Đề tài Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt Vấn Đề Cách đây hai thập kỷ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đúng khi nhận thấy việc sử dụng DNA tái tổ hợp nhƣ là một công cụ hữu hiệu trong việc nâng cao năng suất cây trồng và chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm đồng thời vẫn thúc đẩy đƣợc một nền nông nghiệp bền vững. Tiếp theo những nhận định này là hàng loạt những đột phá trong nghiên cứu khoa học về các phƣơng pháp chuyển gen, trong việc phát hiện và bảo tồn những gen quý. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt đông của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành thực hiện 2 đề tài “ Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α” trong khoá luận tốt nghiệp của mình. 1.2 Mục tiêu của đề tài Thiết lập quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescipt và chuyển đƣợc plasmid tái tổ hợp này vào tế bào ký chủ Ecoly DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện 1.3.1 Phần 1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600nm và mật số tế bào vi khuẩn dựa trên sự tƣơng quan của số tế bào theo thời gian nuôi cấy kết hợp với tƣơng quan của giá trị OD600nm theo thời gian nuôi cấy. Thiết lập quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt. Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzym giới hạn để kiểm tra. 1.3.2 Phần 2 Chuẩn bị đoạn DNA để chèn. Cắt và tinh sạch vector. Phản ứng sửa chữa sai sót trên đoạn DNA chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu bằng. Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào. Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillyn, X-gal, IPTG Kiểm tra lại kết quả biến nạp đoạn gen bằng phản ứng cắt, phản ứng PCR trên plasmid tách chiết từ thể biến nạp. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LYỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là hiện tƣợng tiếp nhận DNA từ bên ngoài vào tế bào vi khuẩn. Hiện tƣợng biến nạp đƣợc chứng minh lần đầu tiên trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae do Fred Griffiths, năm 1928, sau đó đƣợc kiểm chứng lại bởi Avery và cộng sự năm 1944 (viện Rocketfeller). Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng có trạng thái khả nạp tự nhiên, chúng có khả năng hấp thu DNA tự nhiên có sẵn ở môi trƣờng sống. Nguồn DNA này có đƣợc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu đƣợc là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền. Từ các nghiên cứu của Griffiths và Avery đã chỉ ra rằng tế bào vi khuẩn phải ở trạng thái sinh lý đặc biệt mới có khả năng hấp thu DNA, đó là “trạng thái khả nạp”. Trạng thái khả nạp xuất hiện tự nhiên ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dƣỡng và oxy trong môi trƣờng sống của chúng giảm xuống thấp. Trong thực tế nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào vi khuẩn để chúng có khả năng hấp thu DNA. 2.1.2 Vai trò và ứng dụng của biến nạp gen 2.1.2.1 Vai trò Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật. 2.1.2.2 Ứng dụng Biến nạp DNA vào vi khuẩn còn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Từ rất lâu, vi sinh vật đã đƣợc xem và sử dụng nhƣ nhà máy sinh học (lyving factories) tạo ra các sản phẩm sinh học phục vụ nhu cầu con ngƣời, ví dụ kháng sinh Penicillyn đƣợc chiết xuất từ nấm Penicillyum và Streptomycin tạo ra từ vi khuẩn Streptomyces griseus. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con 4 ngƣời. Nhiều loại vaccine dùng trong y học và thú y, nhiều giống cây trồng chứa gen kháng bệnh đã đƣợc tạo ra thay thế cho những phƣơng pháp cổ điển. Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiên những nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đọan gen đƣợc dễ dàng. 2.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiên tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ. Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào. Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998). ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào. Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kých hoạt sự phiên mã. ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự 5 ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và lynh động dọc theo sợi xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT. ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp. 2.3 Sự biến nạp nhân tạo vào tế bào E.coly 2.3.1 Khái niệm sự biến nạp nhân tạo. Biến nạp nhân tạo là việc đƣa một đoạn DNA vào tế bào chủ nhằm nhân nhanh số lƣợng bản sao, phục vụ cho mục đích nghiên cứu khác. Trong phòng thí nghiệm, nhằm mục đích tăng cƣờng khả năng biến nạp, ngƣời ta thƣờng xử lý tế bào chủ bằng các phƣơng pháp hóa học hay vật lý. Tế bào chủ sau khi đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp trên gọi là tế bào khả nạp. Tế bào E.coly là một tế bào chủ đƣợc sử dụng rộng rãi vì cấu trúc di truyền của nó tƣơng đối đơn giản, thông tin di truyền đã đƣợc biết tƣờng tận nên dễ dàng phát hiện tế bào có mang gen lạ. E.coly là một vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2,5µm, có roi (flagella) và bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hoá cho ít nhất 4000 gen. Giống nhƣ tất cả các loài vi khuẩn gram âm khác E.coly không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép. Các tế bào E.coly có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu với X-gal. 2.3.2 Sự điều hoà gen của operon Lac ở E.coly Trong trƣờng hợp có glucose, E.coly tăng trƣởng nhanh chóng. Nếu thay glucose bằng lactose (β-galactisido-glucose), E.coly ngừng tăng trƣởng và hồi phục sau đó nhờ tổng hợp đƣợc 3 enzym Permerase kých thích sự thấm lactose Acetylase (vai trò chƣa rõ) 6 Β-galactosidase xúc tác sự thuỷ giải lactose thành galactose và glucose Ba enzym này chỉ đƣợc tổng hợp khi cần để phóng thích glucose từ lactose; chúng đƣợc cảm ứng bởi lactose. Jacobs và Monod (1961) giải thích sự cảm ứng này qua mô hình hoạt động của operon Lac (lactose operon). Operon Lac là đoạn DNA chứa: Ba gen cấu trúc lacZ (mã hoá β- galactosidase), lacY (mã hoá permerase) và lacA (mã hoá acetylase). Một trình tự nucleotide gọi là promoter (vùng khởi động: P), đánh dấu điểm khởi đầu sao chép của cả 3 gen. Một trình tự nucleotide gọi là operator (vùng hoạt động: O) nằm giữa promoter và các gen mã hoá enzym. Operator quyết địmh RNA polymerase không lyên kết hay lyên kết với promoter và di chuyển dọc theo các gen (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). Hình 2.1 Cấu trúc operon Lac trong vi khuẩn E.coly. Trích dẫn từ Bài giảng sinh học phân tử, Bùi Trang Việt, 2002. Ngƣời ta gọi một nhóm gen với các chức năng lyên hệ cùng với promoter và operator là operon. Operon chỉ có ở procaryote; sự tập hợp các gen trong operon giúp các gen lyên hệ biểu hiện nhanh chóng (do sự thay đổi môi trƣờng), vì chúng đƣợc kiểm soát chỉ bởi một “nút đóng mở” duy nhất (đó chính là operator). Trƣớc operon lacZ là gen điều hoà I, gen này mã hoá repressor, tức protein có vai trò kìm hãm sự biểu hiện gen. Hoạt động của operon Lac đƣợc chứng minh nhƣ sau: Khi có glucose (và không có lactose), gen điều hoà I hoạt động (I có promoter riêng) để tạo ra repressor; repressor nhận biết và lyên kết với operator, cản sự lyên kết gen điều hoà Gen điều hoà Vùng cấu trúc gen của lac operon cấu trúc gen của cấu trúc gen của cấu trúc gen của 7 của RNA polynerase và promoter. Khi có lactose (và không có glucose), lactose lyên kết với repressor và làm biến đổi hình thể của repressor, do đó repressor không lyên kết với operator: operon Lac mở, RNA polymerase lyên kết với promoter và trƣợt dài theo các gen của operon; mRNA (mã hoá cho cả 3 enzym) đƣợc tạo thành và đƣợc dịch mả thành các polypeptide riêng biệt. Với hỗn hợp glucose và lactose, E.coly dùng glucose trƣớc, sự dùng lactose bị đàn áp: đó là sự “kìm hãm dị hoá”. Khi glucose giảm, ngƣời ta chứng minh cAMP gia tăng và cố định trên một protein gọi là CAP (catabolyte gen activator protein) hay CRP (cAMP recepter protein). phức hợp cAMP- CAP cố định trên promoter và làm tăng khả năng lyên kết của RNA polymerase với promoter. Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E.coly dùng để biến nạp đƣợc cải tiến thành các chủng chủ theo các hƣớng cơ bản là loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn khi đó DNA lạ sẽ bị phân giải và thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích luỹ trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA-) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải thiện chất lƣợng DNA chiết tách bằng các phƣơng pháp sinh hoá chuẩn (trích dẫn bởi Bùi Trang Việt, 2002). 2.3.3 Chuẩn bị tế bào khả nạp Có hai phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp 2.3.3.1 Phƣơng pháp vật lý Phƣơng pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao. 2.3.3.2 Phƣơng pháp hoá học Là phƣơng pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ). Phƣơng pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp nhƣng đơn giản và dễ thực hiện. Hiện nay để tạo tế bào E.coly khả nạp theo các phƣơng pháp hóa học, ngƣời ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau Thứ nhất, phƣơng pháp Hanahan cho phép tạo những tế bào E.coly khả nạp có hiệu quả biến nạp cao (5x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA). 8 Thứ hai, phƣơng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phƣơng pháp Hanahan và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 1x108 đến 3x108 khuẩn lạc/µg plasmid DNA. Thứ ba, phƣơng pháp Calcium chloride, phƣơng pháp này đƣợc phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5x106 đến 2x107 khuẩn lạc/µg plasmid DNA. Thông thƣờng, ngƣời ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II nhƣ CaCl2, MgCl2, RbCl2. Việc biến nạp DNA plasmid vào E.coly đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0-4oC). Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.coly dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp để kých thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tƣơng ứng. 2.3.4 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E.coly biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc. Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau: Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation. Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc). Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGem và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E.coly chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn 9 này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β- galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β- galactosidase E.coly (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó, bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kých hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kých hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.3.5 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: Phƣơng pháp nhiệt độ cao Phƣơng pháp Lythium Phƣơng pháp SDS-kiềm 10 2.3.6 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.3.6.1 Giới thiệu về phản ứng PCR Là phản ứng nhân nhanh số lƣợng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro. Quá trình này đƣợc tiến hành nhờ enzym DNA polymerase. Phản ứng PCR gồm các bƣớc chủ yếu sau: Bƣớc 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94-95oC Bƣớc 2: Giai đoạn bắt cặp giữa Primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của Primer, thông thƣờng khoảng 40 – 50oC. Bƣớc 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA đƣợc tiến hành ở 72oC Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc trên đƣợc lập lại nhiều lần. Hình 2.2 Các chu kỳ của phản ứng PCR. 2.3.6.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR Taq polymerase Taq polymerase là enzym chính tham gia vào quá trình tổng hợp các mạch DNA. Enzym này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới. Taq polymerase đƣợc phân lập từ vi khuẩn suối nƣớc nóng thermus aquaticus. Enzym này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu đƣợc nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C. Nhiệt độ tối ƣu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng 70 – 72o C. Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzym này quá thấp không đủ lƣợng enzym xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn. 2 4 6 8 1 0 Biến tính Ủ bắt cặp Kéo dài Lặp lại n lần 94–95o C 72 o C 45-56o C 11 Các nucleotid tự do dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate. Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên lyệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới. Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng sẽ làm phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase. Primer (mồi) Primer (mồi) là những đoạn olygoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Chiều dài của mồi thƣờng từ 10 – 35 nucleotide. Mồi khởi đầu cho quá trình tổng hợp mạch mới. Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq polymerase bắt đầu kéo dài chuỗi DNA. Dung dịch đệm Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2+. Nó rất cần thiết cho quá trình lyên kết các dNTP, xúc tác cho enzym Taq polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép. Nồng độ MgCl2 tối ƣu là 1.5mM. Môi trƣờng đệm KCl đã và đang đƣợc áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR. Tuy nhiên trong nhiều trƣờng hợp môi trƣờng này không hiệu quả nên ngƣời ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2+. Với những đoạn DNA giàu G, C ngƣời ta thƣờng dùng dung dịch đệm amonium sulphate nhằm làm giảm những sản phẩm đƣợc tạo một cách không hoàn toàn trong PCR với Taq . Phƣơng pháp này dùng phát hiện những đoạn gen có kých thƣớc nhỏ chạy trên gel acrylamide. DNA khuôn Phản ứng PCR tối ƣu trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lƣợng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hƣớng giảm từ 1µg xuống khoảng 100ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn. Số chu kỳ phản ứng Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vƣợt qúa 40 chu kỳ. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lƣợng DNA mẫu ban đầu. Nếu ít chu kỳ thì 12 sản phẩm PCR thu đƣợc ít. Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzym dùng trong phản ứng. Nhiệt độ và pH Những enzym đƣợc sử dụng trong phản ứng rất mẫn cảm với nhiệt độ. Theo Trần Thị Dân (2000), sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hƣởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR. Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt lực của Taq polymerase. Để kéo dài chuỗi ngƣời ta sử dụng nhiệt độ 72o C, đây là nhiệt độ tối ƣu cho Taq polymerase hoạt động. Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định nhất, khoảng nhiệt độ này đƣợc xác định tùy từng loại primer. Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao. Thông thƣờng nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C. Hầu hết các enzym, mẫu DNA đƣợc đệm trong môi trƣờng tối ƣu có pH = 8. Ở pH này DNA rất ổn định. Trong môi trƣờng axit các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ. Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8. Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục Bảng 2.1 Các vấn đề thƣờng gặp trong PCR và phƣơng pháp khắc phục 1. Có nhiều sản phẩm chuỗi ngắn không đặc trƣng Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Gia tăng thời gian ủ bắt cặp Gia tăng thời gian kéo dài chuỗi Gia tăng nhiệt độ kéo dài chuỗi lên đến 74 – 78o C Giảm nồng độ KCl buffer đến 0,7 – 0,8 nM, giữ nguyên nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 nM. Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng tap polymerase 13 2. Có nhiều sản phẩm chuỗi dài không đặc trƣng Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn Giảm lƣợng Taq polymerase 3. Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông. Gia tăng hàm lƣợng mồi Gia tăng hàm lƣợng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C 4. Sản phẩm PCR ít Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp đến mức có thể Gia tăng lƣợng mồi Gia tăng lƣợng DNA khuôn Gia tăng lƣợng Taq polymerase Ứng dụng của PCR PCR có nhiều ứng dụng trong ngành sinh học. PCR với cặp primer đƣợc thiết kế riêng sẽ phân lập đƣợc đoạn DNA mong muốn. Từ đây nó đƣợc ứng dụng trong các lĩnh vực: Y khoa: dùng chuẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus. Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng. Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống. Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo nhƣ việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin... 14 Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn hoặc vi rút có trong mẫu thực phẩm. Sử dụng để xác nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen. 2.3.7 Điện di DNA Phƣơng pháp điện di là phƣơng pháp cho phép xác định kých thƣớc của các đoạn DNA. DNA đƣợc cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trƣờng. Do DNA tích điện âm nên trong môi trƣờng điện trƣờng nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng. Agarose là một trong các dạng của polysacharide. Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút. Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gellyng). Giữa những hạt nhƣ vậy có những lổ rất nhỏ. Tùy theo nồng độ của gel mà kých thƣớc của các lỗ nhỏ này khác nhau. Nồng độ gel càng cao thì kých thƣớc của các lổ càng nhỏ và ngƣợc lại. Khi DNA đi qua các lổ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này. DNA có kých thƣớc càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngƣợc lại. Các DNA cùng kých thƣớc sẽ di chuyển về cùng vị trí và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát đƣợc sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và chiếu dƣới tia tử ngoại. 2.4 Vector, công cụ biến nạp DNA Khái niệm về vector Vector là vật lyệu quan trọng trong các thí nghiệm biến nạp DNA, thí nghiệm gen cloning. Vector đƣợc chọn phải có khả năng mang một hoặc nhiều gen vào tế bào chủ và cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau: Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép bộ gen tế bào chủ. Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. Có kých thƣớc càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kých thƣớc vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh và hiểu quả. Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ. Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu hiện gen trong sinh vật chủ. 15 Các dạng vector thƣờng sủ dụng là plasmid và phage (nhiễm sắc thể của virút). 2.4.1 Plasmid Hình 2.3 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài lyệu T.A. Brown, 1997). Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kých thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn và vi sinh vật khác, plasmid có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất có ích cho vi khuẩn . Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillyn hoặc Chloramphenocol sẽ giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để nhận điện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai. Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replycation) giúp quá trình nhân nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào ký chủ cho việc nhân bản của nó, nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó. Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau: Loại 1: F plasmid (Fertilyty) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp. Ví dụ F plasmid của E.coly. Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp Vùng chèn DNA 16 chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào ký chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas. Loại 3: Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi khuẩn khác. Ví dụ ColE1 trong E.coly. Loại 4: Degradative plasmid giúp ký chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc axit. Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida. Loại 5: Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm. Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có nhiều tới rất nhiều gen giúp cho plasmid tồn tại và họat động trong những ký chủ thích hợp. Gen cần thiết gồm gen kháng kháng sinh, giúp cho việc chọn đúng những tế bào mang plasmid, gen ori giúp cho quá trình lập lại, gen chỉ thị nhằm nhận biết sự tái tổ hợp, vùng MSC (multiple cloning site, vùng đa vị trí gắn kết) chứa nhiều vị trí đƣợc nhận biết bởi nhiều loại men cắt khác nhau giúp cho sự chèn nhiều đoạn DNA có cấu trúc khác nhau, và các gen khác nhƣ promoter (p), gen chỉ thị nhƣ lacZ’, vùng có cấu trúc bổ sung của primer cho phép thực hiện PCR kiểm tra kết quả. 2.4.2 Phage Là vật lyệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn công DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào. Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kých thƣớc tới 10kb (pEMBL9, pBluescript). 2.5 Các enzym đƣợc sử dụng cho biến nạp DNA Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector. 2.5.1 Các enzym cắt giới hạn Khái niệm hiện tƣợng giới hạn: Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên 17 đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này có thể do một trong hai nguyên nhân là DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không hoạt động trong một thời gian hay DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây chính là hiện tƣợng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kých thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kých thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage. Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành những đọan có kých thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này. Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote. Khái niện enzym cắt: Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: khi enzym nhận biết đƣợc trình tự nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó. Loại 3: enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại 2 Khái niệm trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một 18 số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. Hình 2.4 : Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đƣôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2: Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 lygase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá Enzym cắt giới hạn EcoRI Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không đƣợc methyl hoá DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính 19 DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATT 3’ 3’ C TTAA G 5’ 2.5.2 Các enzym sửa chữa DNA 2.5.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzym sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I(từ E.coly) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzym: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải) 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’. Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase 5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’. 2.5.2.2 Terminal transferase Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 20 2.5.2.3 Các DNase Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp các olygonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay Mg 2+ . Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ. 2.5.3 Các enzym khử phosphoril hoá. Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bang cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973). 2.5.4 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn lyên quan đến sự hình thành lyên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi lyền kề. Sự hình thành lyên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E.coly DNA lygase hay T4 DNA lygase. 2.5.3.1 E.coly DNA lygase Enzym đƣợc ly trích từ E.coly xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu sole 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT 5’ E.coly DNA lygase 5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’ 21 2.5.3.2 T4 DNA lygase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E.coly. Enzym này có cùng chức năng với lygase trích từ E.coly nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên là lygase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử. 2.6 Thiết kế DNA tái tổ hợp và tăng bội 2.6.1 Với plasmid Enzym hạn chế cắt vector ở vị trí hạn chế hay MSC. Các DNA sợi kép (plasmid thẳng) với các đầu dính hay bằng đƣợc tạo thành. Đoạn DNA lạ đƣợc cắt ra từ một phân tử DNA lớn bởi cùng enzym cắt giới hạn (với trƣờng hợp đầu dính) hoặc thu nhận từ phản ứng PCR. Sau đó, phản ứng nối giữa vector và DNA chèn đƣợc tiến hành dƣới sự xúc tác của DNA lygase, DNA lygase giúp sự tạo nối đồng hóa trị giữa các nucleotide cạnh nhau. 2.6.2 Với DNA phage Khác với DNA plasmid, DNA không đóng vòng, nhƣng ta cũng có thể tạo các ngân hàng DNA bằng cách dùng các phage làm vector, theo cùng nguyên tắc với sự dùng plasmid. Các bƣớc tạo DNA tái tổ hợp : Làm phóng thích DNA phage ra khỏi vỏ, làm cho các đầu tận cùng của đọan DNA insert có khả năng tƣơng hợp với các đầu tận cùng của DNA phage, và sau đó dùng lygase để nối lyền các đoạn DNA, tái tạo vỏ phage nhờ chất trích protein từ vỏ phage. Đến đây, phage sẵn sàng nhiễm vào vi khuẩn. Để tăng bội DNA phage ngƣời ta cho các phage nhiễm vào vi khuẩn. Các phage chứa DNA lạ sinh sản mạnh và phá vỡ vi khuẩn. Các vi khuẩn sau đó đƣợc trải trên thạch trong hộp petri. 