Đề tài Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học

Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, con người có xu hướng trở dần về với tính chất thiên nhiên thông qua việc sử dụng một số chất có hoạt tính sinh học hay các phương pháp sinh học để ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, cải thiện môi trường và để chữa bệnh. Lý do đơn giản là con người đã hiểu được mặt trái khi sử dụng các chất hóa học, chất kháng sinh. Những chất này tuy có hiệu quả nhanh chóng nhưng hậu quả mà nó mang lại rất lớn. Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản trước đây người ta thường dùng những chất kháng sinh để phòng và trị bệnh cho gia súc, gia cầm và tôm, cá... Việc sử dụng kháng sinh trong một thời gian dài đã để lại nhiều hậu quả không mong muốn như sự kháng thuốc của vi khuẩn hoặc rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng hơn và dẫn đến khó điều trị hơn. Nghiêm trọng hơn sự tồn dư kháng sinh trong thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại rất lớn trong chăn nuôi. Để khắc phục được tình trạng này, các nhà khoa học đã nghiên cứu sử dụng trực tiếp những vi sinh vật sống, có lợi thường gọi là “probiotic”. Kết quả đã chứng minh được lợi ích của những vi khuẩn có lợi này trong việc phòng và điều trị một số bệnh trong chăn nuôi, thủy sản và cho cả con người. Điều quan trọng là nó không để lại những hậu quả hay di chứng khi sử dụng như các loại hóa chất và thuốc kháng sinh. Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành đề tài “Xác định môi trường tối ưu để thu sinh khối và enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus. Thử nghiệm sản xuất chế phẩm sinh học” để phục vụ trong chăn nuôi và thủy sản. 1.2. MỤC ĐÍCH Xác định được môi trường tối ưu của vi khuẩn Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm sinh học sử dụng trong chăn nuôi thú y và nuôi trồng thủy sản. 1.3. YÊU CẦU 1.3.1. Đối với Bacillus subtilis Thực hiện việc nuôi cấy Bacillus subtilis trên nhiều loại môi trường khác nhau để xác định xem môi trường nào làm cho vi khuẩn sinh enzyme protease và amylase nhiều nhất. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis . Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. 1.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. Tìm môi trường nhân giống thích hợp cho sinh khối và độ chua cao nhất. Sản xuất chế phẩm chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Kiểm tra chất lượng của chế phẩm vừa sản xuất và sau thời gian bảo quản. Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 2.1.1. Lịch sử Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi tổ chức y học Nari của Đức. Lúc đầu chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi. Năm 1949 – 1957 Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó “Subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa. 2.1.2. Phân loại và đặc điểm 2.1.2.1. Phân loại Theo khóa phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc: Hình 2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 2.1.2.2. Đặc điểm Vi khuẩn Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, Gram dương (G+), kích thước 0,5 - 0,8 µm × 1,8 – 3 µm. Đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 µm. Phát triển bằng cách nảy chồi do sự nứt của bào tử. Chúng là loại vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 36 - 50oC, tối đa khoảng 60oC, bào tử chịu nhiệt khá cao. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacilluss subtilis là 10 – 15% (Lương Đức Phẩm, 2000). Chúng phân bố rộng rãi trong ngoại cảnh, nhất là trên bề mặt thực vật (cỏ khô, khoai tây). Một đặc điểm dùng để phân biệt với các vi khuẩn khác là làm tan chảy gelatine nhanh chóng. Sữa cấy Bacillus subtilis trước tiên sau đó cấy men lactic trở nên acid nhanh chóng hơn sữa chỉ cấy men lactic. Vi khuẩn tác động bằng protease làm hình thành paraprotein từ casein, sữa cấy Bacillus subtilis bị kết tủa khi cho vào clorua calci (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978). Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa Bacillus subtilis có khuẩn lạc tròn, không đều hay phân tán. Đường kính khuẩn lạc 3 – 5 mm, phát triển chậm, màu vàng xám ở giữa sậm màu, rìa có răng cưa. Sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Trong môi trường canh (nutrian broth) chúng phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhăn trên bề mặt, lắng cặn, ít hoặc không tạo nhớt. Bacillus subtilis cho một số phản ứng sinh hóa: Lên men nhưng không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose, mannitol, saccharose, xylose, arabinose. Indol (-), VP (+), nitrat (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrat (+), có khả năng di động và hiếu khí. 2.2. ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN LACTIC Theo hệ thống phân loại của Bergey năm 1979 thì vi khuẩn lactic được phân loại như sau: Họ: Lactobacteriaceae Họ phụ: Streptococcaceae Giống: Streptococcus Leuconostoc Họ phụ: Lactobacteriaceae Giống: Lactobacterium 2.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 2.2.1.1. Lịch sử Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân loại cũng như chức năng của vi khuẩn này. Năm 1906 Metchnikoff xuất bản cuốn “The prolongation of life optinistic studies”. Ông chứng minh rằng vi khuẩn lactic trong yoghurt bulgarian như là nhân tố chống lại sự thối rữa ruột và sự lão hóa. Tuy nhiên sau đó người ta khám phá ra rằng chủng vi khuẩn này không thể sống sót khi qua dạ dày và ruột. Do đó người ta nhanh chóng thay thế chủng vi khuẩn này bằng chủng L. acidophilus như là một probiotic trong ruột. Họ thấy rằng có rất nhiều vi khuẩn Lactobacillus lên men đồng hình và dị hình sống trong ruột, miệng và âm đạo nhưng chiếm ưu thế nhất trong số đó là 6 loài Lactobacillus lên men đồng hình tạo thành nhóm gọi là phức hợp Lactobacillus acidophilus. 2.2.1.2. Đặc điểm Hình 2.2. Lactobacillus acidophilus Lactobacillus acidophilus thuộc họ vi khuẩn lactic. Chúng có dạng trực khuẩn dài và chịu nhiệt. Tế bào hình que, đầu tròn, kích thước 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm đứng riêng rẻ, xếp thành đôi hay thành chuỗi ngắn, không di động, không sinh bào tử, tế bào non bắt màu Gram dương khi nhuộm, tế bào già trở thành Gram âm. Vi hiếu khí, nhiệt độ thích hợp là 37oC, không phát triển ở 20 - 22oC và 43 - 48oC. Trên môi trường nước chiết cà chua hay nước chiết nấm men khuẩn lạc có dạng tròn, nhỏ ở giữa dày và đục hơn mép ngoài. Trong môi trường thạch sâu khuẩn lạc nhỏ và có hình dạng không ổn định. Trên môi trường thạch nghiêng thì khuẩn lạc khô, phát triển kém và giới hạn theo vết cấy. Lên men lactic đồng hình, tích tụ 2,2% acid lactic trong môi trường, không phát triển trong môi trường hydratcarbon, môi trường khoai tây, phát triển tốt trên môi trường dịch thể cao nấm men. L. acidophilus là một dạng probiotic được sử dụng thường xuyên nhất. Là vi khuẩn có lợi cư trú trong ruột, âm đạo, trong phân người và động vật. Chúng có khả năng sinh Bacteriocin là chất có hoạt tính ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường ruột. L. acidophilus có khả năng lên men các loại đường: glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose và không lên men xylose, arabinose, ramnose, glycerol, mannitol, sorbitol, inositol. Cho các phản ứng: methyl red (+), indol (-), VP (-), citrate (-), catalase (-), khả năng đông vón sữa (+). 2.2.1.3. Quá trình trao đổi chất Hiện nay các thành viên của phức hợp Lactobacillus acidophilus được phân vào nhóm lên men đồng hình bắt buộc. Hexose được lên men để tạo thành acid lactic theo con đường EMP. Chúng có enzyme aldolase nhưng thiếu phosphoketolase, không lên men gluconat và pentose. Tất cả các loài đều tạo đồng phân dạng D và L của acid lactic (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004). 