Đề tài Xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene hsp-70 và reverse transcripte-rnaseh ở một số loài virus thực vật

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE HSP-70 và REVERSE TRANSCRIPTE-RNaseH Ở MỘT SỐ LOÀI VIRUS THỰC VẬT Nghành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001-2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN THÁI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE HSP-70 và REVERSE TRANSCRIPTASE-RNaseH Ở MỘT SỐ LOÀI VIRUS THỰC VẬT Giáo viên hƣớng dẫn: TS. TRẦN THỊ DUNG Cử Nhân. LƢU PHÚC LỢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN THÁI iii LỜI CẢM TẠ Thành kính ghi ơn công lao dạy dỗ, tận tụy suốt đời vì con của cha mẹ. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. Trần Thị Dung Cử Nhân. Lưu Phúc Lợi Đã tận tụy hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi hoàn thành khóa luận này, đặc biệt là thầy Lưu Phúc Lợi đã trang bị cho tôi những kiến thức quí báu và là người đầu tiên đưa tôi đến với Bioinformatics. Xin chân thành cảm ơn đến quí thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Thông Tin. Đã nhiệt tình giúp đỡ, khuyên bảo, tạo điều kiện thuận lợi và đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này. Xin gởi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã động viên, giúp đỡ và luôn ở bên cạnh tôi trong những lúc khó khăn trong suốt thời gian học đại học. Nguyễn Văn Thái iv TÓM TẮT KHOÁ LUẬN NGUYỄN VĂN THÁI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU HAI GENE HSP-70 VÀ REVERSE TRANSCRIPTASE-RNaseH Ở MỘT SỐ LOÀI VIRUS THỰC VẬT” Hội đồng hƣớng dẫn: TS. Trần Thị Dung Cử Nhân. Lƣu Phúc Lợi Khóa luận đƣợc thực hiện tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Trong khoảng thời gian từ tháng 3/2005 đến 8/2005. Với sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự, một số lƣợng lớn các gene hsp-70 và RT- RNaseH đã đƣợc giải trình tự. Những trình tự gene này đƣợc lƣu trữ trong CSDL sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj,…Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều thông tin khác nhau, không tập trung thành từng gene cụ thể nên khó có thể thực hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt. Do vậy, mục tiêu của chúng tôi là tiến hành xây dựng cơ sở dữ liệu hai gene hsp-70 và reverse transcriptase-RNaseH ở một số loài virus thực vật. Để đạt đƣợc mục tiêu trên, khóa luận cần đảm bảo thực hiện nội dung nhƣ sau: Dùng Perl script để thu nhận trình tự các nucleotide và protein của hai gene từ trang CSDL GenBank (NCBI cơ sở dữ liệu nucleotide). Xác định gene và protein của hai gene hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH (RT-RNaseH) trong genome hay ORF (Open Reading Frame) của virus. Tìm hiểu về mô hình dữ liệu quan hệ, sử dụng mô hình này vào việc lƣu trữ dữ liệu các trình tự nucleotide và protein của hai gene, tạo CSDL hai gene này. Dùng Perl script để chuyển tự động các dữ liệu vào CSDL. Sử dụng giao thức CGI kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl, để thiết kế trang web CSDL về hai gene hsp-70 và RT-RNaseH ở trên hai họ virus Closteroviridae và Caulimoviridae. v Sau khi thực hiện các nội dung trên chúng tôi đạt đƣợc những kết quả nhƣ sau:  Chúng tôi đã tải đƣợc 325 trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH từ cơ sở dữ liệu NCBI.  Thông qua việc tìm hiểu về hai họ virus, trình tự gene tƣơng đồng, trình tự protein bảo tồn và kết hợp với ClustalW. Chúng tôi đã xác định đƣợc vị trí gene hsp-70 và RT-RNaseH trong ORF hay nằm trong genome của chúng.  CSDL có 325 trình tự đƣợc tích hợp với Web.  Trang Web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH gồm có 6 trang chính, đó là HOME, SEARCH, TOOL, TAXONOMY, LINK, ABOUT PAGE. Ngoài ra, từ những trang web chính này còn có thể kết nối đến những trang phụ khác để cung cấp những tiện ích cho ngƣời dùng. Từ các trang web này, ngƣời sử dụng có thể truy xuất thông tin, so sánh một trình tự quan tâm với các trình tự trong cơ sở dữ liệu gene hsp-70 và RT-RNaseH, tìm kiếm trình tự, các đặc tính của loài,… vi MỤC LỤC Nội dung Trang Trang bìa ........................................................................................................................... i Trang trong ...................................................................................................................... ii Lời Cảm Tạ .................................................................................................................... iii Tóm Tắt Luận Văn ......................................................................................................... iv Mục Lục .......................................................................................................................... vi Danh Sách Các Bảng ...................................................................................................... ix Danh Sách Các Hình ....................................................................................................... x Danh Sách Các Chử Viết Tắt ........................................................................................ xii Phần 1. LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 4 2.1. SƠ LƢỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU .......................................................................... 4 2.1.1. Định nghĩa .................................................................................................... 4 2.1.2. Hệ quản trị CSDL ......................................................................................... 4 2.1.3. Các mô hình dữ liệu ...................................................................................... 5 2.1.3.1. Định nghĩa ........................................................................................ 5 2.1.3.2. So sánh các mô hình dữ liệu………………………………………..5 2.2. NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH PERL, MẠNG INTERNET VÀ WEB .................... 6 2.2.1. Perl ................................................................................................................ 6 2.2.1.1. Tóm tắt lịch sử phát triển .................................................................. 6 2.2.1.2. Ứng dụng .......................................................................................... 7 2.2.1.3. Một số module của Perl thƣờng đƣợc sử dụng ................................. 7 2.2.2. Giới thiệu về mạng Internet ......................................................................... 8 2.2.2.1. Tóm lƣợc lịch sử phát triển ............................................................... 8 2.2.2.2. Một số khái niệm .............................................................................. 9 2.2.3. Web ............................................................................................................... 9 2.2.3.1. Tóm lƣợt lịch sử phát triển ............................................................... 9 2.2.3.2. Tích hợp CSDL với web dùng CGI ................................................ 10 2.3. CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC ........................................................................... 11 2.3.1. NCBI ........................................................................................................... 11 vii 2.3.1.1. Vài nét về NCBI ............................................................................. 11 2.3.1.2. Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI.................................................... 11 2.3.1.3. Một số công cụ trong NCBI ............................................................ 12 2.3.2. EBI .............................................................................................................. 13 2.3.2.1. Vài nét về EBI ................................................................................. 13 2.3.2.2. Một số cơ sở dữ liệu trong EBI ....................................................... 13 2.3.2.3. Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học .......................... 14 2.3.3. SIB ............................................................................................................. 15 2.3.4. DDJB và PDBj ............................................................................................ 15 2.4. VIRUS CAULIMOVIRIDAE VÀ CLOSTEROVIRIDAE ................................... 18 2.4.1. CAULIMOVIRIDAE ................................................................................... 19 2.4.1.1. Khái quát .......................................................................................... 19 2.4.1.2. Cấu tạo ............................................................................................. 20 2.4.1.3. Đặc tính sinh học ............................................................................. 20 2.4.1.4. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ .......................... 20 2.4.2. CLOSTEROVIRIDAE ................................................................................. 21 2.4.2.1. Khái quát .......................................................................................... 21 2.4.2.2. Cấu tạo ............................................................................................. 21 2.4.2.3. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ .......................... 22 2.5. Gene Hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH ................................................ 23 2.5.1. Gene Reverse transciptase-RNaseH ........................................................... 23 2.5.2.1. Vị trí gene RT-RNaseH nằm trong genome .................................... 23 2.5.2.2. Chức năng của protein ..................................................................... 23 2.5.2. Gene hsp-70 ................................................................................................ 24 2.5.1.1. Vị trí gene hsp-70 nằm trong genome ............................................. 24 2.5.1.2. Chức năng ........................................................................................ 24 PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP VÀ CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG ............................. 25 3.1. Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng...................................... 25 3.1.1. Hệ điều hành ............................................................................................... 25 3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự ........................................................... 25 3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW .......................................... 25 3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST ............. 25 viii 3.1.2.3. Hệ quả trị CSDL quan hệ MySQL .................................................. 26 3.1.2.4. Apache web Server .......................................................................... 27 3.1.2.5. Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng .................................... 27 3.2. Phƣơng pháp ....................................................................................................... 28 3.2.1. Thu nhận trình tự ........................................................................................ 28 3.2.2. Xác định gene và protein trong bộ gene virus ............................................ 29 3.2.3. Thiết kế CSDL trình tự gene và protein hsp-70 và RT-RNaseH ................ 32 3.2.3.1. Phân tích dữ liệu .............................................................................. 32 3.2.3.2. Thiết kế CSDL dạng bảng ............................................................... 34 3.2.3.3. Lƣu trữ các thông tin vào CSDL ..................................................... 35 3.2.4. Tích hợp CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH với trang Web .................... 37 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 39 4.1. Kết quả thu nhận trình tự của hai họ Closteroviridae và Caulimoviridae .......... 39 4.2. Kết quả thu nhận trình tự hai gene hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH ... 