2.7 Các nghiên cứu về biến nạp DNA Cohen và công sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E.coly bằng phƣơng pháp Calcium chloride. Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E.coly khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10 n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng 22 OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau: 10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E.coly khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dich TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày. 23 PHẦN 3: VẬT LYỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2005 đến ngày 15 tháng 08 năm 2005. Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh và phòng 118,105 khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật lyệu và phƣơng pháp dùng trong thí nghiệm 3.2.1 Vật lyệu làm thí nghiệm Vật lyệu dùng trong thí nghiệm là vi khuẩn E.coly DH5α và plasmid pBluescirpt II SK ( + /-), đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng PCR. 3.2.1.1 Vi khuẩn E.coly DH5α Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid. Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1. Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986) 3.2.1.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MSC với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MSC là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự. pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MSC so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại. 24 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MSC của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.1.3 Đoạn DNA Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (629bp) chứa gen mã hoá 2,4-diacetylploroglucinol (2,4-DAPG) trong vi khuẩn Psedomonas fluorescens. Đoạn DNA(580bp)trong vùng ITS của loài nấm Beauveria bassiana. 3.2.2 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri, Ống nghiệm Eppendorf các loại Pipet và đầu tip Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất Thùng đựng nƣớc đá Bình tam giác 3.2.3 Các thiết bị máy móc Tủ cấy vô trùng Bồn ổn nhiệt Máy ly tâm Tủ định ôn Máy lắc vi khuẩn Tủ lạnh Máy đo OD Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di Máy chụp gel Lò vi sóng 3.2.4 Các loại môi trƣơng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua ) Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillyn) Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) 25 Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillyn, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillyn, X-gal, IPTG ) 3.2.5 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất dùng cho PCR (đƣợc cung cấp bởi công ty Bio-rad) iTaq polymerase MgCl2 dNTPs PCR buffer Các loại hoá chất khác Tryptone Bacto yeast extract Natri chlorua Canxi chlorua X-gal IPTG Kháng sinh Ampicillyn Glucose Tris- HCl pH 8.0 EDTA Sodium dodecyl sulfat (SDS) Natri hydroxide Glacial acetic Potassium acetat Glycerol 70% Bromophenol blue Ethidiumbromide 3.2.6 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm BamHI với trình tự nhận biết: G GATCC (Roche, Cat.No. 220 612) CCTAG G EcoRV với trình tự nhận biết: GAT ATC (Roche, Cat.No. 667 145) CTA TAG Hind III với trình tự nhận biết: A AGCTT (Roche, Cat.No. 656 313) TTCGA A DNA T4 lygase (usb, Product No. 70005Y) do công ty Amersham cung cấp. DNA Polymerase I large fragment (Klenow) (BioLabs, Code number M0210S) do công ty Bio-rad cung cấp. 26 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn. Nhân sinh khối, tách chiết plasmid,kiểm tra Màng tế bào hồi phục plasmid bắt đầu sao chép Nhiễm sắc thể + CaCl2 Màng tế bào trở nên khả nạp + DNA plasmid sốc nhiệt ổn định tế bào 27 3.3.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coly DH5α và kiểm tra. Vi khuẩn Ecoly DH5α Khả nạp + CaCl2 Plasmid Bluescript II SK (+/-) Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng EcoRV Blunt - end Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7 28 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 100μl 3.3.3 Xác định mật số vi khuẩn bằng cách đo OD600nm kết hợp với phƣơng pháp đếm khuẩn lạc trên môi trƣờng LB agar 3.3.3.1 Nguyên tắc Khi một pha lỏng có chứa nhiều phần tử không tan, thì sẽ tạo thành một hệ huyền phù và có độ đục bởi các phần tử hiện diện trong môi trƣờng lỏng cản ánh sáng, làm phân tán chùm sáng tới. Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trƣờng cũng làm cho môi trƣờng trở nên đục. Độ đục của huyền phù tỷ lệ với mật độ tế bào. Trong một giới hạn nhất định của độ đục và mật độ tế bào, có thể xác lập đƣợc quan hệ tỷ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào và độ đục. Do vậy có thể định lƣợng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua việc đo OD ở các bƣớc sóng từ 550 – 610 nm. Trong trƣờng hợp này, phải thiết lập đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật độ tế bào kết hợp với phƣơng pháp đếm trực tiếp. 3.3.3.2 Cách tiến hành Cấy phân lập vi khuẩn E.coly DH5α từ ống gốc lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Ủ ở 370c từ 16-18 giờ Dùng que cấy bắt một khuẩn lạc (0.5-1mm) từ đĩa petri đã phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút. Sau 3giờ nuôi cấy bắt đầu tiến hành đo OD ở bƣớc sóng 600nm, sử dụng môi trƣờng LB lỏng để xây dựng đƣờng chuẩn, lặp lại sau mỗi giờ nuôi cấy. Ở mỗi thời điểm lấy dịch nuôi cấy để đo OD ta cũng tiến hành đếm khuẩn lạc tại thời điểm đó bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc. Đếm khuẩn lạc Sơ đồ 3.4 Quy trình pha loãng dịch vi khuẩn Tiến hành pha loãng bậc 10 ở các nồng độ Chuẩn bị sẵn các eppendorf 1.5ml sạch chứa 900μl nƣớc 100μl dịch nuôi cấy 900μl nƣớc 29 Hút 100μl dịch vi khuẩn đang nuôi cấy cho vào eppendorf thứ nhất ta đƣợc nồng đô pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng theo sơ đồ đến nồng độ cần thiết. Chọn 3 nồng độ pha loãng lyên tiếp, thích hợp. Ở mỗi độ pha loãng hút 10μl cấy nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trƣờng LB agar. Lập lại 3 lần. Ủ ở 370c qua đêm và chọn nồng độ thích hợp nhất đếm số khuẩn lạc ở 3 giọt cấy. Cách tính Số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD bằng tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc chia 3 rồi nhân với độ pha loãng và nhân với 100 A = A : số khuẩn lạc tại thời điểm đo OD (cfu/ml) 3.3.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bƣớc 1: Bắt một khuẩn lạc đƣờng kýnh từ 2-3 mm từ đĩa phân lập cho vào bình tam giác chứa 100ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc ở 370C đến khi đạt đƣợc mật độ khoảng 108tế bào/ml Bƣớc 3: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần. Bƣớc 6: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40C. Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700C. Khả nạp chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -70oC. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản số khuẩn lạc đếm đƣợc * độ pha loãng *1000 3 * 10 30 khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng. 3.3.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Chúng tôi tiến hành biến nạp thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt, nồng độ khả nạp và plasmid. Nhằm xác định quy trình nào có hiệu quả nhất để phục vụ cho biến nạp plasmid tái tổ hợp. Mỗi quy trình lập lại với thời gian sốc nhiệt là 60 giây, 90 giây Quy trình 1 Hút 30µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 µl, thêm 3µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút Thêm 800µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ Hút 150ml dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh Ampicilyn nồng độ 50µg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 2 Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. 