2.2.1.4. Sự thay đổi thành phần của sữa trong quá trình lên men Trong quá trình lên men sữa tạo thành sản phẩm sữa chua có sự thay đổi sâu sắc các loại đường, casein và các thành phần khác. Sự thay đổi đường sữa Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển hóa lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose muốn được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo hai con đường: Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase (hay enzyme galactosidase) để bẻ gãy H2 chuyển lactose thành glucose và galactose. Lactose được oxi hóa thông qua enzyme lactosehydrogenase thành lactosebionat sau đó phân giải tiếp thành gluconat và galactose qua một giai đoạn diễn biến phức tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách. Sự thay đổi protein sữa Trong quá trình lên men, lượng acid hữu cơ các loại càng tích lũy càng làm tăng quá trình tách calci ra khỏi casein tạo pH đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng quá trình lên men tạo pepton và các sản phẩm khác nhau. +CO2 ADP ATP NAD+ NADH ATP ADP Glucose-6 phosphat e galactose Lactose glucose ATP ADP Fructose-6 phosphat 1,3 diphosphoglycerat Glyceraldehyd-3 phosphat Fructose-1,6 phosphat Dihydroxyaceton phosphat acid pyruvic Aldehyd acetic citric +2H acid malic -CO2 Acetyl- CoA acid propionic Chu trình acid citric Rượu etylic acid malic acid lactic +2H Con đường chuyển hóa chủ yếu của quá trình lên men sữa 2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, môi trường, y dược và nhiều nhất là trong chế biến bảo quản thực phẩm. 2.2.2.1. Trong công nghiệp Vi khuẩn lactic được sử dụng để lên men thu acid lactic. Có vị chua dễ chịu và có đặc tính bảo quản nên có thể làm gia vị đối với các loại nước uống nhẹ, tinh dầu, dịch quả, mứt. Chúng được dùng để acid hóa rượu vang và hoa quả nghèo acid, ngoài ra còn được sử dụng trong công nghiệp thuộc da, dệt, nhuộm, sơn và chất dẻo. 2.2.2.2. Trong nông nghiệp và môi trường Vi khuẩn lactic có khả năng hạn chế sự phát triển của Fusarium loại nấm gây bệnh quan trọng trong nông nghiệp. Nấm Fusarium khi phát triển sẽ làm cây yếu đi và đây là cơ hội gây bệnh cho cây trồng. Chế phẩm EM (effective microorganism) hay chế phẩm vi sinh hữu hiệu nó bao gồm 80 chủng vi sinh trong đó có sự góp phần của vi khuẩn lactic. Hiệu quả của chế phẩm này là cải tạo đất, tăng năng suất cây trồng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường. 2.2.2.3. Trong y dược Vi khuẩn lactic được sử dụng trong y học để chữa bệnh đường ruột, dùng trong phẫu thuật chỉnh hình, nha khoa, bệnh phụ khoa… 2.2.2.4. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm Trong bảo quản và chế biến thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng để làm dưa chua, làm chua quả mà không làm mất màu tự nhiên của quả. Dùng sản xuất tương, đậu phụ hay lên men sữa chua. 2.3. KỸ THUẬT NUÔI CẤY VI SINH VẬT Trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật thì trong môi trường lên men phải có chứa đầy đủ các thành phần sau (Lê Xuân Phương, 2001). Glucid: Là nguồn dinh dưỡng quan trọng để vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất xây dựng và đổi mới, ngoài ra glucid còn đóng vai trò chủ chốt trong việc tạo ra năng lượng cho tế bào. Glucid thường được sử dụng dưới dạng dịch chiết có đường, mật rỉ, tinh bột (phải thủy phân thành đường trước khi lên men). Phosphat vô cơ: Đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng và tổng hợp acid nucleic. Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphat amon và phosphat kali. Nitơ: Tham gia vào quá trình tạo protein, acid nucleic và chất có đặc tính sinh học khác của tế bào vi sinh vật. Nitơ thường sử dụng trong lên men dưới dạng muối nitrat, các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồn gốc vi sinh vật. Các chất sinh trưởng và các nguyên tố vi lượng: Vitamin và các nguyên tố vi lượng là những chất cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Chúng thường được sử dụng với lượng nhỏ nhưng tác dụng rất lớn và đa dạng không thể thiếu được đối với hoạt động sống bình thường của vi sinh vật. 2.3.1. Đối với Bacillus subtilis 2.3.1.1. Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh enzyme cao Không phải tất cả các vi sinh vật đều có khả năng sinh enzyme như nhau và ngay cả những chủng cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy khi tuyển chọn vi sinh vật phải tiến hành tìm kiếm, phân lập và lựa chọn hàng chục, hàng trăm những giống vi sinh vật để có được những chủng có hoạt độ cao trong việc tạo thành những enzyme cần thiết. Người ta thấy rằng enzyme thu nhận từ vi khuẩn có nhiệt độ tối ưu và khả năng chịu nhiệt cao hơn enzyme thu nhận từ nấm mốc (Lương Đức Phẩm, 1998). Trong đất có rất nhiều bào tử và tế bào vi sinh vật trong số đó người ta nhận thấy rằng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp enzyme α-amylase và protease. 2.3.1.2. Nguyên liệu để sản xuất enzyme α-amylase từ vi khuẩn. Nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme từ vi sinh vật là những nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm. Vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn để thu nhận α-amylase có thể dùng tinh bột, maltose, saccarose, glucose và glycerin. Ngoài ra người ta còn cho thêm các acid amin ở dạng phức hợp hoặc riêng từng cơ chất (pepton, protein thủy phân dịch chiết mầm mạch, các acid amin...) Nếu môi trường có CaCO3 làm tác nhân điều chỉnh pH và pepton thì α-amylase được tổng hợp gấp hai lần. Trong một phân tử gam α-amylase của Bacillus subtilis có 4g nguyên tử calci. Trong thành phần dinh dưỡng ion Ca có tác dụng nâng cao khả năng tổng hợp α-amylase, làm ổn định enzyme có tác dụng bảo vệ enzyme này đối với protease (Lương Đức Phẩm, 1998). Trong môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật sinh enzyme nói chung cần phải có mặt của các nguyên tố khoáng trong các dạng muối magie, phospho, kali, và các ion mangan, kẽm, và các nguyên tố vi lượng khác. Nồng độ thích hợp để tổng hợp α-amylase của MnSO4 là 0,05%. Thiếu muối α-amylase không được hình thành. Hoạt độ α-amylase được nâng cao ở nồng độ KH2PO4 là 1%. Ion Mg2+ có tác dụng ổn định amylase ở nhiệt độ cao. Lưu huỳnh cũng có tác dụng đến sinh tổng hợp α-amylase. Các nguồn lưu huỳnh là các acid amin (methionin, sistein, sistin) và các muối sunfat (trừ sunfat đồng), trong đó nguồn lưu huỳnh tốt nhất là methionin. 2.3.1.3. Nguyên liệu để sản xuất enzyme protease từ vi khuẩn Trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh protease thì cần phải có các chất cảm ứng, các nguồn nitơ hữu cơ (bột ngô, bột đậu tương, bột mì, cám mì, mầm mạch, dịch chiết nấm men, pepton, protein....). Vi khuẩn Bacillus subtilis tổng hợp protease có hoạt độ cao ở môi trường có tinh bột, nếu giảm nồng độ tinh bột từ 8 – 2% thì hoạt độ protease giảm vài lần. Ngoài các nguồn nitơ hữu cơ thì nguồn nitơ vô cơ cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp protease như HNO3, HNO2. Trong số các nguồn nitơ vô cơ ta chỉ thấy có phosphat amon dibazic là tốt hơn cả. Những muối khác như NH4Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaNO3, KNO3, Ca(NO3)2 làm giảm hoạt độ protease tới 30 – 50% còn α-amylase giảm tới 7 – 10 lần. Trong môi trường chỉ có nguồn nitơ hữu cơ thì hoạt độ protease và amylase cũng thấp hơn trong môi trường đối chứng có (NH4)2HPO4 và nước chiết đậu tương (Lương Đức Phẩm, 1998). Các acid amin ức chế đến tổng hợp enzyme protease ở Bacillus subtilis là methionin, acid glutamic, alanin, leucin... 2.3.1.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sinh enzyme Phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Môi trường sử dụng là môi trường lỏng hoặc sử dụng môi trường đặc (môi trường bán rắn). Môi trường lỏng vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường tạo thành váng khuẩn ngăn cách pha lỏng và pha khí. Vi sinh vật sẽ sử dụng chất dinh dưỡng từ dung dịch môi trường, oxy từ không khí, tiến hành quá trình tổng hợp enzyme. (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Ở môi trường đặc để tăng khả năng xâm nhập của không khí vào trong lòng môi trường người ta thường sử dụng cám, trấu, hạt ngũ cốc để làm môi trường. Vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Độ ẩm thích hợp ở môi trường đặc là 55 – 65%. Ưu điểm của phương pháp bề mặt là dễ thực hiện và khi bị nhiễm vi sinh vật lạ thường xảy ra hiện tượng nhiễm cục bộ vì vậy ta dễ dàng xử lý. Nhưng nhược điểm là tốn nhiều diện tích và khó cơ giới hóa, tự động hóa. Phương pháp nuôi cấy chìm Phương pháp này người ta sử dụng môi trường lỏng và được thực hiện trong những thùng lên men. Trong các thiết bị lên men thường lắp đặt hệ thống cánh khuấy, hệ thống cung cấp oxy, hệ thống điều chỉnh pH và nồng độ các chất dinh dưỡng. Trong đó hệ thống điều hòa không khí và khuấy trộn có ý nghĩa rất lớn do chúng làm xáo trộn môi trường làm tế bào vi sinh vật phân bố đều, tăng khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và tế bào vi sinh vật đồng thời dòng khí được cung cấp và thải ra liên tục giúp cho sự sinh sản và phát triển, làm tăng khả năng tạo enzyme của vi sinh vật. Ưu điểm của phương pháp này là ít tốn diện tích và dễ cơ giới hóa nhưng có nhược điểm là dễ bị nhiễm và khó kiểm soát. 2.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 2.3.2.1. Nhu cầu sinh trưởng Lactobacillus acidophilus là loài vi hiếu khí nên có thể phát triển trong điều kiện hiếu khí và trong điều kiện nuôi cấy tĩnh không lắc, ở điều kiện kị khí thì sự phát triển thích hợp hơn. Chúng phát triển mạnh trong môi trường agar ở điều kiện khí chuẩn (5% CO2, 10% H2 và 85% N2). 