41 4.3. CSDL trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH ........................................................ 42 4.4. Trang web thể hiện thông tin CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH ..................... 46 4.4.1. Trang thông tin chung về CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH .................... 47 4.4.2. Trang tìm kiếm ............................................................................................ 47 4.4.3. Trang công cụ .............................................................................................. 49 4.4.4. Trang cây phân loài ..................................................................................... 52 4.4.4.1. Trang Caulimoviridae ..................................................................... 52 4.4.4.2. Trang Closteroviridae ..................................................................... 54 4.4.5. Trang liên kết ............................................................................................... 54 4.4.6. Trang thông tin về bộ môn công nghệ sinh học .......................................... 54 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 55 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................ 55 4.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................... 55 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 57 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 59 ix DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Một số CSDL sinh học lớn và các địa chỉ web tƣơng ứng ........................... 17 Bảng 2.2. Một số CSDL sinh học lớn và các địa chỉ web tƣơng ứng.(tiếp theo) .......... 18 Bảng 3.1. Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính Sinh vật (Organism) .............. 33 Bảng 3.2. Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính trình tự (Sequence) ................ 34 Bảng 4.1 Tổng số trình tự trong CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH ........................... 43 Bảng 4.2 Số trình tự gene hsp-70 .................................................................................. 43 Bảng 4.3 Số trình tự gene RT-RNaseH .......................................................................... 43 x DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Định nghĩa Bioinformatics theo NCBI ............................................................. 1 Hình 1.2 Định nghĩa bioinformatics đƣợc mở rộng ........................................................ 2 Hình 2.1 Tƣơng tác giữa Perl script-DBI-DBD-và RBDMS .......................................... 8 Hình 2.2 Tƣơng quan giữa NCBI, NLM ....................................................................... 11 Hình 2.3 Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI ................................................................... 14 Hình 2.4 Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMB - DDB) và công cụ tìm kiếm tƣơng ứng……………………………………………………………………………...16 Hình 2.5. Sự hợp nhất của ba cơ sở dữ liệu MSD, PDBj, PDB .................................... 16 Hình 2.6 Tổ chức genome của virus CaMV .................................................................. 19 Hình 2.7 Một số loài trong họ Caulimoviridae ............................................................. 20 Hình 2.8 Cơ chế nhân bản, sao mã và dịch mã vào tế bào ký chủ của virus dsDNA ......... 21 Hình 2.9 Hình thái virion của Citrus tristeza virus thuộc Closterovirus ...................... 22 Hình 2.10 Cơ chế nhân bản, sao mã và dịch mã vào tế bào ký chủ của virus (+)ssRNA ...................................................................................................................... 22 Hình 2.11 Vị trí gene RT-RNasseH nằm trong cấu trúc genome Cauliflower mosaic virus ...................................................................................................................... 23 Hình 2.12. Protein reverse transcriptase ........................................................................ 24 Hình 2.13 Vị trí gene hsp-70 nằm trong tổ chức genome của Beet yellows virus .............. 24 Hình 2.14 Protein HSP-70 ............................................................................................. 24 Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận trình tự ....................................................... 28 Hình 3.2 Sơ đồ xác định gene trong genome virus ....................................................... 29 Hình 3.3 Định dạng FASTA để thực hiện sắp gióng cột hai trình tự ............................ 30 Hình 3.4 Kết quả sắp gióng cột cặp trình tự gene RT-RNaseH (đã biết vị trí) với RT- RNaseH trong ORF hay genome của virus .......................................................... 31 Hình 3.5 Sơ đồ các đối tƣợng của CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH ........................ 32 Hình 3.6 Tiến trình lấy thông tin từ CSDL hai gene ở hai loài virus ........................... 37 Hình 3.7 Sơ đồ chi tiết các bảng quan hệ trong CSDL hai gene và protein hsp-70 và RT-RNaseH ở hai họ virus Caulimoviridae và Closteroviridae …………………………38 Hình 4.1 File chứa accession number và dòng định nghĩa của giống Crinivirus.......... 39 xi Hình 4.2 Mẫu tin về gene hsp-70 của Sweet potato chlorotic stunt virus trên NCBI………..40 Hình 4.3 Mô hình thu nhận gene RT-RNaseH trong ORF5 của CMV………………..41 Hình 4.4 Sơ đồ cấu trúc của trang web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH ................. 46 Hình 4.5 Trang HOME PAGE ...................................................................................... 47 Hình 4.6 Trang tìm kiếm trình tự khi biết ACCESSION NUMBER ............................ 48 Hình 4.7 Trang kết quả tìm kiếm trình tự khi biết ACCESION NUBER ..................... 48 Hình 4.8 Trang tìm kiếm trình tự tƣơng đồng bằng Alignment .................................... 50 Hình 4.9 Trang kết quả khi thực hiện Alignment giữa các trình tự…………………..51 Hình 4.10 Trang tìm kiếm trình tự tƣơng đồng bằng BLAST ...................................... 51 Hình 4.11 Trang cây phân loài của hai họ Caulimoviridae và Closteroviridae ............ 52 Hình 4.12 Trang web thể hiện nội dung các đặc tính của họ…………………………53 xii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT CSDL Cơ sở dữ liệu. RT-RNaseH Reverse transcriptase-RnaseH hsp-70 Heat sock protein 70. Perl Practical Extraction and Report Language CGI Common Gateway Interface DBI Database Interface DBD Datadbase Driver WWW World Wide Web HTML Hypertext Markup Language HTTP Hypertext Transfer Protocol NCBI Center for Bioinformatic Information BLAST Basic Local Alignment Search Tool EBI European Bioinformatics Insiture EMBL European Molecular Biology Laboratory SIB Swiss Insitute of Bioiformatics DDBJ DNA Data Bank Japan PDBj Protein Database Japan CaMV Caulimoflower mosaic virus 1 PHẦN 1 LỜI MỞ ĐẦU Với những bƣớc tiến vƣợt bậc trong việc khám phá và ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào trong giải trình tự genome của sinh vật, ngày càng nhiều trình tự đƣợc giải. Đòi hỏi có sự lƣu trữ, tổ chức, quản lý và khai thác tốt các thông tin về trình tự thu đƣợc này ngày càng hiệu quả và nhanh chóng hơn. Vì vậy, cần có sự hỗ trợ đắc lực của các nghành khoa học khác.Với khả năng xử lý, lƣu trữ, liên kết và truy xuất một lƣợng thông tin lớn một cách nhanh chóng của máy tính đã giúp nó trở thành một công cụ hữu ích cho việc ứng dụng vào trong lĩnh vực sinh học. Sự kết hợp giữa ngành tin học và sinh học dẫn đến cho ra đời một công cụ mới, phục vụ cho việc nghiên cứu trong sinh học đó là Tin - sinh học. Mặc dù Tin - sinh học là một lĩnh vực mới ra đời nhƣng triển vọng của nó phục vụ cho nghiên cứu sinh học rất lớn. KHÁI NIỆM VỀ TIN - SINH HỌC Sự kết hợp, liên thông giữa các ngành khoa học giúp cho khoa học có những bƣớc phát triển mới.Trong thời đại khoa học hiện nay, sự kết hợp giữa các ngành lại với nhau là hết sức cần thiết. Không một ngành khoa học nào có thể phát triển mà không cần sự hổ trợ của ngành khác.Với những bƣớc đột phá mạnh mẽ trong lĩnh vực công nghệ thông tin và một số thành tựu mới trong nghiên cứu sinh học (giải mã toàn bộ genome của ngƣời và một số loài khác) thì sự kết hợp này cho ra đời một lĩnh vực nghiên cứu mới – Bioinformatics hay Tin - sinh học là một ví dụ điển hình cho sự liên kết này. Nhƣ vậy, bioinformatics là gì? Có nhiều định nghĩa khác nhau về thuật ngữ này. Có thể định nghĩa một cách ngắn gọn thuật ngữ này nhƣ sau “Bioinformatics là sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và công nghệ thông tin với mục tiêu giúp hiểu biết và khám phá những nguyên lý trong sinh học” (theo trang web NCBI). [7, 22] Công nghệ sinh học Bioinformatics: giúp hiểu biết và khám phá những nguyên lý trong sinh học Hình 1.1 Định nghĩa Bioinformatics theo NCBI. Công nghệ tin học 2 TOÁN HỌC KHOA HỌC MÁY TÍNH THỐNG KÊ SINH HỌC HÓA HỌC VẬT LÝ Bioinformatics Hình 1.2 Định nghĩa bioinformatics đƣợc mở rộng Thật vậy, sự kết hợp này đã giải quyết hàng loạt những nghiên cứu trong sinh học mà đòi hỏi thời gian khá dài hay khó có thể thực hiện bằng tay và mắt thƣờng đƣợc. Nhƣng định nghĩa trên chƣa hoàn toàn đầy đủ, vì bioinformatics không chỉ đơn thuần là sự kết hợp giữa công nghệ sinh học và công nghệ thông tin, mà là sự kết hợp của nhiều ngành khoa học khác nhau nhƣ toán học, thống kê, khoa học máy tính, sinh học, hóa học, vật lý,… Ngoài ra, sự kết hợp này có sự đan xen tƣơng hỗ với nhau. Vì thế, thành quả nghiên cứu mang lại của ngành học này không chỉ đóng góp cho sinh học mà còn cho các ngành khác. Một ví dụ rõ ràng nhất là trong qui trình nghiên cứu về hệ thần kinh của động vật, con ngƣời đã phát hiện ra neuron thần kinh và cách xung thần kinh đƣợc dẫn truyền các tính hiệu qua các tế bào thần kinh. Kết hợp với những tính toán vật lý, trí tuệ nhân tạo, những lý thuyết sinh học trên đƣợc áp dụng vào tin học, để hình thành một mạng tính toán (Neuron network). Một ví dụ khác là thuật giải di truyền (GA - Genetic Algorithm) giúp giải những bài toán gần đúng có tính chính xác cao, dựa trên lý thuyết tiến hóa trong sinh học của Darwin. Nhƣ vậy, sơ đồ trên cần đƣợc bổ sung nhƣ sau: 3 Hầu hết, các nhà tin – sinh học trên thế giới hiện nay đang phát triển bioinformatics theo hƣớng nhƣ định nghĩa ban đầu (theo trang NCBI) do công nghệ sinh học là ngành khoa học mũi nhọn của thế kỷ 21. Sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự, một số lƣợng lớn các gene hsp-70 và RT-RNaseH đã đƣợc giải trình tự. Những trình tự gene này đƣợc lƣu trữ trong CSDL sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj,… Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều thông tin khác nhau, không tập trung thành từng gene cụ thể nên khó có thể thực hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt Vì vậy, khóa luận đƣợc thực hiện với các mục tiêu lần lƣợt nhƣ sau. Một là xây dựng cơ sở dữ liệu (CSDL) về trình tự nucleotide và protein của 2 gene hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH (RT-RNaseH). Hai là dùng giao diện web để truy xuất thông tin về cơ sở dữ liệu và thực hiện việc chia sẻ thông tin đó. Để đạt đƣợc mục tiêu này, khóa luận cần đảm bảo thực hiện nội dung nhƣ sau: Dùng Perl script để thu nhận trình tự các nucleotide và protein của hai gene từ CSDL GenBank (NCBI cơ sở dữ liệu nucleotide). Xác định gene và protein của hai gene hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH (RT-RNaseH) trong genome hay ORF (Open Reading Frame) của virus. Tìm hiểu về mô hình dữ liệu quan hệ, sử dụng mô hình này vào việc lƣu trữ dữ liệu các trình tự nucleotide và protein của hai gene, tạo CSDL hai gene này. Dùng Perl script để chuyển tự động các dữ liệu vào CSDL. Sử dụng giao thức CGI kết hợp với ngôn ngữ lập trình Perl, để thiết kế trang web CSDL về hai gene hsp-70 và RT-RNaseH trên hai họ virus Closteroviridae và Caulimoviridae. 