31 Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 3 Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 60μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. 3.3.6 Chọn lọc khuẩn lạc mong muốn và tính hiệu suất biến nạp Nguyên tắc của chọn lọc khuẩn lạc mong muốn là dựa vào phản ứng tạo màu với X-gal trong môi trƣờng LB có sự hiện diện của kháng sinh Ampicillyn và IPTG. Sau khi ủ qua đêm trên đĩa petri sẽ xuất hiện các khuẩn lạc màu xanh và các khuẩn lạc màu trắng. Tiến hành đếm các khuẩn lạc màu xanh trên mỗi đĩa. Dùng tăm vô trùng bắt ở mỗi đĩa 10 khuẩn lạc màu xanh cho vào 10 ống nghiệm có chứa 5 ml môi trƣơng LB lỏng có kháng sinh nồng độ 60 µg/µl. Nuôi cấy lắc 150 vòng/phút qua đêm ở 370c. Cách tính hệ số biến nạp theo Sambrook và cộng sự, 1989 : N = A x10 n x OV/PV N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) 3.3.7 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.3.7.1 Chiết tách plasmid 32 Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kých thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng. Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. 33 Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200c. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasnid đối chứng. Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không. 3.3.7.2 Phản ứng cắt DNA Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau Buffer 10X 2.5µl DNA plasmid 1µg Enzym EcoRV 1 unit (0.1 µl) Thêm nƣớc cho tới 25µl Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 0.8%, với hiệu điện thế 100V, trong 30 phút để kiểm tra. 34 3.3.7.3 Quy trình điện di trên gel agarose Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W. Để nguội đến 40-500C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TAE 0.5X. Chuẩn bị một miếng parafilm (kých thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận). 3.3.8 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel. Quy trình tinh sạch DNA từ gel Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV. Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc). Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10 mg gel ≈ 10µl capture buffer. Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút). Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf. Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. 35 Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C. Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/ phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại. Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch. Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản phẩm PCR là 5:1. Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng /phút trong 30 giây ở 40C Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi. Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 1 phút ở 40c, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại. Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8% để kiểm tra kết quả tinh sạch 3.3.9 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính.Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi 36 tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow). Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA. Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau: NEbuffer 10X 2µl DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút. 3.3.10 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) T4 DNA lygase không giống nhƣ E.coly DNA lygase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym lygase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10. Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng lygation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ lygase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó Phản ứng tạo đầu bằng Đầu dính Đầu bằng 37 chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra. Cơ sở để tính tỉ lệ về lƣợng vector và DNA insert theo số mol Đổi từ số mol ra lượng (ng) của phân tử DNA μg DNA = fmole DNA x x Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn (ng)DNA chèn = Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau T4 reaction buffer 1µl DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) DNA plasmid 1µl (50ng) T4 lygase 1 unit Thêm nƣớc cho tới 10µl Ủ phản ứng ở 220c trong 4 giờ, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer. 3.3.11 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực hiện biến nạp theo quy trình sau Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. 1 μg 3000 fmol Kích thƣớc DNA (bp) 1000 bp Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb) X Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector 38 Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣơng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ). 3.3.12 Kiểm tra kết quả chiết tách plasmid sử dụng enzym BamHI và Hind III, thực hiện phản ứng PCR plasmid với cặp primers (T3, T7) và (ITS4, ITS5) Chiết tách theo quy trình 3.3.7.1, thực hiện phản ứng cắt theo quy trình 3.3.7.2 Phản ứng PCR trên plasmid: Primer T3 và primer T7 đƣợc thiết kế dựa trên trình tự T3, T7 RNA polymerase promoter có trình tự là T7 primer 5’- TAATACGACTCACTATAGGG – 3’ T3 Primer 5’ – ATTAACCCTCACTAAAGGGA – 3’ (Dựa theo Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan) Primer ITS4 và primer ITS5 đƣợc thiết kế dựa trên vùng bảo tồn ITS của loài nấm Beauveria bassiana. Thực hiện phản ứng PCR (theo Samuel S.M.Sun, 1994 có chỉnh sửa) với thành phần và quy trình nhƣ sau: H2O 15.3μl PCR buffer 10X 2.5μl dNTPs (25mM) 2.5μl 5’ primer (20μM) 1.25μl 3’ primer (20μM) 1.25μl DNA plasmid (10ng/μl) 2μl Thực hiện biến tính ở 950C trong 7 phút, thêm vào 1U Taq polymerase. Quy trình: 950C/1’, 550C/1’, 720C/1’, 30 chu kì , 720/7’. 39 PHẦN 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1 Xây dựng đƣờng tƣơng quan tuyến tính Sau khi nuôi cấy lắc 4 giờ bắt đầu đo giá trị OD600 nm và kết hợp với đếm spot cuonting, chỉ chọn những nồng độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25 – 300 để đếm. Nếu các khuẩn lạc mọc dày quá thì có thể đếm ½ hoặc ¼ giọt rồi nhân lên tƣơng ứng. Hình 4.1 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 5, 6 giờ nuôi cấy. (a) kết quả cấy vi khuẩn sau 5 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 100, 10-1, 10-2 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) kết quả cấy vi khuẩn sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Hình 4.2 Kết quả cấy vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng khác nhau sau 7, 8 giờ nuôi cấy. (a) sau 7 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần ; (b) sau 6 giờ nuôi cấy ở nồng độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 mỗi nồng độ lập lại 3 lần. Sau 4 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.06, giá trị này tƣơng đối thấp nên chúng tôi chỉ pha loãng và đếm số khuẩn lạc không ghi lại hình ảnh. b a a b 40 Sau 5 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.14, với giá trị OD này chúng tôi pha loãng từ 100 – 10-6. Nhƣng chỉ chọn nồng độ pha loãng 10-1 để đếm, kết quả 3 lần lập lại nhƣ sau : 283, 298,252. Ở nồng độ này các khuẩn lạc mọc rất dày phải chia ra ½ giọt đếm. Tuy nhiên ở nồng độ pha loãng kế tiếp thì số khuẩn lạc mọc ít không đủ từ 25 – 300 khuẩn lạc. Sau 6 giờ nuôi cấy giá trị OD là 0.36, chúng tôi pha loãng từ 10-1 đến 10-6 và chọn đếm ở độ pha loãng 10-2, kết quả đếm của 3 lần lặp lại là : 109, 138, 143. Sau 7 giờ nuôi cấy giá trị OD đạt đƣợc là 0.6, ở lần đếm này chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-2 đến 10-7 để cấy lên đĩa và chọn ở nồng độ 10-3 để đếm, số khuẩn lạc đếm đƣợc nhƣ sau : 43, 52, 59. Sau 8 giờ nuôi cấy giá trị OD đo đƣợc là 1.3, chúng tôi chọn độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8 để cấy lên đĩa và chọn đếm ở độ pha loãng 10-5 kết quả là : 20,38, 47. Khi giá trị OD đạt 1.3 thì dừng lại không theo dõi nữa vì thực tế chúng tôi chỉ cần biết trong điều kiện làm thí nghiệm này, để đạt đƣợc mật số tế bào 108 tế bào/ml thì giá trị OD tƣơng ứng sẽ là bao nhiêu. Bảng 4.1 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 1 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA 4 gờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.12 0.3 0.54 0.96 1.81 5 x 10 4 1.6 x 10 5 1.3 x 10 6 10 7 1.3 x 10 8 4.7 5.2 6.1 7 8.1 Bảng 4.2 Gía trị đo OD và số tế bào/ml theo thời gian nuôi cấy lần 2 Thời gian nuôi cấy Giá Trị OD600 nm Số tế bào/ml (A) LgA 4 giờ 5 giờ 6 giờ 7 giờ 8 giờ 0.06 0.14 0.36 0.6 1.3 10 5 3 X 10 5 1.3 X 10 6 5 X 10 6 3.5 X 10 8 5 5.5 6.1 6.7 8.6 41 Biểu đồ 4. 