.3 trên chúng tôi nhận thấy: Ở nghiệm thức A0 (nghiệm thức đối chứng) tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần theo dõi, các mẫu đều chết. Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy, có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tất cả các nghiệm thức bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái. Khi bổ sung vào môi trường từ 1 - 5 mg/l kinetin, kết quả cho thấy tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái khi cho 1 - 2 mg/l kinetin tăng lên từ 30,83 - 63,33% và khi cho 3 - 5 mg/l kinetin thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái giảm dần. Trong đó, nghiệm thức A2 (bổ sung 2mg/l kinetin) cho tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 63,33%. Quan sát sự phát sinh hình thái của mẫu cấy, chúng tôi nhận thấy mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo chồi và tạo protocorm. Tất cả các mẫu tạo chồi đều có protocorm, một số ít mẫu chỉ có protocorm. Khi quan sát tỷ lệ mẫu vừa tạo chồi vừa tạo protocorm, chúng tôi nhận thấy kinetin có hiệu quả tốt trong việc kích thích mẫu tạo chồi khi bổ sung ở nồng độ thấp. Tỷ lệ tạo chồi cao nhất khi bổ sung kinetin 2 mg/l, đạt 55,83%. Khi lần lượt tăng nồng độ kinetin lên 5 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi càng giảm, chỉ còn 39,17% ở nghiệm thức A5. Các chồi tạo thành hầu hết xanh, mập, chiều cao thấp. Cùng với hướng vừa tạo chồi và protocorm, có một số mẫu phát sinh theo hướng chỉ tạo protocorm. Các nghiệm thức bổ sung kinetin, tỷ lệ mẫu phát sinh tạo protocorm dao động từ 5 - 8,33%. Protocorm tạo thành có màu xanh vàng, nhỏ, đường kính từ 1 - 1,5mm. Với mục tiêu nhân giống in vitro, chúng tôi chỉ quan tâm đến mục tiêu phát sinh tạo chồi của mô cấy. Trong thí nghiệm này, nghiệm thức A2 với nồng độ kinetin bổ sung 2 mg/l là công thức tối ưu nhất, với tỷ lệ mẫu tạo chồi cao nhất (55,83%). Hình 3.1. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 2mg/l kinetin Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Sau khi tiến hành thí nghiệm 2.1, chúng tôi nhận thấy kinetin có khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một cytokinin khác đến khả năng phát sinh hình thái của mắt ngủ cây hoa Huệ Hương. BA là một cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Trong nuôi cấy mô tế bào, BA được sử dụng khá phổ biến và trong một số trường hợp BA còn là một chất không thể thay thế. Kết quả thí nghiệm sau 8 tuần được thể hiện ở bảng 3.4. Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 0 0,00 0,00 0,00 - A1 1 38,33 18,33 20,00 Phần lớn chồi tạo thành mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm có đường kính 1 - 2 mm, màu xanh. A2 2 55,83 32,50 23,33 A3 3 65,00 48,33 16,67 A4 4 73,33 66,67 6,67 A5 5 69,17 54,17 15,00 Ghi chú : (-) không có Qua bảng số liệu 3.4 chúng tôi nhận thấy: Bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích mẫu phát sinh hình thái. Nghiệm thức A0 (không bổ sung BA), tất cả mẫu nuôi cấy đều không phát sinh hình thái, sau 8 tuần nuôi cấy thì mẫu chết. Khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy, tất cả các nghiệm thức đều có mẫu phát sinh hình thái. Nồng độ BA bổ sung từ 1 - 5mg/l, trong đó, nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất là 77,33% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA với nồng độ 4mg/l) và nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái thấp nhất là 38,33% ở nghiệm thức A1 (với nồng độ BA bổ sung là 1mg/l). Khi bổ sung BA vào môi trường, mẫu phát sinh hình thái theo hướng tạo protocorm và tạo chồi. Tất cả các nghiệm thức có bổ sung BA mẫu đều tạo protocorm và tạo chồi. Trong đó, phần lớn mẫu vừa tạo chồi đồng thời tạo protocorm, một số ít mẫu chỉ tạo protocorm. Ở tỷ lệ mẫu chỉ tạo protocorm riêng biệt, chúng tôi nhận thấy các protocorm tạo thành có màu xanh, hơi vàng, đường kính khoảng 1 - 2 mm. Ở các nghiệm thức bổ sung BA, khi nồng độ BA tăng từ 1 - 4 mg/l, tỷ lệ mẫu tạo chồi tăng và đạt cao nhất 66,67% ở nghiệm thức A4 (bổ sung BA 4mg/l). Đây cũng là nghiệm thức có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BA lên 5mg/l thì tỷ lệ mẫu tạo chồi lại giảm xuống 54,17%, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cũng giảm còn 69,17%. Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy chồi tạo thành phần lớn mập, xanh và phát triển tốt. Như vậy, với mục đích tạo chồi là hướng chủ đạo. Chính vì vậy, trong thí nghiệm này tỷ lệ mẫu tạo chồi là chỉ tiêu quyết định để lựa chọn môi trường cho mẫu phát sinh hình thái phù hợp. Từ những nhận định trên, chúng tôi nhận thấy rằng khi bổ sung nồng độ BA 4mg/l vào môi trường đem lại hiệu quả tốt, kích thích mẫu phát sinh theo hướng tạo chồi tốt hơn kinetin. Mặc dù ở nồng độ thấp, kinetin có hiệu quả cao nhưng nghiệm thức tối ưu khi bổ sung kinetin (2mg/l kinetin) thì tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái và mẫu tạo chồi thấp hơn hẳn so với nghiệm thức tối ưu khi bổ sung BA (4mg/l) vào môi trường nuôi cấy. Hình 3.2. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 4mg/l BA Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Tùy vào tỷ lệ auxin/cytokinin khác nhau mà mẫu có những hướng phát sinh hình thái khác nhau. Vì vậy, tùy mục đích nghiên cứu có thể điều khiển sự phát sinh hình thái thông qua tỷ lệ giữa chất điều hòa sinh trưởng thuộc 2 nhóm auxin/cytokinin. Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng khả năng kích thích mẫu phát sinh hình thái và tạo chồi trực tiếp của các cytokinin chưa thật sự cao. Chính vì thế, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của cytokinin và các auxin đến khả năng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy. Thí nghiệm được tiến hành với 4 loại auxin kết hợp với BA nồng độ 4mg/l (là nghiệm thức tốt nhất ở thí nghiệm 2.2). Sau 8 tuần nuôi cấy, kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.5 dưới đây. Bảng 3.5. Ảnh hưởng kết hợp của BA và các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy sau 8 tuần nuôi cấy. Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ auxin (mg/l) Tỷ lệ mẫu cảm ứng (%) Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Tỷ lệ mẫu tạo protocorm (%) Hình thái mẫu tái sinh A0 4 0 68,33 65,83 2,50 Chồi mập, xanh, phát triển tốt. Protocorm màu xanh, có đường kính 2 - 2,5 mm. A1 4 0,25 α-NAA 88,33 80,83 7,50 A2 4 0,25 IAA 87,50 76,67 10,83 A3 4 0,25 IBA 76,67 59,17 17,50 A4 4 0,25 2,4D 80,00 71,67 8,33 Từ kết quả bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy: Khi bổ sung các auxin vào môi trường nuôi cấy, sự kết hợp của auxin và cytokinin BA (nghiệm thức A1 đến A4) có tác động tích cực đến sự phát sinh hình thái của mẫu so với trường hợp chỉ có BA (nghiệm thức A0). Các nghiệm thức bổ sung auxin α-NAA, IAA, IBA, 2,4D đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái, tỷ lệ mẫu tạo protocorm và tỷ lệ mẫu tạo chồi cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0). Như vậy, việc bổ sung các loại auxin này vào môi trường làm tăng hiệu quả kích thích mẫu phát sinh hình thái. Tuy vậy, nghiệm thức bổ sung IBA mặc dù có tỷ lệ phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 nhưng lại có tỷ lệ mẫu tạo chồi thấp hơn. Trên môi trường MS cơ bản có 4mg/l BA, các nghiệm thức bổ sung các loại auxin khác nhau cho kết quả khác nhau. Điều đó chứng tỏ hiệu quả của các auxin khác nhau đối với việc kích thích mẫu phát sinh hình thái là khác nhau. Tất cả các nghiệm thức bổ sung auxin đều có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức A0 (không bổ sung auxin). Trong các loại auxin bổ sung vào môi trường nuôi cấy thì nghiệm thức bổ sung 0,25mg/l α-NAA có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao nhất 88,33%, trong khi đó, bổ sung 0,25mg/l IBA lại cho kết quả thấp, tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái ở nghiệm thức này chỉ đạt 76,67%. Các nghiệm thức bổ sung auxin đều có một số ít mẫu phát sinh theo hướng tạo rễ tuy vậy, rễ tạo thành rất ít, ngắn và yếu. Qua quan sát, chúng tôi nhận thấy các chồi tái sinh ở các nghiệm thức này có hình thái tốt, xanh mập, cao chồi đều cao hơn so với chồi ở nghiệm thức đối chứng. Trong khi đó, bổ sung thêm 0,25mg/l IBA (nghiệm thức A3) mặc dù có tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái cao hơn nghiệm thức đối chứng (nghiệm thức A0) nhưng tỷ lệ mẫu tạo chồi lại thấp hơn (59,17%). Hình 3.4. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l 2,4D + 4mg/l BA Hình 3.3. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l IBA + 4mg/l BA Hình 3.6. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l IAA + 4mg/l BA Hình 3.5. Mẫu phát sinh hình thái trên môi trường MS + 30g/l saccaroza + 9g/l agar + 0,25mg/l α-NAA + 4mg/l BA Qua thí nghiệm này, với mục tiêu của nhân giống in vitro, chúng tôi nhận định rằng: việc kết hợp 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA (nghiệm thức A1) có ảnh hưởng tốt đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy với tỷ lệ mẫu phát sinh hình thái là 83,33%, tỷ lệ mẫu tạo protocorm là 7,5%, tỷ lệ mẫu tạo chồi đồng thời tạo protocorm là 80,83%. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận Thí nghiệm 1. Xác định phương pháp khử trùng tốt nhất đối với mẫu nuôi cấy là phần đỉnh của các mắt ngủ tách từ củ hoa Huệ Hương. Thí nghiệm 1.1. Khảo sát ảnh hưởng của HgCl2 0,1% ở các mức thời gian khác nhau đến hiệu quả khử trùng mẫu. Trong các thí nghiệm, khử trùng HgCl2 0,1% trong 15 phút là nghiệm thức có hiệu quả tốt nhất trong các thí nghiệm. Tỷ lệ sống cao đạt 45,83% và tỷ lệ mẫu nhiễm và chết 54,17%. Thí nghiệm 1.2. Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp HgCl2 0,1% trong 15 phút và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy. Phương pháp khử trùng mẫu tốt nhất đối với mắt ngủ củ hoa huệ là dùng HgCl2 0,1% trong 15 phút kết hợp với Ca(OCl)2 15% trong 20 phút. Với chế độ khử trùng này tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất 58,33%. Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tới quá trình phát sinh hình thái của mẫu cấy. Thí nghiệm 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của kinetin lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Kinentin là một cytokinin tổng hợp được sử dụng chủ yếu trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Trong thí nghiệm này, nồng độ 3mg/l kinetin là tối ưu nhất, tỷ lệ mẫu cảm ứng là 54,17% và tạo chồi là 46,67%. Thí nghiệm 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. BA là một cytokinin tổng hợp có tác dụng kích thích sự hình thành, sinh trưởng và phát triển của chồi. Sau khi tiến hành thí nghiệm, cho thấy 4mg/l BA là nồng độ tối ưu nhất trong thí nghiệm này, tỷ lệ mẫu cảm ứng là 73,33% và tỷ lệ tạo chồi là 66,67%. Thí nghiệm 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của BA với các auxin khác nhau lên khả năng phát sinh hình thái của mẫu cấy. Môi trường tối ưu cho mẫu phát sinh hình thái là môi trường MS + 30 g/l saccaroza + 9 g/l agar + 4mg/l BA + 0,25mg/l α-NAA. Trên môi trường này, mẫu phát sinh hình thái đạt 88,33%, trong đó tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi đạt cao nhất là 80,83%. 4.2. Đề nghị Vì thời gian thực hiện có hạn nên em xin đề nghị: - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu giai đoạn nhân nhanh, một giai đoạn then chốt của quy trình nhân giống in vitro. Nó có ý nghĩa tạo hiệu quả kinh tế cao, thực hiện mục tiêu nhân nhanh giống cho sản xuất và các nghiên cứu cho chuyển gen, lai tạo giống. - Tiến hành nghiên cứu giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh, trong nuôi cấy mô, một cây in vitro sau khi kết thúc giai đoạn sống dị dưỡng trong ống nghiệm chuyển sang cuộc sống tự dưỡng trong tự nhiên cần có bộ rễ khỏe, hoàn chỉnh giúp cây có khả năng hút nước và dinh dưỡng tốt, làm tiền đề cho sự sinh trưởng và phát triển sau này. - Thực hiện giai đoạn đưa cây ra vườn ươm đây là giai đoạn cuối của quá trình nhân giống in vitro. Giai đoạn này có tính chất quyết định đến khả năng ứng dụng của kỹ thuật nhân giống in vitro trong nhân giống cây trồng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt [1]. Tạ Như Thục Anh (2002), Nghiên cứu công nghệ nhân nhanh cây trinh nữ hoàng cung, Luận văn Thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội. [2]. Lê Trần Bình (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến của cây trồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà nội. [3]. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, Giáo trình Cao học Nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà nội, Hà Nội. [4]. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978), Phân loại thực vật, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội. [5]. Phạm Văn Hiển, Nguyễn Văn Thuận, Phạm Kim Mãn (1988), “Kết quả bước đầu nghiên cứu di thực cây Dioscorea floribunđa”, Tạp chí dược học, số 1, trang 8 -10. [6]. Nguyễn Xuân Linh (1998), Hoa và Kỹ thuật trồng hoa, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [7]. Đinh Thế Lộc, Đặng Văn Đông, Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao, NXB Lao động – xã hội. [8]. Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, Nhà xuất bản Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. [9]. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Lý Anh (2007), Công nghệ nuôi cấy mô, Nhà xuất bản Nông nghiệp. [10]. Chu Bá Phúc, Lê Huy Hàm, Nguyễn Khánh Vân, Đỗ Năng Vịnh (1999), Áp dụng phương pháp nuôi cấy mô để nhân nhanh các loại hồng môn, báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc năm 1999, Hà Nội. [11]. Mai Thị Tân, Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn và cộng sự (1993), “Phục tráng khoai tây Thường Tín bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng”, Kết quả nghiên cứu khoa học, Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội. (trang 90 - 95). [12]. Nguyễn Thị Phương Thảo (1998), Nghiên cứu nhân giống in vitro cây hoa loa kèn, Luận văn Thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [13]. Nguyễn Quang Thạch (2001), Công nghệ sinh học trong trồng trọt, Giáo trình sau đại học. [14]. Nguyễn Quang Thạch (chủ biên), Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004) , Giáo trình Công nghệ sinh học nông nghiệp, NXB Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [15]. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn (2000), Giáo trình Sinh lý thực vật, NXB Nông Nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [16]. Huỳnh Thị Huế Trang, Lê Hồng Giang, Nguyễn Bảo Toàn (2007), “Phục hồi giống hoa huệ trắng (Polianthes tuberosa Linn) nhiễm bệnh chai bông bằng nuôi cấy phân sinh mô chồi”, Báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học – Công nghệ sinh học thực vật trong công tác nhân giống và chọn tạo giống hoa, 2007. [17]. Đặng Phương Trâm (2005), Giáo trình kỹ thuật trồng hoa và cây cảnh, Đại học Cần Thơ. [18]. Nguyễn Huy Trí (2000), Trồng hoa và cây cảnh trong gia đình, Nhà xuất bản Lao Động. [19]. Nguyễn Văn Uyển (2000), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, Tập 1, NXB Nông nghiệp. [20]. Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. [21]. Nguyễn Thị Thanh Y (2009), Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. [22]. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà nội. 2. Tài liệu tiếng Anh [23]. Bajaj P.S (1997), High-tech and micropagation, Publ. Spriger, Berlin. [24]. Bhojwani S.S., Razdan, M.K (1983), Plant tissue culture – Theory and practice, Elsevier Academic Publ., Amsterdam. [25]. Chaturvedi, H.C., Sinha, M. (1979), “Mass propagation of discorea floribunda by tissue culture”, Ext. Bull. No6. NBRI. Lucknow, India. [26]. Chen CC, Chang CA (1998), “Characterization of a polyvirus causing mild mosaic on tuberose”, Plant Dis 82: 45 – 49. [27]. Chin- Chil Chen, Tom Hsiang, Fen-lan Chiang and Chin-An Chang, Molecular Characterization of Tuberose mild mosaic virus and preparation of its antiserum to the coat protein expressed in bacteria. [28]. D’Amato, F (1997), “Cytogenetics of differentiation in tissue anh cell cultures”. In: Applied and Fundamental Aspects of plant cell, tissue and organ culture. Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj, Spriger-Verlag, Berlin, pp. 343-357. [29]. Debergh P.C and Zimmeiman P.H (1991), Micropagation-Techniques and Application, Kenwer Academi Pube. [30]. Horner MB, Person MN (1988), “Purification and electron microscopy studies of a probable polyvirus from polianthes tuberose L.”, J. Phytopathol, 122: 261- 266. [31]. Hu and Wang (1983), In Evans et al 177, 277. [32]. Kozai T, Smith MAL (1995), “Environmental control in plant tissue culture – general introduction and overview”. In: Aitken-Christie J, Kozai T, Smith ML (eds). Automation and Environmental Control in Plant Tissue Culture. Kluwer Academic Publisher, Dordrecht – Boston – London, pp. 301 – 318. [33]. Limasset and Cornel (1949), C.R.Acad.Sci Paris 228, 1888-1890 [34]. Morel and Martin (1952), C.R.Acad,Sci: 235, 1324 - 1325. [35]. Murashige, T., and R.Skoog (1962), “A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”. Physiol. Plant. 15: 473-479. [36]. Murashige, T., Serpa, M., Jones, J.B (1974), “Colonal multiplication of Gerbera through tissue culture”. Hortcience, 9, 175-180. [37]. Murashige, T., (1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue culture”. In: Plant growth Substances 1979, ed. by F.Skoog. Springer- Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 426 – 434. [38]. Narayanaswamy S. (1997), “Regenneration of plants from tissue cultures”. In: applied and Fundamental aspects of plants cell, tissue and Organ culture. Eds.J.Reinert and Y.P.S Bajaj. Springer – Verlag, Berlin Heidelberg New York, pp. 179 – 145. [39]. Nickell, L.G. (1973), “Test-tube Approaches to by pass sexx”, Hawaiian Planters Record. 58, pp. 239 – 314. [40]. Saurabh Kulshrestha, Arpna Mehra, Vipin Hallan, Gaurav Raikhy, Raja Ram, Molecular envidence for occurrence of Tuberose mild mottle virus infecting tuberose ( Polianthes tuberosa) in India. [41]. Shad, R.R., Dalal, K.C. (1980), “Propagation of liquorice by axillary bud cultures”, In: Plant tissue culture. Genetic Manipulatin and somatic Hybridisation of plant cells. Eds.P.S.Rao, M.R.Heble and MS. Chadha. Bhabha Atomic Research Centre, Bombay. [42]. Staritsky, G. (1970), “Tissue culture of the oil palm (Elaeis guineensis Jacq) as a tool for its vegetative propagation”, Euphytica, 288 – 292. 3. Tài liệu Internet [43]. [44]. [45]. PHỤ LỤC 1. Kết quả xử lý số liệu Thí nghiệm 1.1. Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9169.79 1833.96 660.21 0.000 2 * RESIDUAL 12 33.3342 2.77785 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9203.12 541.360 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 1794.79 358.958 206.76 0.000 2 * RESIDUAL 12 20.8336 1.73613 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 1815.63 106.801 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9075.00 1815.00 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 12.4995 1.04163 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9087.50 534.559 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NHIEM SONG CHET 1 3 80.0000 15.8333 4.16667 2 3 66.6667 23.3333 10.0000 3 3 55.8333 27.5000 16.6667 4 3 36.6667 45.8333 17.5000 5 3 29.1667 28.3333 42.5000 6 3 14.1667 16.6667 69.1667 SE(N= 3) 0.962263 0.760730 0.589244 5%LSD 12DF 2.96506 2.34407 1.81566 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN1 10/ 8/** 18:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 18 47.083 23.267 1.6667 3.5 0.0000 SONG 18 26.250 10.334 1.3176 5.0 0.0000 CHET 18 26.667 23.121 1.0206 3.8 0.0000 Thí nghiệm 1.2. Ảnh hưởng của HgCl2 0.1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy BALANCED ANOVA FOR VARIATE NHIEM FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 NHIEM TY LE MAU NHIEM LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 773.333 193.333 154.67 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.5000 1.25000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 785.833 56.1310 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE SONG FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 SONG TY LE MAU SONG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 2330.83 582.708 349.62 0.000 2 * RESIDUAL 10 16.6668 1.66668 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 2347.50 167.679 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHET FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V005 CHET TY LE MAU CHET LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 4551.67 1137.92 682.75 0.000 2 * RESIDUAL 10 16.6667 1.66667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 4568.33 326.310 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NHIEM SONG CHET 1 3 36.6667 46.6667 16.6667 2 3 32.5000 49.1667 18.3333 3 3 24.1667 58.3333 17.5000 4 3 20.8333 42.5000 36.6667 5 3 17.5000 20.8333 61.6667 SE(N= 3) 0.645497 0.745358 0.745358 5%LSD 10DF 2.03398 2.34865 2.34865 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN2 10/ 8/** 18:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 5 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NHIEM 15 26.333 7.4921 1.1180 4.2 0.0000 SONG 15 43.500 12.949 1.2910 3.0 0.0000 CHET 15 30.167 18.064 1.2910 4.3 0.0000 Thí nghiệm 2.1. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 7836.46 1567.29 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6675 1.38896 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 7853.13 461.949 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 5986.46 1197.29 862.04 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6668 1.38890 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 6003.12 353.125 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 0.000000 0.000000 2 3 30.8333 25.8333 3 3 63.3333 55.8333 4 3 54.1667 46.6667 5 3 51.6667 45.0000 6 3 47.5000 39.1667 SE(N= 3) 0.680430 0.680417 5%LSD 12DF 2.09664 2.09660 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN3 8/ 9/** 22:55 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 41.250 21.493 1.1785 2.9 0.0000 CHOI 18 35.417 18.792 1.1785 3.3 0.0000 Thí nghiệm 2.2. Ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 11419.4 2283.89 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6671 1.38892 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 11436.1 672.712 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 9120.83 1824.17 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 16.6679 1.38899 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 9137.50 537.500 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 0.000000 0.000000 2 3 38.3333 18.3333 3 3 55.8333 32.5000 4 3 65.0000 48.3333 5 3 73.3333 66.6667 6 3 69.1667 54.1667 SE(N= 3) 0.680422 0.680439 5%LSD 12DF 2.09661 2.09667 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN4 8/ 9/** 22:50 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 18 50.278 25.937 1.1785 2.3 0.0000 CHOI 18 36.667 23.184 1.1786 3.2 0.0000 Thí nghiệm 2.3. Ảnh hưởng của BA va auxin đến khả năng phát sinh hình thái BALANCED ANOVA FOR VARIATE PSHT FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V003 PSHT TY LE PHAT SINH HINH THAI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 818.333 204.583 163.67 0.000 2 * RESIDUAL 10 12.5001 1.25001 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 830.833 59.3452 ----------------------------------------------------------------------------- BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHOI FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN VARIATE V004 CHOI TY LE TAO CHOI LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 887.500 221.875 106.50 0.000 2 * RESIDUAL 10 20.8334 2.08334 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 908.333 64.8810 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS PSHT CHOI 1 3 68.3333 65.8333 2 3 88.3333 80.8333 3 3 87.5000 76.6667 4 3 76.6667 59.1667 5 3 80.0000 71.6667 SE(N= 3) 0.645499 0.833335 5%LSD 10DF 2.03399 2.62587 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TN5 8/ 9/** 22:58 ---------------------------------------------------------------- PAGE 4 THIET KE HOAN TOAN NGAU NHIEN F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | PSHT 15 80.167 7.7036 1.1180 1.4 0.0000 CHOI 15 70.833 8.0549 1.4434 2.0 0.0000 2. Thành phần môi trường dinh dưỡng MS (Murashige and Skoog, 1962) STT Tên khoa học Hàm lượng/l môi trường I Các nguyên tố đa lượng (g/l) 1 NH4NO3 1,65 2 KNO3 1,90 3 CaCl2.2H2O 0,44 4 MgSO4.7H2O 0,50 5 KH2PO4 0,17 II Các nguyên tố vi lượng (mg/l) 1 H3PO3 6,20 2 MgSO4.4H2O 22,30 3 ZnSO4.4H2O 8,60 4 KI 0,83 5 MoO4.2H2O 0,25 6 CoCl2.6H2O 0,025 7 CuSO4.5H2O 0,025 III Các vitamin (mg/l) 1 Glycin 2,0 2 Thiamin HCl 0,5 3 Pyridoxin 0,5 4 Nicotin 0,5 IV Inositol 100 (mg/l) V NaFeEDTA (g/l) 1 NaEDTA 0,03725 2 FeSO4.2H2O 0,02785