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. SƠ LƢỢC VỀ CƠ SỞ DỮ LIỆU 2.1.1. Định nghĩa [3, 8] Cơ sở dữ liệu (CSDL) là một tập hợp dữ liệu đƣợc tổ chức theo một cấu trúc chặt chẽ nhằm phục vụ cho nhiều mục tiêu khác nhau một cách có chọn lọc. Tập hợp dữ liệu sẽ đƣợc lƣu trữ trên các thiết bị lƣu trữ thông tin thứ cấp nhƣ băng từ, đĩa từ,… để thỏa mãn nhu cầu khai thác thông tin đồng thời của nhiều ngƣời sử dụng hay nhiều chƣơng trình ứng dụng với nhiều mục đích khác nhau. Nhƣ vậy, các đặc tính của một CSDL là: Tính nhất quán Tính toàn vẹn Tính tích hợp Tính chia sẻ Tính độc lập dữ liệu Tính an toàn Tính bảo mật 2.1.2. Hệ quản trị CSDL (Database Management System – DBMS) Là một hệ thống phần mềm cho phép các nhà phân tích và thiết kế CSDL cũng nhƣ ngƣời khai thác CSDL đƣợc thuận lợi trong quá trình định nghĩa, thao tác, truy xuất và quản lý dữ liệu. Hệ quản trị CSDL đầu tiên ra đời vào đầu những năm 60 dựa trên mô hình dữ liệu phân cấp và mô hình mạng. Năm 1976 đánh dấu sự ra đời hệ quản trị CSDL đầu tiên dựa trên mô hình quan hệ mang tên System-R. Đến những năm 90, bắt đầu xuất hiện các hệ quản trị CSDL dựa trên mô hình hƣớng đối tƣợng,… Tuy nhiên chúng vẫn dựa chủ yếu vào nền tảng là mô hình quan hệ. Hệ quản trị ODMG ra đời năm 1996 đƣợc coi là hệ quản trị thuần hƣớng đối tƣợng nhất. Hiện nay, một số hệ quản trị CSDL mạnh đang đƣợc đƣa ra thị trƣờng nhƣ Visual FoxPro, SQL-Server, Oracle,… 5 Một hệ quản trị cơ sở dữ liệu phải có khả năng giải quyết các vấn đề:  Tính chủ quyền của dữ liệu: đó là phải bảo đảm vấn đề an toàn dữ liệu và tính chính xác của dữ liệu.  Tính bảo mật và quyền khai thác thông tin của ngƣời sử dụng.  Tranh chấp dữ liệu: do có thể cùng một lúc có nhiều ngƣời cùng truy cập vào một nguồn tài nguyên dữ liệu với các mục đích khác nhau nên hệ quản trị CSDL phải có cơ chế ƣu tiên truy cập dữ liệu. Cơ chế ƣu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng cách cấp quyền ƣu tiên cho ngƣời khai thác (ngƣời đƣợc cấp quyền hạn ƣu tiên cao hơn thì đƣợc phép truy cập dữ liệu trƣớc) hay dựa vào thời điểm truy cập (ngƣời truy xuất trƣớc thì có quyền truy cập dữ liệu trƣớc).  Phục hồi dữ liệu khi có sự cố. 2.1.3. Các mô hình dữ liệu [2, 3] 2.1.3.1. Định nghĩa Mô hình dữ liệu là sự trừu tƣợng hóa thế giới thực, là sự biểu diễn dữ liệu mức quan niệm. Mô hình dữ liệu đƣợc phân loại dựa trên các cách tiếp cận dữ liệu khác nhau của các nhà phân tích, thiết kế CSDL. Mô hình dữ liệu hoàn toàn độc lập giữa hệ thống máy tính và cấu trúc dữ liệu. Hiện nay, có năm loại mô hình dữ liệu chính. Đó là:  Mô hình dữ liệu mạng: thập niên 60-70.  Mô hình dữ liệu phân cấp: thập niên 60-70.  Mô hình dữ liệu quan hệ: thập niên 80.  Mô hình dữ liệu thực thể kết hợp: thập niên 90.  Mô hình dữ liệu hƣớng đối tƣợng: thập niên 90. 2.1.3.2. So sánh các mô hình dữ liệu [2] Sự ra đời của mô hình dữ liệu quan hệ đã khắc phục đƣợc những khó khăn khi thiết kế và quản lí CSDL theo mô hình mạng và mô hình phân cấp.  Thứ nhất, mô hình mạng và mô hình phân cấp sử dụng nguyên lý chủ nhân – thành viên, cha – con rất khó khăn cho việc thiết kế, sắp xếp và sau khi thiết kế xong muốn sửa đổi rất phức tạp, hầu nhƣ phải làm lại từ đầu. Mô hình quan hệ tổ chức dữ liệu dƣới dạng bảng dễ hiểu và đơn giản hơn 6 trong việc thiết kế và sửa đổi sau này. Ngoài ra, việc thiết kế mô hình quan hệ hoàn toàn độc lập với hệ quản trị CSDL.  Thứ hai, các ngôn ngữ để tạo và thao tác các cấu trúc trong mô hình mạng và mô hình phân cấp rất khó sử dụng. Ví dụ khi sử dụng hệ quản trị IDMS đòi hỏi phải thông thạo về ngôn ngữ từ điển dữ liệu tích hợp và các trình biên dịch lƣợc đồ và lƣợc đồ con. Trong khi đó, các hệ quản trị theo mô hình quan hệ dễ sử dụng hơn vì sử dụng ngôn ngữ truy vấn dữ liệu ở mức độ cao nhƣ SQL,… Do những ƣu điểm trên CSDL quan hệ ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp, mô hình quan hệ trở nên không thích hợp, nhất là khi sử dụng nó để thể hiện những dữ liệu có quan hệ cấu trúc nhƣ cây hệ thống sinh học. đối với những loại dữ liệu loại này, sử dụng mô hình dữ liệu hƣớng đối tƣợng là thích hợp nhất. Khi một CSDL đƣợc xây dựng xong, thì việc tiếp theo là làm sao để có thể truy xuất thông tin từ CSDL này, nghĩa là ngƣời dùng có thể nhận đƣợc các thông tin mà họ cần hay có thể bổ sung thêm một vài thông tin qua một giao diện thân thiện. Hơn thế nữa, ngƣời dùng còn muốn chia sẻ thông tin với các nơi khác. Để thực hiện đƣợc điều đó, ngƣời ta thƣờng chọn giao thức CGI, hiển thị những đòi hỏi thông tin về CSDL của ngƣời dùng thông qua dịch vụ web. 2.2. NGÔN NGỮ LẬP TRÌNH PERL, MẠNG INTERNET VÀ WEB 2.2.1. Perl [19] 2.2.1.1. Tóm tắt lịch sử phát triển Perl là chữ viết tắt của “Practical Extraction and Report Language”. Larry Wall tạo ra ngôn ngữ Perl năm 1986 nhằm quản trị và cấu hình các mạng máy tính lớn. Ngôn ngữ này phát sinh từ ngôn ngữ lập trình C và bị ảnh hƣởng bởi ngôn ngữ khác nhƣ BASIC, awk, sed và UNIX shell. Năm 1987, Perl 1.0 ra đời. Năm 1988, Perl 2.0 phát hành và đƣợc các nhà quản trị UNIX sử dụng rộng rãi. 7 Năm 1989, Perl 3.0 ra đời, nhƣng phiên bản này đƣợc phát hành dƣới bản quyền đƣợc bảo vệ của GNU. Với phiên bản này Perl nhanh chóng trở thành tiêu chuẩn để viết CGI script dùng cho việc xử lý dữ liệu đƣợc gửi trên Internet. Năm 1991, phiên bản 4.0 đƣợc đƣa ra vào tháng 3. Đến thời điểm này, Perl đã trở thành ngôn ngữ khá hoàn chỉnh mặc dù vẫn còn một số khuyết điểm nhỏ. Năm 1994, phiên bản Perl 5.0 ra đời cùng với sự ra đời của DBI (Database Interface) và DBD (Datadbase Driver) cho hệ quản trị CSDL Oracle của Tim Bunce. Từ đó, các DBD của các hệ quản trị CSDL khác cũng dần xuất hiện. Năm 2000, phiên bản 5.6 xuất hiện vào tháng 3. Phiên bản này đã chuyển sang định dạng tiêu chuẩn và có sự hỗ trợ cả Unicode và UTF-8. Năm 2002, phiên bản Perl 5.8 ra đời cùng với nhiều cải tiến mới đƣợc bổ sung. 2.2.1.2. Ứng dụng [6] Perl đƣợc dùng để xử lý tập tin, truy cập dữ liệu và đƣợc dùng cho giao diện cổng chung (Common Gateway Interface – CGI), tiến hành tạo script của Microsoft Windows, tạo giao diện ngƣời dùng đồ họa (graphical user interface – GUI). Ƣu điểm: là ngôn ngữ dễ nắm bắt, thích hợp cho xử lý chuỗi và văn bản thuần túy, đƣợc sự hổ trợ của nhiều hệ điều hành. Vì vậy, Perl là ngôn ngữ lập trình thích hợp cho các nhà tin – sinh học vì nó có thể giúp cho việc thao tác trên các chuỗi trình tự sinh học, tạo CSDL sinh học dễ dàng hơn. Ngoài ra, Perl còn đƣợc sự hỗ trợ module (tập các hàm) giúp kết nối, truy xuất CSDL với trang Web, tạo ra trang web động. Nhƣợc điểm: chỉ có thể dùng để viết các chƣơng trình, script nhỏ. 2.2.1.3. Một số module của Perl thƣờng đƣợc sử dụng [20, 21] Mudule CGI (Common Gateway Interface – CGI) của Perl: do Lincoln D. Stein viết và bổ sung, nâng cấp thêm các tính năng từ version 1.44 đến version 3.04. Module này gồm các hàm giúp viết kịch bản Perl theo giao thức CGI. Các script này giúp lấy thông tin từ trình diệt khách gởi đến máy chủ, đƣa vào chƣơng trình sử lý và đƣa lại thông tin kết quả đến máy khách. Module DBI (Database Interface) của Perl: là tập các hàm, biến và những qui ƣớc cần thiết cho việc tƣơng tác với một CSDL nhất định thông qua Perl script, hoàn toàn độc lập với hệ quản trị CSDL (do tác giả của DBI, Tim Bunce, định nghĩa). 8 Những tƣơng tác có thể nhập, nâng cấp, xử lý, rút trích,…dữ liệu vào hay ra khỏi CSDL. Phiên bản hiện tại là 1.48. Module DBD (Datadbase Driver) của Perl: là một module phụ thuộc loại hệ quản trị CSDL và liên kết với module BDI để truy cập vào một loại hệ quản trị CSDL nhất định. Nhƣ vậy tƣơng ứng với một hệ quản trị CSDL có một loại DBD. Ví dụ nhƣ hệ quản trị MySQL có Database Driver là DBD::MySQL. 2.2.2. Giới thiệu về mạng Internet [2] 2.2.2.1. Tóm lƣợc lịch sử phát triển Năm 1957, Bộ quốc phòng Mỹ thành lập cơ quan nghiên cứu các dự án kỹ thuật cao ARPA (Advanced Research Projects Agency), thuộc một bộ phận trong bộ quốc phòng. Chỉ một thập niên sau, năm 1969, ARPA thiết lập mạng ARPANET – tiền thân của Internet ngày nay. ARPANET là một mạng máy tính nối bốn máy chủ tại các trƣờng đại học California – Los Angeles, đại học California – Santa Barbara, viện nghiên cứu Standford và đại học Utah lại với nhau. Từ năm 1969 đến 1986, số lƣợng máy chủ tăng lên khoảng năm ngàn. Đến năm 1973, mạng xuyên quốc gia đầu tiên đƣợc thiết lập giữa hai nƣớc Anh và Na Uy. Năm 1982, giao thức TCP/IP ra đời và nhanh chóng trở thành giao thức chuẩn. Internet dần dần đƣợc phát triển và đột phá từ khi có sự ra đời của dịch vụ WWW (World Wide Web). Và từ đây, Internet đƣợc mở rộng sử dụng cho các ngành nghiên cứu khác và trở thành một công cụ có mụch đích thƣơng mại. P E R L S C R I P T D B I S w it c h DBD DBD DBD RDBMS RDBMS RDBMS Hình 2.1 Tƣơng tác giữa Perl script-DBI-DBD-và RBDMS RDBMS (Relational Database Management Systems): hệ quản trị CSDL quan hệ 9 2.2.2.2. Một số khái niệm Internet là một mạng toàn cầu, kết nối các mạng máy tính theo cùng một giao thức chung TCP/IP. Giao thức là cách thức đóng gói, mã hóa dữ liệu truyền trên đƣờng mạng và các qui tắc để thiết lập và duy trì quá trình trao đổi dữ liệu. Giao thức TCP/IP là giao thức dùng cho hệ mạng Internet/Intranet. 2.2.3. Web [2, 4] 2.2.3.1. Tóm lƣợt lịch sử phát triển Năm 1991, WWW đƣợc phát triển đầu tiên ở Thụy Sỹ và trở thành dịch vụ thông dụng trên mạng Internet. Tim Berners – Lee và các cộng sự tại phòng thí nghiệm Vật lý Phân tử Châu Âu đã phát minh ra giao thức truyền thông trên cơ sở các thông tin dạng siêu văn bản (Hypertext). Từ đó, một loạt các thuật ngữ lần lƣợt ra đời nhƣ webServer, webClient, webPage, webSite, URL: WebServer: máy cung cấp thông tin dạng web. WebClient: máy truy xuất thông tin từ web server. WebSite: tập hợp các trang web của một tổ chức, một website có thể có nhiều web server. WebPage: một trang tự liệu web. URL (Uniform Resource Locator) đƣờng dẫn chỉ đến một tập tin trong một máy chủ trên Internet. Để truy xuất các thông tin trên web server, các web client phải sử dụng một chƣơng trình để duyệt các thông tin này gọi là web browser. Đến năm 1993, trung tâm ứng dụng siêu máy tính quốc gia NCSA (National Center Supercomputer Application) xây dựng trình duyệt web, có tên là Mosaic, đầu tiên có giao diện đồ họa. Năm 1995, đánh dấu sự ra đời của trình duyệt Netscape và sau đó là Microsoft Internet Explorer. Các trình duyệt này cho phép truy xuất dữ liệu khu trú trên máy WWW. Hai công cụ hỗ trợ WWW là ngôn ngữ đánh dấu siêu văn bản HTML (Hypertext Markup Language) dùng để tạo ra các trang web và giao thức truyền siêu văn bản HTTP (Hypertext Transfer Protocol). 10 Tuy nhiên, các trang web này chỉ là những trang web tĩnh. Khi nhu cầu trao đổi thông tin ngƣời sử dụng và các nhà cung cấp thông tin ngày càng tăng, các trang web động dần dần thay thế các trang web tĩnh. Trang web động là trang web đƣợc tạo ra để đáp ứng các dữ liệu nhập vào của ngƣời dùng trực tiếp hay gián tiếp và trả lại kết quả thông qua sự tƣơng tác với hệ thống CSDL. Có nhiều kỹ thuật đƣợc dùng để tích hợp CSDL với web để tạo ra trang web động nhƣ CGI, PHP, ASP, JSP, Coldfusion. Trong đó:  CGI (Common Gateway Interface): là kỹ thuật ra đời sớm nhất và đƣợc các nhà tin – sinh học sử dụng. Cụ thể CGI đƣợc định nghĩa là một cách thức mà web server chạy một chƣơng trình một cách cục bộ và trả lại kết quả thông qua máy server về trình duyệt web (ở máy client) của ngƣời dùng yêu cầu nội dung động. Nhiều ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng để viết CGI nhƣ Perl, C, C++.  ASP (Active Server Page): là kỹ thuật của Microsoft sử dụng Visual Basic hay các ngôn ngữ khác để viết, thƣờng chỉ ứng dụng trên hệ điều hành Windows.  JSP (Java Server Page): là thuật ngữ dùng Java để viết, có thể chạy trên các hệ điều hành nhƣ Unix, Linux, Windows, Mac,…  PHP (Hypertext Preprocessior): là dự án của Apache Software Foundation. Tƣơng tự nhƣ ASP và JSP, PHP có một tập các thẻ mã chƣơng trình đặt bên cạnh các thẻ HTML. 2.2.3.2. Tích hợp CSDL với web dùng CGI [2] Gồm ba bƣớc: Bƣớc 1: từ trình duyệt web (trên máy client) gởi đi những yêu cầu của ngƣời dùng đến máy server. Ở máy server, thông qua trình ứng dụng CGI chuyển những yêu cầu đó thành những câu truy vấn SQL. Bƣớc 2: kết nối CSDL, thực hiện những câu truy vấn đó. Bƣớc 3: thu lấy kết quả truy vấn, thông qua trình ứng dụng CGI chuyển kết quả thu đƣợc từ CSDL thành định dạng HTML, rồi trả về máy client. 