1 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc cất. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. Theo đƣờng tƣơng quan này chúng tôi nhận thấy mối tƣơng quan giữa hai giá trị khảo sát tƣơng đối chặt. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) mật số tế bào là 108/ml tƣơng ứng với giá trị OD là 0.145-0.45, nhƣng theo chúng tôi để đạt đƣợc 108 tế bào/ml thì giá trị OD phải là 1.5-1.8. với so sánh này chúng tôi nghi ngờ đã có một lƣợng lớn tế bào bị chết khi pha loãng bằng nƣớc cất. Chúng tôi tiến hành lặp lại thí nghiệm, sử dụng nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Biểu đồ 4.2 Đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD600 nm và LgA khi pha loãng tế bào bằng nƣớc muối sinh lý. (A) là số tế bào đếm được tại thời điểm đo OD. 42 Dựa vào đƣờng tƣơng quan tuyến tính giữa giá trị OD và mật số tế bào ta thấy để đạt đƣợc mật số tế bào từ 5 x 107 – 108 tế bào/ ml thì ta nên chọn dịch nuôi cấy có giá trị OD từ 0.6 – 1, kết quả này khác biệt rất nhiều so với lần thí nghiệm thứ 1. Điều đó cho thấy khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lí cho kết quả chính xác hơn khi pha loãng bằng nƣớc cất. So sánh giữa pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý và pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng có sự khác biệt rất lớn. Pha loãng bằng nƣớc cất vô trùng số tế bào đếm đƣợc sẽ ít hơn khi pha loãng bằng nƣớc muối sinh lý dù chúng có giá tri OD tƣơng đƣơng nhau. Kết quả này cho thấy khi dùng nƣớc cất vô trùng pha loãng sẽ có một số tế bào bị chết. Vì vậy, khi cần sự chính xác thì phải sử dung nƣớc muối sinh lý để pha loãng. Và khi so sánh kết quả này với nghiên cứu của Zhiming Tu và cộng sự (2004) vẫn có sự khác biệt lớn. Sự khác biệt này do nhiều nguyên nhân. Trong đó có hai nguyên nhân chính là chủng vi khuẩn và thiết bị đo OD. Những điều cần lƣu ý Do phải hút dịch vi khuẩn đang nuôi cấy để đo OD nhiều lần nên dịch nuôi cấy rất dễ bị nhiễm vi sinh vật từ bên ngoài, phải cẩn thận khi thao tác. Mật độ tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các yếu tố sau Thể tích môi trƣờng nuôi cấy Lƣợng tế bào vi khuẩn cho vào ban đầu Nhiệt độ nuôi cấy Tốc độ của máy lắc Vì vậy mặc dù mỗi lần xác định giá trị OD đều có các mốc thời điểm cụ thể, nhƣng không thể áp dụng các mốc thời điểm này để chuẩn bị khả nạp mà không cần xác định giá trị OD. 43 4.2 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn 4.2.1 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 60µg/ ml Hình 4.3 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 90 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. . b a c DC 44 Hình 4.4 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp khi sốc nhiệt 60 giây. (a) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X- gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng,cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(c) biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37 o C.(DC) biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(60μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. Kết quả biến nạp trong 90 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên hình 4.3. Với kết quả biến nạp này cho thấy có một lƣợng khả nạp tiếp nhận đƣợc plasmid và thể hiện đƣợc đặc tính chọn lọc trên môi a b c DC 45 trƣờng LB/Amp/X-gal/IPTG, nhƣ vậy tế bào khả nạp đƣợc chuẩn bị có khả năng tiếp nhận plasmid. Tuy nhiên, việc xuất hiện khuẩn lạc trắng với mật độ rất cao ở các đĩa biến nạp và cả đĩa đối chứng không cho phép xác định đƣợc tỉ lệ biến nạp nào là thích hợp, đồng thời cho phép khẳng định nồng độ kháng sinh 60µg/ ml không đủ để chọn lọc thể biến nạp Biến nạp trong 60 giây với tỉ lệ khả nạp : plasmid là 30 : 3 ; 10 : 1 ; 3 : 0.5 và đối chứng đƣợc thể hiện trên Hình 4.4. Kết quả này tƣơng tự với kết quả biến nạp trong 90 giây. Nhƣ vậy, trong các quy trình biến nạp trên không có sự khác biệt lớn về nồng độ plasmid và mật độ vi khuẩn, cũng không có sự khác biệt lớn về thời gian biến nạp. Vì vậy, ở các lần biến nạp sau chúng tôi chọn sốc nhiệt trong 60 giây. Mặc khác, ở đĩa đối chứng mọc rất nhiều khuẩn lạc nhƣng chỉ toàn là khuẩn lạc trắng, còn ở các đĩa có trang vi khuẩn biến nạp thì có cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng. Điều này chứng tỏ nồng độ kháng sinh có trong môi trƣờng không đủ để loại những vi khuẩn không mong muốn. Với nhận định này, chúng tôi quyết định chọn lọc thể biến nạp với nồng độ kháng sinh là 100µg/ ml. 4.2.2 Chọn lọc vi khuẩn biến nạp với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml Hình 4.5 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp đối chứng. Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid ( thể tích là 30μl tế bào khả nạp) phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. 46 Hình 4.6 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 30 : 3. Hình 4.7 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 10 : 1. Hình 4.8 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp ở tỉ lệ thể tích là 3 : 0.5. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích(μl) là 30 :3 phục hồi trong 800μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 10 :1 phục hồi trong 500μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (μl) là 3 :0.5 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC. 47 Với nồng độ kháng sinh 100µg/ ml, đĩa đối chứng không xuất hiện khuẩn lạc nào. Trên cơ sở này tiến hành đánh giá các tỉ lệ biến nạp. Kết quả chọn lọc thể biến nạp ở nồng độ kháng sinh 100µg/ ml (Hình 4.6, 4.7, 4.8) cho khuẩn lạc xanh với mật độ rất cao, điều này cho thấy đây là nồng độ phù hợp để chọn lọc các khuẩn lạc mong muốn. Biến nạp ở thể tích 30µl khả nạp và 3µl plasmid cho kết quả ở giữa đĩa chỉ toàn khuẩn lạc xanh và các khuẩn lạc trắng chỉ có ở xung quanh đĩa. Điều này có thể giải thích do trong quá trình làm thí nghiệm đã có những xảy ra làm cho một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh, thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa, do đó các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân huỷ vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng, tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen lacZ diễn ra chậm. Đối với các khuẩn lạc này khi quan sát kĩ sẽ thấy màu xanh nhạt Tổng số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 450, nhƣ vậy theo công thức tính hệ số biến nạp do Sambrook và cộng sự đƣa ra, chúng tôi tính đƣợc hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 3,073x103CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 10µl khả nạp và 1µl plasmid xuất hiện cả khuẩn lạc xanh và trắng với mật độ tƣơng đƣơng nhau. Điều này chỉ có thể giải thích là do các tế bào bị đột biến kháng kháng sinh. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 150, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,9x103CFU/ μg plasmid. Kết quả biến nạp ở thể tích 3µl khả nạp và 0.5µl plasmid chỉ thu đƣợc toàn khuẩn lac màu xanh, đây là kết quả tốt nhất trong các quy trình biến nạp mà chúng tôi đƣa ra. Theo chúng tôi thì tỉ lệ giữa khả nạp và plasmid trong quy trình này là phù hợp nhất và chúng tôi sẽ dựa vào tỉ lệ này để làm các bƣớc tiếp theo trong thí nghiệm. Số khuẩn lạc xanh đếm đƣợc trên đĩa là 180, hệ số biến nạp ở tỉ lệ này là 1,846x103CFU/ μg plasmid. Nhƣ vậy, sau 3 lần lập lại thí nghiệm với các tỉ lệ biến nạp khác nhau, chúng tôi thu đƣợc hệ số biến nạp nằm trong khoảng từ 1,8-3,0x103CFU/ μg plasmid. 