Đề tài Xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân Glôcôm bẩm sinh nguyên phát bằng kĩ thuật giải trình tự gen – Nguyễn Sơn Tùng

8 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN CYP1B1 TRÊN BỆNH NHÂN GLÔCÔM BẨM SINH NGUYÊN PHÁT BẰNG KĨ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ GEN Nguyễn Sơn Tùng1, Trần Thu Hà1,2, Trần Huy Thịnh1, Tạ Thành Văn1, Trần Vân Khánh1 1Trung tâm Nghiên cứu Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội 2Bệnh viện Mắt Trung ương Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh lý di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đã được xác định có liên quan với đột biến gen CYP1B1. Bệnh là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây mù lòa ở trẻ em. Việc phát hiện đột biến CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát là rất cần thiết, cấp bách để tạo điều kiện tư vấn di truyền cho người lành mang gen bệnh. Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm trên exon 2 và exon 3. Tuy nhiên, tỷ lệ phát hiện đột biến CYP1B1 thay đổi cho từng chủng tộc, ở Châu Á tỷ lệ này từ 17,2% đến 33,3%. Ở Việt Nam, hiện nay chưa có nghiên cứu nào xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Nghiên cứu này nhằm xác định đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Việt Nam bằng kỹ thuật giải trình tự. Kết quả cho thấy, 4/15 (26,7%) bệnh nhân có đột biến điểm trên gen CYP1B1 trong đó 3 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys (01 bệnh nhân có đột biến kết hợp với đột biến Val198Ile, 02 bệnh nhân có đột biến kết hợp với SNP-Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val trên exon 3). Một bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay thế acid amin (missense) Glu229Lys trên exon 2. Đột biến Gln86Lys và Asp218His trên exon 2 là các đột biến mới chưa được công bố, trong khi đó 2 đột biến missense (Val198Ile và Glu229Lys) và các SNP đã được công bố. Từ khóa: Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát, gen CYP1B1, đột biến gen Địa chỉ liên hệ: Trần Vân Khánh, Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Email: tranvankhanh@hmu.edu.vn Ngày nhận: 30/8/2018 Ngày được chấp thuận: 18/10/2018 I. ĐẶT VẤN ĐỀ Glôcôm bẩm sinh nguyên phát là tình trạng tăng nhãn áp do sự phát triển bất thường của bán phần trước nhãn cầu. Tuy hiếm gặp nhưng bệnh thường xảy ra ở hai mắt (65 - 80%), xuất hiện sớm ngay từ những năm đầu sau sinh và là một trong những nguyên nhân gây mù lòa quan trọng ở trẻ nhỏ [1 - 3]. Bệnh được xác định là một thể bệnh glôcôm di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường liên quan đến đột biến gen CYP1B1 [4; 5]. Gen CYP1B1 nằm ở vị trí 2p22.2 trên nhiễm sắc thể số 2, gồm 3 exon và 2 intron. Gen CYP1B1 quy định tổng hợp protein CYP1B1 (một phân họ của enzym cytochrom P450), đóng vai trò trong việc hình thành các cấu trúc ở phía trước của mắt và cũng có thể tham gia vào một quá trình điều chỉnh sự bài tiết thủy dịch. Đột biến gen CYP1B1 được cho là làm rối loạn sản xuất enzyme, dẫn đến bất thường cấu trúc mạng lưới vùng bè và ứ trệ thủy dịch làm tăng nhãn áp gây nên bệnh glôcôm [6]. Đột biến gen CYP1B1 chủ yếu là đột biến điểm nằm trên exon 2 và exon 3; tỉ lệ phát hiện đột biến CYP1B1 ở Châu Á cũng rất thay đổi từ 17,2% đến khoảng 33,3% [7 - 10]. Ở Việt Nam, bệnh glôcôm nguyên phát thường phát hiện muộn, điều trị phẫu thuật dễ tái phát [2]. Việc phát hiện đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh TCNCYH 117 (1) - 2019 9 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nguyên phát sẽ làm cơ sở cho việc triển khai chẩn đoán trước sinh, cũng như tư vấn di truyền cho các gia đình có trẻ đã mắc bệnh nhằm giảm tỷ lệ mù lòa ở trẻ em. Theo tổng kết năm 2010, đột biến gen CYP1B1 phát hiện chủ yếu ở exon 2 và exon 3 chiếm tới 99,8% số đột biến phát hiện được [7]. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành với mục tiêu: Xác định đột biến gen CYP1B1 tại exon 2 và exon 3 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng Tiêu chuẩn lựa chọn 15 bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại Bệnh viện Mắt Trung ương khi bệnh nhân dưới 1 tuổi. Bệnh nhân chẩn đoán xác định bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát khi có từ 4 triệu chứng trở lên [11]: - Nhãn áp cao ≥ 25 mmHg (Nhãn áp kế Maclakov) hoặc ≥ 22 mmHg (Nhãn áp kế Icare). - Chói, chảy nước mắt, sợ ánh sáng. - Đường kính giác mạc to bất thường ≥ 12 mm - Giác mạc phù, mờ đục. - Tiền phòng sâu, góc tiền phòng có tổ chức bất thường - Tổn hại lõm teo gai thị trong bệnh glôcôm Tiêu chuẩn loại trừ - Glôcôm bẩm sinh thứ phát: tổn thương của giác mạc: hội chứng tách lớp bán phần trước (Axenfeld, Reiger, Peters); Tổn thương của mống mắt: tật không mống mắt, tồn lưu màng Wachendorf; Dị thường thể thủy tinh: hội chứng Lowe, Marfan, Machesani. - Bệnh nhân hoặc gia đình không đồng ý tham gia nghiên cứu. 2. Phương pháp Lấy mẫu bệnh phẩm: 2 ml máu tĩnh mạch chống đông bằng EDTA Tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA tổng số được tách chiết từ máu toàn phần bằng phenol - chloroform - isopropanol (25: 24: 1). Kỹ thuật PCR: PCR được sử dụng để khuếch đại exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1 với 3 cặp mồi được thiết kế [12]. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) gồm: 1X đệm PCR; 2,5 mM dNTP, 0,2 μM mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 20- 50ng DNA. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94oC/5 phút, 37 chu kỳ [94oC/30 giây, 55oC/30 giây, 72oC/60 giây], 72oC/7 phút. Bảo quản mẫu ở 15oC. Kỹ thuật giải trình tự gen: các sản phẩm PCR sẽ được tiến hành giải trình tự trực tiếp trên máy ABI 3100 Genetic Analyzer. Kết quả được thu thập và xử lý bằng phần mềm ABI PRISMTM 3100 - Avant Data Collection, DNA Sequencing Analysis 5.2 và BLAST NCBI. Trình tự được so sánh trên ngân hàng gen: DNA (NG_008386) và mRNA (NM_000104). 3. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 09/2017 đến tháng 09/2018. 10 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 4. Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ theo đạo đức nghiên cứu trong Y học. Bệnh nhân và gia đình bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu và có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia. Bệnh nhân và gia đình được thông báo về kết quả xét nghiệm gen để giúp cho các bác sỹ tư vấn di truyền hoặc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp. Các thông tin cá nhân được đảm bảo bí mật. III. KẾT QUẢ 1. Kết quả xác định khuếch đại exon 2 và exon 3 của gen CYP1B1 Sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho exon 2 và exon 3 gen CYP1B1 để khuyếch đại DNA sau tách chiết từ mẫu máu của bệnh nhân. Hình 1 là hình ảnh PCR đại diện khuếch đại exon 3 của gen CYP1B1. Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại exon 3, gen CYP1B1 * (MK) Marker; (1 - 4) mẫu bệnh nhân; (+) mẫu đối chứng dương; (-) mẫu đối chứng âm Kết quả hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR thu được chỉ có 1 băng đặc hiệu, rõ nét, kích thước 885 bp, không có sản phẩm phụ. Sản phẩm PCR đảm bảo cho phản ứng giải trình tự tiếp theo để phát hiện đột biến điểm. MK 1 2 3 4 (+) (-) 885 bp 2. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 Sản phẩm PCR được giải trình tự gen để phát hiện đột biến. Kết quả cho thấy đã phát hiện được 4/15 bệnh nhân có đột biến gen CYP1B1. Trong đó, 3/15 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys trên exon 2 kết hợp với một số đa hình thái gen-SNP (Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val trên exon 3) và đột biến thay thế acid amin (missense) Val198Ile đã công bố trước đây. 1 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay thế acid min (missense) Glu229Lys trên exon 2. Kết quả bảng 1 cho thấy 2/4 trường hợp có đột biến mới dị hợp tử Gln86Lys kết hợp với các đa hình đơn nucleotid SNP và 2/4 trường hợp phối hợp các đột biến dị hợp tử (Compound heterozygous). Trong đó, 01 bệnh nhân có đột biến mới dị hợp tử Gln86Lys phối hợp với đột biến missense Val198Ile và 01 bệnh nhân có đột biến mới dị hợp tử Asp218His phối hợp với đột biến Glu229Lys dị hợp tử. Các đột biến đều được phát hiện ở trên exon 2. TCNCYH 117 (1) - 2019 11 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Bảng 1. Kết quả xác định đột biến gen CYP1B1 Mã số Exon Đột biến Thể đột biến Chú thích Tài liệu công bố cDNA Acid amin G02.00 2 c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New 2 c.545C > G Arg48Gly Dị hợp SNP [12] 2 c.758G > T Ala119Ser Dị hợp SNP [12] G05.00 2 c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New 3 c.1697C > G Leu432Val Dị hợp SNP [12] G10.00 2 c.659C > A Gln86Lys Dị hợp New 2 c.995G > A Val198Ile Dị hợp Missense [9] 3 c.1697C > G Leu432Val Dị hợp SNP [12] G07.00 2 c.1055G > C Asp218His Dị hợp New 2 c.1088G>A Glu229Lys Dị hợp Missense [13] New: Đột biến mới; SNP: Single Nucleotide Polymorphism (đa hình đơn nucleotid); Missense: Đột biến thay thế acid amin. Hình 2. Hình ảnh giải trình tự gen CYP1B1 của bệnh nhân mã số G10.00 Kết quả giải trình tự gen ở hình 2 cho thấy, khi so sánh với trình tự cDNA người bình thường, bệnh nhân mã số G10.00 có đột biến thay thế nucleotid C thành A tại vị trí 659 trên cDNA, dẫn tới sự thay đổi acid amin Glutamine thành Lysine tại codon 86; đột biến thay thế nucleotid G thành A c.659C c.659C > A (Q86K) c.995G > A (V198I) c.1697C c.1697C > G (L432V) Mẫu bệnh nhân Người bình thường c.955 G 12 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC tại vị trí 995 trên cDNA, dẫn tới sự thay đổi acid amin Valine thành Isoleucine tại condon 198 và đột biến thay thế nucleotid C thay bằng G tại vị trí 1697 trên cDNA, dẫn tới sự thay đổi acid amin Leucine thành Valine tại condon 432. Như vậy, bệnh nhân mã số G10.00 có một đột biến mới phát hiện dạng dị hợp tử Gln86Lys trên exon 2 kết hợp với 1 đột biến missense Val198Ile trên exon 2 và 1 SNP Leu432Val trên exon 3 đã công bố trước đây. IV. BÀN LUẬN Tỷ lệ phát hiện đột biến gen CYP1B1 ở bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát châu Á rất thay đổi từ 17,2% đến 33,3%. Nghiên cứu năm 2014 trên 192 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Trung Quốc phát hiện 18 đột biến khác nhau trên 21 bệnh nhân (chiếm 17,2%) [8]. Nghiên cứu trên 12 bệnh nhân Indonesia phát hiện 4 bệnh nhân (chiếm 33,3%) có đột biến gen CYP1B1 [10]. Trong nghiên cứu của chúng tôi tỷ lệ phát hiện đột biến là 26,7% (4/15), tuy nhiên do cỡ mẫu còn nhỏ nên để xác định tỷ lệ đột biến gen CYP1B1 ở bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát Việt Nam vẫn cần tiến hành nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn. Theo tổng kết năm 2010, trong 52 nghiên cứu được báo cáo đã phát hiện 542 bệnh nhân mang 147 đột biến khác nhau trên gen CYP1B1. Trong số 1007 đột biến phát hiện được có 2 đột biến ở vùng không mã hóa thuộc exon 1; 489 đột biến phát hiện được ở exon 2 và 516 đột biến phát hiện được ở exon 3 [7]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chỉ phát hiện đột biến trên exon 2 và đa hình gen SNP trên exon 2 và exon 3. Nghiên cứu đã phát hiện 3/15 bệnh nhân có đột biến Gln86Lys và 1/15 bệnh nhân có đột biến Asp218His, đây là các đột biến mới chưa được công bố. Phân tích in silico sử dụng phần mềm dự đoán kiểu hình protein, chúng tôi thấy cả 2 đột biến Gln86Lys và Asp218His được dự đoán có khả năng gây bệnh. Tuy nhiên muốn khẳng định đây là các đột biến gây bệnh cần phải có nghiên cứu in vitro hoặc trên mô hình động vật. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tìm thấy 2 đột biến missense đã được công bố trước đây là Val198Ile và Glu229Lys. Đột biến Val198Ile cũng được tìm thấy trên bệnh nhân Nhật bản, trong khi đột biến Glu229Lys được tìm thấy trên bệnh nhân Iran và gợi ý gây ra kiểu hình nặng [9; 13]. Ngoài ra, nghiên cứu của chúng tôi cũng tìm được 3 dạng đa hình thái đã được bố trước đây là Arg48Gly, Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val trên exon 3. Những đột biến này đều nằm trong vùng chức năng của protein CYP1B1 [12]. Trong số 4 bệnh nhân mang đột biến mới, 2/4 bệnh nhân mang đột biến Gln86Lys dị hợp tử phối hợp với các dạng đa hình thái và 2/4 bệnh nhân phối hợp các đột biến dị hợp tử. Điều này có thể giải thích bệnh còn đột biến ở alen khác phối hợp chưa được phát hiện và phối hợp đột biến dị hợp có thể tạo ra hiệu ứng cộng hưởng gây bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát. Trong nghiên cứu của chúng tôi, 100% các đột biến phát hiện được là đột biến thay thế nuleotide dẫn đến sự thay đổi acid amin . Kết quả này cũng tương đồng với các tác giả trên thế giới. Theo các nghiên cứu tại Úc tỷ lệ đột biến thay thế acid amin là khoảng 72,7% tổng số đột biến phát hiện được. Theo những nghiên cứu ở Châu Á, tỷ lệ đột biến loại này dao động khoảng từ 60% đến 97% trong tổng TCNCYH 117 (1) - 2019 13 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC số đột biến gen CYP1B1 cụ thể ở Nhật là 66,8%; Indonesia là 62,5%; Ả rập là 96,5% và Iran là 90%. Ngoài ra một số các dạng đột biến khác cũng được tìm thấy nhưng tỷ lệ rất thấp như đột biến xóa đoạn, lặp đoạn, đột biến vô nghĩa hay thêm nucleotide [7]. Trong nghiên cứu này, các đột biến tìm được đều ở dạng thay thế nucleotide dẫn đến sự biến đổi acid amin. Tuy nhiên đây mới chỉ là nghiên cứu bước đầu, cần có nghiên cứu tiếp theo để đưa ra số liệu cụ thể hơn về vấn đề này. Bệnh glôcôm bẩm sinh nguyên phát là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường. Khoảng 90% trẻ mang đột biến gen CYP1B1 sẽ biểu hiện bệnh ở cả hai mắt với các mức độ khác nhau. Ở Việt Nam, các trẻ mắc bệnh thường được phát hiện và điều trị muộn, dẫn đến hậu quả nặng nề về vật chất và tinh thần cho trẻ và gia đình. Việc nghiên cứu đột biến gen CYP1B1 trên bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát là cơ sở để tư vấn di truyền cho gia đình mang gen bệnh và hạn chế tỷ lệ mù lòa ở trẻ em. V. KẾT LUẬN Đã phát hiện được 4/15 bệnh nhân glôcôm bẩm sinh nguyên phát có đột biến gen CYP1B1. Trong đó có 3 bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Gln86Lys kết hợp với đột biến thay đổi acid amin (missense) Val198Ile và một số đa hình gen SNP (Arg48Gly,Ala119Ser trên exon 2 và Leu432Val trên exon 3). Một bệnh nhân có đột biến dị hợp tử Asp218His kết hợp với đột biến thay đổi acid amin (missense) Glu229Lys trên exon 2. Đột biến Gln86Lys và Asp218His là các đột biến mới chưa được công bố. Lời cảm ơn Nghiên cứu được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Sở Khoa học và Công nghệ Hà Nội “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử xác định đột biến gen CYP1B1 trong bệnh Glôcôm bẩm sinh nguyên phát tại Hà Nội” và sự giúp đỡ của các cán bộ Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Đỗ Như Hơn (2012). Nhãn khoa. Nhà xuất bản Y học, 1, 465 - 474. 2. Nguyễn Như Quang (1982). Đặc điểm lâm sàng bệnh glôcôm bẩm sinh và phẫu thuật cắt bè củng mạc. Nhãn khoa, 1, 65 - 70. 3. Shields M. B. (1982). Primary congenital glaucoma. Williams and Wilkins, Third edition, 220 - 233. 4. Robert N. Weiss, Shaffer., Daniel I. (1970). Congenital and pediatric glaucomas. Mosby, St. Louis, 37. 5. Lim SH, Tran-Viet KN, Yanovitch TL và cộng sự (2013). CYP1B1, MYOC, and LTBP2 Mutations in Primary Congenital Glaucoma Patients in the United States. American journal of ophthalmology, 155(3), 508 - 517. 6. Sarfarazi M., Stoilov I (2000). Molecular genetics of primary congenital glaucoma. Eye (London, England), 14(3B), 422 - 428. 7. Li N, Zhou Y, Du L et al (2011). Overview of Cytochrome P450 1B1 gene mutations in patients with primary congenital glaucoma. Experimental Eye Research, 93 (5), 572 - 579. 8. Chen X, Chen Y, Wang L et al (2014). CYP1B1 genotype influences the phenotype in primary congenital glaucoma and surgical treatment. The British Journal of Ophthalmology, 98(2), 246 - 251. 14 TCNCYH 117 (1) - 2019 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 9. Mashima Y, Suzuki Y, Sergeev Y et al (2001). Novel cytochrome P4501B1 (CYP1B1) gene mutations in Japanese patients with primary congenital glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42(10), 2211 - 2216. 10. Sitorus R, Ardjo SM, Lorenz B et al (2003). CYP1B1 gene analysis in primary congenital glaucoma in Indonesian and European patients. J Med Genet, 40(1), e9. 11. T. S. Dietlein, P. C. Jacobi., G. K. Krieglstein (1999). Prognosis of primary ab externo surgery for primary congenital glaucoma. Br J Ophthalmol, 83(3), 317 - 322. 12. Stoilov I, Akarsu AN, Alozie I et al (1998). Sequence analysis and homology modeling suggest that primary congenital glaucoma on 2p21 results from mutations disrupting either the hinge region or the conserved core structures of cytochrome P4501B1. American Journal of Human Genetics, 62(3), 573 - 584. 13. Fereshteh Chitsazian, Betsabeh Khoramian Tusi và Elahe Elahi (2007). CYP1B1 Mutation Profile of Iranian Primary Congenital Glaucoma Patients and Associated Haplotypes. The Journal of Molecular Diagnostics, 9(3), 382 - 393. Summary MUTATION ANALYSIS OF CYP1B1 GENE IN PATIENTS WITH PRIMARY CONGENITAL GLAUCOMA USING SEQUENCING METHOD Primary congenital glaucoma is an autosomal recessive inherited disease which associate with CYP1B1 mutations. Glaucoma leads to blindness if left untreated, and it is considered one of the most common leading cause of blindness in children. Detection of CYP1B1 mutations in patients with primary congenital glaucoma is essential, urgently needed to facilitate genetic counseling for healthy carriers of the gene. Point mutation is the most common in the CYP1B1 gene and almost located in exon 2 and exon 3. However, the proportion of PCG patients which have CYP1B1 mutations varies among populations, the numbers in Asian range from 17.2% to 33.3%. In Vietnam, in present no research perform CYP1B1 mutations analysis in patients with primary congenital glaucoma. This study was planned with the aim to identify the mutation profile of CYP1B1 in Vietnam primary congenital glaucoma (PCG) patients by using sequencing technique. The results showed that 4/15 (26,7%) cases harbored the CYP1B1 mutations, in which 3 patients carrying novel heterozygous Gln86Lys mutation in exon 2 combined with missense mutation Val198Ile and others SNPs (Arg48Gly, Ala119Ser in exon 2 and Leu432Val in exon 3). One patient has novel heterozygous Asp218His mutation in exon 2 combined with missense mutation Glu229Lys. Gln86Lys and Asp218His in exon 2 are novel mutations, whereas missense mutations and SNPs had been reported in other studies. Keywords: primary congenital glaucoma, CYP1B1 gene, mutation