Đề tài Xác định đột biến gen CYP21A2 trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-Hydroxylase thể mất muối – Vũ Chí Dũng

TCNCYH 117 (1) - 2019 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP21A2 TRÊN BỆNH NHÂN TĂNG SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH THIẾU 21-HYDROXYLASE THỂ MẤT MUỐI Vũ Chí Dũng1,2, Trần Huy Thịnh1, Nguyễn Thanh Bình1,2, Tạ Thành Văn1 Trần Vân Khánh1 1Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu hụt enzym 21-OH là bệnh lý di truyền lặn nhiễm sắc thể thường xảy ra do giảm hoặc mất chức năng của enzyme 21-Hydroxylase, được mã hóa bởi gen CYP21A2. Bệnh được chia thành 3 thể bệnh lâm sàng chính là thể mất muối, thể nam hóa đơn thuần và thể không cổ điển, trong đó thể mất muối chiếm tỉ lệ cao nhất. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu (1) Xác định tỉ lệ bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối (2) xác định đột biến trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể bệnh mất muối. Phương pháp: 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh được chẩn đoán và được xác định đột biến gen CYP21A2; áp dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen. Kết quả xác định được 30/40 (75%) bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh với thể mất muối. Nghiên cứu phát hiện được 8 kiểu gen, trong đó kiểu gen phổ biến nhất là Del/Del (33,33%), tiếp đến là I2g/I2g (20%), các kiểu gen còn lại có tỉ lệ thấp hơn từ 3,3-13,3%. Đột biến đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử chiếm 33,3%. Allele đột biến chiếm tỉ lệ cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và p.Q318X (2%). Từ khóa: tăng sản thượng thận bẩm sinh thể mất muối, CYP21A2, MLPA, giải trình tự gen Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội, Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 10/10/2018 Ngày được chấp thuận: 12/12/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Tăng sản thượng thận bẩm sinh thể thiếu 21-hydroxylase xảy ra do một phần hoặc hoàn toàn của enzym 21-hydroxylase tham gia tổng hợp cortisol từ cholesterol ở tuyến thượng thận. Mức độ nặng và biểu hiện lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào hoạt độ 21-Hydroxylase còn lại của bệnh nhân [1; 2]. Tăng sản thượng thận bẩm sinh được phân loại thành hai thể bệnh chính là thể cổ điển (thể nặng) và thể không cổ điển (thể nhẹ). Thể cổ điển được chia ra thành thể mất muối (salt wasting) và nam hóa đơn thuần (simple virilizing) phản ánh mức độ thiếu hụt aldosterone [3; 4]. Thể mất muối chiếm 75% các ca mắc thể cổ điển [4], ở thể này bệnh nhân thiếu hụt hoàn toàn hoạt độ enzym 21-Hydroxylase gây nguy hiểm đến tính mạng và tử vong do mất nước, hạ natri máu. Trẻ trai mắc thể cổ điển không có triệu chứng khi sinh ngoại trừ xạm da kín đáo và dương vật có thể có kích thước lớn hơn. Do vậy, tuổi chẩn đoán ở trẻ trai thể cổ điển mất muối khác nhau tùy theo mức độ thiếu hụt aldosterone. Các trẻ trai mắc thể mất muối thường xuất hiện triệu chứng từ 7 - 14 ngày sau sinh với các biểu hiện nôn, sụt cân, li bì, mất nước, hạ natri, tăng kali huyết thanh và sốc gây nguy hiểm đến tính mạng. Các trẻ gái mắc thể mất muối nếu không được điều trị sớm sau sinh có thể xuất hiện các triệu chứng suy thượng thận cấp, mất muối trong giai đoạn sơ sinh. Các nghiên cứu trên thế giới đã phát hiện 40 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC được một số dạng đột biến liên quan đến tăng sản thượng thận bẩm sinh, trong đó phát hiện allele đột biến có tỉ lệ cao nhất ở các bệnh nhân thể mất muối bao gồm đột biến xóa đoạn (Del), đột biến vùng Intron 2 (I2g) và đột biến điểm p.R356W [5; 6]. Nghiên cứu của Krone và cộng sự phát hiện trên 91,3% các allele của bệnh nhân thể mất muối có các đột biến xóa đoạn, I2g, I172N, R356W và Q318X. Việc xác định đột biến có ý nghĩa trong sàng lọc sơ sinh, chẩn đoán sớm bệnh và đưa ra phác đồ điều trị kịp thời cho bệnh nhân. Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: 1. Xác định tỉ lệ bệnh nhân mang thể mất muối trên các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh. 2. Xác định đột biến trên bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh do thiếu hụt enzym 21- hydroxylase thể bệnh mất muối. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase, bệnh nhân được chẩn đoán và phân loại thể bệnh lâm sàng bởi các bác sĩ tại khoa Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương. 2. Phương pháp 2.1. Kỹ thuật tách chiết DNA DNA được tách chiết từ bạch cầu máu ngoại vi theo quy trình phenol/chloroform. Tất cả các mẫu DNA sẽ được tiến hành đo nồng độ và độ tinh sạch, chỉ có mẫu DNA đạt giá trị ≥ 1,8 mới đạt yêu cầu về tinh sạch và được sử dụng để phân tích. 2.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Toàn bộ chiều dài gen CYP21A2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu theo quy trình đã được mô tả trước đây [5]. - Thành phần phản ứng: thể tích 20 µl gồm: 100 - 150 ng DNA, 5 pmol primer, 200 µmol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2 µl GeneAmp 10 x buffer. - Chu trình nhiệt: 94oC/5phút, [94oC/1phút, 60oC/1phút, 72oC/1phút] x 35 chu kỳ, 72oC/ 2phút, giữ ở 15oC. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, 90V trong 30 phút. - Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose được tinh sạch bằng Gel purification Kit trước khi tiến hành giải trình tự gen. Để giải trình tự được toàn bộ gen CYP21A2, sử dụng các mồi như đã mô tả ở bảng 2.1. Quy trình được thực hiện theo phương pháp Big- Dye terminator sequencing (Applied Biosys- tems, Foster city, Hoa Kỳ). Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench. Mẫu DNA của bệnh nhân được so sánh với mẫu DNA đối chứng và trình tự của CYP21A2 trên GeneBank (Accession number NM_0005002) 2.3 Kỹ thuật MLPA Sử dụng kit MLPA P050B2 (MRC- Holland) để phát hiện đột biến xóa đoạn trên bệnh nhân và người lành mang gen bệnh. Thành phần của kit gồm các đầu dò (probe) để khuyếch đại gen CYP21A2, mỗi đầu dò tương ứng với một vùng gen, ngoài ra còn có các đầu dò đặc trưng cho gen của người cũng được sử dụng để làm đối chứng và 2 đầu dò cho nhiễm sắc thể X và Y để xác định giới tính. Sản phẩm khuếch đại sẽ được điện di mao quản trên máy giải trình tự. Số lượng sản phẩm khuếch đại của mỗi đầu dò sẽ tỷ lệ thuận với số bản copy của đoạn DNA đích đặc hiệu với đầu dò đó. TCNCYH 117 (1) - 2019 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 3. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ tuyệt đối các quy định về đạo đức trong nghiên cứu y sinh. Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân hoàn toàn có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu. Bệnh nhân sẽ được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ Kết quả phân tích phát hiện 30/40 (75%) bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh mắc thể mất muối. Đột biến gen CYP21A2 được phát hiện trên tất cả các bệnh nhân thể mất muối. Trong đó đột biến đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử chiếm 33,3%. Nghiên cứu phát hiện được 8 kiểu gen, trong đó kiểu gen phổ biến nhất là Del/Del (33,33%), tiếp đến là I2g/I2g (20%), các kiểu gen còn lại có tỉ lệ thấp hơn từ 3,3 - 13,3% (hình 1). Bảng 1. Kết quả phát hiện đột biến gen CYP21A2 của bệnh nhân Kiểu gen Đồng/Dị hợp tử n % Del/Del Homozygous 10 33,3 Đồng hợp tử 66,6% I2g/I2g Homozygous 6 20,0 p.R356W/p.R356W Homozygous 4 13,3 Del/I2g Heterozygous 4 13,3 Dị hợp tử 33,3% Del/p.R356W Heterozygous 2 6,7 Del/p.L307FfsX6 Heterozygous 2 6,7 I2g/p.R356W Heterozygous 1 3,3 I2g/p.Q318X+p.R356W Heterozygous 1 3,3 Tổng cộng 30 100% Biểu đồ 1. Tỉ lệ các allele đột biến 42 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Biểu đồ 1 mô tả các allele đột biến phát hiện được trong nghiên cứu và tỉ lệ tương ứng. Allele có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và p.Q318X (2%). g.655A/C g.655A/C > G IVS2-13A/C > G Người bình thường Bệnh nhân Hình 1. Kết quả giải trình tự gen CYP21A2 - Hình ảnh đột biến đồng hợp tử IVS2 - 13A/G > C (I2g) Kết quả giải trình tự của bệnh nhân trong hình 1 cho thấy bệnh nhân có đột biến tại vị trí g.655 (A/C > G), vị trí này nằm trên Intron 2 và nằm tại vùng cắt nối intron-exon (splice site). Đột biến gây ảnh hưởng đến quá trình phiên mã, làm mất chức năng của protein 21-Hydroxylase. IV. BÀN LUẬN Nghiên cứu này đã phát hiện 30/40 (75%) bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh có kiểu hình mất muối. Krone và cộng sự (2000) nghiên cứu trên 155 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh phát hiện thể mất muối chiếm 59,4% (92/155) tổng số bệnh nhân; thể nam hóa đơn thuần chiếm 33,5% (52/155) và thể không cổ điển 7,1% (11/155) [3]. Một số nghiên cứu khác phát hiện thấy tỉ lệ thể không cổ điển cao hơn: 63,2% các bệnh nhân Tây Ban Nha; 54,7% các bệnh nhân Hy Lạp và 24,6% các bệnh nhân Ý mắc thể không cổ điển [6]. Dolzan V và cộng sự (2005) đã công bố kết quả lâm sàng cho 348 bệnh nhân ở các nước Trung Âu bao gồm: Áo, Cộng hòa Séc, Hungary, Slovakia và Slonenia và nhận thấy 63,5% các bệnh nhân có kiểu hìnhmất muối; 26,4% có kiểu hình nam hóa đơn thuần và 10,1% có kiểu hình không cổ điển. Nghiên cứu hồi cứu số liệu 100 năm tại Thụy Điển cho thấy trong tổng số 606 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thì thể cổ điển chiếm 75,4% (457 bệnh nhân); thể không cổ điển là 12,7% và chưa rõ kiểu hình là 11,9%. Trong số 457 bệnh nhân kiểu hình thể cổ điển thì thể mất muối chiếm 61,1% (279 bệnh nhân) [7]. Sự khác nhau về phân bố kiểu hình có thể do yếu tố chủng tộc, ngoài ra có giả thiết là các bệnh nhân mắc thể không cổ điển xuất hiện các triệu chứng lâm sàng muộn và không điển hình do vậy ít tìm đến các cơ sở y tế hơn. Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật MLPA, và giải trình tự gen để phát hiện các đột biến của gen CYP21A2. Với kỹ thuật MLPA chúng ta có thể phát hiện các xóa đoạn, lặp đoạn dị hợp tử, còn kỹ thuật giải trình tự sẽ phát hiện được các đột biến điểm. Các dạng đột biến được phát hiện bao TCNCYH 117 (1) - 2019 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC gồm: Del, I2g, p.R356W, p.L307fsX6, Q316X. Nghiên cứu đã phát hiện được 8 kiểu gen, kiểu gen thường gặp nhất là Del/Del (33,33%), đứng thứ hai là I2g/I2g (20%), tiếp đó là các kiểu gen p.R356W/p.R356W, Del/ I2g, Del/p.R356W. Các kiểu gen này đều trùng hơp với các kiểu gen được dự đoán trong các nghiên cứu in silico và in vitro nghiên cứu mức độ ảnh hưởng của đột biến lên chức năng của 21-hydroxylase, trong đó các đột biến nặng như I2g và R356W gây mất hoàn toàn chức năng của 21-OH do vậy gây nên thể mất muối, các kiểu gen dị hợp tử với p.I172N, p.401L, V281L sẽ bảo tồn được 1 phần hoạt độ của 21-OH do đó gây ra thể bệnh nhẹ hơn như nam hóa đơn thuần hoặc thể không cổ điển [3]. Nghiên cứu của Krone và cộng sự cũng cho thấy đột biến xóa đoạn, I2g, I172N, R356W và Q318X xuất hiện trên 91,3% các allele của bệnh nhân thể mất muối. Kết quả này có ý nghĩa trong dự báo kiểu hình của các bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh, giúp định hướng chẩn đoán và đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. Nghiên cứu này đã áp dụng kỹ thuật MLPA và giải trình tự gen để xác định đột biến gen CYP21A2 trên 40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu enzym 21-hydroxylase. Việc xác định đột biến có ý nghĩa trong sàng lọc sơ sinh, chẩn đoán sớm bệnh và đưa ra phác đồ điều trị kịp thời cho bệnh nhân [8 - 12]. V. KẾT LUẬN Nghiên cứu đã phát hiện được đột biến điểm gen CYP21A2 trên 30/40 bệnh nhân tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21-OH thể mất muối. Trong số 8 kiểu gen được phát hiện, kiểu gen có tỉ lệ cao nhất là Del/Del (33,33%), đứng thứ hai là I2g/I2g (20%), các kiểu gen còn lại có tỉ lệ từ 3,3-13,3%. Đột biến đồng hợp tử chiếm 66,6%, đột biến dị hợp tử chiếm 33,3%. Allele đột biến có tỉ lệ xuất hiện cao nhất là Del (46%), tiếp theo là I2g (29%) và p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) và p.Q318X (2%). Lời cám ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí bởi Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu quy trình phát hiện người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử” và sự giúp đỡ của các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu Gen- Protein, Bộ môn Nhi, Trường Đại học Y Hà Nội; Khoa Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. White P.C (2000). Congenital Adrenal Hyperplasia due to 21-Hydroxylase Defi- ciency. Endocr Rev, 21(3), 245 - 291. 2. Gonçalves J., Friães A., Moura L (2007). Congenital adrenal hyperplasia: focus on the molecular basis of 21-hydroxylase defi- ciency. Expert Rev Mol Med, 9(11), 1 - 23. 3. Krone N., Braun A., Roscher A.A et al (2000). Predicting phenotype in steroid 21- hydroxylase deficiency? Comprehensive ge- notyping in 155 unrelated, well defined pa- tients from southern Germany. J Clin Endocri- nol Metab, 85(3), 1059 - 1065. 4. New M.I. (2003). Inborn errors of adre- nal steroidogenesis. Mol Cell Endocrinol, 211 (1-2), 75 - 84. 5. Lee H.H., Chao H.T., Lee Y.J et al (1998). Identification of four novel mutations in the CYP21 gene in congenital adrenal hyper- plasia in the Chinese. Hum Genet, 103(3), 304 – 310. 44 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 6. White P.C., Tusie-Luna M.T., New M.I et al (1994). Mutations in steroid 21- hydroxylase (CYP21). Hum Mutat, 3(4), 373 - 378. 7. Wedell A., Thilén A., Ritzén E.M et al (1994). Mutational spectrum of the steroid 21- hydroxylase gene in Sweden: implications for genetic diagnosis and association with dis- ease manifestation. J Clin Endocrinol Metab, 78(5), 1145 - 1152. 8. Speiser P.W., Azziz R., Baskin L.S et al (2010). Congenital Adrenal Hyperplasia Due to Steroid 21-Hydroxylase Deficiency: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab, 95(9), 4133 - 4160. 9. Parsa A.A. và New M.I (2017). Steroid 21-hydroxylase deficiency in congenital adre- nal hyperplasia. J Steroid Biochem Mol Biol, 165, 2 - 11. 10. Su L., Yin X., Cheng J., Cai Y et al (2018). Clinical presentation and mutational spectrum in a series of 166 patients with clas- sical 21-hydroxylase deficiency from South China. Clin Chim Acta, 486, 142 - 150. 11. Simonetti L., Bruque CD2, Fernández CS., Nadra AD., Dain L et al (2018) CYP21A2 mutation update: Comprehensive analysis of databases and published genetic variants. Hum Mutat, 39(1), 5 - 22. 12. Nordenström A., Ahmed S., Jones J et al (2005). Female preponderance in conge- nital adrenal hyperplasia due to CYP21 defi- ciency in England: implications for neonatal screening. Horm Res, 63(1), 22 - 28. Summary MUTATION IDENTIFICATION IN PATIENTS WITH SALT WASTING CONGENITAL ADRENAL HYPERPLASIA Congenital adrenal hyperplasia (CAH) due to 21-hydroxylase deficiency is an autosomal recessive disorder commonly caused by CYP21A2 gene mutation. The disease is classified into three major clinical subtypes: salt wasting, simple virilizing and non-classical; salt wasting type is the most common and poses a high mortality rate. The study was conducted with these objectives: (1) Determining the percentage of patients with salt wasting CAH (2) Identifying muta- tions in patients with congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency. Methods: 40 patients with CAH were clinically diagnosed and molecular analysis identified mutations in the CYP21A2 gene. MLPA and sequencing methods were applied to detected mutations. Results: We identified 30 of the 40 patients with Salt wasting CAH. Among Salt wasting CAH patients, we iden- tified 8 genotypes, the most common genotypes were Del/Del (33.33%), I2g/I2g (20%), and the remaining genotypes accounted for 3.3 - 13.3%. Homozygous mutations accounted for 66.6%, heterozygous mutations accounted for 33.3%. Mutation allele with highest incident were Del (46%), followed by I2g (29%), p.R356W (20%), p.L307FfsX6 (3%) and p.Q318X (2%). Keywords: Congenital Adrenal Hyperplasia with Salt wasting, CYP21A2, MLPA, sequencing