2.3.2.2. Nhu cầu dinh dưỡng Nhu cầu dinh dưỡng của Lactobacillus acidophilus phản ánh bản chất rất khó của những vi khuẩn này. Môi trường nuôi cấy chuẩn thường rất giàu acid amin và vitamin như pepton, trypton, dịch chiết nấm men, dịch chiết thịt bò, ngoài ra còn chứa sorbitol, monooleat (Tween 80), sodium acetat và muối magie kích thích sự tăng trưởng. Môi trường nuôi cấy thường sử dụng là MRS lỏng (De Man, Rogosa và Sharpe). 2.3.2.3. Môi trường sản xuất Trong sản xuất sinh khối người ta thường sử dụng sữa bò hay từ sữa đậu nành. Do trong sữa bò và sữa đậu nành có nhiều casein và nhiều thành phần dinh dưỡng khác nhau: Thành phần của sữa bò Trong sữa bò gồm có thành phần chính là protein bao gồm casein, lactoalbumin, lactoglobulin. Casein là loại protein phức tạp (phosphoprotein). Trong sữa ngưng kết casein ở dạng phức chất caseinat-calci-phosphat. Trong sữa tươi, casein ở dạng hòa tan là caseinogen, nếu sữa acid (pH = 4,5 - 4,7) thì casein lắng xuống, sữa ngưng kết thành khối. Khi bị tác dụng của pepsin hay chymozin thì casein chuyển thành dạng không hòa tan. Trong sữa còn có triglyceric, acid béo bay hơi và acid béo không bay hơi chủ yếu là acid oleic (40,6%), acid palmitic và stearic (50,9%), các glyceric khác chiếm 8,5%. Ngoài ra còn có vết lecithin, cholesterol (Trần Thị Dân, 2000). Thành phần hóa học của sữa đậu nành Trong đậu nành có chứa rất nhiều chất dinh dưỡng nhưng người ta quan tâm nhiều nhất là hàm lượng protein và lipid, nhóm glucid của đậu nành không thuộc loại có giá trị cao về dinh dưỡng. Protein đậu nành chiếm trên 40%, nó gấp 10 lần so với sữa, gấp 2 lần so với thịt bò. Ngoài ra protein đậu nành còn có chứa đủ các acid amin thiết yếu như lysine, methionin, isoleucin, tryptophan.... Lipid đậu nành chiếm 20%, chủ yếu chứa hai thành phần quý là trylycerid và lecithin, hàm lượng acid béo không no cao (khoảng 85%), acid béo no thấp (15%). Trong đậu nành còn chứa các vitamin A, E, K, B1, B2 chiếm khoảng dưới 1% và các khoáng chất chiếm khoảng 5% nhưng chất lượng dinh dưỡng của các khoáng chất từ đậu nành thấp hơn so với các khoáng chất của động vật. Ngoài ra trong đậu nành còn chứa một số chất không có lợi khác như chất ức chế trypsin, chất này làm giảm sự sinh trưởng gây phình to tụy tạng động vật... Những chất như hemaglutinins gây đông tế bào máu, cản trở sự hoạt động của hồng cầu. Chất goitrogens gây phình to tuyến giáp, urease gây phân giải protein thành amoniac gây độc cho cơ thể... Các chất độc này đa số tập trung ở màng ngoài của hạt đậu nành (Nguyễn Thị Hiền, 2004). 2.3.2.4. Điều kiện sản xuất Trước khi lên men, sữa phải được thanh trùng để loại bỏ những vi sinh vật tạp nhiễm có trong sữa. Người ta thường sử dụng phương pháp Pasteur để thanh trùng sữa (65oC trong 30 phút hoặc 72 – 75oC trong 10 - 20 giây). Sau khi thanh trùng người ta cấy vi khuẩn lactic vào sữa, lượng giống cho vào từ 5 - 10%. Sau một thời gian lên men thì sữa có độ chua khá cao thường là 90 – 120oT (oT = độ chua Therne) và đông vón lại. 2.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PROBIOTIC (Trích dẫn của Lã Văn Kính, 1998). 2.4.1. Định nghĩa probiotic Thuật ngữ probiotic được đưa ra lần đầu tiên bởi Lilly và Stillwel (1965) để mô tả những yếu tố kích thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Probiotic được bắt nguồn từ gốc Hylạp với nghĩa “tiền sự sống” (prolife). Năm 1989 Fuller định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vi sinh vật sống có tác động có lợi đến động vật chủ thông qua việc cải tiến cân bằng vi sinh vật của nó. Năm 1992 Havenar et al chỉ ra rằng định nghĩa probiotic của Fuller bị hạn chế ở những thức ăn bổ sung cho động vật qua đường ruột. Ông nới rộng định nghĩa probiotic của Fuller như là một lứa cấy đơn hay hỗn hợp của các vi sinh vật sống mà chúng (dùng áp dụng cho người và động vật) có ảnh hưởng có lợi đối với vật chủ bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật bản xứ. 2.4.2. Cơ chế tác động 2.4.2.1. Duy trì hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột Động vật khỏe mạnh có hệ thống tiêu hóa hoạt động tốt. Đó là cơ sở cho sự chuyển hóa có hiệu quả thức ăn cho duy trì và sản xuất. Đặc tính quan trọng nhất của đường tiêu hóa hoạt động tốt là sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong nó. Vi khuẩn lactic có mặt khắp đường ruột và trong một số điều kiện nó là vi khuẩn chiếm ưu thế (Fuller, 1977; Jin et al,1997). Sự cân bằng trong đường ruột bị phá vỡ khi các động vật bị stress như nhiệt độ cao, độ ẩm cao, thay đổi thức ăn, vận chuyển…Việc cho con vật ăn thường xuyên probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật bằng hai con đường: Chống lại vi sinh vật gây bệnh và bằng hoạt động đối kháng. 2.4.2.2. Hoạt động đối kháng Các nghiên cứu in vitro chỉ ra rằng vi khuẩn sinh acid lactic có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật truyền nhiễm ở gia cầm. Chateau et al (1993) phân lập được 103 chủng Lactobacillus ssp từ hai sản phẩm DFM (cho ăn trực tiếp) thương mại và kiểm tra khả năng ức chế hai chủng Salmonella. Khoảng 47% Lactobacillus của sản phẩm A và 70% của sản phẩm B có thể ức chế tất cả 6 serotype E. coli. Ozayabal và Coner (1995) báo cáo rằng 3 chủng thương mại (L. acidophilus, L. casei và L. faecium) có thể ức chế sự phát triển của của 6 serotype Salmonella. Jin et al (1996) phát hiện ra rằng tất cả 12 chủng Lactobacillus có thể ức chế sự phát triển của 5 chủng Salmonella và 3 chủng E. coli . Các sản phẩm vi sinh từ Lactobacillus có Bacteriocin, acid hữu cơ và hydroperoxyd. Bacteriocin là hỗn hợp của các sản phẩm vi sinh vật có các thành phần protein sinh học chủ động và hoạt động vi sinh (Tag et al, 1976). Các chủng Lactobacillus có ở đường ruột của người và một số động vật thí nghiệm khác cũng sản xuất các chất giống Bacteriocin được gọi là Lactocidin (Vincent et al., 1995). Chất này họat động ở pH 5 - 7,8 và không mẫn cảm với các hoạt động xúc tác. Lactocidin thô có các hoạt động ức chế nhiều loại vi khuẩn bao gồm Proteus spp, Salmonelle spp, E. coli và Staphylococcus spp. Vì Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Vincent et al (1959) kết luận rằng L. acidophilus có thể đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các vi sinh vật có hại trong đường ruột của gia súc và người. Hoạt động đối kháng bởi vi khuẩn lactic có liên quan chặt chẽ với sản phẩm cuối của quá trình trao đổi chất. Hàng loạt các sản phẩm phụ của quá trình trao đổi do Lactobacillus có khả năng có hoạt động đối kháng (trong phòng thí nghiệm). Các sản phẩm phụ được biết tới nhiều nhất là các acid hữu cơ như acid lactic, acetic (Trammer, 1966; Sorrel và speck, 1970) và hydro peroxid (Wheater et al, 1952) Dahiafa và Speck, 1968); Price và Lee, 1970). Các acid acetic, lactic ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh Gram âm (Sorrel và Speck, 1970; Herrick, 1972): Adams và Hall (1988) phát hiện ra các hoạt động của các acid này phụ thuộc vào độ pH. Nếu độ pH thấp sẽ tăng mức độ acid ở dạng không hòa tan. 2.4.2.3. Sự loại trừ cạnh tranh Fuller (1977) báo cáo rằng các chủng Lactobacillus 59 và 74/1 có khả năng giảm E. coli trong diều và ruột non nhưng không làm giảm trong ruột già của gà. Muralidhara (1977) tìm ra rằng tính đồng nhất của các mô bào ruột non được cung cấp Lactobacillus lactic đã có nhiều Lactobacilli hơn và ít E. coli hơn các động vật bình thường hoặc tiêu chảy. Francis (1978) kết luận rằng việc thêm các chế phẩm Lactobacillus ở mức 75 mg/kg thức ăn đã giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng Coliform trong ruột non và ruột thừa ở gà tây. Watkin (1982) và Miller (1983) đã thấy sự giảm đáng kể E. coli trong đường dạ dày ruột của gà đã được cho ăn, uống Lactobacillus acidophilus. Tuy nhiên có nhiều yếu tố cần phải lưu ý nếu muốn nhận được kết quả tốt khi sử dụng probiotic. Trong đa số các trường hợp cần phải biết chắc chắn rằng các vi sinh vật cần phải sống sót và phát triển trong đường ruột phải có khả năng sống trong môi trường pH thấp và có khả năng chống lại tác dụng của mật. Để sống được trong đường ruột, các chủng vi sinh vật cần có khả năng đính vào và sinh sôi nảy nở ở trên bề mặt của ruột non. Mặc dù một vài tác giả đưa ra một số cơ chế giải thích tại sao vi sinh vật có lợi trong đường ruột có thể ức chế sự thâm nhập của vi sinh vật có hại (Rolfe, 1991) nhưng cơ chế chính xác của sự loại trừ cạnh tranh của vi sinh vật gây bệnh bằng probiotic vẫn chưa được khẳng định. Trong số các cơ chế này có sự cạnh tranh về vị trí, cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh về khối lượng các chất sinh ra bởi vi sinh vật. 2.4.2.4. Tăng thức ăn ăn vào và khả năng tiêu hóa Hệ vi khuẩn đường ruột