11 NLM NCBI NIH Hình 2.2 Tƣơng quan giữa NCBI, NLM (National Library of Medicine và NIH) 2.3. CƠ SỞ DỮ LIỆU SINH HỌC Dữ liệu sinh học ngày càng tăng theo cấp số mũ qua các dự án giải trình tự bộ gene, do sự phát triển của kỹ thuật và thiết bị thí nghiệm nhƣ kỹ thuật DNA micro array, kỹ thuật giải trình tự tự động cho phép tạo ra hàng ngàn dữ liệu sinh học trong chốc lát. Nhƣ vậy vấn đề đặt ra là cần phải có biện pháp lƣu trữ, quản lý, sử dụng và chia sẽ nguồn dữ liệu này. Do đó cần xây dựng các dữ liệu này thành một CSDL hoàn chỉnh để có thể thực hiện đƣợc mục đích trên. Hơn thế nữa, với việc hệ thống hóa toàn bộ dữ liệu trên, chúng ta dễ dàng thực hiện việc chia sẽ những thông tin ấy qua mạng Internet hay kết nối thêm vào những tập dữ liệu ở nơi khác. Một số CSDL lớn, trực tuyến đã đƣợc xây dựng để cung cấp thông tin cho các nhà nghiên cứu sinh học nhƣ NCBI, EBI, SIB, DDBJ,… 2.3.1. NCBI (National Center for Bioinformatic Information) [22] 2.3.1.1. Vài nét về NCBI NCBI là chữ viết tắt của “Center for Bioinformatic Information”. Đây là trung tâm quốc gia về Công nghệ sinh học, thuộc viện sức khỏe quốc gia của Hoa kỳ (NIH – National Insitute of Health). NCBI chính thức đƣợc thành lập vào ngày 4/10/1988. Đến năm 1991, NCBI đảm nhiệm việc quản lý CSDL trình tự DNA và từ đó NCBI còn đƣợc gọi là GenBank. NCBI là nơi cung cấp, trao đổi thông tin về sinh học phân tử của Mỹ, thông qua những CSDL trực tuyến. Ngoài ra, NCBI còn tham gia những nghiên cứu về “sinh học tính toán” (computation biology), phát triển những công cụ phân tích dữ liệu bộ gene, protein,… 2.3.1.2. Một số cơ sở dữ liệu trong NCBI Nucleotide (GenBank): là CSDL về trình tự nucleotide. Protein: là CSDL về trình tự amino acid. Genome: trình tự toàn bộ genome của một số sinh vật. 12 Structure: hay còn có tên gọi là MMDB (Molecular Modeling Database) chứa cấu trúc ba chiều của những đại phân tử bao gồm cả protein lẫn những chuỗi nucleotide. Ngoài ra, NCBI còn một số CSDL khác. Chúng là các CSDL trung gian, đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của hai hay nhiều CSDL trên, hay do liên kết đến các CSDL khác. 2.3.1.3. Một số công cụ trong NCBI  Công cụ khai thác dữ liệu o Tìm kiếm thông tin sinh học dựa trên từ khóa có dạng văn bản: Entrez: chứa các phƣơng thức tìm kiếm nhƣ tìm kiếm dựa trên accession number, hay dựa theo tên sinh vật, tên gene, tên protein,… trên tất cả các CSDL đã đề cập ở phần 2.3.1.2. o Tìm kiếm trình tự tƣơng đồng: có phần mềm điển hình nhƣ: BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): có BLAST Homepage là nơi cung cấp thông tin hƣớng dẫn về BLAST, chƣơng trình BLAST,… Blink: nơi hiển thị kết quả bằng BLAST trên mọi protein có trong mọi CSDL protein Entrez. Network-client BLAST: client BLAST (blastcl3) có thể thâm nhập vào bộ máy BLAST của NCBI. Blastcl3 này có thể tìm kiếm tất cả các trình tự dƣới dạng file FASTA và tạo sự gióng cột một-nhiều trình tự, sau đó lƣu dƣới dạng file text hay HTML. Ngoài ra, blastcl3 còn có thể thực hiện việc tìm kiếm trên nhiều CSDL. Stand-alone BLAST: là phần mềm có thể tải về từ NCBI. Phần mềm này thực hiện việc tìm kiếm các trình tự tƣơng tự trên CSDL trình tự cục bộ. o Phân loại sinh vật: Taxonomy Browser: công cụ thực hiện việc tìm kiếm trên CSDL Taxonomy. Taxonomy BLAST: nhóm lại những kết quả có tỉ lệ tƣơng đồng khi thực hiện BLAST, tùy thuộc vào sự phân loại của chúng trong CSDL Taxonomy. TaxTable: tóm tắt kết quả sau khi thực hiện BLAST với CSDL Taxonomy và hiển thị mối quan hệ giữa sinh vật này với sinh vật khác bằng các biểu đồ màu. 13  Công cụ phục vụ cho việc góp trình tự protein, DNA, EST, STS, …lên NCBI Sequin: phần mềm này có thể tải về từ NCBI, hổ trợ cho việc tạo ra những file văn bản (chứa trình tự, tên tác giả, bài báo,…) có cấu trúc theo khuôn mẫu. Trong phần mềm này còn kèm theo một số công cụ nhỏ nhƣ công cụ tìm khung đọc mở, công cụ gióng cột trình tự,… phần mềm này thích hợp cho việc góp nhiều trình tự cùng một lúc.  NCBI còn tích hợp khá nhiều những công cụ, phần mềm phân tích trình tự DNA, protein nhƣ: BanklIt, ORF Finder, Electronic-PCR (e-PCR), VecScreen, Homologene, COGs, COGnitor, GEO, MGC, Clone Registry, CDD, LocusLink,… 2.3.2. EBI (European Bioinformatics Insiture) [23] 2.3.2.1. Vài nét về EBI EBI là viện Tin - sinh học của Cộng đồng chung Châu Âu, EBI đặt tại Welcome Trust Genome Campus nƣớc Anh, thành lập năm 1992. EBI bắt nguồn từ EMBL (European Molecular Biology Laboratory). EBML đƣợc thành lập năm 1980 tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử Heidelberg của Đức và đây là CSDL trình tự nucleotide đầu tiên của thế giới. EBI phục vụ cho việc nghiên cứu trong các lĩnh vực nhƣ sinh học phân tử, di truyền, y học, nông nghiệp,… bằng cách xây dựng, duy trì những CSDL chia sẻ trực tuyến thông tin cần thiết. Bên cạnh đó, EBI còn thực hiện những nghiên cứu trong lĩnh vực Tin-sinh học và sinh học phân tử tính toán. 2.3.2.2. Một số cơ sở dữ liệu trong EBI EMBL (European Molecular Biology Laboratory): còn đƣợc gọi là EMBL- BANK chứa CSDL về trình tự DNA, RNA. MSD (Macromolecular Structure Database): chứa thông tin cấu trúc của các đại phân tử sinh học nhƣ protein, DNA, RNA,… ArrayExpress: tích trữ nguồn dữ liệu về sự biểu hiện của gene dựa trên kỹ thuật microArray. TrEMBL (Translate EMBL): là cơ sở dữ liệu về protein. Do lƣợng trình tự này ngày càng nhiều và để quản lý tốt hơn, TrEMBL đã kết hợp với Swiss-Prot (CSDL 14 Cơ sở dữ liệu về protein của Thụy Sỹ đặt tại Genva Cơ sở dữ liệu về protein của trƣờng đại học Y Georgetown (Mỹ) Hình 2.3 Một số cơ sở dữ liệu trong EBI về trình tự protein của Thụy Sỹ), PIR (CSDL về protein của trƣờng đại học Y Georgetown, Hoa Kỳ) tạo thành CSDL UniProt. Ngoài ra, EBI còn một số CSDL khác. Chúng là các CSDL trung gian, đƣợc tạo thành từ sự kết hợp của hai hay nhiều CSDL trên, hay do liên kết đến CSDL khác 2.3.2.3. Một số công cụ hỗ trợ phân tích trình tự sinh học FASTA: Do Smith và Waterman tạo ra năm 1981, là chƣơng trình tìm kiếm những trình tự tƣơng đồng, có thể là trình tự DNA hay trình tự protein, trong CSDL đã chọn. BLAST: chủ yếu là phần mềm WU-BLAST (Washington University Bacis Local Alignment Tool version 2.0). Đặc điểm chính của công cụ này là tìm kiếm vùng trình tự tƣơng đồng nhanh chóng. ClustalW: là công cụ dành cho việc sắp gióng cột ở hai hay nhiều trình tự sinh học (cả protein và DNA), công cụ này cho ra kết quả có ý nghĩa sinh học cao. 15 2.3.3. SIB (Swiss Insitute of Bioiformatics) [32] Là viện Tin-sinh học của Thụy Sỹ đặt tại Genva, nơi cung cấp dịch vụ trên web chất lƣợng cao cho cộng đồng khoa học thế giới qua trang ExPASy (Expert Protein Analyis System). Một số CSDL trong ExPASy: SWISS-PROT: là CSDL protein, đƣợc thành lập năm 1986. Nhƣng kể từ năm 1987, SWISS-PROT liên kết với EBI. SWISS-2DPAGE (2-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis database): chứa dữ liệu điện di hai chiều từ protein của ngƣời, chuột, E.coli,… PROSITE: tích trữ về các họ protein có cùng chức năng. ENZYME (enzyme nomenclature): cung cấp thông tin về danh pháp của enzyme. SWISS-3DIMAGE: lƣu trữ hình ảnh chất lƣợng cao của các đại phân tử sinh học đã biết cấu trúc không gian ba chiều. 2.3.4. DDBJ (DNA Data Bank Japan) và PDBj (Protein Database Japan) [25] DDBJ là CSDL về trình tự DNA của Nhật Bản, chính thức đi vào hoạt động năm 1986, đặt tại viện di truyền quốc gia (NIG). Đến năm 2001, trung tâm thông tin về sinh học ở NIG đƣợc tổ chức lại với cái tên là CIB (Center Information Biology) kết hợp với DDBJ, viết tắt CIB/DDBJ. PDBj là CSDL của Nhật Bản, tích trữ dữ liệu về cấu trúc, chức năng protein. DDBJ của Nhật Bản, EMBL của Châu Âu, NCBI của Hoa Kỳ là ba CSDL về trình tự nucleotide lớn, mang tính chất toàn cầu và ba cơ sở dữ liệu này có sự hợp tác, trao đổi qua lại dữ liệu. Từ đó càng làm cho dữ liệu về trình tự nucleotide trở nên phong phú hơn. 16 Các tổ chức này đều xây dựng công cụ tìm kiếm trong CSDL của họ. Với NCBI là Entrez, EBI là SRS và CIB là getentry. Nhƣ vậy để có thể khai thác hiệu quả các CSDL này thì việc đầu tiên cần thực hiện là nắm vững các hoạt động của công cụ tìm kiếm (“search engines”) này. Ngoài ra, cũng có sự kết hợp của các CSDL protein trên thế giới để tạo ra một CSDL thống nhất wwPDB (world wide Protein Database). EB I GenBank DDBJ EMB L EMB L Entrez SRS getentry NIG CI B NCB I NI H •Submissions •Updates •Submissions •Updates •Submissions •Updates Hình 2.4 Ba cơ sở dữ liệu nucleotide (GenBank – EMB -DDB) và công cụ tìm kiếm tƣơng ứng. Hình 2.5 Sự hợp nhất của ba cơ sở dữ liệu MSD, PDBj, PDB 17 Bảng 2.1. MỘT SỐ CSDL SINH HỌC LỚN VÀ CÁC ĐỊA CHỈ WEB TƢƠNG ỨNG. STT Tổ chức Tên cơ sở dữ liệu Địa chỉ trang web 1 EBI ( ww.ebi.a c.uk/) EMBL-BANK TrEMBL MSD Ensembl ArrayExpress 2 NCBI ( ww.ncbi. nlm.nih. gov) OMIM GenBank Protein Genome MMDB Taxonomy dbSNP CDD Pubmed Cancer Chromosomes Chromosomes dbEST dbSTS DbGSS 18 Bảng 2.2. MỘT SỐ CSDL SINH HỌC LỚN VÀ CÁC ĐỊA CHỈ WEB TƢƠNG ỨNG (tiếp theo) 2.4. VIRUS CAULIMOVIRIDAE VÀ CLOSTEROVIRIDAE Giới thiệu chung [1] Bệnh hại do virus thực vật gây ra cho nền nông nghiệp rất lớn. Nhƣng xác định đúng tác nhân gây ra những thiệt hại này đối với từng loại cây trồng gặp nhiều khó khăn vì bệnh do virus gây ra thƣờng rất khó xác định, do kích thƣớc của chúng quá bé, do biến chuyển của quá trình gây bệnh thƣờng rất phức tạp và chịu ảnh hƣởng của nhiều điều kiện khác nhau. Ví dụ: Theo J.S.Hu và cộng sự, bệnh héo do virus (Mealybug wilt of pineapple- MWP) là bệnh gây thiệt hại ở nhiều khu vực trồng dứa trên thế giới. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng một yếu tố tiềm tàng liên quan đến bệnh là virus. Một dạng closterovirus hình que gấp khúc đƣợc phân lập từ những cây có triệu chứng MWP ở Hawaii. Tuy nhiên sau đó những tiểu phần closterovirus cũng đƣợc tìm thấy ở cả cây dứa có và không có thể hiện triệu chứng trên phạm vi thế giới. Virus liên quan đến bệnh héo ở dứa (PMWaV) thực chất là phức hợp của 2 loại virus PMWaV-1 và PMWaV-2. Vì tác nhân không biểu hiện ra ngoài không gây ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của dứa, để phát hiện phân biệt hai tác nhân này ở những cây không và có biểu hiện ra ngoài là rất khó khăn. STT Tổ chức Tên cơ sở dữ liệu Địa chỉ trang web 3 SIB ( asy.org) SWISS-PROT SWISS-2DPAGE PROSITE ENZYME SWISS-3DIMAGE CD40L 4 CIB/DDBJ DDBJ 5 Pdbj Pdbj 6 PDB PDB 7 wwPDB wwPDB 19 Trong đó: ORF I Movement protein ORF II Insect transmission factor ORF III ORF IV Capsid protein ORF V Protease, reverse transcriptase and RNaseH ORF VI Translational activator / Inclusion body protein ORF VII Unknown (dispensable) Hình 2.6 Tổ chức genome của virus CaMV (Caulimoflower mosaic virus) 2.4.1. CAULOMOVIRIDAE [29] 2.4.1.1. Khái quát Caulimoviriruse là họ virus thực vật có genome chứa dsDNA. Đƣợc chia ra làm năm nhóm gồm:  Caulimovirus (loài đặc trƣng: cauliflower mosaic virus).  Soymovirus (loài đặc trƣng: Soybean chlorotic mottle-like viruses).  Cavemovirus (loài đặc trƣng: Cassava vein mosaic-like viruses).  Tungrovirus (loài đặc trƣng: Rice tungro bacilliform-like viruses).  Badnavirus (loài đặc trƣng: Cammelina yellow mottle virus).  Petuvirus (loài đặc trƣng: Petunia vein clearing-like virus). Trong đó, Virion của các loài Caulimovirus, Soymovirus, Cavemovirus, Petuvirus có đƣờng kính khoảng 50 nm. Còn Tungrovirus và Badnavirus có chiều dài 110-400 và 130 nm, đƣờng kính khoảng 30-35 và 30-35 nm tƣơng ứng. Các loài trong họ có kích thƣớc genome khoảng 7,5-8 kb và tổ chức genome gồm 9 ORF (Open Reading Frame) trong ORF1 gồm có ORF1a và ORF1b). Sự sao mã genome của virus trong tế bào ký chủ phụ thuộc vào gene reverse transcriptase (gene này không chèn vào DNA của tế bào ký chủ trong quá sao mã và dịch mã) 20 2.4.1.2. Cấu tạo Virion có cấu trúc đơn giản gồm một lớp vỏ capsid. Viron không có áo (enveloped) bao bọc bên ngoài. Capsid có hình cầu hoặc dạng bacilliform. Ở dạng cầu có đƣờng kính khoảng 35-47.52-50 nm. Các lớp vỏ (shell) capsid của virion là tổ hợp của những màng đa, sự sắp xếp của capsomer không có sự phân biệt. Còn ở dạng bacilliform thì capsid có độ dài 130 nm hoặc 60-900 nm và có đƣờng kính 24-30-35 nm. 2.4.1.3. ĐẶC TÍNH SINH HỌC  Dãy ký chủ tự nhiên Ký chủ của virus liên quan đến Domain Eucarya.  Mối quan hệ vector và ký chủ trung gian Virus có thể đƣợc vận chuyển bởi một số nhân tố sau: vector, hạt, phấn hoa, sự cọ sát giữa hai ký chủ,…  Vùng phân bố Phân bố khắp nơi nhƣ châu Phi, Mỹ, Á,… 2.4.1.4. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ [18] Virus tấn công vào tế bào ký chủ thông qua các thụ thể trên màng, khi vào tế bào ký chủ tiến hành cởi bỏ lớp vỏ, phóng thích dsDNA vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Sợi dsDNA này tiến hành đi vào nhân của tế bào ký chủ, sau đó nó tiến hành nhân bản trong nhân và sao mã tạo mRNA dƣới sự tham gia của các enzyme của nhân và virus (DNA-dependent RNA polymerase). mRNA này từ nhân đi ra tế bào chất của tế bào ký chủ để thực hiện việc dịch mã. Các protein của sự dịch mã mRNA virus lại trở Hình 2.7 Hình thái virion của một số loài trong họ Caulimoviridae 21 Hình 2.8 Cơ chế nhân bản, sao mã và dịch mã vào tế bào ký chủ của virus dsDNA lại nhân, kết hợp với sản phẩm của quá trình nhân bản, để hình thành nên các virion, các virion này thoát khỏi nhân và cuối cùng ly giải ra khỏi tế bào ký chủ (Hình 2.8). 2.4.2. CLOSTEROVIRIDAE 2.4.2.1. Khái quát [12] Closteroviridae cũng là họ virus gây hại trên thực vật, có bộ genome là ssRNA và virion có hình dạng sợi tròn mảnh (flexuous rod-shaped virion), có độ dài khoảng 1250-2200 nm chứa một sợi sense dƣơng, kích thƣớc của một RNA sợi đơn khoảng 15,5-19.3 kb (Martelli và cộng sự, 2002). Đƣợc chia ra làm 3 nhóm gồm:  Ampelovirus (loài đặc trƣng: Grapevine leafroll-associated virus 3).  Closterovirus (loài đặc trƣng: Beet yellows virus).  Crinivirus (loài đặc trƣng: Lettuce infectious yellows virus). 2.4.2.2. Cấu tạo [30] Virion có cấu tạo đơn giản gồm có một lớp vỏ (capsid), không có lớp áo (enveloped) bao bên ngoài. Capsid của nó rất mảnh, có độ dài khoảng 650-900 hoặc 1200-2325 nm và có đƣờng kính khoảng 10-13 nm. 22 Hình 2.9 Hình thái virion của Citrus tristeza virus thuộc Closterovirus 2.4.2.3. Cơ chế xâm nhiễm và sao mã trong tế bào ký chủ [18] Thông qua các thụ thể trên màng của tế bào ký chủ, virus nhận biết và tấn công vào vào tế bào ký chủ để đi vào tế bào chất của tế bào ký chủ. Khi ở trong tế bào chất virus tiến hành sự hóa acid thể nhân (acidification of endosome) để tạo ra sợi single strand RNA sense (+). Ở trong tế bào chất, mRNA này có hai nhiệm vụ là:  Thực hiện việc dịch mã ra protein virus, protein này sau đó đƣợc biến đổi để hình thành nên các protein cấu trúc của virus  Sao mã genome của virus tiếp đó tạo nên sợi single strand RNA (ssRNA). Các protein cấu trúc đƣợc hình thành sẽ “gói” các ssRNA ở trên để hình thành các virion trong tế bào chất, sau đó ly giải màng tế bào ký chủ và phóng thích ra ngoài. (hình 2.10). Hình 2.10 Cơ chế nhân bản, sao mã và dịch mã vào tế bào ký chủ của virus (+)ssRNA 23 2.5. Gene Hsp-70 và Reverse transcriptase-RNaseH Mụch tiêu của khóa luận là xây dựng CSDL phục vụ cho việc phân biệt các loài trong họ hay phân biệt các họ với nhau thông qua phản ứng PCR phát hiện. Nên chúng tôi chỉ quan tâm đến vùng gene bảo tồn để tiến hành xây dựng CSDL. Mặc dù, trong hai họ virus này có nhiều gene bảo tồn, nhƣng sau khi tìm hiểu thông tin chúng tôi tiến hành xây dựng CSDL về hai gene hsp-70 và RT-RnasH với hai lý do sau: Thứ nhất, gene hsp-70 là gene quan trọng ở Closteroviridae khi tồn tại trong môi trƣờng sốc nhiệt và gene Reverse Transcriptase-RNaseH (RT-RNaseH) ở Caulimoviridae thuộc nhóm Retrovirus nên gene RT-RNaseH rất quan trọng cho quá trình hoàn thành chu kỳ sống của chúng trong tế bào ký chủ. Thứ hai, các thông tin về trình tự hai gene này đƣợc nghiên cứu, giải trình tự và đăng tải nhiều trên CSDL nucleotide của NCBI. 2.5.1. Gene Reverse transciptase-RnasH (RT-RNaseH) 2.5.1.1. Vị trí gene RT-RNaseH nằm trong genome [15, 16] Gene RT-RNaseH đây là tổ hợp của hai gene RT và RNaseH mã hóa cho enzyme reverse transcriptase và ribonuclease H (RNaseH) thuộc ORF5 trong tổ chức genome của Cauliflower mosaic virus. Đây là hai gene có mối quan hệ chặt chẽ trong quá trình thực hiện sao chép từ ssRNA sang dsDNA của quá trình tạo genome hoàn chỉnh của virus. Ngoài ra, trong ORF5 này còn chứa một số gene khác mã hóa cho một số polyprotein khác nhƣ aspartic protease, protein áo,… Còn một số thành viên khác thuộc giống Badnavirus thì gene này nằm trong ORF3. Gene RT-RNaseH bảo tồn trong họ mã hóa cho protein reverse transcriptase-RNaseH, đây là một trong những protein bảo tồn trong họ virus Caulimoviridae. 2.5.1.2. Chức năng của protein [31] Đối với các loài virus có tổ chức genome là dsDNA trong quá trình sao mã trong tế bào ký chủ, chúng sử dụng enzyme Reverse transcriptase-RNaseH để hoàn thành chu kỳ sao mã của chúng. Protein Reverse transcriptase-RNaseH có hai chức năng:  DNA polymerase: Trong chu kỳ sống của virus reverse transcriptase chỉ sao chép RNA. Nó sẽ sao mã cả khuân mẫu RNA và DNA sợi đơn. Trong cả hai trƣờng hợp này nó điều cần những primer RNA hoặc DNA để khởi đầu cho sự tổng hợp của nó. Hình 2.11 Vị trí gene RT-RNaseH nằm trong cấu trúc genome Cauliflower mosaic virus (CMV) 24 Hình 2.13 Vị trí gene hsp-70 nằm trong tổ chức genome của Beet yellows virus (BYV) Hình 2.12 Protein Reverse transcriptase  RNase H: là một ribonuclease, enzyme này có chức năng phân tách RNA từ những RNA-DNA lai, RNA-DNA lai này đƣợc hình thành trong quá trình sao mã ngƣợc của đoạn khuôn mẫu RNA. RNase H hoạt động có hai tính năng endonuclease và exonuclease trong quá trình phân tách RNA-DNA lai. 2.5.2. Gene hsp-70 2.5.2.1. Vị trí gene hsp-70 nằm trong genome [13, 17] Gene hsp-70 mã hóa cho enzyme HSP-70 thuộc ORF2 trong tổ chức genome (gồm có 9 ORF nằm trong 2 RNA là RNA1 và RNA2) và gene này thuộc RNA2 của họ Closteroviridae. Đây là gene bảo tồn trong họ và nhiều nghiên cứu tiến hành xây dựng cây phát sinh loài dựa trên gene này. 2.5.2.2. Chức năng [10] Protein HSP-70 (hình 2.14), trọng lƣợng phân tử 70 kD đƣợc mã hóa từ gene hsp-70 có vai trò quan trọng trong quá trình tồn tại của sinh vật trong môi trƣờng có sự thay đổi đột ngột về nhiệt độ. Ngoài ra, protein HSP-70 còn tham gia vào một số quá trình điều hòa quan trọng khác nhƣ: giúp sự hình thành cấu của protein, giúp di chuyển của virus qua các tế bào ký chủ,…Đây là protein bảo tồn trong họ. Hình 2.14 Protein HSP-70 25 PHẦN 3 PHƢƠNG PHÁP VÀ CHƢƠNG TRÌNH SỬ DỤNG 3.1. Các chƣơng trình và ngôn ngữ lập trình đƣợc sử dụng 3.1.1. Hệ điều hành: Windows XP (Microsoft). Xây dựng CSDL trình tự nucleotide, protein ở Caulimoviridae và Closteroviridae trên hệ điều hành này. 3.1.2. Các chƣơng trình phân tích trình tự 3.1.2.1. Chƣơng trình so sánh trình tự ClustalW [26] ClustalW là một phần mềm (chạy trên nền Dos) dùng để so sánh sự tƣơng đồng của hai hay nhiều trình tự sinh học (pairswise or mutiple alignment). ClustalW mô tả kết quả bằng hệ thống các kí hiệu làm nổi bậc những nét đặc trƣng trong những đoạn tƣơng đồng. ClustalW ngày càng trở nên hữu ích cho các nhà nghiên cứu trong việc tìm kiếm những vùng bảo tồn trên những trình tự DNA hoặc protein. Sự hiểu biết về mutiple alignment giúp ích rất nhiều cho các nhà khoa học trong việc dự đoán cấu trúc bậc hai, bậc ba của protein, đồng thời phát hiện sự tƣơng đồng giữa những đoạn gene (hoặc protein) vừa đƣợc giải trình tự với những gene (hoặc protein) đã tồn tại. ClustalW tiến hành so sánh tƣơng đồng nhiều trình tự sinh học qua ba giai đoạn: Đầu tiên chƣơng trình sử dụng thuật toán alignment xấp xỉ của Wilbur và Lipman năm 1983 để tính hệ số tƣơng đồng giữa mỗi cặp trình tự. Những hệ số tƣơng đồng tính đƣợc sẽ đƣợc sử dụng để thành lập cây phả hệ (“Guide tree” hay dendrogram) bằng phƣơng pháp UPGMA (Unwieghted Pair – Group Method) của Sneath và Sokal năm 1973. Cuối cùng các trình tự đƣợc so sánh với những nhóm trình tự lớn hơn và cứ thế tiếp tục. Ở mỗi giai đoạn so sánh này, ClustalW sẽ sử dụng thuật toán của Myers và Miller (1998) nhằm tối ƣu kết quả. ClustalW 1.83 đƣợc sử dụng trong khóa luận này, đƣợc tải về từ trang web ( 3.1.2.2. Chƣơng trình tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng – BLAST [27] BLAST là một chƣơng trình tìm kiếm và so sánh trình tự tƣơng đồng đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay. Thuật giải của BLAST xuất phát từ ý tƣởng “liệu trong ngân hàng dữ liệu (bao gồm cả CSDL cục bộ và những CSDL lớn trên thế giới 26 nhƣ GenBank, EMBL,…) có trình tự nào giống hoặc gần giống với trình tự đang quan tâm”. BLAST thực hiện so sánh trình tự nhập vào (có thể DNA hay protein) với những trình tự trong CSDL. Kết quả của BLAST là những số liệu thống kê chính xác về tỉ lệ tƣơng đồng và nguồn gốc các trình tự. Chiến lƣợc tìm kiếm trình tự tƣơng đồng trong BLAST đƣợc thực hiện qua ba bƣớc chính: Đầu tiên BLAST tìm kiếm những đoạn tƣơng đồng HSPs (High Scoring Pair) giữa một trình tự đƣa vào và mỗi trình tự trong CSDL. Công việc tiếp theo là thực hiện đánh giá ý nghĩa thống kê dựa trên bất cứ sự tƣơng đồng nào đƣợc tìm thấy. Sau cùng BLAST đƣa ra một báo cáo kết quả giống nhau thỏa mãn ngƣỡng giá trị mà ngƣời dùng mong muốn. Stand-alone BLAST version 2.28 là phiên bản đƣợc sử dụng trong khóa luận này, có thể dễ dàng tải về từ địa chỉ web của trang CSDL NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov.blast/executables/). 3.1.2.3. Hệ quả trị CSDL quan hệ MySQL[33] MySQL là một hệ quản trị CSDL quan hệ nguồn mở phổ biến nhất, dƣới sự phát triển, phân phối và bảo vệ bởi MySQL AB (MySQL AB là một công ty thƣơng mại). Phần SQL của MySQL đƣợc viết tắt từ chữ ”Structured Query Language''. SQL là một ngôn ngữ chuẩn đƣợc dùng phổ biến để xây dựng CSDL và đƣợc công nhận bởi cơ quan tiêu chuẩn SQL là ANSI/ISO công nhận (phiên bản chuẩn của SQL ra đời từ năm 1986 và cho đến nay thì có rất nhiều phiên bản đã tồn tại, “SQL:2003” là phiên bản chuẩn ra đời vào giữa năm 2003, phiên bản này có nhiều ƣu điểm so với các phiên bản trƣớc đó). Xuất xứ của tên MySQL không rõ. Tiền tố My của MySQL chỉ xuất hiện cách đây khoảng 10 năm nay, có lẽ nó đƣợc lấy từ tên con gái của Monty Widenius (ngƣời đặt nền móng cho sự phát triển của MySQL). MySQL đƣợc viết dựa trên ngôn ngữ C và C++, hoạt động trên nhiều hệ điều hành khác nhau. Phiên bản mới nhất của MySQL là MySQL 5.0. Ƣu điểm.  Dể sử dụng.  Mã nguồn mở. 27  Thích hợp cho việc xây dựng CSDL vừa và nhỏ. Nhƣợc điểm:  Không thích hợp cho việc xây dựng CSDL lớn. Phiên bản MySQL 4.0.15 đƣợc sử dụng trong khóa luận này. 3.1.2.4. Apache web Server [28] Trên thế giới hiện nay có rất nhiều trình chủ web hỗ trợ CGI và một trong số đó là Apache web Server. Apache web Server là một trình chủ web đƣợc nhiều ngƣời dùng nhất hiện nay trên Internet. Theo số liệu thăm dò của NetCraft, có trên 60% trình chủ web đang đƣợc sử dụng trên Internet hiện nay là sử dụng Apache web Server. Sở dĩ Apache có đƣợc một vị trí đáng nể nhƣ thế là nhờ vào việc nó là một chƣơng trình mã nguồn mở và hoàn toàn miễn phí. Hai ƣu điểm này đã giúp Apache đƣợc yêu thích đối với những công việc vừa và lớn của nhiều công ty trên thế giới. Hơn thế, Apache hoạt động ổn định, an toàn và đáng tin cậy. Chỉ trong thời gian 5 năm qua, Apache đã trở thành một trình chủ web có chức năng tƣơng đƣơng, thậm chí còn vƣợt trội so với nhiều trình chủ web thƣơng mại khác. Một trong những điểm mạnh của Apache là khả năng nâng cấp trình chủ web thông qua các module. Có 2 loại module trong Apache đó là external module và internal module. Cả hai loại module này điều có thể đƣợc sửa chữa, thay thế hoặc nâng cấp vì chúng có kèm theo mã nguồn mở. Khi một yêu cầu từ trình tự khách đƣợc gởi đến Apache phải trải qua một loạt nhiều giai đoạn sử lý để cuối cùng trả về kết quả cho ngƣời dùng. Apache có một chế độ bảo mật đáng tin cậy. Quy trình làm việc của Apache cho phép ngƣời dùng thêm mới những module cần thiết vào bất kỳ giai đoạn nào của quá trình xử lý. Apache 1.3.24 là phiên bản đƣợc sử dụng trong khóa luận này, có thể tải phiên bản này từ địa chỉ ( 3.1.2.5. Ngôn ngữ lập trình Perl và các gói sử dụng Trình dịch phiên bản Perl phiên bản 5.6 DBI, DBD::MySQL, CGI.pm DBI: version 1.37 DBD::MySQL version 2.9002 28 Dùng Perl script tải về lấy tất cả các trình tự có ACCESSION NUMBER của hai gene RT-RNaseH và hsp-70 Từ khóa Tách lấy ACCESSION NUMBER NCBI Toàn bộ thông tin về trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận trình tự CGI.pm version 2.752 Các gói này đƣợc cài đặt thông qua ppm trong Perl. 