4.3 Tách chiết DNA plasmid Chọn ở mỗi tỉ lệ biến nạp trong mục 4.2 năm khuẩn lạc cấy chuyền sang ống nghiệm chứa 5 ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh 100μg/ml, nuôi cấy lắc 48 ở 370C qua đêm, cả 15 ống nghiệm trên đều có sinh khối vi khuẩn.Tiến hành tách chiết plasmid, thu đƣợc kết quả nhƣ sau : Hình 4.9 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% (lần 1). Mẫu số 1, 2, 3, 4, 5 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 30 :3 ; Mẫu số 6, 7, 8, 9, 10 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 10 :1 ; Mẫu số 11, 12, 13, 14, 15 : sản phẩm tách chiết plasmid từ khuẩn lạc thu được khi biến nạp ở tỉ lệ 3 :0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 20 phút. Trong 15 mẫu tách chiết, mẫu số 3, 5, 7, 15 mặc dù vi khuẩn phát triển đƣợc trên môi trƣờng có kháng sinh nhƣng không thu đƣợc plasmid. Kết quả bƣớc đầu chiết tách plasmid còn lẫn rất nhiều DNA của bộ gen. Các mẫu không thu đƣợc plasmid có thể do sai sót trong quá trình tách chiết plasmid. Chiết tách DNA plasmid còn lẫn DNA của bộ gen là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Qua kết quả tách chiết trên tính đƣợc tỉ lệ tế bào tiếp nhận plasmid là 11/15. Với nhận định trên chúng tôi tiến hành chiết tách plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Kết quả đƣợc thể hiện ở Hình 4.10. Kết quả chiết tách plasmid 5 mẫu, mẫu số 4 không thu đƣợc plasmid. Ở lần tách chiết này đã loại đƣợc DNA genome Tuy nhiên còn lẫn rất nhiều tạp chất, lỗi này có thể do khi thực hiện bƣớc 7 và bƣớc 8 trong quy trình tách chiết, chúng tôi đã để cho các tạp chất lẫn vào phần dịch nổi phía trên. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tiến hành tách chiết lần 3 với mong muốn xác nhận những nghi ngờ của mình. Kết quả tách chiết lần 3 (có chú ý khắc phục những sai sót khi thực hiện ở lần tách chiết thứ 1 và thứ 2) đƣợc thể hiện ở Hình 4.11. Tiến hành tách chiết plasmid 5 mẫu, cả 5 mẫu đều có plasmid. Trong sản phẩm thu đƣợc không còn lẫn tạp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 DNA genome DNA plasmid 3.0kb 49 chất, chỉ thu đƣợc toàn plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hoá chất sử dụng đơn giản. Hình 4.10 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 2). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Hình 4.11 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 0.8% ( lần 3). (DC) plasmid đối chứng, mẫu 1, 2, 3, 4, 5 là sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 : 0.5, điện di ở 100V trong 30 phút. Qua 3 lần tách chiết, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình tách chiết plasmid từ vi khuẩn E.coly biến nạp, kết quả tách chiết không còn lẫn DNA genome và các tạp DC 1 2 3 4 5 1 2 DC 3 4 5 DNA plasmid 3.0kb DNA plasmid 3.0kb 50 chất khác. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzym cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid : Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.4 Phản ứng cắt plasmid bằng enzym cắt giới hạn EcoRV Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel agarose 0.8%. (EcoRV) sản phẩm cắt bằng enzym EcoRV của plasmid tách chiết từ tỉ lệ biến nạp theo thể tích giữa tế bào khả nạp và plasmid là 3 :0.5 (lần 1), (DC1) plasmid gốc (chưa biến nạp), (DC2, DC3) plasmid đối chứng từ sản phẩm tách chiết. Kết quả trên hình cho thấy plasmid đã đƣợc cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kých của plasmid đối chứng, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS. Từ dạng thẳng này chúng ta có thể thực hiện phản ứng khử phosphoril ở hai đầu để duy trì sự ổn định của plasmid nhằm thực hiện phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid. 4.5 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid đã cắt bằng enzym EcoRV 4.5.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng (blunt end) cho đoạn DNA DC TS TS DC EcoRV DC1 DC2 DC3 DNA plasmid 3.0kb 51 sau đó tinh sạch. kết quả tinh sạch đoạn DNA bằng 2 phƣơng pháp đƣợc thể hiện ở Hình 4.13 và Hình 4.14 Hình 4.13 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch trực tiếp đoạn DNA bằng cột GFX. Hình 4.14 Kết qủa điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX. . Kết quả điện di (hình 4.13) cho thấy quá trình tinh sạch đã loại đƣợc hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzym Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể đƣợc kiểm tra khi đã chèn vào plasmid (đã đƣợc cắt tạo đầu bằng) và biến nạp vào vi khuẩn. Kết quả diện di (hình 4.14) cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch không còn band phụ, tuy nhiên trong lúc kiểm tra kết quả tinh sạch cần chú ý chạy thêm đối chứng để 1 (DC) đoạn DNA đối chứng kích thước 629bp từ sản phẩm PCR chưa tinh sạch, (TS) đoạn DNA kích thước 629bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 1%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. (1) đoạn DNA kích thước 580bp từ sản phẩm PCR đã được tạo đầu bằng và tinh sạch bằng phương pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX DC TS TS DC 52 đối chiếu, ở thí nghiệm này chúng tôi đã không chú ý đến điều này, đây là một thiếu sót của chúng tôi. Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.5.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzym cắt mở vòng mới tinh sạch. Hình 4.15 Kết qủa điện di sản phẩm plasmid tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX. Kết quả điện di cho thấy sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm của phản ứng cắt. Từ sản phẩm tinh sạch này chúng tôi tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.6 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng blunt-end sản phẩm PCR, tinh sạch sản phẩm của phản ứng blunt-end, và nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid ta đƣợc plasmid tái tổ hợp. Biến nạp các plasmid tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coly DH5α khả nạp, thu đƣợc kết quả nhƣ sau DC1 DC2 TS (DC1) mẫu plasmid cắt bằng enzym EcoRV chưa tinh sạch, (DC2) mẫu plasmid cắt bằng enzym HindIII chưa tinh sạch, (TS) mẫu plasmid cắt bằng EcoRV được tinh sạch trực tiếp bằng cột GFX, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V trong 30 phút. 53 Hình 4.16 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629 bp trên môi trƣờng LB/amp(100μg/ml)/ X-gal/IPTG. (a) Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) một phần của hình ( a) được phóng to. Hình 4.17 Kết quả cấy vi khuẩn biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp trên môi trƣờng LB/amp/ X-gal/IPTG. (a)Biến nạp với tỉ lệ tế bào khả nạp và plasmid tái tổ hợpvới đoạn DNA 580bp theo thể tích (μl) là 10 :10 phục hồi trong 200μl môi trường LB lỏng, cấy 150μl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/ Amp(100μg/ml)/ X-gal/ IPTG, ủ qua đêm ở 37oC.(b) một phần của hình a được phóng to. a b a b 54 Với đoạn DNA có kých thƣớc 629bp, chỉ có 6 khuẩn lạc trắng trong tổng số 68 khuẩn lạc, các khuẩn lạc xanh là do sự tái đóng vòng của plasmid, các khuẩn lạc trắng có thể là do các tế bào mang plasmid tái tổ hợp. để khẳng định, chúng tôi tiến hành cấy chuyền, chiết tách plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thựic hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers T3, T7. Với đoạn DNA có kých thƣớc 580bp, kết quả cho 4 khuẩn lạc trắng trong tổng số 108 khuẩn lạc, để kiểm tra các khuẩn lạc trắng này chúng tôi thực hiện cấy chuyền, tách chiết plasmid, kiểm tra bằng men cắt và thực hiện phản ứng PCR trên plasmid với cặp primers ITS4, ITS5. 4.7 Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng từ hình 4.15 cấy sang môi trƣờng LB lỏng/Amp nhân sinh khối qua đêm và tiến hành tách chiết theo quy trình 3.3.7 Hình 4.18 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp. (1.1), (1.2), (1.3), (1.4), (1.5), (1.6) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 629bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Theo kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết mẫu số 1.5 nằm cao hơn các mẩu plasmid khác nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III các mẫu số 1.2, 1.4, 1.5. 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 2.1 2.2 2.3 2.4 Kích thƣớc dự đoán 3.0kb Kích thƣớc dự đoán 3.629kb 55 Hình 4.19 Sản phẩm tách chiết plasmid mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (2.1) ,(2.2),( 2.3),( 2.4) sản phẩm tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp với đoạn DNA 580bp, điện di trên gel agarose 0.8%, hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Kết quả chạy điện di sản phẩm tách chiết chỉ thu đƣợc hai mẫu có mang plasmid, mẫu số 2.1 nằm cao hơn mẫu 2.3 nên nghi ngờ là plasmid tái tổ hợp. Tiến hành phản ứng cắt với hai enzym cắt BamHI và Hind III mẫu số 2.1 và chạy kiểm tra với plasmid đối chứng. 