của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thụ thức ăn ăn vào của vật chủ. Chúng tham gia vào sự trao đổi chất của các chất dinh dưỡng như là carbon hydrat, protein, lipid và khoáng. Các chất này cũng có vai trò trong sự tổng hợp các vitamin. Nahashon et al (1992, 1993, 1994, 1996) phát hiện rằng bổ sung lứa cấy Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp/ lúa mạch/ đậu nành đã kích thích tính thèm ăn và làm tăng tích lũy mỡ, nitơ, phospho, đồng và mangan cho gà đẻ. 2.4.2.5. Sự trao đổi chất của vi khuẩn. Hoạt tính enzyme tiêu hóa. Lactobacillus spp và Bacillus spp có khả năng sản xuất enzyme tiêu hóa trong điều kiện thí nghiệm và trong ruột. Chúng làm tăng khả năng tiêu hóa các chất dinh dưỡng đặc biệt trong ruột dưới (March, 1979; Sison, 1989). Những enzyme chúng tiết ra gồm: amylase, protease, và lipase…(Jin et al,1996). Những enzyme này có hoạt tính phân giải tinh bột, lipid và protein (Moon và Kim, 1989; Lee, 1990). Ngăn chặn sản sinh amoniac Ngăn chặn sự sản sinh amoniac và hoạt động của urease có thể là có lợi để cải thiện sức khỏe gia súc và làm tăng cường sinh trưởng của gia súc bởi vì amoniac được sản sinh do sự phân giải urê trong màng nhày ruột non có thể gây nên một sự thiệt hại đáng kể đến bề mặt của tế bào. Chiang và Hsieh (1995) báo cáo rằng probiotic (chứa L. acidophilus, S. faecium và B. subtilis) làm giảm nồng độ amoniac trong phân và chất độn chuồng của gà Broiler. 2.4.3. Vai trò của probiotic Probiotic tác dụng rất có lợi đối với cơ thể con người và động vật như: Trung hòa độc tố ruột. Kích thích hệ thống miễn dịch, đặc biệt quan trọng trong sự phát triển khả năng miễn dịch ở gia súc non chống lại những kháng nguyên có thể gây ra những phản ứng viêm. (Perdigon et. al,1990). Khả năng gắn vào tế bào ruột nhằm loại bỏ hay hạn chế sự gắn của các tác nhân gây hại. Tồn tại lâu dài và sinh sản nhanh. Tạo ra các acid, H2O2 và các Bacterion chống lại sự phát triển của các tác nhân gây bệnh. An toàn, không lan truyền rộng, không gây ung thư và không gây bệnh (Lê Thị Hồng Tuyết, 2004). Giúp ích cho tiêu hóa thức ăn đặc biệt một số loại vi khuẩn có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B, vitamin K… Có thể làm giảm cholestrol trong máu nếu sử dụng liều cao và thường xuyên. Giúp cải thiện được tình trạng không sử dụng được đường lactose. Gần đây nhất có nghiên cứu cho thấy người mẹ mang thai dùng thuốc có chứa Lactobacillus, sau khi sinh tiếp tục dùng trong thời gian cho con bú có thể giúp trẻ ngừa được một số bệnh dị ứng như eczema (Nguyễn Hữu Đức, Thuốc và sức khỏe số 202, 2001). 2.4.4. Một số chế phẩm probiotic có chứa B. subtilis và L.acidophilus hiện nay Hiện nay trên thị trường có bán rất nhiều chế phẩm sinh học dưới nhiều dạng khác nhau. Những chế phẩm này được dùng trong chăn nuôi và thủy sản như: Enzymbiosub của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng để phòng và trị các bệnh tiêu chảy cấp, mãn tính, rối loạn đường tiêu hóa của gia súc, gia cầm và cá, giúp tăng cường tiêu hóa, kích thích tăng trưởng. Chế phẩm men vi sinh EBS của công ty Vaccin và Sinh Phẩm Số 2 được dùng kích thích tôm, cá sử dụng triệt để nguồn thức ăn, giúp tôm, cá tiêu hóa tốt thức ăn và tăng trọng nhanh. Cải thiện môi trường nước, kích thích tảo có lợi, phiêu sinh vật phù du có trong ao nuôi, tạo nguồn thức ăn tự nhiên dồi dào cho tôm, cá. Ổn định hệ vi sinh vật có lợi trong đường ruột, lấn át, tiêu diệt các vi khuẩn có hại. Phòng và điều trị có hiệu quả các bệnh đường tiêu hóa, bệnh phân trắng, bệnh nhiễm trùng đường ruột cho tôm, cá… Baciflora For Shrimp của công ty liên doanh Bio – Pharmachemie có tác dụng tượng tự như các chế phẩm trên. Vime-bactevit, của công ty Vemedim Vietnam được dùng cho cá, tôm cũng có tác dụng tương tự. Lactogen của công ty Gấu Vàng được dùng cho heo gà cũng có tác dụng tương tự. Ngoài các chế phẩm trong nước còn có rất nhiều loại chế phẩm của nước ngoài được dùng trong chăn nuôi và thủy sản như: Protexin, Unleash, hay Florazyme efa …. 2.4.5. Một số đề tài đã nghiên cứu 2.4.5.1. Trong nước Theo Nguyễn Văn Đông (1993) đã khảo sát một số tính chất của vi khuẩn Bacillus subtilis dùng sản xuất chế phẩm Biosubtyl để phòng và trị bệnh tiêu chảy cho heo con. Ghi nhận vi khuẩn Bacillus subtilis không có độc lực khi truyền qua đường tiêu hóa, có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh: Staphylococcus aureus, E.coli. Năm 2001, Đậu Ngọc Hào, Phạm Minh Hằng, Nguyễn Chí Quốc đã nghiên cứu một số đặc tính trợ sinh học (probiotic) của Bacillus subtilis trong phòng bệnh đường tiêu hóa của gà và ghi nhận rằng Bacillus subtilis có khả năng ức chế sự sinh trưởng và phát triển của E. coli invitro. Gà được ăn chế phẩm Bacillus subtilis ở lượng 106 cfu/g có thể ổn định hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đặc biệt là E. coli, và có thể tồn tại trong chế phẩm với thời gian bảo quản là 6 tháng. Tạ Thị Vịnh và cộng tác viên (2002) đã nghiên cứu sử dụng chế phẩm Vitom3 (Bacillus subtilis chủng VKPMV – 7092) để phòng trị bệnh phân trắng cho heo con ghi nhận rằng Vitom3 có tác dụng kích thích tăng trọng, phòng bệnh heo con phân trắng, tỷ lệ mắc bệnh giảm 11%, tỷ lệ khỏi bệnh 100% và không có heo bị tái phát. Đinh Văn Cải, Phạm Hồ Hải và Võ Thị Hạnh (2004) đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ các loại men vi sinh bổ sung vào khẩu phần ăn của bò vắt sữa và bê sau cai sữa đã kết luận rằng bê được bổ sung 50 gam BIO-C tăng trọng cao hơn từ 48 – 49 g/ con/ ngày so với bê không bổ sung. Nguyễn Thị Lam Kiều, 2004 “Khảo sát đặc điểm sinh học của hai chủng Lactobacillus trong men tiêu hóa” ghi nhận chúng có khả năng chịu được mật từ 0,2 – 0,6%, ức chế E. coli và có khả năng sinh acid và tiêu thụ đường. Tăng Thị Rít, Nguyễn Thị Bích Thủy, Quan Quốc Đăng và Nguyễn Kim Trinh, 2004 đã tổng hợp chế phẩm sinh học SH bổ sung vào thức ăn tôm sú Penaeus monodon nhằm kích thích tăng trưởng và tăng sức đề kháng bệnh đốm trắng. Kết quả tỷ lệ pha trộn 1% chế phẩm vào thức ăn của tôm giúp tăng trọng hơn 10% và tỷ lệ tôm sống sót trên 80% sau 30 ngày gây nhiễm nhân tạo bệnh đốm trắng so với khoản 20% của lô không có bổ sung chế phẩm. 2.4.5.2. Ngoài nước Nhóm nghiên cứu của Alexopoulos (Đức) đã nghiên cứu hiệu quả của chế phẩm Bioplus 2B (chứa Bacillus subtilis và Bacillus licheniformis) lên trình trạng sức khỏe, tính năng sinh đẻ của heo nái và lên chất lượng thịt của heo thịt. Kết quả ghi nhận được khi bổ sung chế phẩm Bioplus 2B cho heo nái con và mẹ làm hạn chế sự giảm trọng lượng của heo mẹ trong thời kỳ tiết sữa (15,3 ± 3,6 đối với chế phẩm Bioplus 2B so với đối chứng là 18,8 ± 3,1. Làm cải thiện các thông số của máu và sữa (ngoại trừ lactose và chất rắn). Ngoài ra nhóm nghiên cứu còn kết luận chế phẩm Bioplus 2B có ảnh hưởng đến tình trạng sức khỏe và tính năng sinh sản của heo nái và làm tăng phẩm chất quầy thịt ở heo đang lớn. Nhóm nghiên cứu của Sirirat Rengpipat (Thái Lan) về tác dụng của probiotic trong nuôi tôm sú (Penaeus monodon) ghi nhận rằng Bacillus dòng S11 không hạn chế quá trình nở của Artemia, làm tăng trọng lượng và chiều dài của ấu trùng tôm (trọng lượng là 43,8 mg so với 26 mg so với đối chứng, chiều dài (cm) là 1,83 ± 0,31 so với đối chứng là 1,71 ± 0,2. Tôm có tỷ lệ sống sót cao (13% so với 4% đối chứng) khi thử nghiệm với Virio harveyi (vi khuẩn gây bệnh phát sáng). Ngoài ra nhóm còn kết luận Bacillus dòng S11 không có ảnh hưởng đến chất lượng nước ao nuôi và Arterma là vật mang probiotic có hiệu quả. 2.5. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME Enzyme hay còn gọi là “men” là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Chúng có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà nó còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “invitro”. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên enzyme còn được gọi là chất xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác. Hình 2.3. Enzyme α-amylase 2.5.1. Enzyme amylase Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác trong đời sống. Những nghiên cứu đầu tiên về enzyme amylase được bắt đầu vào những năm 1811 - 1814. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Cho mãi tới thời gian gần đây người ta mới thu nhận amylase từ malt. Hiện nay người ta thu amylase từ canh trường vi sinh vật chủ yếu là từ vi khuẩn, nấm mốc và một số loài nấm men (Nguyễn Quyết, 2004). 2.5.1.1. Đặc điểm enzyme α-amylase Enzyme amylase có thể thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Hiện nay người ta đã biết enzyme amylase được vi khuẩn và nấm sợi tổng hợp nhiều nhất, còn ở các loài vi sinh vật khác khả năng này yếu hơn. Các loại enzyme amylase thường gặp khi nuôi cấy vi sinh vật gồm: α-amylase (α- 1,4 glucan-4-glucanhydrolase), ß-amylase (α-1,4glucan-4-maltohydrolase), γ-amylase (glucoamylase). Trong đó vi khuẩn Bacillus subtilis có thể tổng hợp nên α-amylase. α-amylase thủy phân liên kết α -1,4 glucoside ở giữa mạch polysaccharide chính vì thế nhiều tài liệu còn gọi chúng là endoamylase. Dưới tác dụng của α-amylase tinh bột sẽ mất khả năng tạo màu với iod và độ nhớt bị giảm rất nhanh, α-amylase thường bền nhiệt hơn các loại amylase khác. Khi có mặt ion calci cấu trúc của α-amylase sẽ bền hơn, và kém bền trong môi trường acid. Khi α-amylase tác dụng vào tinh bột, sản phẩm tạo thành của phản ứng này bao gồm: dextrin (trong đó chủ yếu là dextrin phân tử lượng thấp), maltose, glucose. α-amylase từ nguồn khác nhau có thành phần acid amin khác nhau, song chúng đều có khá nhiều tyrosin và tryptophan còn methionin rất ít và chỉ có khoảng 7 - 10 gốc cystein. α-amylase của Bacillus subtilis không có các liên kết disulfit và disunithidin. Hoạt độ của chúng có liên quan mật thiết với sự có mặt của ion calci trong phân tử vì ion này được dùng để duy trì hình thể hoạt động của enzyme, từ đó nó có vai trò quan trọng trong việc ổn định hoạt tính của enzyme và tăng cường độ bền của α-amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy protease. Phản ứng thủy phân tinh bột bằng α-amylase thường xảy ra hai giai đoạn: Giai đoạn đầu: Chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh, người ta gọi đây là giai đoạn dịch hóa. Giai đoạn 2: thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa được tạo thành. Nhờ đó tinh bột có thể chuyển thành maltotriose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu thành dextrin phân tử thấp không cho màu với iốt và một ít maltose. Theo số liệu của Liphsis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Bacillus subtilis là giống nhau và nằm trong vùng pH 5,6 – 6,2. Còn số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6 – 7, bị vô hoạt hoàn toàn ở pH = 1 và bị vô hoạt một phần ở pH = 8. 2.5.1.2. Ứng dụng của α-amylase Amylase là một trong những enzyme quan trọng nhất trong ngành công nghệ sinh học hiện nay do có những ứng dụng hết sức rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, lên men, công nghiệp dệt, sản xuất giấy và trong nông nghiệp. Trong công nghiệp rượu – bia Vài chục năm trở lại đây chế phẩm amylase từ nấm mốc (Aspergillus oryzae, Asp. awamori,…) hoặc từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus) được thay thế malt (đại mạch nảy mầm) làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có tinh bột. Trong sản xuất bánh mì Khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng của bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng, độ xốp của bánh mì. Trong công nghiệp dệt Chế phẩm amylase được dùng để rủ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải mộc thường chứa 5% tinh bột và nhiều tạp chất khác. Để làm vải mềm, có khả năng nhúng ướt, tẩy trắng và bắt màu tốt thì phải tách tinh bột và người ta thường sử dụng enzyme amylase từ vi khuẩn (Bacillus subtilis, Bacillus mesentricus) hay từ nấm mốc. Khi rủ hồ vải thì lượng chế phẩm tính cho dung dịch là 0,3 – 0,6g. Nhiệt độ xử lý là 90oC, thời gian từ 5 – 15 phút. Trong sản xuất thức ăn gia súc Sử dụng amylase của Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, hay B. subtilis thêm vào thức ăn giàu tinh bột của động vật nhất là động vật còn non làm tăng khả năng đồng hóa thức ăn dẫn đến tăng trọng nhanh. Trong nghiên cứu sinh học Có rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của amylase. Một dung dịch bền vững chứa α-amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy rất cao. 2.5.2. Enzyme protease 2.5.2.1. Nguồn thu nhận enzyme protease Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease như: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, xạ khuẩn, Str. griseus, Str. rimosus… và một số loài nấm mốc Asp. oryzae, Asp. niger…(Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.5.2.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: Hình 2.4. Enzyme protease Protease – xerin Protease – tiol Protease – kim loại Protease – acid Một số tác giả khác chia protease ra ba nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm: Protease acid: pH < 3 được ứng dụng trong sản xuất bia và công nghiệp bánh kẹo. Protease trung tính: proteinase trung tính là metalloenzyme, chúng có pH hoạt động 6 - 7, chúng thường được sản xuất từ Bacillus subtilis, Bacillus thermoproteolyticus. Protease kiềm: chúng có khoảng pH hoạt động 9 - 11, trong trung tâm hoạt động của chúng có serine. Trong bốn nhóm kể trên, các protease-xerin và protease-tiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của amino acid. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của aminoacid. Các protease-xerin có trọng lượng phân tử vào khoảng 20.000 - 27.000 dalton, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-xerin vào khoảng 33.800 - 48.400 dalton. Protease tiol và nhiều protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton. Trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aminoacid khác. Ví dụ histidin thường tham gia trong trung tâm hoạt động của các proteae-xerin, protease tiol còn tyrosin là trung tâm hoạt động của các protease kim loại. Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E + S E – S E – S’ + P1 E + P2 Trong đó: E – là enzyme, S – là cơ chất. E - S – là phức chất enzyme – cơ chất E - S’ – là phức chất trung gian enzyme – cơ chất hóa (axilenzyme). P1 – là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amine tự do mới được tạo thành) P2 – là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do mới được tạo thành). 2.5.3. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Hiện nay người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme. Ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). 2.5.3.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Hiện nay người ta sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme: Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme đã xác định trước. Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm. 2.5.3.2. Đơn vị hoạt độ Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme. Hoạt độ hoạt động của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị: Đơn vị hoạt độ quốc tế (UI) Đơn vị Katal (Kat) Đơn vị hoạt độ riêng Đơn vị hoạt độ riêng phân tử Ngoài ra còn có nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như: đơn vị Wohgemuth cải tiến (MWU), đơn vị SKB, GAU, NU, HU, AU... Các đơn vị hoạt độ này được trình bày chi tiết ở mục 3.7 phần phụ lục. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Khóa luận được thực hiện từ ngày 15/2/2005 đến 15/6/2005 tại phòng thí nghiệm Vi Sinh khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.2.1. Giống vi khuẩn Chế phẩm chúng tôi sản xuất sử dụng hai loại vi khuẩn: Bacillus subtilis ATCC - 6633 được cung cấp từ khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Công thành phố Hồ Chí Minh. Lactobacillus acidophilus được phân lập từ chế phẩm Antibio do Hàn Quốc sản xuất. 3.2.2.Thiết bị - dụng cụ Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy, giá đỡ ống nghiệm, nồi hấp autoclave, tủ lạnh, giấy đo pH, kính hiển vi, cân, máy lắc, đường kế, bếp điện… Dụng cụ: ống nghiệm, que cấy, đĩa petri, pipet, micropipet, đầu type vô trùng, que cấy trang, đũa thủy tinh, khăn giấy… 3.2.3. Hóa chất Các loại thuốc nhuộm: crystal violet, fushin, lugol… Thuốc thử kowac, methyl red, NaOH 1N, HCl 1N, H2O2 30%, dầu soi kính, cồn... Dung dịch tinh bột 0,1%, dung dịch NaCl 0,1%, dung dịch iốt 0,02%, dung dịch casein 0,1%... 3.2.4. Môi trường nuôi cấy 3.2.4.1. Đối với Bacillus subtilis Môi trường tăng sinh nutrien broth (NB) Môi trường giữ giống và đếm số lượng tế bào nutrien agar (NA) Môi trường nhân giống cấp1: môi trường Frage, môi trường pepton – gelatin, môi trường chứa mật rỉ đường + 2 % tinh bột, môi trường Edward và môi trường Nomura. Môi trường sản xuất: bắp, đậu nành, bột sữa, bột mì… Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.2.4.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Môi trường tăng sinh chọn lọc MRSB Môi trường phân lập MRSA Môi trường nuôi cấy và thử các phản ứng sinh hóa Môi trường sản xuất: môi trường sữa đặc có đường và môi trường sữa đậu nành. Thành phần và tỉ lệ các loại môi trường được trình bày chi tiết ở mục 1 phần phụ lục. 3.3. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.3.1. Đối với Bacillus subtilis 3.3.1.1. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 Cách tiến hành: Giống gốc chứa Baclillus subtilis được tăng sinh trong môi trường NB có pH = 7 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ 37oC. Sau 24 giờ cho dung dịch tăng sinh này vào từng loại môi trường: Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường + tinh bột 2%, và pepton-gelatin với các điều kiện khảo sát: Nhiệt độ: nhiệt độ phòng Lượng giống: 5% pH = 7 Thời gian nuôi cấy là 48 giờ Nhu cầu oxi: sử dụng máy lắc Sau 48 giờ nuôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase và protease. Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trực tiếp trên lame (được trình bày ở mục 3.6 phần phụ lục) Phương pháp kiểm tra hoạt độ enzyme: Kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth (xem mục 3.1 phần phụ lục) Kiểm tra hoạt độ enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld (Xem mục 3.2 phần phụ lục) Môi trường Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 Edward Fragie Nomura Pepton - gelatin Rỉ đường + tinh bột 2% Sau khi kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme trên từng loại môi trường chúng tôi chọn được môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất để tiếp tục nhân giống trên môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được lập lại 3 lần. Sơ đồ 3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Bacillus subtilis Giống gốc Bacillus subtilis Môi trường NB (nutrien broth) Tăng sinh Môi trường Nomura s Môi trường Fragie su Môi trường rỉ đường +2 % tinh bột s s Môi trường Edwards Môi trường pepton - gelatin 5 % giống 48 giờ, to phòng Kiểm tra Hoạt tính enzyme amylase Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Hoạt tính enzyme protease Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Bảo quản, kiểm tra Chọn môi trường tối ưu nhất Môi trường A Môi trường B Môi trường D Môi trường C 10 % giống Chọn môi trường tối ưu nhất Môi trường E 3.3.1.2. Khảo sát khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn lọc được môi trường nhân giống cấp 1 tốt nhất chúng tôi tiến hành xác định môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như sau: Môi trường sử dụng là môi trường bán rắn gồm 5 loại môi trường A, B, C, D và E có bổ sung CaCO3 2% để ổn định pH môi trường. Tất cả các loại môi trường trước khi đem nuôi cấy đều được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 - 20 phút. Các thành phần môi trường này được trình bày chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục. Lượng giống sử dụng ở môi trường nhân giống cấp 2 là 10%, với độ ẩm 60 – 65%, pH = 7. Từng loại môi trường được đặt trong các khay bằng nhựa có kích cỡ 0,5 × 0,25 × 0,08 m, mỗi khay chứa 0,6 kg môi trường. Trong quá trình nuôi phải giữ ẩm cho môi trường bằng cách phủ vải ẩm. Sau thời gian 72 giờ nuôi bắt đầu thu hoạch sau đó đem sản phẩm này kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme amylase, protease. Sau khi kiểm tra trên tất cả các môi trường A, B, C, D và E chúng tôi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 cho sinh khối và hoạt độ enzyme cao nhất để tiến hành sản xuất. Mỗi môi trường thí nghiệm được lập lại 3 lần. Môi trường Số lượng tế bào vi khuẩn Hoạt độ enzyme amylase Hoạt độ enzyme protease Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần3 A B C D E 3.3.1.3. Sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Nước 60 – 65 % so với nguyên liệu Môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu Khoáng hỗn hợp Hấp khử trùng 1210C trong 20 - 25 phút Đổ lên khay Làm nguội đến 37oC Nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng Giống Bacillus subtilis 10% Sấy khô 40 - 45oC Đánh tơi Xay mịn Đóng gói, kiểm tra và bảo quản Sơ đồ 3.2. Sơ đồ quy trình sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis Chế phẩm chứa Bacillus subtilis Sau khi tìm được môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện tương tự như thí nghiệm 3.3.1.2. Sau thời gian nuôi 72 giờ bắt đầu thu hoạch và đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem đóng gói, kiểm tra và bảo quản. Quy trình sản xuất được thực hiện theo sơ đồ 3.2. 3.3.1.4. Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ enzyme Chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau khi sấy khô tiến hành kiểm tra số lượng và hoạt độ enzyme amylase, protease và sau thời gian bảo quản 10, 20, 30 ngày ở nhiệt độ phòng. Phương pháp kiểm tra tương tự như thí nghiệm 3.3.1.1. Phân lập Chế phẩm Antibio (chứa L. acidophilus) MRSA MRSB tăng sinh (24 giờ /37oC) Môi trường sữa đặc có đường Môi trường sữa đậu nành 24 giờ, nhiệt độ phòng Kiểm tra Số lượng vi khuẩn có trong 1ml Độ chua Therne Chọn khuẩn lạc điển hình Kiểm tra sinh hóa Xác định Lactobacillus acidophilus Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đối với Lactobacillus acidophilus Kiểm tra, đóng gói và bảo quản Sản xuất chế phẩm chứa L. acidophilus trên môi trường tối ưu Chọn ra môi trường tối ưu 3.3.2. Đối với Lactobacillus acidophilus 3.3.2.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Mẫu phân lập: sử dụng chế phẩm Antibio chứa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus do Hàn Quốc sản xuất. 1ml Quy trình phân lập: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml Đồng nhất và pha loãng mẫu Môi trường phân lập MRSA Cấy giữ giống Chọn khuẩn lạc điển hình, nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa Môi trường giữ giống MRSA Sơ đồ 3.4. Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus 10-2 10-3 1 gam mẫu + 9ml dd NaCl 90/00 10-4 10-1 10-7 10-6 10-5 Cách tiến hành Cho 1 gam chế phẩm Antibio hòa vào 9 ml nước muối sinh lý (nồng độ 9 o/oo) sau đó lắc đều sao cho dung dịch trở nên đồng nhất ta được dung dịch có nồng độ pha loãng 10-1. Tiếp theo lấy 1ml dung dịch 10-1 cho vào 9 ml dung dịch NaCl 9 o/oo ta được dung dịch có nồng độ 10-2. Tiếp tục như thế cho đến khi được các dung dịch có nồng độ 10-6, 10-7. Dùng micropipet hút 0,2 ml dịch khuẩn ở nồng độ 10-6, 10-7 (mỗi nồng độ cho vào 2 đĩa) trang đều trên mặt thạch chứa môi trường MRSA sau đó đem ủ ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ và chọn khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc tròn đều, nhô lên và bên ngoài có vòng trong) đem nhuộm Gram và cấy giữ giống. Những khuẩn lạc nghi ngờ này được tăng sinh trong môi trường MRSB trong 24 giờ ở nhiệt độ 37oC để tiến hành thử các phản ứng sinh hóa. Xác định vi khuẩn Lactobacillus acidophilus Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus xác định dựa trên các phương pháp truyền thống như: Quan sát hình dạng tế bào khuẩn lạc và sự bắt màu khi nhuộm Gram. Thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa. Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đông vón sữa Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose 3.3.2.2. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đặc có đường Giống L. acidophilus sau khi phân lập được tăng sinh trên môi trường MRSB trong thời gian 24 giờ ở 37oC. Sau đó cho lượng giống 5 % vừa tăng sinh này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ là:15%, 20% và 25% sữa. Sau thời gian nuôi 24 giờ với pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne của từng loại môi trường. Nồng độ sữa (%) Độ chua Therne (g) Số lượng tế bào vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 15 20 25 3.3.2.3. Khảo sát số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua Therne trên môi trường sữa đậu nành Tương tự như ở thí nghiệm 3.3.2.2 sử dụng 5% giống cho vào môi trường sữa đậu nành với nồng độ đậu nành là 10%, 15% và 20%. Ứng với mỗi nồng độ đậu chúng tôi khảo sát từng nồng độ đường cho vào là 0%, 10%, 15% và 20%. Những nồng độ này được ký hiệu như sau: Ở nồng độ 10% đậu có bổ sung từng hàm lượng đường là 0%,10%,15% và 20% được ký hiệu lần lượt là NA0, NA10, NA15, NA20. Tương tự ở nồng độ 15% đậu có: NB0, NB10, NB15 và NB20. Ở nồng độ 20% đậu có: NC0, NC10, NC15 và NC20. Sau thời gian nuôi cấy là 24 giờ, pH = 6,5 - 7 ở nhiệt độ phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn tương tự như thí nghiệm 3.3.2.2. Nồng độ đậu nành Kí hiệu Độ chua Therne Số lượng tế bào vi khuẩn Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 10% NA0 NA10 NA15 NA20 15% NB0 NB10 NB15 NB20 20% NC0 NC10 NC15 NC20 3.3.2.4. Tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Từ kết quả khảo sát độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn ở hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành chúng tôi chọn được môi trường tối ưu nhất để tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. Sau 24 giờ nuôi trên môi trường tối ưu ở nhiệt độ phòng với lượng giống cho vào là 5%. Chúng tôi bắt đầu thu hoạch và đem phối trộn với bột đậu nành khô đã qua khử trùng (sấy 100oC trong 2giờ). Tỷ lệ phối trộn là 1:1 sau đó đem sấy ở nhiệt độ 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sản phẩm này được xây mịn, đóng gói sau đó đem kiểm tra và bảo quản ở nhiệt độ phòng. 3.3.2.5. Kiểm tra sản phẩm sau thời gian bảo quản Sản phẩm sau khi sấy khô chúng tôi tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 gam sản phẩm và sau thời gian bảo quản 10 và 20 ngày bằng phương pháp đếm số lượng tế bào sống trên thạch (được trình bày chi tiết ở mục 3.5 phần phụ lục). 3.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.4.1. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab release 13.20 để so sánh sự khác biệt giữa các môi trường. Đối với thí nghiệm trên Bacillus subtilis Môi trường nhân giống cấp 1 và môi trường nhân giống cấp 2 chúng tôi dùng dùng trắc nghiệm 1 yếu tố để xem tác động của: Môi trường lên số lượng tế bào vi khuẩn Môi trường lên hoạt độ enzyme amylase Môi trường lên hoạt độ enzyme protease Đối với thí nghiệm trên Lactobacillus acidophilus Môi trường sữa đặc có đường dùng trắc nghiệm một yếu tố để xem ảnh hưởng của nồng độ sữa lên số lượng và độ chua của L. acidophilus. Môi trường sữa đậu nành dùng trắc nghiệm hai yếu tố là nồng độ đậu nành và hàm lượng đường trong sữa đậu nành để: So sánh sự khác biệt giữa từng nồng độ đậu và từng hàm lượng đường lên số lượng và độ chua Therne của sữa. Ảnh hưởng của nồng độ đậu và hàm lượng đường lên số lượng và độ chua của sữa. 3.4.2. Biểu đồ Biểu đồ được vẽ bằng phần mềm Excel phiên bản 2003. Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐỐI VỚI BACILLUS SUBTILIS 4.1.1. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 1 Sau khi nuôi cấy trên 5 loại môi trường Edward, Fragie, pepton-gelatin, Nomura và rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột trong thời gian 48 giờ ở nhiệt độ phòng, pH = 7 chúng tôi tiến hành theo dõi các chỉ tiêu về số lượng, khả năng sinh enzyme amylase, protease với kết quả như sau. 4.1.1.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 4.1. Số lượng tế bào Bacillus subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 1 Môi Trường Edward Fragie Nomura pepton-gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Lặp lại (n) (×1010 cfu/g) SD CV% 3 1,5667a 0,21455 13,69 3 1,3600b 0,391 28,78 3 1,4267b 0,411 28,83 3 0,4537c0,0773 17,05 3 1,9200d 0,2455 12,78 Ghi chú : Chữ a, b, c, d chỉ sự khác biệt về mặt thống kê giữa từng loại môi trường Qua bảng 4.1 chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào trung bình ở môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là cao nhất ở mức 1,92 ×1010 cfu/ml. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các loại môi trường là có ý nghĩa (P < 0,01). 4.1.1.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Sau 48 giờ nuôi ở nhiệt phòng chúng tôi tiến hành kiểm tra hoạt độ enzyme amylase bằng phương pháp Wolhgemuth và enzyme protease bằng phương pháp Gross + Fuld. Kết quả ghi nhận được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột có khả năng cho hoạt độ enzyme amylase cao nhất là 256 W0/ml và protease là 128 Hđp/ml. Qua xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt giữa các môi trường là rất có ý nghĩa (P < 0,001). Kết quả khảo sát được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp1 Môi trường Enzyme Edward Fragie Nomura pepton-gelatin Rỉ đường + 2% tinh bột Amylase Lặp lại (n) (W0/ml) SD Cv% 3 8a 0 0 3 16b 0 0 3 26,67c 9,2376 34,63 3 10,67a 4,6188 43,28 3 256d 0 0 Protease Lặp lại (n) (Hđp/ml) SD Cv% 3 8a 0 0 3 13,33b 4,6188 34,64 3 16b 0 0 3 32c 0 0 3 128d 0 0 Hình 4.1. Xác định hoạt độ amylase theo phương pháp Wolhegemuth Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch không có màu xanh Đối chứng (-) không có enzyme: dung dịch có màu xanh Hình 4.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Gross + Fuld Đối chứng (+) có enzyme: dung dịch trong Đối chứng (-) không có enzyme: dung dịch đục có kết tủa trắng Qua kết quả khảo sát số lượng tế bào/ml, hoạt độ enzyme amylase, protease trên môi trường nhân giống cấp 1. Chúng tôi nhận thấy rằng môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường tối ưu nhất trong 5 loại môi trường khảo sát. Từ đây chúng tôi quyết định chọn môi trường này là môi trường nhân giống cấp 1 thích hợp nhất để sử dụng cho môi trường nhân giống cấp 2. 4.1.2. Kết quả về khả năng tăng sinh khối và enzyme của Bacillus subtilis trên môi trường nhân giống cấp 2 Sau khi chọn được môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường nhân giống cấp 1 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành tìm môi trường nhân giống cấp 2. Thí nghiệm được bố trí trên 5 loại môi trường mà chúng tôi tự tổng hợp và được ký hiệu lần lượt A, B, C, D, E (thành phần môi trường xem chi tiết ở mục 1.11 phần phụ lục). Lượng giống bổ sung vào là 10%, pH = 7. Sau thời gian nuôi 72 giờ ở nhiệt độ phòng bắt đầu thu hoạch và kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease trên từng loại môi trường này. Kết quả được ghi nhận ở bảng 4.3 và 4.4. 4.1.2.1. Khả năng tăng sinh khối Bảng 4.3. Số lượng tế bào B. subtilis trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2 Môi Trường A B C D E Lặp lại (n) (×1010 cfu/g) SD CV% 3 345,67a 126,595 36,62 3 155,33b 55,229 35,55 3 11,368c 1,362 11,98 3 13,26c1,623 12,24 3 12,74c 2,619 20,56 Qua bảng 4.3 chúng tôi nhận thấy rằng môi trường A cho số lượng tế bào cao nhất là 345,67×1010 cfu/g. Qua xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các môi trường là rất có ý nghĩa (P < 0,001). Giữa các môi trường C, D, E thì không thấy có sự khác biệt về số lượng tế bào /gam. Hình 4.3. Kiểm tra số lượng vi khuẩn B. subtilis trên môi trường A 4.1.2.2. Khả năng sinh enzyme amylase và protease Sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ phòng chúng tôi kiểm tra hoạt độ enzyme amylase và protease trên từng loại môi trường nhân giống cấp 2. Kết quả được ghi nhận trong bảng 4.4. Bảng 4.4. Hoạt độ enzyme amylase và protease trên môi trường nhân giống cấp 2 Môi trường Enzyme A B C D E Amylase Lặp lại (n) (W0/ml) SD Cv % 3 160a 0 0 3 160a 0 0 3 80b 0 0 3 80b 0 0 3 80b 0 0 Protease Lặp lại (n) (Hđp/ml) SD Cv % 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 80a 0 0 3 40b 0 0 Qua bảng 4.4 chúng tôi nhận thấy hoạt độ enzyme amylase và protease cao nhất ở môi trường A và B. Qua kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa từng loại môi trường lên khả năng tạo enzyme của Bacillus subtilis là có ý nghĩa (P < 0,05). Sau khi khảo sát chúng tôi nhận thấy ở môi trường A và B thì có sự tương đồng về khả năng sinh enzyme amylase và protease. Tuy nhiên khi xét đến khả năng tạo sinh khối thì môi trường A là môi trường tối ưu nhất. Từ kết quả khảo sát số lượng và hoạt độ enzyme trên môi trường A, B, C, D và E. Chúng tôi quyết định chọn môi trường A làm môi trường sản xuất thích hợp nhất để sản xuất chế phẩm chứa B. subtilis. A B Hình 4.4 . Sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis( màu trắng) trên môi trường A và B. 4.1.3. Kết quả kiểm tra số lượng B. subtilis và hoạt độ enzyme sau khi sản xuất chế phẩm Sau khi chọn được môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 tối ưu nhất chúng tôi tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa Bacillus subtilis. Cách thực hiện giống như thí nghiệm 3.3.1.2. Lượng giống sử dụng là 10% và tiến hành nuôi ở nhiệt độ phòng, pH = 7. Sau khi thu hoạch chúng tôi tiến hành sấy trong 2 ngày ở nhiệt độ 40 - 450C sao cho sản phẩm khô hoàn toàn. Sau đó đem kiểm tra, đóng gói và bảo quản. Kết quả kiểm tra số lượng tế bào, hoạt độ enzyme trong chế phẩm trước thời gian bảo quản là: Số lượng tế bào vi khuẩn: 58,9 × 1010 cfu/g  Hoạt độ enzyme amylase: 160 Wo/ml Hoạt độ enzyme protease: 80 Hđp/ml Hình 4.5. Hoạt độ amylase trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis Hình 4.6. Hoạt độ protease trong chế phẩm chứa Bacillus subtilis 4.1.4. Kết quả kiểm tra chế phẩm chứa Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Chế phẩm sau khi sản xuất chúng tôi tiến hành đóng gói và đem bảo quản ở nhiệt độ phòng. Sau đó kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn, hoạt độ enzyme amylase, protease trong thời gian bảo quản là 10, 20 và 30 ngày. Kết quả ghi nhận được ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis trong thời gian bảo quản Chế độ bảo quản Thời điểm kiểm tra (ngày) Số lượng tế bào (×109 cfu/g) Hoạt độ amylase (W0/ml) Hoạt độ protease (Hđp/ml) Nhiệt độ thường 10 20 30 118 88.9 68.9 160 160 160 80 80 80 Như vậy sau khi kiểm tra chế phẩm ở 30 ngày chúng tôi ghi nhận sản phẩm chứa Bacillus subtilis do chúng tôi sản xuất có số lượng tế bào là 68,9 × 109 cfu/g, hoạt độ amylase là 160W0/ml và hoạt độ protease là 80 Hđp/ml Quy đổi hoạt độ enzyme amylase và protease sang đơn vị quốc tế. Hoạt độ amylase 160 Wo/g ~ 6576 UI/ml Hoạt độ protease 80 Hđp/ml ~ 572,8 UI/ml Biểu đồ 4.1. Số lượng vi khuẩn Bacillus subtilis sau thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Số lượng cfu/g 4.2. ĐỐI VỚI LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 4.2.1. Đặc điểm của Lactobacillus acidophilus 4.2.1.1. Quan sát đại thể Sau khi phân lập Lactobacillus acidophilus từ chế phẩm chúng tôi chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường thạch đĩa MRSA có dạng tròn, nhỏ, ở giữa dày và đục hơn mép bên ngoài, xung quanh khuẩn lạc có vòng trong. Sau thời gian 48 giờ ở tâm khuẩn lạc có màu hơi vàng, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 2 mm. Hình 4.7. Vi khuẩn L. acidophilus trên môi trường MRSA 4.2.1.2. Quan sát vi thể Sau khi quan sát hình dạng bên ngoài chúng tôi tiến hành nhuộm Gram những khuẩn lạc nghi ngờ và quan sát trên kính hiển vi với vật kính 100 (độ phóng đại là 1000 lần). Qua quan sát trên kính hiển vi chúng tôi nhận thấy vi khuẩn có dạng hình que, hai đầu tròn, kích thước trung bình từ 0,6 - 0,9 × 1,5 – 6 µm. Chúng tồn tại dạng đơn, cặp đôi hay đôi khi tạo chuỗi ngắn, bắt màu tím (Gram dương) và không có bào tử. 4.2.1.3. Đặc điểm sinh hóa Từ chủng Lactobacillus acidophilus nghi ngờ chúng tôi tiến hành tăng sinh chúng trong môi trường MRSB ở 24 giờ /37oC. Sau đó thử các phản ứng sinh hóa để xác định vi khuẩn vừa phân lập. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. Bảng 4.6. Kết quả thử phản ứng sinh hóa của Lactobacillus acidophilus Phản ứng Kết quả Lên men đường Kết quả Indol VP MR Citrat Nitrat Di động Catalase Khả năng đông vón sữa - - + - - - - + Lactose Sucrose Glucose Manitol Rabinose + + + - - Hình 4.8. Khả năng lên men đường của Lactobacillus acidophilus Từ kết quả 4.2.1.1, 4.2.1.2 và 4.2.1.3 chúng tôi kết luận được chủng vi khuẩn phân lập từ chế phẩm đó là vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Từ chủng vừa phân lập được này tiến hành khảo sát khả năng đông vón sữa và kiểm tra số lượng tế bào của chúng trên hai loại môi trường sữa đặc có đường và sữa đậu nành. 4.2.2. Kết quả kiểm tra số lượng L. acidophilus và độ chua Therne trên từng loại môi trường 4.2.2.1. Trên môi trường sữa đặc có đường Sau khi tăng sinh trên môi trường MRSB ở 37oC / 24 giờ chúng tôi cho lượng giống 5% này vào môi trường sữa đặc có đường với từng nồng độ là 15%, 20% và 25%. Sau thời gian nuôi 24 giờ ở nhiệt độ phòng tiến hành kiểm tra độ chua Therne và số lượng tế bào vi khuẩn có trong 1 ml dịch môi trường. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7 và 4.8. Bảng 4.7. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường Nồng độ sữa 15 % 20 % 25 % Lặp lại (n) (g/100ml) SD CV % 3 0,8233a 0,045 5,477 3 0,9420b 0,059 6,361 3 1,169c 0,046 4,009 Bảng 4.8. Số lượng của L. acidophilus trên môi trường sữa đặc có đường. Nồng độ sữa 15 % 20 % 25 % Lặp lại (n) ( ×109 cfu/ml) SD CV % 3 8,83a 0,317 3,59 3 11,017b 1,086 9,86 3 21,967c 3,350 15,25 Qua bảng 4.7 và 4.8 chúng tôi nhận thấy nồng độ sữa càng cao thì khả năng tạo độ chua và sinh khối của vi khuẩn L. acidophilus càng nhiều. Độ chua và số lượng tế bào vi khuẩn cao nhất ở môi trường có nồng độ 25% sữa. Kết quả xử lý thống kê cho thấy có sự khác biệt giữa các nồng độ lên số lượng tế bào vi khuẩn và độ chua là có ý nghĩa (P < 0,001). 4.2.2.2. Trên môi trường sữa đậu nành Tương tự như cách thực hiện trên môi trường sữa đặc có đường chúng tôi bố trí thí nghiệm trên môi trường sữa đậu nành ở từng nồng độ đậu có bổ sung từng hàm lượng đường khác nhau. Kết quả thu được trình bày ở 4.9 và 4.10. Bảng 4.9. Khả năng tạo độ chua của L. acidophilus trên môi trường sữa đậu nành. Nồng độ Kết quả 10% 15% 20% NA0 NA10 NA15 NA20 NB0 NB10 NB15 NB20 NC0 NC10 NC15 NC20 Lặp lại (n) (g/100ml) SD CV % 3 1,05 0,035 3,38 3 1,27 0,045 3,54 3 1,32 0,047 3,57 3 1,41 0,035 2,47 3 1,0 0,017 1.61 3 1,27 0,066 5,25 3 1,6 0,017 1,08 3 1,70 0,024 1,42 3 1,13 0,055 4,08 3 1,41 0,047 3.35 3 1,61 0,034 2,15 3 1,8 0,025 1,39 Bảng 4.10. Số lượng của Lactobacillus acidophilus trên môi trường sữa đậu nành Nồng độ Kết quả 10% 15% 20% NA0 NA10 NA15 NA20 NB0 NB10 NB15 NB20 NC0 NC10 NC15 NC20 Lặp lại (n) (× 1010 cfu/g) SD CV % 3 1,093 0,066 6,08 3 1,126 0,267 23,75 3 1,37 0,157 11,47 3 1,45 0,088 6,12 3 3,60 0,156 4,33 3 5,68 0,682 12 3 7,316 0,301 4,11 3 7,993 0,507 6,35 3 3,61 0,19 5,26 3 6,04 0,359 5,94 3 7,596 0,175 2,31 3 8,093 0,102 1,26 Qua bảng 4.9 và 4.10 cùng với kết quả xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy nồng độ đậu và hàm lượng đường có ảnh hưởng đến khả năng tạo độ chua và số lượng tế bào của vi khuẩn L. acidophilus (với P < 0,001). Độ chua và số lượng đạt cao nhất ở môi trường NC20. Tuy nhiên sau khi xử lý thống kê nhận thấy không có sự khác biệt giữa môi trường NB15 và NC20 (P = 0,1113) hay NB15 và NB20 (P = 0,1520). Như vậy xét về mặt kinh tế ở môi trường NB15 là môi trường cho hiệu quả kinh tế cao. Như vậy qua kết quả ở trên chúng tôi quyết định chọn môi trường NB15 làm môi trường sản xuất chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus. 4.2.3. Kết quả sản xuất thử và kiểm tra chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus Sau khi chọn được môi trường NB15 là môi trường tối ưu nhất, chúng tôi tiến hành sản xuất thử chế phẩm chứa L. acidophilus. Sau khi nuôi trên môi trường NB15 trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng chúng tôi phối trộn với bột đậu nành đã được sấy khử trùng với tỷ lệ là 1:1. Hỗn hợp được sấy khô ở 40 - 45oC trong 2 ngày sao cho khô hoàn toàn sau đó đem kiểm tra số lượng tế bào Lactobacillus acidophilus có trong 1 gam sản phẩm và tiến hành đóng gói đem bảo quản ở nhiệt độ phòng. Kết quả kiểm tra được trình bày ở bảng 4.11. Bảng 4.11. Số lượng vi khuẩn L. acidophilus sau thời gian bảo quản Thời gian 0 ngày 10 ngày 20 ngày Số lượng (×106 cfu/g) 38 4,15 2,83 Qua bảng 4.11 chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào vi khuẩn giảm nhiều nhất vào 10 ngày đầu sau đó giảm dần sau thời gian bảo quản. Hình 4.9. Chế phẩm chứa B. subtilis và L. acidophilus sau khi đóng gói Biểu đồ 4.2. Số lượng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sau thời gian bảo quản Thời gian (ngày) Số lượng × 106 cfu/g Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1.1. Đối với Bacillus subtilis Trong số 5 loại môi trường nhân giống cấp 1 là Edward, Nomura, Fragie, Rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột và pepton-gelatin, chúng tôi ghi nhận môi trường rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột là môi trường có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase và protease cao nhất với số lượng tế bào là 19,2 × 109 cfu/ml, hoạt độ amylase là 256 (Wo/ml) và protease là 128 (Hđp/ml). Môi trường A là môi trường nhân giống cấp 2 có khả năng cho sinh khối và hoạt độ enzyme amylase, protease cao nhất với số lượng tế bào là 345,67×1010 cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (Wo/ml) và protease là 80 (Hđp/ml). Sau khi sản xuất chế phẩm chứa Bacillus subtilis có số lượng tế bào là 589 × 109 cfu/g, hoạt độ amylase là 160 (Wo/ml) và protease là 80 (Hđp/ml). Sau thời gian bảo quản 10, 20 và 30 ngày ở nhiệt độ phòng chúng tôi nhận thấy số lượng tế bào có giảm nhưng hoạt độ enzyme amylase và protease không thay đổi. 5.1.2. Đối với Lactobacillus acidophilus Trên môi trường sữa đặc có đường, độ chua và số lượng của tế bào tăng dần khi nồng độ sữa tăng dần. Số lượng vi khuẩn và độ chua cao nhất ở nồng độ 25% sữa và cho số lượng tế bào là 21,96 × 109 cfu/ml và độ chua là 1,1093g/100 ml. Đối với môi trường sữa đậu nành số lượng và độ chua cao nhất ở môi trường NB15. Số lượng tế bào là 73,1 × 109 cfu/ml và độ chua là 1,6g/100 ml. Chế phẩm chứa Lactobacillus acidophilus sau khi sản xuất có số lượng tế bào là 38 × 106 cfu/g. Sau thời gian bảo quản số lượng tế bào giảm nhanh vào 10 ngày đầu sau đó giảm dần sau thời gian bảo quản. 5.2. ĐỀ NGHỊ Cần khảo sát thêm khi nuôi cấy B. subtilis ở nhiệt độ 37oC và vào từng thời điểm khác nhau như 24 và 36 giờ để xác định chính xác điều kiện tối ưu nhất để sản xuất chế phẩm. Chiết xuất ra enzyme tinh khiết phục vụ trong chăn nuôi và các ngành công nghiệp khác. Khảo sát thêm khả năng sinh enzyme lipase của vi khuẩn Bacillus subtilis. Cần phân lập thêm nhiều chủng Lactobacillus acidophilus từ nhiều nguồn khác nhau như sữa chua, nem… để tìm ra chủng tốt nhất phục vụ cho sản xuất. Sản xuất trên dây chuyền khép kín với số lượng lớn để hạ giá thành sản xuất 5.3. TỒN TẠI Chưa kiểm tra được khả năng ức chế của chế phẩm đối với các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Salmonella… Chưa kiểm tra được độ an toàn cũng như tác dụng của chế phẩm trên thú và thủy sản.