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1 Thu nhận trình tự Trình tự nucleotide và protein của hai gene hsp-70 (heat sock protein 70) và RT-RNaseH (Reverse transcriptase-RNaseH), dùng để tạo CSDL đƣợc thu nhận từ trang CSDL NCBI. Sơ đồ tóm tắt quá trình thu nhận nhƣ sau: Các bƣớc thực hiện tuần tự theo sơ đồ sau: Từ khóa sử dụng là: “Caulimovirus[ORGANISM]reverse transcriptase-RNaseH[GENE]” “Badnavius[ORGANISM]reverse transcriptase-RNaseH[GENE]” “Soymovirus[ORGANISM]reverse transcriptase-RNaseH[GENE]” “Cavemovirus[ORGANISM]reverse transcriptase-RNaseH[GENE]” 29 Tách lấy tất cả các trình tự Thực hiện sắp gióng cột từng cặp trình tự gene (trên cùng loài) tƣơng ứng Sau đó ta xác định vị trí của gene trong ORF hay genome thông qua trình tự gene đã biết Hình 3.2 Sơ đồ xác định gene trong ORF hay genome virus Lƣu trữ các trình tự trên vào CSDL Trình tự của gene RT- RNaseH trong ORF hay genome từ NCBI Trình tự gene RT-RNaseH đã biết đƣợc thu nhận từ NCBI Viết chƣơng trình Perl script để tách lấy các gene đã đƣợc xác định vị trí ở trên “Tungrovirus[ORGANISM]reverse transcriptase-RNaseH[GENE]” “Petuvirus[ORGANISM]reverse transcripte-RNaseH[GENE]” “Ampelovirus[ORGANISM]hsp-70[GENE]” “Closterovirus[ORGANISM]hsp-70[GENE]” “Crinivirus [ORGANISM]hsp-70[GENE]” 3.2.2. Xác định gene và protein trong bộ gene virus Sau khi khảo sát các mẫu tin về trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH trên hai họ virus chúng tôi nhận thấy toàn bộ mẫu tin gene hsp-70 và chỉ có một số mẫu tin của gene RT-RNaseH đƣợc xác định vị trí rõ trong ORF hay genome, nên chúng tôi chỉ cần viết chƣơng trình perl script để tách chúng (thông qua vị trí đã biết). Còn đối với có một số mẫu tin chứa gene RT-RNaseH chƣa biết vị trí chúng tôi tiến hành thu nhận gene này theo sơ đồ sau: 30 Các bƣớc thực hiện Bƣớc 1: thu nhận trình tự gene về gene RT-RNaseH đã biết và chƣa biết (các mẫu tin chứa toàn bộ genome hay ORF). Để xác định đƣợc vị trí của một gene trong các gene khác trong ORF hay genome của virus, phải thông qua các trình gene đã biết thu nhận đƣợc. Từ đó, thông qua trình tự gene đã biết này ta xác định vị trí của gene RT- RNasH nằm trong genome hay nằm cùng với các gene trong ORF của virus. Bƣớc 2: tách các trình tự gene trong các file text tải về từ NCBI có chứa gene mong muốn, nằm cùng với các gene khác trong ORF hay genome. Các trình tự sau khi rút trích đƣợc lƣu vào file dƣới dạng FASTA (Hình 3.3), đây là một trong những dạng file mà ClustalW có thể nhận dạng đƣợc. Bƣớc 3: thực hiện sắp gióng cột trình tự gene đã biết ở trên với trình tự nuleotide trong ORF hay genome của virus, bằng công cụ ClustalW. Thông qua kết quả của sắp gióng cột (Hình 3.4), ta có thể xác định vị trí của gene trong genome của virus, do tính bảo tồn cao nên kết quả của sắp gióng cột có độ tƣơng đồng rất cao. >AY186615 agccatattt caaagaaaaa tggactcggt attcaaaggg tgtgaaaaat tcctcgctgt ttatattgat gatattctgg tattttctaa caatgaggaa gatcatgcaa aacacctgac tatcatgcta caactgtgta aagaacatgg tcttgttctt tcacccacca agatgaatat tgcagtcaaa gaagttaatt ttctcggagc tactattggc agcagaaaag taaagctcca ggaaaatatt attaagaaga tccttgactt caatgaagaa aatcttcaat caaagaaggg tcttcggtca ttcttgggaa ttctcaacta tgcccgaaat catattccta atctcgggaa aatagctggt cctctttatt ctaagacttc cgtctatggt gatatcaggt tttcagcatc tgattggaag cttattaaag agatcaaggc tattgtggag aagctcccac cgcttgatta tccaccagag caagcataca tcattattga atctgatggc tgtatggat >NC_007002 tggtgctgaa aagaaaggca aagaacgtct tgtcttcaat tataaaaggc ttaatgacaa tactgaaaag gatcagtatt ccttacctgg gataaacaca atcatagcta gaatcagcca ttcaaaaata tattctaaat ttgacttgaa gagcggtttt catcaagtag ctatggagga ggaatctatc ccatggacgg ccttttgggc tattaacggg ttatacgaat ggctcgtaat gccgtttggt ctgaagaacg cacctgccat atttcaacga aagatggaca actgcttccg aggtacagaa aaatttatag ctgtttacat agatgatatt ctaatctttt cagatagcaa ggaagcccat cgaacccatc tcagacaatt catcaccata tgtgaagaaa atgggctggt actaagccca acgaagatga agataggagt ccaacaagtg gatttcttgg gtgcaaccat tggcgattct aaagtaaggc ttcagcctca catagtcaaa aaagtgctag aaacaaagga agaaagcctg tctgaaacga aggccttaag aagatggtta ggcatactca attatgccag agcatatatt cctgatcttg gaaaaatcct aggtccctta tactcaaaaa cctcaggaaa aggggagcga aaactcaatc accaagacat gaagataatt caccagatca aggaaaaggt aaaaaatctc cctgaattag aggttcctcc accagagtcc atcatactaa ttgaaacaga cggatgtatg gatggttggg gtggcatttg caaatggaag ttaaacaaag gggaaccccg atccgctgaa aagatctgtg cttatgcaag tggacgtttc aaccccatca aaggagctat tgacgctgaa atacaggctg ttatctacag tctagaaaaa tttaagatct actatcttga caaaagggag cttattttaa gaactgacag caaggcaatt gtcaggttct acgaaaaatg (…) ttcagaacac aaaccctctc gtgtccgatg gatgactcta actgactaca tctcgggatg cggagtcaag gtatattttg aacacatcga tggaaaagat aatacacttg cagacgaact atcacgactt gttcaagcaa ttctcatcaa caaagaagaa tctcctataa tactatctct aatcaaagca acaacggagg tattacaaaa ggaaaatcct atttccagga gtagattagc tctatgcatt tccagagcac tgg taacaa atatcaagtc aatttcatga cttgggaaca accccagctg aagtgtgcct gtggagaaaa tgccgtactc cttacttcac ataccagccg aaatccag a cggag ttct atagatgtgg taccaaca t tgtcatgta ggtactgg c tgatctaatc gaagattata ttgcgcaact tagcaatctt cagaatcttg actcaggaca (…) agcagatgat gaaggatggg cctatcaaac agaagatctg atcaacccag aagatctggc caactccgac atagacgacc ctccagaaga ctcaggacta ttccaccgac atgatgacta aggcggacgt ggtggaccca gcaataatta aggaatccaa ttccttactt caccaggttc attattaaag agcctttaca gctcataccc ttattaataa tgttggtgct tgtactattg (…) Hình 3.3 Định dạng FASTA để thự hiện sắp gióng cột h i trình tự 31 Từ các thông số hiển thị trong bản kết quả của ClustalW ta có thể xác định vị trí của gene thông qua các vị trí đƣợc biết này ta viết chƣơng trình Perl script để tách lấy trình tự gene mong muốn. Sau đó các trình tự này đƣợc đƣa vào CSDL Khi thu nhận mẫu tin trình tự gene thì chúng đồng thời chứa luôn trình tự protein của gene đó. Nên chúng tôi tiến hành thu nhận trình tự protein với các bƣớc đã đƣợc thực hiện để thu nhận đƣợc một trình tự gene. (…) NC_007002 GCCGTTTGGTCTGAAGAACGCACCTGCCATATTTCAACGAAAGATGGACAACTGCTTCCG AY186615 ------------------------AGCCATATTTCAAAGAAAAATGGACTCGGTATTCAA ************ **** ****** *** NC_007002 AGGTACAGAAAAATTTATAGCTGTTTACATAGATGATATTCTAATCTTTTCAGATAGCAA AY186615 AGGGTGTGAAAAATTCCTCGCTGTTTATATTGATGATATTCTGGTATTTTCTAACAATGA *** ******** * ******** ** *********** * ***** * * * NC_007002 GGAAGCCCATCGAACCCATCTCAG-ACAATTCATCACCATATGTGAAGAAAATGGGCTGG AY186615 GGAAGATCATGCAAAACACCTGACTATCATGCTACAAC-TGTGTAAAGAACATGGTCTTG ***** *** ** ** ** * * ** * ** * * *** ***** **** ** * NC_007002 TACTAAGCCCAACGAAGATGAAGATAGGAGTCCAACAAGTGGATTTCTTGGGTGCAACCA AY186615 TTCTTTCACCCACCAAGATGAATATTGCAGTCAAAGAAGTTAATTTTCTCGGAGCTACTA * ** ** ** ******** ** * **** ** **** **** * ** ** ** * NC_007002 TTGGCGATTCTAAAGTAAGGCTTCAGCCTCACATAGTCAAAAAAGTGCTAGAAACAAAGG AY186615 TTGGCAGCAGAAAAGTAAAGCTCCAGGAAAATATTATTAAGAAGATCCTTGACTTCAATG ***** ******* *** *** * ** * ** ** * ** ** ** * NC_007002 AAGAAAGCCTGTCTGAAACGAAGGCCTTAAGAAGATGGTTAGGCATACTCAATTATGCCA AY186615 AAGAAAATCTTCAATCAAAGAAGGGTCTTCGGTCATTCTTGGGAATTCTCAACTATGCCC ****** ** ** ***** * * ** ** ** ** ***** ****** NC_007002 GAGCATATATTCCTGATCTTGGAAAAATCCTAGGTCCCTTATACTCAAAAACCTCAGGAA AY186615 GAAATCATATTCCTAATCTCGGGAAAATAGCTGGTCCTCTTTATTCTAAGACTTCCGTCT ** ******** **** ** ***** ***** * ** ** ** ** ** * NC_007002 AAGGGGA-GCGAAAACTCAATCACCAAGACATGAAGATAATTCACCAGATCAAGGAAAAG AY186615 ATGGTGATATCAGGTTTTCAGCATCT-GATTGGAAGCTTATTAAAGAGATCAAGGCTATT * ** ** * * * ** * ** **** * *** * ********* * NC_007002 GTAAAAAATCTCCCTGAATTAGAGGTTCCTCCACCAGAGTCCATCATACTAATTGAAACA AY186615 GTGGAGAAGCTCCCACCGCTTGATTATCCACCAGAGCAAGCATACATCATTATTGAATCT ** * ** ***** * ** *** *** * * *** * ****** * NC_007002 GACGGATGTATGGATGGTTGGGGTGGCATTTGCAAATGGAAGTTAAACAAAGGGGAACCC AY186615 GATGGCTGTATGGAT--------------------------------------------- ** ** ********* (…) Hình 3.4 Kết quả sắp gióng cột cặp trình tự gene RT-RNaseH (đã biết vị trí) với RT- RNaseH trong ORF hay genome của virus 32 3.2.3. Thiết kế CSDL trình tự gene và protein hsp-70 và RT-RNaseH 3.2.3.1. phân tích dữ liệu Các yêu cầu của dữ liệu Dữ liệu về trình tự nucleotide của gene hsp-70 và RT-RNaseH gồm có hai thực thể chính cần quan tâm: là Trình tự (Sequence) và Sinh vật (Organism). Nhƣ vậy, ta có thể xác định đƣợc sơ đồ đối tƣợng nhƣ sau: Đối tƣợng sinh vật cung cấp các thông tin về:  Tên sinh vật trong hai họ virus là Caulimoviridae và Closteroviridae.  Ký chủ nhạy cảm.  Ký chủ không nhạy cảm  Ký chủ trung gian.  Hình thể.  Đặc tính hóa lý và vật lý.  Vùng phân bố địa lý  Nucleic acid  Protein  Phƣơng pháp chẩn đoán. CSDL tham khảo của sinh vật nhƣ accession number, họ,… Đối tƣợng trình tự cung cấp các thông tin về:  Trình tự các gene hsp-70 và RT-RNaseH.  Trình tự các protein HSP-70 và RT-RNaseH tƣơng ứng với các trình tự nucleotide nói trên.  Tên của các trình tự nucleotide và protein trên.  Chiều dài của gene hsp-70 và RT-RNaseH. CSDL tham khảo của trình tự tác giả, bài báo,… Sinh vật Trình tự có Hình 3.5 Sơ đồ các đối tƣợng của CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH 33 Xác định các đối tƣợng phụ  Đối tƣợng Sinh vật (Organism): Các đối tƣợng phụ dựa trên thực thể Sinh vật đƣợc liệt kê trong bảng 3.1. Mối quan hệ của các đối tƣợng này là: một sinh vật có thể có nhiều gene, protein (mỗi trình tự thì chỉ có một số accession number) và một sinh vật có những đặc điểm (sinh lý sinh hóa, vùng phân bố,…) riêng biệt. Bảng 3.1 Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính Sinh vật (Organism) Tên đối tƣợng Ý nghĩa của đối tƣợng Thuộc tính Ý nghĩa của thuộc tính Organism Chứa các đặc điểm về các loài trong họ Organism_name Chứa tên của các loài trong họ Morphology Hình thể của virus Physicochemical_and_ph ysical properties Chứa các đặc tính hóa lý và vật lý Nucleic acid Mô tả về trạng thái DNA và kích thƣớc genome Protein Chứa sự mã hóa của virus cho các protein Symptom_and_host Chứa các triệu chứng virus gây ra cho ký chủ Susceptible_host Ký chủ nhạy cảm Insusceptible_host Ký chủ không nhạy cảm Transmission Ký chủ trung gian Geographic_distribution Chứa vùng phân bố của virus Diagnostic_and_method Phƣơng pháp chuẩn đoán Char Chứa các thông tin về quan hệ họ hàng Family Chứa họ virus genus Giống species Loài RNA_stage Trạng thái RNA Acc Chứa số truy cập trên NCBI Acc_no Các số truy cập 34  Đối tƣợng trình tự (Sequence) Các đối tƣợng dựa trên thực thể Sequence đƣợc liệt kê trong bảng 3.2 Mối quan hệ của các đối tƣợng này là một trình tự của đối tƣợng Sequence chỉ có một số accession number, một thông tin chung về trình tự đó. Nhƣng một trình tự có một hay nhiều tác giả cũng nhƣ một hay nhiều bài báo về trình tự đó. Bảng 3.2 Các đối tƣợng phụ dựa trên đối tƣợng chính Trình tự (Sequence) 3.2.3.2. Thiết kế CSDL dạng bảng Theo các mô tả trong mô hình đối tƣợng, ta chuyển từ mô hình đối tƣợng sang mô hình quan hệ nhƣ sau:  Mỗi đối tƣợng trong mô hình đối tƣợng là một quan hệ trong mô hình quan hệ.  Mỗi thuộc tính trong mô hình đối tƣợng là thuộc tính trên quan hệ tƣơng ứng.  Khóa của đối tƣợng là khóa của quan hệ tƣơng ứng. Tên đối tƣợng Ý nghĩa của đối tƣợng Thuộc tính Ý nghĩa của thuộc tính Gen_seq Chứa trình tự nucleotide Gen_name Chứa tên trình tự nucleotide Gen_seq Chứa trình tự nucleotide Length Chứa chiều dài của gene Pro_seq Chứa trình tự protein Pro_name Chứa tên protein Pro_seq Chứa trình tự protein Accession number Chứa số truy cập của các trình tự trong CSDL Acc_no Là các số truy cập NCBI Các thông tin chung cho trình tự Definition Định nghĩa của trình tự Locus Locus của trình tự Pubday Ngày công bố trình tự Author Các thông tin về tác giả giải trình tự và những bài báo của tác giả về các trình tự đó Author Tác giả của trình tự Paper Bài báo của tác giả về trình tự 35  Tạo các quan hệ nhƣ sau:  1:1 đặt khóa chính của quan hệ thứ nhất thành khóa ngoại của quan hệ thứ hai và ngƣợc lại.  1: n đặt khóa chính của quan hệ ở đầu một thành khóa ngoại của quan hệ ở đầu n. Ta có các bảng quan hệ và sơ đồ chi tiết của các bảng quan hệ (hình 3.7) này nhƣ sau:  organism_table(organism_id, organism_name, morphology, physicochemical, nucleic_acid, protein, symptom_and_host_range, susceptible_host, insusceptible_host, transmission, geographic_distribution, diagnostic_and_method).  char_table (char_id, family, genus, species, RNA_stage, organism_id)  acc_table (acc_id, acc_no, organism_id)  gen_seq (gen_id, gen_name, gen_seq, length, acc_id)  pro_table (pro_id, pro_name, pro_seq, acc_id)  ncbi_table (ncbi_id, definition, pubday, locus, acc_id)  author_table (author_id, author_name, paper, ncbi_id) Sau khi có các bảng quan hệ, ta thực hiện thiết kế các bảng này ở mức vật lý, nghĩa là đƣa vào hệ quản trị CSDL quan hệ MySQL bằng các ngôn ngữ truy vấn SQL nhƣ tạo CSDL, tạo bảng,… 3.2.3.3. Lƣu trữ các thông tin vào CSDL Sau khi CSDL đƣợc thiết kế ở mức vật lý, ta thực hiện việc đƣa các dữ liệu vào CSDL. Công việc này đƣợc thực hiện tự động cùng một lúc tất cả các quan hệ bằng Perl script và thông qua hai gói DBI, DBD::MySQL để kết nối với CSDL. Tuy nhiên, để việc trình bày này đƣợc mạch lạc rõ ràng, chúng tôi chia ra thành từng phần nhƣ sau: o Lƣu trữ các trình tự (chỉ có chứa trình tự gene và protein hsp-70 và RT- RNaseH), thông tin chung, tác giả, bài báo, definition, locus, tên sinh vật,…(các thành phần này đã có trong mẫu tin của NCBI). o Lƣu trữ các đoạn gene và protein RT-RNaseH, mà chúng nằm trong bộ genome hay các gene khác trong ORF (dữ liệu của phần này cần đƣợc xác định qua nhiều bƣớc và đã đƣợc trình bày ở phần 3.2.2) và các thông 36 tin khác (ký chủ, vùng phân bố, triệu chứng,…) đƣợc tham khảo và thu nhận từ các trang web trên Internet [21, 22]. Lƣu trữ các trình tự, thông tin chung, tác giả và bài báo,… Một mẫu tin về trình tự gene hsp-70 hay RT-RNaseH đƣợc trình bày nhƣ hình 4.2 ta có thể rút trích các thông tin để đƣa vào CSDL.  Trong phần LOCUS: ta lấy phần đầu “SPO010920“ cho vào trƣờng locus trong bảng ncbi_table, phần ngày tháng “02-MAR-2000 “ ta cho vào trƣờng pubday cũng trong bảng ncbi_table.  Trong phần DEFINITION: lấy toàn bộ phần này cho vào trƣờng definition trong bảng ncbi_table.  Phần ACCESSION: lấy số truy cập này cho vào trƣờng acc_no của bảng acc_table.  Phần ORGANISM: tách lấy các phần tên loài, họ, giống và RNA_stage.  Phần AUTHOR, TITLE: lần lƣợt cho vào trƣờng author, paper của bảng author_table  Phần gene:lấy độ dài của đoạn gene.  Phần note: lấy tên của gene.  Phần product: lấy tên protein.  Phần translation: cho vào trƣờng pro_seq của bảng pro_table.  Phần ORIGIN: cho vào trƣờng gen_seq của bảng gen_table. Lƣu trữ các thông tin gen, protein, morphylogy,… Tất cả các trình tự gene, protein đƣợc xác định trong mục 3.2.2 đƣợc đƣa tự động vào CSDL gen_seq và pro_seq bằng Perl script. Đồng thời các dữ liệu về morphology, triệu chứng,… cũng đƣợc đƣa vào CSDL tự động bằng Perl script hay bằng các thao tác bằng tay. Gồm có các thông tin sau:  Trình tự gene và protein của virus có số ACCESSION tƣơng ứng.  Độ dài của gene.  Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, hình thể, vùng phân bố,… Do quan hệ của các bảng đƣợc xác định ngay từ đầu, nên việc đƣa dữ liệu vào phải đƣợc thực hiện tuần tự nhƣ sau:  Đầu tiên là đƣa vào bảng organism_table  Rồi lần lƣợt đến acc_table, gen_table, pro_table, char_table.  Cuối cùng vào các bảng ncbi_table, author_table. 37 3.2.4. Tích hợp CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH với trang Web Nhằm mục đích cung cấp giao diện cho ngƣời sử dụng truy xuất thông tin, chia sẽ CSDL trực tuyến, CSDL gene và protein hsp-70 và RT-RNaseH đƣợc tích hợp với Web bằng giao thức CGI. Bên cạnh đó, việc tích hợp với web cũng nhằm cung cấp một vài công cụ phân tích trình tự sinh học để hổ trợ cho việc truy xuất thông tin tốt hơn. Tiến trình ngƣời sử dụng lấy thông tin từ CSDL về hai gene trên đƣợc thực hiện ở hình 3.6, gồm các bƣớc nhƣ sau:  Thông qua giao thức truyền siêu văn bản HTTP, trình chủ web Apache nhận thông tin từ yêu cầu trình duyệt, sau đó sử lý và chuyển đến script CGI.  Từ yêu cầu đƣa vào, sử dụng ngôn ngữ truy vấn SQL và các hàm trong module DBI, DBD::MySQL để lấy kết quả trong CSDL của hai gene trên.  Kết quả đƣợc script CGI chuyển đến trình chủ Apache. Sau đó Apache chuyển thông tin kết quả lên trình duyệt của ngƣời sử dụng. CSDL hai GEN Trình chủ web Apache * Nhận và xử lý yêu cầu * Tƣơng tác CSDL * Trả kết quả PERL DBI, CGI DBD::MySQ L Kết quả Yêu cầu Trình duyệt client Hình 3.6 Tiến trình lấy thông tin từ CSDL hai gene ở hai loài virus 38 gen_table gen_id gen_name gen_seq length acc_id acc_table acc_id acc_no organism_id organism_table organism_id organism_name morphology physicochemical nucleic_acid protein symptom_and_host susceptible_host insusceptible_host transmission geographic_distribution diagnostic_and_method ncbi_table ncbi_id definition pubday locus acc_id pro_table pro_id pro_name pro_seq acc_id author_table author_id author paper ncbi_id char_table char_id family genus species RNA_stage organism_id 1 Hình 3.7 Sơ đồ chi tiết các bảng quan hệ trong CSDL hai gene và protein hsp-70 và RT-RNaseH ở hai họ virus Caulimoviridae và Closteroviridae pk: primary key fk: foreign key 1 1 1 n 1 1 1 AY 99 55 66 Ci tr us tr is te za vi ru s is ol at e 46 4- 2 p6 , Hs p7 0h , p6 1, CP m, CP , p1 8, p1 3, p2 0, an d p2 3 ge ns , co mp le te cd 1 1 1 1 39 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu nhận trình tự của hai họ Closteroviridae và Caulimoviridae Khi sử dụng các từ khóa và phƣơng pháp nhƣ ở mục 3.2 (phần phƣơng pháp và chƣơng trình sử dụng). Chúng tôi đã thu nhận đƣợc 7 file gồm: Thu 3 file chứa ACCESSION NUMBER và dòng định nghĩa về loài và gene hsp-70 tƣơng ứng cho 3 giống trong họ Closteroviridae. Thu 4 file chứa ACCESSION NUMBER và dòng định nghĩa về loài và gene Reverse transcriptase-RNaseH tƣơng ứng cho 4 giống trong họ Caulimoviridae. Ví dụ, một file của giống Crinivirus chứa bảng danh sách các ACCESSION NUMBER và dòng định nghĩa về loài và gene hsp-70 trong giống nhƣ sau: Sau khi thu đƣợc các file chứa số ACCESSION NUMBER cùng với dòng định nghĩa ngắn ngọn nhƣ trên, chúng tôi tiến hành chạy chƣơng trình perl script (đƣợc viết dựa trên ngôn ngữ lập trình perl để phục vụ cho việc tải mẫu tin chứa ACCESSION NUMBER có trong file) trên mạng Internet để tải thông tin, kết quả chúng tôi thu đƣợc hơn 300 các mẫu tin có số ACCESION NUMBER và dòng định nghĩa chứa trong 7 file trên. Ví dụ, một mẫu tin có số ACCESSION NUMBER AJ010920 sau khi chạy chƣơng trình perl script thu đƣợc mẫu tin trên NCBI có dạng nhƣ sau: Hình 4.1 File chứa ACCESSION NUMBER và dòng định nghĩa của giống Crinivirus 1: AJ344213 Tomato infectious chlorosis virus partial HSP70 gene for heat shock protein 70, genomic RNA, isolate Gr/P1 gi|17976838|emb|AJ344213.1|TIN344213[17976838] 2: AJ010920 Sweet potato chlorotic stunt virus mRNA for heat shock protein 70, isolate S1EA-19a, partial gi|3560042|emb|AJ010920.1|SPO010920[3560042] 3: AY048854 Tomato chlorosis virus Sicily heat shock protein 70 gene, partial cds gi|15292654|gb|AY048854.1|[15292654] (…) 4: AJ010921 Sweet potato chlorotic stunt virus mRNA for heat shock protein 70, isolate S2EA-4a, partial gi|3560044|emb|AJ010921.1|SPO010921[3560044] (…) 20: AY048855 Tomato infectious chlorosis virus Liguria heat shock protein 70 gene, partial cds gi|15292656|gb|AY048855.1|[15292656] (…) 40 LOCUS SPO010920 486 bp mRNA linear VRL 02-MAR-2000 DEFINITION Sweet potato chlorotic stunt virus mRNA for heat shock protein 70, isolate S1EA-19a, partial. ACCESSION AJ010920 VERSION AJ010920.1 GI:3560042 KEYWORDS heat shock protein 70; hsp70 gene; HSP70 protein. SOURCE Sweet potato chlorotic stunt virus ORGANISM Sweet potato chlorotic stunt virus Viruses; ssRNA positive-strand viruses, no DNA stage; Closteroviridae; Crinivirus. REFERENCE 1 AUTHORS Alicai,T., Fenby,N.S., Gibson,R.W., Adipala,E., Vetten,J.H., Foster,G.D. and Seal,S. TITLE Occurence of two serotypes of sweet potato chlorotic stunt virus in East Africa and their associated differences in coat protein and HSP70 homologue gene sequences JOURNAL Plant Pathol. 48, 718-726 (1999) REFERENCE 2 (bases 1 to 486) AUTHORS Fenby,N.S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (28-AUG-1998) Fenby N.S., Department of Biology, Bristol University, Woodland Road, Bristol, BS8 1UG, U.K FEATURES Location/Qualifiers source 1..486 /organism="Sweet potato chlorotic stunt virus" /mol_type="mRNA" /isolate="S1EA-19a" /db_xref="taxon:81931" gene 1..486 /gene="hsp70" CDS 486 /gene="hsp70" /codon_start=2 /product="heat shock protein 70 (HSP70)" /protein_id="CAA09397.1" /db_xref="GI:3560043" /db_xref="GOA:Q9YIR1" /db_xref="UniProt/TrEMBL:Q9YIR1" /translation="SAYVGGTMKVLRINGSEFIPTCLSVTATGDVVVGGAAQVLDSSQ PHCYFYDLKRWVGVDRLSFEEIKRKISPQYTVRLEGNDVLITGISKGFSCTYTVK QLYVDTLVRLFSNVEKLKILSLNVSVPADYKTKQRMFMKSVCESLGFPLRRIINE PSAA" ORIGIN 1 atcggcgtat gttggtggta cgatgaaggt ccttagaata aacgggtcgg agtttattcc 61 cacctgttta tctgtcacgg ctacaggcga cgtggttgtt ggtggggctg cccaggtttt 121 ggattcttcg cagttacccc attgctattt ctatgactta aaacgttggg ttggcgttga 181 taggttgtcc tttgaagaaa taaaacgtaa gatatcccca cagtatacgg tcagattgga 241 aggtaatgat gtgctaataa caggaatctc gaaggggttc tcttgtacat atactgtgaa 301 acagctcatt cttctctatg ttgacacctt ggtcagacta ttctcaaatg ttgaaaagct 361 gaagattctg agtttaaatg tgtcagttcc cgcagattac aaaaccaagc aacggatgtt 421 tatgaaatca gtttgtgagt cgctcggttt tccattgaga aggatcataa acgagccttc 481 tgctgc // Hình 4.2 Mẫu tin về gene hsp-70 của Sweet potato chlorotic stunt virus trên NCBI 41 Khi tiến hành khảo sát thu nhận trình tự bằng các từ khóa và nhƣ phƣơng pháp phần 3.2.1, ở các giống thuộc họ Caulimoviridae chúng tôi chỉ nhận đƣợc 4 giống (Caulimovirus, Soymovirus, Badnavirus và Petuvirus) có trình tự gene RT-RNaseH đƣợc đăng tải trên NCBI. Còn hai giống còn lại (Tungrovirus và Cavemovirus) thì không thu nhận đƣợc mẫu tin về gene RT-RnasH của hai giống này đăng tải. Trong 4 giống (Caulimovirus, Soymovirus, Badnavirus và Petuvirus) ở Caulimoviridae và 3 giống (Ampelovirus, Crinivirus và Closterovirus) ở Closteroviridae khi sử dụng các từ khóa và phƣơng pháp này, chúng tôi nhận đƣợc hầu hết các loài trong giống có chứa hai gene này. Vì trong quá trình tìm kiếm chúng tôi tiến hành kiểm tra các mẫu tin thu nhận đƣợc bằng cách lấy trình tự gene trên để thức hiện BLAST với tất cả các sinh vật trong CSDL nucleotide của NCBI, kết quả BLAST không hoặc rất ít xuất hiện loài nào thuộc hai họ mà chúng tôi chƣa thu nhận. Tuy nhiên, cũng thông qua BLAST thì chúng tôi nhận thấy các từ khóa đƣợc sử dụng vẫn chƣa hoàn toàn đầy đủ, để có thể nhận đƣợc hoàn toàn gene hsp-70 và RT-RNaseH trong hai họ, nên cần có sự kiểm tra lại bằng cách lấy một đoạn gene hsp-70 hay RT- RNaseH rồi thực hiện BLAST trên NCBI. 4.2. Kết quả thu nhận trình tƣ hai gene hsp-70 và RT-RNaseH Sau khi tải trên Internet chúng tôi thu nhận đƣợc:  125 gene hsp-70 của Closteroviridae đã biết.  215 gene RT-RNaseH của Caulimoviridae Trong đó: o Gene RT-RNaseH chỉ có 180 gene đã biết còn 35 gene lại nằm chung với các gene khác trong ORF hay trong genome. Vì có các gene RT-RNaseH nằm trong ORF hay genome nên chúng tôi tiến hành thu nhận gene này bằng phƣơng pháp đƣợc mô tả nhƣ ở phần 3.2.2. Kết quả chúng tôi thu nhận đƣợc 35 gene RT-RNaseH còn lại. Ví dụ: mô hình xác định gene RT-RNaseH ở Caulimoviridae theo sơ đồ sau: Alignment Thu nhận đƣợc vị trí gene RT- RNaseH trong ORF5, rồi dùng perl script tách ra. Hình 4.3 Mô hình thu nhận gene RT-RNaseH trong ORF5 của CMV Gene RT-RNaseH Gene RT-RNaseH nằm trong ORF5 42 Khi tiến hành khảo sát thu nhận trình tự trên NCBI, chúng tôi nhận đƣợc chiều dài của hai gene có sự giao động lớn, do các phƣơng pháp và mục tiêu giải trình tự khác nhau nên kết quả đăng tải trình tự về hai gene này có sự giao động khoảng từ 409 đến 2200 bp. Nhƣ phƣơng pháp thu nhận trình tự ở phần 3.2.2, chúng tôi chỉ tiến hành sắp gióng cột dựa vào một trình tự gene RT-RNaseH đã biết chiều dài để tách lấy trình tự gene RT-RNaseH nằm cùng với các gene khác hay genome của virus nên chỉ thu đƣợc một đoạn nhất định của gene này. Tuy nhiên, với mụch đích xây dựng CSDL phục vụ cho việc thiết kế primer để phân biệt giữa các loài nên có thể chấp nhận đƣợc. Việc dựa vào sự bảo tồn của gene RT-RNaseH để thực hiện sắp gióng cột nên độ chính xác của phƣơng pháp này không cao. Chỉ rất ít loài trong họ Caulimoviridae gene Reverse transcriptase đƣợc xác định chính xác, còn lại hầu hết nó nằm chung với gene RNaseH, nên chúng tôi chƣa có đủ các thông tin để tách riêng chúng ra đƣợc nên trong CSDL chứa cả gene RT và RNaseH. 4.3. CSDL trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH Nhờ sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự, một số lƣợng lớn các gene hsp-70 và RT-RNaseH đã đƣợc giải trình tự. Những trình tự gene này đƣợc lƣu trữ trong CSDL sinh học lớn nhƣ NCBI, EMBL, DDBj, … Vì các CSDL này quá lớn và chứa rất nhiều thông tin khác nhau, không tập trung thành từng gene cụ thể nên khó có thể thực hiện việc truy xuất các thông tin phục vụ trực tiếp cho một nghiên cứu chuyên biệt. Do vậy, chúng tôi đã tập hợp các trình tự gene hsp-70 (của Closteroviridae) và RT-RNaseH (của Caulimoviridae). Để xây dựng CSDL riêng cho hai gene này. Đồng thời xác định các loài trong họ có chứa hai gene trên. Về sinh vật CSDL lƣu trữ hai họ, 7 giống, 56 loài. Số lƣợng trình tự thu nhận ở bảng 4.1. Về trình tự CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH gồm 325 trình tự (hsp-70 và RT-RNaseH), kết quả chi tiết ở bảng III.3.2. và III.3.3. CSDL gene này đƣợc phân chia thành hai nhóm trình tự hsp-70 thuộc Closteroviridae và RT-RNaseH thuộc Caulimoviridae, tƣơng ứng với mỗi gene có thông tin về protein tƣơng ứng. 43 Bảng 4.1 Tổng số trình tự trong CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH Họ Số trình tự gene Số trình tự protein Closteroviridae 125 125 Caulimoviridae 200 200 Bảng 4.2 Số trình tự gene hsp-70 Họ Genus Species Số trình tự Closteroviridae Ampelovirus Grapevine leafroll-associated virus 1 45 Grapevine leafroll-associated virus 3 16 Grapevine leafroll-associated virus 9 2 Closterovirus Beet yellows virus 3 Apricot stem pitting asso 3 Mint virus 1 4 Citrus tristeza virus 6 Little cherry virus 1 2 Grapevine leafroll-associated virus 2 2 Crinivirus Sweet potato chlorotic stunt virus 16 Cucurbit yellow stunting disorder virus 3 Tomato infectious chlorosis virus 9 Potato yellow vein virus 7 Tomato chlorosis virus 4 Beet pseudo-yellows virus 3 Tổng số trinh tự 125 Tƣơng tự, số trình tự về protein của họ Closteroviridae cũng thu nhận đƣợc với số lƣợng tƣơng ứng với gene hsp-70 (mỗi trình tự điều có một trình tự protein tƣơng ứng trong CSDL). Bảng 4.3 Số trình tự gene RT-RNaseH Họ Genus Species Số trình tự Caulimoviridae Badnavirus Banana streak Obino l'Ewai virus 13 Banana streak Goldfinger virus 10 Banana streak Imove virus 8 44 Banana streak Uganda A virus 11 Banana streak Uganda B virus 2 Banana streak Uganda C virus 1 Banana streak Uganda D virus 2 Banana streak Uganda E virus 3 Banana streak Uganda F virus 2 Banana streak Uganda G virus 2 Banana streak Uganda H virus 2 Banana streak Uganda I virus 26 Banana streak Uganda J virus 4 Banana streak Uganda K virus 4 Banana streak Uganda L virus 20 Banana streak Uganda M virus 32 Banana streak virus 1 Rubus yellow net virus 2 Stilbocarpa mosaic bacilliform virus 1 Banana streak OL virus 2 Taro bacilliform virus 9 Citrus yellow mosaic virus 2 Bougainvillea spectabilis chlorotic vein-banding virus 1 Pineapple bacilliform virus 1 Sugarcane bacilliform virus 1 Cacao swollen shoot virus 5 Kalanchoe top-spotting virus 1 Banana streak GF virus 1 45 Banana streak virus strain Acuminata Vietnam 1 Banana streak Mys virus 1 Caulimovirus Cauliflower mosaic virus 8 Blueberry red ringspot virus 2 Dahlia mosaic virus 2 Carnation etched ring virus 2 Horseradish latent virus 1 Peanut chlorotic streak virus 2 Cassava vein mosaic virus 2 Figwort mosaic virus 2 Petuvirus Petunia vein clearing virus 4 Soymovirus Peanut chlorotic streak virus 2 Soybean chlorotic mottle virus 2 Tổng số trình tự 200 Trong CSDL chứa hai đối tƣợng chính thì còn chứa đối tƣợng phụ nhằm cung cấp các thông tin khác để bổ sung cho hai đối tƣợng chính nhƣ: tên tác giả, tên bài báo, cây phân loài,… CSDL về hai gene hsp-70 và RT-RNaseH, rất tiện ích cho việc truy xuất, nghiên cứu các thông tin liên quan đến trình tự DNA, protein, loài, các đặc trƣng của từng loài chứa hai gene này, tiết kiệm thời gian tìm hiểu, nắm bắt thông tin nhanh. CSDL này đƣợc xây dựng trên hai gene khá bảo tồn ở hai loài nên chúng ta có thể dựa vào các thông tin trong CSDL để nghiên cứu các hiện tƣợng biến chủng trong họ, giúp đƣa ra các kết luận chính xác về các biến chủng xảy ra ở trên hai gene này. Nhƣng CSDL nhỏ, chỉ có 325 trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH ở hai họ virus, chứa lƣợng thông tin ít và chƣa có chế độ bảo mật. Ở cấp độ phòng thí nghiệm, cơ quan nghiên cứu hay trƣờng đại học thì việc xây dựng CSDL cho từng đối tƣợng (về một gene, một sinh vật,…) thì rất tiện ích để phục vụ cho các nghiên cứu về một đối tƣợng nhất định. 46 4.4. Trang web thể hiện thông tin CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH Cấu trúc của các trang web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH thể hiện ở hình (4.4) Hsp-70 and RT-RNaseH gene DATABASE WEB PAGE HOME PAGE SEARCH PAGE TOOL PAGE TAXONOMY PAGE ABOUT PAGE LINK PAGE ACCESSION NUMBER(s) ORGANISM ALIGNMENT CAULIMOVIRDAE CLOSTEROVIRIDAE BIOTECH. Dep. BLAST Hình 4.4 Sơ đồ cấu trúc của trang web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH 46 47 4.4.1. Trang thông tin chung về CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH (HOME PAGE)  Nội dung trang web: cung cấp thông tin về các giống, loài trong họ, trình tự của từng loài, kiểm tra độ tƣơng đồng về trình tự (nucleotide và protein) giữa các loài trong họ thông qua công cụ Alignment.  Hình thức thể hiện: Hình 4.5 4.4.2. Trang tìm kiếm (SEARCH PAGE)  Nội dung của trang web: cho phép ngƣời dùng tìm kiếm trình tự gene hay protein có trong CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH. Trong trang này gồm có hai thanh công cụ tìm kiếm. Tìm kiếm khi biết ACCESSION NUMBER, hai là khi biết tên của loài trong họ. Hình 4.5 Trang HOME PAGE 48  Hình thức thể hiện:  Với trang tìm kiếm khi biết ACCESSION NUMBER(s) o Khi biết ACCESSION NUMBER (số truy cập của CDSL GenBank), ngƣời ta dùng có thể nhập một hoặc nhiều mã số này, để tìm các trình tự nucleotide, protein,… có mã số tƣơng ứng (Hình 4.6). o Ngƣời dùng có thể tùy chọn các phần sẽ hiện thị trong kết quả tìm kiếm, ví dụ ngƣời dùng có thể tùy chọn các phần cần thông tin cần tìm và kết quả sẽ hiển thị sau khi thực hiện lệnh SEARCH là trình tự protein, gene và cả phần định nghĩa, tác giả, ngày xuất bản, tựa đề của bài báo,… của trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH (Hình 4.7). Hình 4.6 Trang tìm kiếm trình tự khi biết ACCESSION NUMBER 49  Với trang tìm kiếm khi biết tên của loài. o Khi biết tên của sinh vật, chúng ta có thể nhập tên của nó vào trong thanh ORGANISM(s). để tìm sinh vật đó trong CSDL (phụ lục). o Ngƣời dùng có thể tùy chọn các phần sẽ hiển thị trong kết quả tìm kiếm, ví dụ ngƣời dùng có thể tùy chọn phần hiển thị nhƣ là loài, giống, vùng phân bố, đặc tính sinh lý,… của sinh vật đó (phụ lục). 4.4.3. Trang công cụ (TOOL PAGE) Sắp gióng cột (alignment) hai hay nhiều trình tự là một công cụ khá thông dụng để khảo sát sự tƣơng đồng, đột biến, nghiên cứu chức năng của gene. Mặc khác để tìm trình tự tƣơng đồng với một trình tự quan tâm, các nhà sinh học thƣờng sử dụng Hình 4.7 Trang kết quả tìm kiếm trình tự khi biết ACCESION NUMBER 50 công cụ BLAST. Do nhu cầu đó, chúng tôi đã tích hợp hai công cụ này vào trang web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH.  Nội dung trang web: trang này cung cấp hai công cụ chủ yếu để phân tích trình tự sinh học, đó là sắp gióng cột (alignment) và tìm kiếm trình tự tƣơng đồng (BLAST).  Hình thức thể hiện:  Với công cụ Alignment: ngƣời sử dụng có thể nhập vào một hay nhiều trình tự (có thể là DNA hay protein) thông qua ô nhập văn bản hay một tập tin dƣới định dạng FASTA. Rồi chọn một hay nhiều trình tự trong CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH để thực hiện sắp gióng cột (có thể thực hiện Alignment giữa các gene, protein trong CSDL) (Hình 4.8).  Với công cụ BLAST: ngƣời dùng có thể nhập vào một trình tự (có thể là DNA hay protein). Trình tự này sẽ đƣợc so sánh tƣơng đồng cục bộ với CSDL của trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH. Các tham số của BLAST: giá trị mong đợi E_value, ma trận sử dụng có thể thay đổi (Hình 4.10). Hình 4.8 Trang web tìm kiếm trình tự tƣơng đồng bằng Alignment 51 Hình 4.9 Trang kết quả Alignment giữa các trình tự Hình 4.10 Trang web tìm kiếm trình tự tƣơng đồng bằng BLAST 52 4.4.4. Trang cây phân loài (Taxonomy)  Nội dung trang web: trang gồm có hai trang về hai họ Caulimoviridae và Closteroviridae.  Hình thức thể hiện: Hình 4.11 4.4.4.1. Trang Caulimoviridae: cung cấp thông tin chung cho các đặc trƣng cho họ nhƣ thông tin về các giống, loài trong hai họ, đồng thời, kích thƣớc genome, hình thể, các đặc tính sinh hóa, dãy kí chủ trong tự nhiên, triệu chứng, vùng phân bố, các loài trong họ,… Hình 4.11 Trang web cây phân loài của hai họ 53  Nội dung trang web: đƣợc thể hiện qua các mục điển hình sau: o Đặc tính Virion: cung cấp các thông tin về hình thể, đặc tính vật lý và hóa lý, acid nucleic, protein, tổ chức genome,… o Đặc tính sinh học: cung cấp các thông tin về dãy kí chủ tự nhiên, kí chủ trung gian, triệu chứng, vùng phân bố địa lý, phƣơng pháp chuẩn đoán,… o Cấu trúc phân loài: chứa các thông tin về các thành viên trong loài.  Hình thức thể hiện: Hình 4.12 Hình 4.12 Trang web thể hiện nội dung các đặc tính của họ 54 4.4.4.2. Trang Closteroviridae: cung cấp các thông tin về họ Closteroviridae tƣơng tự nhƣ trang caulimoviridae (phụ lục). 4.4.5. Trang liên kết (LINK PAGE) Trang này thực hiện việc liên kết đến một vài CSDL lớn trên thế giới nhƣ NCBI, EMBL,… (phụ lục). 4.4.6. Trang thông tin về bộ môn công nghệ sinh học (ABOUT PAGE) Trang này cung cấp các thông tin về cấu trúc tổ chức, các hoạt động giáo dục - đào tạo và nghiên cứu khoa học,… của khoa công nghệ sinh học (phụ lục). Dùng giao diện web để truy xuất thông tin và chia sẽ nguồn thông đó. Trang web đƣợc viết dựa trên mụch đích tiện ích cho ngƣời sử dụng. Các thông tin cần truy xuất hầu hết điều hiển thị trên giao diện web. Nên ngƣời sử dụng chỉ check vào các ô chọn lựa để truy xuất các thông tin mong muốn. Web chứa trang công cụ Alignment và BLAST giúp ngƣời sử dụng tìm kiếm các trình tự tƣơng đồng thông qua công cụ này chúng ta có thể biết đƣợc mức độ tƣơng đồng của về trình tự giữa các loài. Ngoài ra, trên web này còn liên kết với các CSDL lớn nhƣ NCBI, EBI, DDBj, SIB thông qua trang liên kết. Mục đích của trang web chỉ phục vụ cho việc truy xuất thông tin trong nội bộ ở cấp độ phòng thí nghiệm, trƣờng đại học,… nên chúng tôi không xây dựng chế độ bảo mật cho web. Tuy nhiên, trang web còn tồn tại một số vấn đề nhƣ số lƣợng trang trên web ít (6 trang chính), các thông tin cung cấp không chƣa đáp ứng thỏa mãn cho các nghiên cứu lớn và các công cụ đƣợc tích hợp vào ít cần đƣợc bổ sung vào thêm. 55 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN  Chúng tôi đã tải đƣợc 325 trình tự gene hsp-70 và RT-RNaseH từ cơ sở dữ liệu NCBI.  Thông qua việc tìm hiểu về hai họ virus, trình tự gene tƣơng đồng, trình tự protein bảo tồn và kết hợp với ClustalW. Chúng tôi đã xác định đƣợc vị trí gene hsp-70 và RT-RNaseH nằm trong ORF hay trong genome của chúng.  CSDL có 325 trình tự đƣợc tích hợp với Web  Trang Web CSDL gene hsp-70 và RT-RNaseH gồm có 6 trang chính, đó là HOME, SEARCH, TOOL, TAXONOMY, LINK, ABOUT PAGE. Ngoài ra, từ những trang web chính này còn có thể kết nối đến những trang phụ khác để cung cấp những tiện ích cho ngƣời dùng. Từ các trang web này, ngƣời sử dụng có thể truy xuất thông tin, so sánh một trình tự quan tâm với các trình tự trong cơ sở dữ liệu gene hsp-70 và RT-RNaseH, tìm kiếm trình tự, các đặc tính của loài,… 5.2. ĐỀ NGHỊ  Dùng từ khóa chính xác hơn để khảo sát đƣợc toàn bộ các loài chứa hai gene này ở hai họ và khảo sát về hai hai giống còn lại trong họ Caulimoviriae trên NCBI.  Tiến hành khảo sát chính xác vị trí gene hsp-70 và RT-RNaseH trong ORF hay genome của hai loài virus thông qua các thông tin cung cấp trên mạng hay sử dụng trình tự nucleotide đã biết để thiết kế một primer, primer còn lại đƣợc thiết kế ngẩu nhiên, thông qua