4.8 Kết quả phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp Sản phẩm tách chiết plasmid các mẫu biến nạp đƣợc cắt với hai enzym là BamHI và HindIII. Hai enzym này có trình tự nhận biết nằm ngoài trình tự nhận biết của enzym EcoRV, do đó khi cắt mẫu plasmid tái tổ hợp sẽ tạo dạng thẳng mang cả đoạn DNA đƣợc chèn vào theo đúng sơ đồ cắt trong vùng MCS. Kích thƣớc dự đoán 3.58kb Kích thƣớc dự đoán 3.0kb 56 Hình 4.20 Sản phẩm cắt plasmid tách chiết mẫu biến nạp đoạn DNA 629bp và mẫu biến nạp đoạn DNA 580bp. (DCB) plasmid đối chứng cắt với enzym BamHI, (DCH) plasmid đối chứng cắt với enzym HindIII, (2.1B-1.4B) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym BamHI, (2.1H-1.4H) các mẫu tách chiết plasmid của các khuẩn lạc trắng khi biến nạp plasmid tái tổ hợp khi cắt với enzym HindIII. Cắt bằng BamHI mẫu số 1.5, 2.1 khi chạy điện di các band cao hơn band mẫu đối chứng, mẫu số 1.2, 1.4 có band bằng với band của mẫu đối chứng. Cắt bằng HindIII mẫu số 2.1 khi chạy điện di band cao hơn band mẫu đối chứng, các mẫu còn lại có các band bằng với band của mẫu đối chứng. Nhƣng mẫu số 1.5 còn có thêm 1 band mờ nằm ở dƣới, có thể đoạn DNA đƣợc chèn ở mẫu số 1.5 có chứa site cắt của HindIII. Qua kết quả kiểm tra bằng men cắt chúng tôi có thể khẳng định đã chọn lọc đƣợc thể tái tổ hợp. 4.9 Kết quả kiểm tra bằng kĩ thuật PCR Tiến hành chạy PCR kiểm tra mẫu số 7 với primer của đoạn DNA đó, kiểm tra mẫu số 9 với cặp primer T3, T7. DCB 2.1B 1.5B 1.2B 1.5B 1.4B 2.1H 1.5H 1.2H 1.5H 1.4H DCH 57 Hình 4.21 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên plasmid tái tổ hợp. (1) đối chứng mẫu số 2.1 (sản phẩm PCR từ genome, đoạn DNA insert), (2) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 2.1 với cặp primer của chính đoạn gen đó (ITS4, ITS5), (3) leader 100bp, (4) sản phẩm PCR plasmid mẫu số 1.5 với cặp primer T3, T7, (5)đối chứng mẫu số 1.5 (đoạn DNA insert). Mẫu số 2.1 : Sản phẩm PCR trên genome và trên plasmid có trọng lƣong phân tử băng nhau, chứng tỏ đã chèn đƣơc đoạn DNA kých thƣớc 580bp vào plasmid và biến nạp thành công vào vi khuẩn DH5α. Mẫu số 1.5 : Sản phẩm PCR trên plasmid có kých thƣớc lớn hơn sản phẩm PCR trên genome, kết quả trên band diện di cho thấy sản phẩm này có kých thƣớc tƣơng đƣơng với tổng kých thƣớc của đoạn DNA chèn và kých thƣớc của vùng poly cloning site trên plasmid. Điều này cho thấy phản ứng nối đã không gây ảnh hƣởng khả năng hoạt động của T3, T7 RNA polymerase promoter. Tuy nhiên, mức độ khuyếch đại của phản ứng này thấp, nguyên nhân có thể do bởi phản ứng PCR chƣa hoàn chỉnh 1 2 3 4 5 580bp 857bp 629bp 58 PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng tôi đã xây dựng đƣợc quy trình chuyển một đoạn DNA bất kỳ vào tế bào chủ DH5α. Quy trình này có thể sử dụng cho các thí nghiệm tạo dòng áp dụng trực tiếp tại phòng thí nghiêm. Các bƣớc chính trong quy trình là Chuẩn bị khả nạp Dịch tế bào chuẩn bị để làm khả nạp phải có mật độ tế bào từ 5 x 107 đến 108 và tiến hành theo quy trình sau : Bƣớc 1: Chuyển bình tam giác chứa dịch nuôi cấy vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 2: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 3: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này 3 lần. Bƣớc 4: Cho 1 ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 5: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10phút ở 40c Bƣớc 6: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 7: Cho 150μl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20μl glycerol 98% vào và trữ ở -700C. Biến nạp plasmid vào khả nạp Bƣớc 1: Hút 3µl dịch huyền phù tế bào competen cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. Bƣớc 2: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. Bƣớc 3: Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 200µl môi trƣơng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370c trong 1 giờ. Bƣớc 5: Hút 150µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilyn nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. Bƣớc 6: Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. 59 Quy trình tách chiết plasmid Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, vortex nhẹ, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhe eppendorf. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 37 0 C trong 1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho 40µl TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 0.8% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. 5.2 Đề nghị Tiếp tục hoàn thiện quy trình theo điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm, chuyển đoạn DNA từ sản phẩm cắt vào tế bào, chuyển một gen hoàn chỉnh vào tế bào chủ và kiểm soát sự biểu hiện của của gen đó. 60 Nếu trong trƣờng hợp không đủ hoá chất để tách chiết plasmid theo quy trình sử dụng SDS - Kiềm thì nên tách chiết plasmid theo phƣơng pháp xử lý nhiệt gồm các bƣớc sau : Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200c Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200c, lặp lai cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Hoà tan kết tủa trong 500μl TE, vortex để làm tan hết phần kết tủa. Bƣớc 4: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dung dịch TE thu lấy kết tủa. Bƣớc 5: Hoà tan kết tủa trong 500 μl dung dịch STET đƣợc làm lạnh . Bƣớc 6: Thêm 30 – 50 μl dung dịch men lysozyme, vortex làm hoà tan đều. Bƣớc 7: Cho vào bồn nƣớc đƣợc đun sôi trong 1- 2 phút. Bƣớc 8: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C. Bƣớc 9: Thu phần dịch nổi bên trên cho vào eppendorf mới. Bƣớc 10: Thêm 170 – 200 μl dung dịch ammonium acetate 7.5 M và thêm 550μl dung dịch isopropanol. Trộn đều và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Bƣớc 11: Ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu lấy kết tủa. Bƣớc 12: Thêm 500μl ethanol 70% lạnh vào, ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C Bƣớc 13: Loại bỏ dịch nổi thu lấy kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng. Bƣớc 14: Hoà tan kết tủa trong TE với lƣợng thích hợp. Bƣớc 15 : Điện di kiểm tra kết quả tách chiết plasmid. 61 TÀI LYỆU THAM KHẢO Tài lyệu tiếng việt 1. Bùi Trang Việt, 2002, Bài giảng sinh học phân tử ( chƣơng trình cao học), NXB đại học quốc gia TPHCM. 2. Đinh Duy Kháng, 7-2005, Bài giảng gen cloning và chỉ thị phân tử, Tài lyệu lƣu hành nội bộ trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM. 3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng,2002, Sinh học phân tử, NXB giáo dục. 4. Lê Đình Lƣơng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB khoa học kỹ thuật 5. Trần Lynh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại học quốc gia TPHCM. Tài lyệu tiếng nƣớc ngoài. 1. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall. 2. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 3. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 4. Sambrook J, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 5. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Enginereering Techniques. Các website 1. 2. 12. 3. 13. 4. 14. 5. 15. 6. 16. 7. 17. 8. 9. 62 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 63 PHỤ LỤC Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillyn Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillyn nồng độ cuối 60µg/ml, 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillyn + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coly) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillyn, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch  Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid 64 Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch STET (sodium chloride, Tris, EDTA, Triton) Sucrose 8% Triton X - 100 0.5% EDTA pH 8.0 50mM Tris- HCl pH 8.0 10mM Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) 65 Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,2μm Dung dịch kháng sinh Ampicillyn 100mg/ml Cân 100mg ampicillyn dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kých thƣớc lỗ 0,45μm. Các loại buffer  PCR buffer 10X Tris-HCl pH 8.4 200mM (NH4)2SO4 166mM MgCl2 67mM DTT 100mM NP 40 0,1% Tween-20 0,1%  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuff