Đề tài Việc nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm vaccine ăn thông qua cây trồng chuyển gen

LỜI MỞ ĐẦU: Tiêm chủng là một trong những trang bị tối cần thiết để một đứa trẻ lớn lên an toàn và khoẻ mạnh, tuy nhiên bất kỳ một đứa trẻ nào, (và ngay những trẻ đã lớn) đều rất “ngại” chỉ cần nghĩ đến việc tiêm thuốc. Vì đường tiêm thường gây đau cho người sử dụng, cộng thêm số lượng virút gây bệnh nguy hiểm ngày càng nhiều kéo theo số lượng mũi tiêm cũng tăng lên và mỗi lần tiêm vào mỗi chỗ khác nhau của cơ thể . Chưa kể đến việc bảo quản, vận chuyển với điều kiện nghiêm ngặt đối với các vaccine. Giải quyết hết tất cả những vấn đề này các nhà khoa học của chúng ta đã tạo ra một cái gọi là “Vaccine ăn” Ở nước ta Vaccin ăn có lẻ là một cụm từ khá mới mẻ nhưng đối với các nước phát triển trên thế giới thì nó không có gì xa lạ lắm, bởi từ những năm đầu thập niên 90 người ta đã tạo thành công những “cây Vaccine ăn” đầu tiên Tuy nhiên cho đến nay việc Nghiên cứu và phát triển vaccine ăn vẫn còn đang là một phương hướng nghiên cứu rất mới của công nghệ sinh học, đặc biệt là ở những nước đang phát triển và những nước nghèo, nơi mà vấn đề miễn dịch thường là mối quan tâm lớn. Nghiên cứu và phát triển vaccine ăn cần sự kết hợp đồng thời giữa lĩnh vực miễn dịch học và thực vật học. Do vậy việc nghiên cứu, phát triển và thử nghiệm vaccine ăn thông qua cây trồng chuyển gen vẫn còn nhiều hạn chế, tuy nhiên cũng đã thu được những nhiều thành tựu to lớn. I/ ĐỊNH NGHĨA: Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tiểu phần protein làm kháng nguyên mong muốn. Vaccine ăn là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bào [1] Ngoài ra vaccine ăn được còn là vaccine tiểu phần bao gồm một hoặc nhiều chuổi polypeptitcủa protein kháng nguyên trong vi sinh vật gây bệnh. Người ta chọn lọc những gen mã hoá cho các thành phần này, đưa vào vectơ, dựa vào hệ thống di truyền thực vật để khuyếch đại gen và biểu hiện thành công kháng nguyên protein mong muốn trong các bộ phận ăn được của thực vật, loại văccine này được cơ thể chấp nhận và nó bền vững trong dịch tiêu hoá đi qua đường tiêu hoá mà không bị phân huỷ [1] Vaccine ăn được có hoạt tính tương tự như vaccine thông thưòng, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả, hạt. Nổ lực sản xuất vaccine đầu tiên từ thực vật được ghi nhận vào năm 1990 khi công trình nghiên cứu biểu hiện protein kháng nguyên bề mặt A của vi khuẩn Streptococus mutans ở cây thuốc lá [1] II. CƠ SỞ KHOA HỌC Với các tiến bộ khoa học hiện nay trong việc tạo cây trồng chuyển gen cho phép tạo cây trồng chuyển gen có chứa vaccine ăn được với các bước: Chọn lựa và nhân bản đoạn gen kháng nguyên của vi khuẩn và vi rút gây bệnh. Thử nghiệm thành công các vectơ biểu hiện gen tái tổ hợp. Chuyển thành công gen kháng nguyên vào nhiều loài đối tượng thực vật. Gia tăng tốc độ và khối lượng protein tái tổ hợp được được sản sinh trong cây trồng . Vaccine ăn được có những ưu điểm nổi trội: Dể dàng tăng qui mô sản xuất và dể thu sinh khối Tính ổn định cao,dễ bảo quản và sử dụng: Các kháng nguyên biểu hiện trong thực vật ổn định ngay ở nhiệt độ phòng do chúng được sản xuất và được bao bọc bởi các mô thực vật mà cụ thể là chúng được định vị trong lưới nội chất, thể Golgi hoặc bề mặt tế bào. Nhờ tính ổn định này mà chúng trở nên dể dàng bảo quản và sử dụng (ngay trong thực vật) mà không cần giữ lạnh như các vaccine tiêm. Trong quá trình sản xuất vaccine ăn được người ta chỉ cần vận chuyển và sử dụng ngay bộ phận thực vật chứa vaccine đó Tính ăn được: Loại vaccine trong thực vật này được chính mô trong thực vật bao bọc, hạn chế được sự phân huỷ của dịch tiêu hoá ở đường ruột và ổn định, bền vững trong cơ thể nên vaccine này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ). Nhiều nghiên cứu cho thấy nhiều kháng nguyên vaccine được biểu hiện hiệu quả ở rau diếp cá (lá), khoai tây (củ), cà chua (quả) và ngô (hạt). Tính An toàn: Vì vaccine được sản xuất trong thực vật là vaccine dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho một phần protein vỏ virus mà không cần đến virus sống như vaccine giảm độc lực hay virus chết như vaccine bất hoạt. Do đó vaccine này không trở lại thành virus gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ vaccine. Do đó, không cần tách chiết và tinh sạch kháng nguyên vaccine Vaccine ăn được kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn vaccine tiêm Ta biết rằng hầu hết các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Khi vaccine ăn vào cơ thể theo đường miệng nó sẽ cảm ứng hệ thống miển dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại vi sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miển dịch của tế bào, tạo ra các globulin miển dịch tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể. Khi tiêu hoá vaccine ăn được, kháng nguyên được giải phong trong ruột non. Những nghiên cứu bảo vệ kháng nguyên làm vaccine ăn được trước tác động của dịch tiêu hoá, đặc biệt của cơ thể con người khẳng định giá trị thực tiễn của vaccine ăn được sản xuất nhờ thực vật chuyển gen Với những ưu điểm nỗi bật của vaccine ăn thì việc sản xuất vaccine ăn đuợc xem là hệ thống sản xuất vaccine lý tưởng đơn giản và giá thành thấp đã thành công và được đăng kí bảo hộ sáng chế. Sau đó nhiều thành công khác về vaccine thực vật cũng đựoc công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Số lượng nghiên cứu về vaccine ăn được đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh III.NGUYÊN LÝ SẢN XUẤT VACCINE ĂN ĐƯỢC: Quy trình sản xuất vaccie ăn được: Lựa chọn gen cần được biểu hiện (gen quan tâm) và đưa vào một vector thích hợp ; Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen; Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật đã lựa chọn bằng các phương pháp chuyển gen khác nhau; Gen lấy từ nguồn bệnh người được chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật Vi khuẩn được nhiễm vào các mẫu lá khoai tây mầm tạo đựoc từ các mẫu lá mang gen bệnh người Khi ăn khoai tây gây ra phản ứng miễn dịch mầm bệnh Kiểm tra biểu hiện của gen quan tâm trong những bộ phận ăn được của thực vật; Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine sản xuất từ thực vật; Sử dụng vaccine đã thử nghiệm thành công bằng cách ăn tươi dưới dạng thức ăn đã chế biến. Thiết kế vector biểu hiện Điểm quan trọng nhất trong thiết kế vector biểu hiện là promoter, đây phải là promoter khoẻ, có ái lực mạnh với RNA-polymerase của vật chủ và hoạt động của promoter được điều hoà một cách dễ dàng. Trong nhiều nghiên cứu gần đây, với mục đích biểu hiện kháng nguyên vaccine trong các bộ phận ăn được của thực vật, người ta đã thiết kế promoter đặc hiệu mô thực vật, ví dụ promoter đặc hiệu mô củ hoặc mô hạt thì protein sẽ được sản xuất trong củ hoặc hạt. IV.CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO THỰC VẬT Hình 1.1 :Tạo thực vật chuyển gen bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Các phương pháp biểu hiện gen dựa trên thực vật đã được phát triển từ cuối những năm 1970 đầu 1980. Hiện nay, có thể xếp những phương pháp này vào hai nhóm chính sau: Chuyển gen ổn định tức là gen quan tâm được bảo tồn qua nhiều thế hệ do gắn vào hệ gen vật chủ (chuyển gen vào nhân hoặc plastid) và biểu hiện gen tạm thời dựa trên Agrobacterium và vector virus thực vật, theo nguyên tắc có thể sử dụng bất kỳ phương pháp chuyển gen vào thực vật nào cũng có thể tạo ra thực vật chứa vaccine ăn được, tuy nhiên hiện nay người ta chỉ mới tạo thành công vaccine ăn nhờ súng bắn gen và nhờ vi khuẩn Agrobacterium 1. Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium[1] Cây chuyển gen đầu tiên đã được tạo ra năm 1983 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Đây là loại vi khuẩn sống trong đất, gây bệnh cho cây bằng cách gắn các đoạn gen vào hệ gen của tế bào chủ và sinh ra u nhờ một loại plasmid của vi khuẩn này, plasmid Ti. Người ta đã lợi dụng đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium để chuyển gen mong muốn vào thực vật, trong đó plasmid Ti bị bất hoạt, nó chỉ còn khả năng gắn DNA vào tế bào và mất khả năng gây bệnh. Trong sản xuất vaccine ăn được, người ta thiết kế một vector gồm hai gen: Một gen mã hoá cho kháng nguyên virus và một gen kháng kháng sinh. Do đó, trong môi trường có kháng sinh, những tế bào thực vật không mang gen chuyển sẽ bị chết, trái lại tế bào mang gen sẽ hình thành callus, từ đó tạo thành cây hoàn chỉnh. Phương pháp này có một số bất lợi: plasmid Ti gắn gen ngẫu nhiên vào hệ gen thực vật, làm tăng tính không đồng đều về mức độ biểu hiện kháng nguyên trong cây chuyển gen. Ngoài ra cách gắn gen này có thể phá vỡ biểu hiện gen dẫn đến sinh trưởng bất thường của cây chuyển gen. Mặc dù hệ thống chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với một số loài nhưng không phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường này. Ðặc biệt, lớp một lá mầm bao gồm các cây ngũ cốc chính trên thế giới như lúa, lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. tumefaciens. Ðể khai thác và sử dụng A. tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-DNA và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật. 2.Chuyển gen ổn định:[1] Chuyển gen vào nhân Là phương pháp chuyển gen ổn định do gắn gen quan tâm vào nhiễm sắc thể thực vật được ứng dụng phổ biến trong sản xuất protein chức năng. Ngoài ra, có thể đưa gen vào lục lạp. Lục lạp là cơ quan tử của thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh trong thực vật và có cơ thể di truyền rất giống với các plasmid vi khuẩn. Người ta tính rằng trong tế bào lá trưởng thành có tới 100 lục lạp, mỗi lục lạp có chưa 100 bản sao DNA vòng, vì thế mức độ biểu hiện gen rất cao, có thể tới 35% protein tổng số. Tuy nhiên, protein được biểu hiện thường không có chức năng đầy đủ do bộ máy di truyền của lục lạp ở mức độ cơ quan tử nên khó có thể đảm bảo các biến đổi sau dịch mã.[1] Chuyển gen trực tiếp vào protoplast Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast. Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector. Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện. Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được. Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài cây một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil, 1992). Chuyển gen bằng kỹ thuật xung điện Hình 2.14:Sơ đồ màng phospholipid kép Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid (hình 2.14), tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào. Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ. Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nước phía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng một cách tự do Sơ đồ bên cho thấy các thành phần hóa học của màng sinh chất. Các đầu ưa nước phân cực hướng về phía ngoài trong khi các đuôi kỵ nước hướng về phía trong và tương tác với đuôi kỵ nước khác để cùng bám giữ màng. Các phân tử phân cực không thể đi qua màng này nếu như không có sự hỗ trợ bên ngoài. Hình 2.15: Cuvette nhựa có điện cực Nhiều phương pháp đã được phát triển để vượt qua rào cản này, cho phép đưa DNA và các phân tử khác vào trong tế bào đã được nghiên cứu. Một trong những phương pháp này là kỹ thuật xung điện. Hình 2.16 :Máy xung gen (Gene pulser) (Hãng Biorad) Kỹ thuật xung điện dựa trên trạng thái tương đối yếu của các tương tác kỵ nước của phospholipid kép và khả năng tập hợp lại một cách tự động của nó sau khi bị rối loạn (Purves, 2001). Vì vậy, một xung điện chớp nhoáng có thể gây ra rối loạn ở các vị trí của màng một cách nhất thời, làm cho các phân tử phân cực có thể đi qua, nhưng sau đó màng có thế đóng kín lại nhanh chóng và tế bào không bị ảnh hưởng gì cả. Các tế bào chủ và DNA ngoại lai được tạo thành dịch huyền phù và cho vào trong một cuvette nhựa có điện cực (hình 2.15) Ðể tạo ra xung điện cao thế trong một thời gian ngắn người ta sử dụng một thiết bị gọi là máy xung gen (gene pulser). (hình 2.16) Quá trình cơ bản diễn ra bên trong máy này có thể được trình bày bằng sơ đồ (hình 2.17) Hình 2.17: Sơ đồ bố trí mạch cơ bản của máy xung điện Sơ đồ này cho thấy mạch điện cơ bản cung cấp điện cho kỹ thuật xung điện. Khi công tắc thứ nhất đóng, tụ điện nạp điện vào và tích một điện áp cao. Khi công tắc thứ hai đóng, điện áp này phóng qua dịch huyền phù tế bào. Một xung điện cần thiết cho kỹ thuật này thường là khoảng 10.000-100.000 v/cm (thay đổi tùy theo kích thước của tế bào) trong vài phần triệu giây đến một phần ngàn giây. Xung điện này làm rối loạn phospholipid kép của màng tế bào và tạo ra các lỗ tạm thời. Khả năng điện qua màng tế bào cùng lúc tăng lên 0,5-1,0 v vì vậy các phân tử đã được nạp điện này đi qua màng tế bào thông qua các lỗ bằng cách thức tương tự như điện di (Hình 2.18). Hình 2.18: Sơ đồ plasmid chứa DNA ngoại lai đi qua các lỗ tạm thời trên màng bào chất Lối DNA đi vào tế bào không thể quan sát thấy dưới kính hiển vi, nhưng hình vẽ này cho thấy khái niệm cơ bản của sự tạo thành các lỗ trên màng mà DNA có thể đi qua. Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng và phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ (Weaver, 1995). Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Phương pháp này có thể sử dụng đối với gần như tất cả các loại tế bào của các loài. Lúc đầu phương pháp này được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào động vật có vú, về sau cho cả tế bào thực vật ở dạng protoplast... Với một số cây một lá mầm quan trọng (loài lúa phụ Japonica, ngô, lúa mì) mà không thể thực hiện được bằng phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium thì người ta đã thành công với phương pháp này. Hiệu quả biến nạp cao. Trong một nghiên cứu ở E.coli, 80% số tế bào nhận được DNA ngoại lai (Miller và Nickoloff, 1995). Lượng DNA ngoại lai cần thiết là ít hơn so với các phương pháp khác (Withers, 1995). Phương pháp này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn (Weaver, 1995). Ðoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn. Tuy nhiên nếu các xung điện có cường độ và chiều dài không đúng thì một số lỗ của tế bào sẽ trở nên quá lớn hoặc bị hỏng không thể đóng lại sau khi tế bào phóng điện, làm cho tế bào bị tổn thương hoặc bị thủng (Weaver, 1995). Một hạn chế nữa là sự vận chuyển DNA ngoại lai vào và ra khỏi tế bào trong suốt thời gian điện biến nạp là tương đối không đặc hiệu. Ðiều này dẫn đến kết quả là không cân bằng ion mà sau đó sẽ làm rối loạn chức năng của tế bào và tế bào chết (Weaver, 1995). Kỹ thuật xung điện được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của sinh học phân tử và y học. Các ứng dụng của kỹ thuật xung điện bao gồm: Biến nạp DNA: các gen đặc hiệu có thể được tạo dòng trong plamid và sau đó plasmid này được đưa vào tế bào chủ để nghiên cứu cấu trúc và chức năng của gen và protein. Dung hợp tế bào đã kích thích: sự tạo thành các lỗ thủng trên màng xảy ra do xung điện chớp nhoáng tạo ra cho thấy đã kích thích sự dung hợp tế bào (Weber và Berrg, 1995). 3.Chuyển gen bằng súng bắn gen[2] Súng bắn gen Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA. Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gai tốc các hạt. Hình 2.21:Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen Súng bắn gen bao gồm hai buồng bằng thép không gỉ, kích thước 6“x7“x10“ nối với hai bơm chân không. DNA ngoại lai được gắn vào các hạt tungsten có đường kính rất nhỏ, khoảng 1μm (các kim loại nặng khác như vàng và bạc cũng được sử dụng nhưng không thường xuyên do giá cả đắt). Các hạt này được đặt trên một cái đĩa ở mặt bên trong của súng. Sự bùng nổ khí helium ở 1000psi làm cho cái đĩa bắn về phía trước với tốc độ 1300 food/s, tương đương với tốc độ khi một viên đạn rời khỏi nòng súng. Một tấm chắn làm dừng đĩa lại và các hạt vàng hay tungsten được phóng về phía các tế bào đích. Chúng xuyên qua vách tế bào và phóng thích các phân tử DNA (Hình 2.21). Súng bắn gen sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để hợp nhất sự biểu hiện các gen đã phân phối. Các tế bào biến đổi di truyền có thể được sử dụng để tạo thực vật bao gồm cả sự sửa đổi di truyền mong muốn ở trong tất cả các tế bào của chúng (Voiland, 1999). Mục tiêu của súng bắn gen thường là callus của các tế bào thực vật giống nhau sinh trưởng trong môi trường gel trên đĩa petri. Sau khi các hạt tungsten đã va chạm vào đĩa, gel và callus bị phá vỡ nhiều. Tuy nhiên một số tế bào không bị phá vỡ khi va chạm mạnh và đã tiếp nhận các hạt tungsten được bao bọc DNA và cuối cùng các phân tử DNA ngoại lai đã xâm nhập và hợp nhất vào nhiễm sắc thể thực vật. Các tế bào từ đĩa petri được tập hợp lại và chọn lọc các tế bào đã hợp nhất thành công và biểu hiện DNA ngoại lai bằng các kỹ thuật hóa sinh hiện đại như sử dụng gen chọn lọc nối tiếp và Northern blots. Các tế bào đơn đã chọn lọc từ callus có thể được xử lý với một số hormone thực vật như auxin, gibberelin và mỗi một tế bào có thể phân chia, biệt hóa thành các tế bào mô, cơ quan, tế bào chuyên hóa của toàn bộ cây. Cây mới có nguồn gốc từ một tế bào nảy mầm thành công có thể mang các đặc tính di truyền mới. Phương pháp này có ưu điểm là thao tác dễ dàng, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào và mô, các tế bào được biến nạp có tỉ lệ sống sót cao, cho phép đưa các gen vào tế bào ở vị trí mong muốn....Do vậy nó được sử dụng rộng rãi trongHình 2.23: Phức hợp DNA-calcium phosphat nhiều lĩnh vực. 4. Kỹ thuật calcium phosphate Kỹ thuật calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rông rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980). Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphat (Hình 2.23). Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do ẩm bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ Hình 2.24: Cấu trúc tổng quát của lipid cation tổng hợp Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Tỉ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp. 5. Chuyển gen qua liposome Hình 2.25: Cấu trúc của DOPE (L-diolecyl phosphatidylethanolamine) Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA vào tế bào. Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pH sinh lý là thành phần lipid tổng hợp phổ biến nhất của liposome được phát triển cho chuyển gen (Hình 2.24). Thường thì lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoyl phosphatidyl-ethanolamine (DOPE) (Hình 2.25). Phần cation của phân tử lipid kết hợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức hợp liposome-DNA (Hình 2.26). Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ Hình 2.26: Phức hợp liposome-DNA lưới tích điện dương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gen cao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết hợp với màng tế bào tích điện âm bền hơn. Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau đó đi vào nhân. Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màng nhân như thế nào. DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vai trò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sự dung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễ dàng. Trong phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trong các túi phospholipid. Các loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớp mỏng là thích hợp nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứa nước ở bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệ phân phối cao hơn. Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một sự kiện hiếm. Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp vi tiêm vào tiền nhân. Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra các điều kiện thí nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kết nang từ con đường ẩm bào. Liposome đã được sử dụng để đưa protein, lipid và các phân tử nhỏ vào nhiều loại tế bào nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả thấp hơn vi tiêm đối với RNA hoặc protein. Cũng như thế, chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt qua được các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự biểu hiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyết thanh có thể xảy ra. Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là gen chuyển sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và in vivo, có thể mang được các DNA có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao, không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuật calcium phosphat không có hiệu quả.. ĐỊNH HƯỚNG VÀ THÀNH TỰU Trên thế giới: Những thành công của các nhóm nghiên cứu trên thế giới đã chứng tỏ việc sản xuất và đưa sản phẩm vaccine trong thực vật ra thị trường sẽ trở thành hiện thực trong một tương lai không xa. Những tiến bộ mà các nhà công nghệ sinh học thực vật trên thế giới đã đạt được tập trung vào một số vấn đề sau: *Tăng cường mức độ biểu hiện kháng nguyên Ở phần trên, chúng ta đã biết nhiều kĩ thuật được sử dụng để cải biến di truyền thực vật, tuy nhiên hầu hết các báo cáo hiện nay về sản xuất vaccine ăn được đều liên quan đến phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium và promoter phổ biến nhất trong thiết kế gen biểu hiện là CaMV 35S (promoter của vi khuẩn khảm súp lơ), một promoter khoẻ cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao. Bên cạnh đó, nhiều hệ thống vector khác cũng được sử dụng để biểu hiện kháng nguyên. Việc nghiên cứu sản xuất kháng nguyên dưới đơn vị B của độc tố kém bền nhiệt (LT-B) ở E. coli, được điều khiển bằng promoter đặc hiệu vị trí (đặc hiệu hạt), làm bằng mức độ biểu hiện LT-B tới 1,8% protein hoà tan tổng số. Đồng thời, việc áp dụng hai phương pháp lai tạo giống ngô khác nhau đã nâng thành phần kháng nguyên gấp 5 và 10 lần. Chikwamba và đồng tác giả cũng biểu hiện LT-B thành công ở ngô, đây cũng là báo cáo đầu tiên sử dụng súng bắn gen để sản xuất vaccine trong thực vật. Tuy nhiên hiện nay mức độ biểu hiện kháng nguyên ở thực vật còn thấp là trở ngại chính trong việc phát triển vaccine này. Trong nỗ lực tìm kiếm giải pháp cho vấn đề này, Gleba và đồng tác giả (2005) thuộc công ty Genetics (Đức) đã công bố phương pháp mới nâng cao mức độ biểu hiện của kháng nguyên vaccine trong thực vật. Phương pháp này, gọi là “magnifection” đã kết hợp được những ưu điểm của ba hệ thống sinh học là tính hiệu quả và khả năng lây nhiễm hệ thống của Agrobacterium, tốc độ và mức độ biểu hiện cao của virus, khả năng cải biến sau dịch mã và giá thành sản xuất thấp của thực vật. Nguyên tắc của phương pháp này là lợi dụng sự lây nhiễm của Agrobacterium để vận chuyển và phát tán vector virus vào thực vật, sau đó vector mang gen quan tâm này sẽ tiến hành sao chép, nhân lên và lây nhiễm cho toàn bộ tế bào. Sử dụng phương pháp này trên cây thuốc lá Nicotiana benthamiana và củ cải đỏ ăn được, nhóm nghiên cứu trên đã thu kết quả rất khả quan. Tốc độ sản xuất kháng nguyên rất nhanh, vài mg-g trong 3-4 tuần, có thể tăng sản lượng tới 100kg/năm. Mức độ biểu hiện rất cao, đạt 5g protein tái tổ hợp trên 1kg lá tươi tương đương 80% protein hoà tan tổng số, gấp hơn 10 lần so với các phương pháp biểu hiện thông thường. Nhóm tác giả cũng chỉ ra hạn chế của phương pháp này như biểu hiện hạn chế các oligopeptide đa thành phần. Tuy nhiên với những ưu điểm vượt trội, phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả và có tiềm năng ứng dụng cao để sản xuất kháng nguyên vaccine thực vật giá rẻ an toàn về mặt sinh học. Tregoning và đống tác giả (2004) đã biểu hiện kháng nguyên vaccine mức độ cao trong lục lạp thuốc lá với kháng nguyên mô hình là Tet C (kháng nguyên vi khuẩn uốn ván). Trong nghiên cứu này, tác giả đã thu được mức độ biểu hiện khác nhau khi thay đổi hai yếu tố duy trì tính ổn định của promoter (vùng điều khiển gen) là cách sử dụng mã bộ ba (codon usage) và vùng trình tự không dịch mã 5’ (5’ UTR). Ví dụ, khi tăng gấp đôi các codon giàu A-T trong gen, mức độ biểu hiện cũng tăng gấp đôi từ 10 đến 20% protein hoà tan tổng số. Hoặc khi thay đổi 5’ UTR từ rbcl UTR thành T 7gen 10 5’ UTR cũng làm tăng gấp đôi mức biểu hiện của kháng nguyên TetC. Như vậy, có thể thấy phát hiện này rất quan trọng trong việc chuẩn hoá các đặc điểm của cây chuyển gen vì mức độ biểu hiện gen chuyển qua cao có thể gây hại cho cây. *Lựa chọn đối tượng thực vật Đến năm 2000 đã có 5 kháng nguyên được biểu hiện thành công ở rau quả. Trong đó dưới đơn vị B của nội độc tố kém bền nhiệt ở E. coli (LT-B), dưới đơn vị B của độc tố tả (CL-B), protein vỏ capsid virus Norwalk và kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B đều được sản xuất ở khoai tây. Riêng protein G của virus dại được biểu hiện ở cà chua. Năm 2005, trong một báo cáo mới nhất về vaccine ăn được trong thực vật, đã có những phân tích sâu sắc về các đối tượng thực vật được sử dụng để sản xuất vaccine, đặc biệt là viêm gan siêu vi B. 4 tiêu chuẩn đối với hệ thống thực vật đáp ứng mục đích này, đó là: Mức độ biểu hiện cao Mức độ kháng nguyên đồng đều trong mô thực vật Nguyên liệu thực vật phải ăn được Kháng nguyên ổn định ở nhiệt độ phòng và có thể bảo quản lâu dài. Nhiều nghiên cứư cho thấy, hạt ngô hội tụ 4 tiêu chuẩn trên của hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, đây cũng là đối tượng mà nhóm ông quan tâm để sản xuất kháng nguyên vaccine viêm gan B. Năm 2003, họ đã biểu hiện thành công dưới đơn vị B của độc tố kém bền nhiệt ở E.coli (LT-B). Họ thấy rằng phôi mầm của hạt ngô chuyển gen tập chung lượng kháng nguyên cao nhất, gấp 6 lần so với bộ phận khác và những nhân này tương ứng với một liều mg kháng nguyên. Sau đó, năm 2005 nhóm này lại biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt chính của virus viêm gan B trong hạt ngô. Mức độ biểu hiện gen trong hạt thu được từ cây chuyển gen thế hệ thứ nhất là 0,2% protein hoà tan tổng số, trong đó kháng nguyên tập trung tới 20% trong các phôi mầm của hạt. Korban và đồng tác giả đã biểu hiện kháng nguyên vaccine dưới đơn vị virus RSV ở cà chua, đây là virus gây bệnh đường hô hấp nghiêm trọng ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. Các thiết kế gen (một loại mang promoter CaMV 35 S và một loại mang promoter đặc hiệu quả E-8) chứa gen mã hoá cho kháng nguyên RVS-F được chuyển vào cà chua thông qua phương pháp chuyển gen bằng Agrobacterium. Sử dụng promoter đặc hiệu quả cho phép biểu hiện protein chỉ ở trong quả của tất cả các cây chuyển gen. Protein này tạo đáp ứng miễn dịch khi được thử nghiệm ở chuột.[3] *Thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của vaccine ăn được Hầu hết vaccine ăn được ở thực vật đã thử nghiệm ở động vật và giai đoạn 1 ở người. Một trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến việc thử nghiệm quy mô lớn ở người là do sự ngại rằng vaccine ăn được bị phân huỷ bởi dịch tiêu hoá trong đường ruột. Do đó, khó có thể thu được kết quả chính xác do không có phản ứng sinh kháng thể hoặc kháng thể rất ít, không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Đồng thời vaccine ăn được không biểu hiện đồng nhất trong các mô thực vật cũng gây khó khăn trong việc xác định liều lượng để thử nghiệm. Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên ở người được ghi nhận vào năm 1997 bởi nhóm nghiên cứu của Arntzen và được sự chấp nhận của Cơ quan quản lí dược phẩm và thực phẩm Hoa Kì. Trong thử nghiệm vaccine dưới đơn vị độc tố E.coli LT-B này, 11 người đã ăn sống 50-100g khoai tây chuyển gen. Kết quả cho thấy 10/11 người kiểm tra đều tạo kháng thể chống lại LT-B, lượng kháng thể này tương ứng với kháng thể đo được ở những người niễm E. coli nồng độ 106 . Như vậy, protein LT-B này trong các mô thực vật ăn được không bị phân huỷ trong đường tiêu hoá và có khả năng đáp ứng miễn dịch ở người. Hiện nay, Thanavala và đồng tác giả (2005) đang thử nghiệm giai đoạn I và II vaccine viêm gan B ở khoai tây. Khi ăn 2 đến 3 liều, mỗi liều 100g khoai tây sống tương đương 1mg kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B, 33 người kiểm tra có phản ứng tạo kháng thể với nồng độ 10 mIU/mL. Thành công đầu tiên về biểu hiện gen mã hoá cho kháng nguyên vỏ virus Staphyloccocus mutants vào năm 1990 đã mở ra hướng mới sản xuất vaccine ăn được trong thực vật, thu hút sự quan tâm đặc biệt của nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới, trong đó hai nhóm nghiên cứu với nhiều đóng góp quan trọng là nhóm của Arntzen tại viện nghiên cứu thực vật Boyce Thomson, thuộc trường đại học Cornell, Hoa Kỳ và tại ProdiGene một công ty tư nhân về công nghệ sinh học thực vật của Hoa Kỳ. Có thể nói nhóm nghiên cứu của Mason là nhóm tiên phong trong lĩnh vực vaccine trong thực vật với việc biểu hiện thành công kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HbsAg) ở thuốc lá năm 1992 . Nhóm này đã có những đóng góp to lớn trong sự phát triển của vaccine ăn được như đóng góp về mặt cơ sở, nguyên lý khoa học, lựa chọn đối tượng sản xuất vaccine như khoai tây, chuối; thử nghiệm vaccine này ở người và động vật, tiến tới đưa sản phẩm thực vật mang vaccine đến mọi người. Hiện nay, nhóm này đang thực hiện dự án chuyển giao công nghệ và trao đổi thông tin về vaccine ăn được với các nhà khoa học ở những nước đang phát triển. Dự án trị giá 58000 USD, kéo dài trong 3 năm do Rockefeller Foundation tài trợ, thực hiện đầu tiên với CINESTAV - một tổ chức y tế chính phủ Mexico nhằm mục đích sản xuất vaccine HIV ăn được giá rẻ trong chuối và có thể sử dụng trên toàn thế giới để chống lại HIV/AIDS. Hiện nay nhóm nghiên cứu của Arntzen đang triển khai dự án sản xuất vaccine trong chuối. Họ hi vọng chuối sẽ là nguồn cung cấp chính vaccine ăn được, dễ ăn và giá thành rẻ. Thứ ba là tăng cường tính bền vững của vaccine với dịch tiêu hoá trong đường ruột người và động vật. Ngoài ra, việc xác định liều lượng thực vật mang vaccine rất quan trọng khi thử nghiệm và đưa sản phẩm ra thị trường. Nhóm của Streatfield và đồng tác giả (2003) mặc dù khởi đầu muộn hơn nhưng đã có những đóng góp đáng kể trong việc sản xuất vaccine ăn được. Hiện nay nhóm này đang tham gia vào các dự án vaccine dựa trên thực vật của công ty ProdiGene, chủ yếu trên cây ngô, một đối tượng nghiên cứu được xem là lý tưởng cho sản xuất vaccine ăn được. Nhóm đã xây dựng thành công hệ thống sản xuất vaccine viêm gan B ở ngô. có thể sử dụng dưới dạng bánh snack (ngô qua chế biến được nghiền thành bột). Các vaccine sản xuất trong thực vật đã nâng cao giá trị cây trồng, nhất là cây chuyển gen do chúng được trồng và chế biến trên quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu thuốc và sinh dược phẩm. Vaccine ăn được đã mở ra một kỉ nguyên mới của nông nghiệp, được các nhà khoa học gọi là “biofarming”, trong đó các cây nông nghiệp được cải biến chất lượng (tăng cường giá trị dinh dưỡng, làm thuốc), trồng trong các khu vực đặc biệt và sử dụng đặc biệt như các “nhà máy” sản xuất vaccine và các tác nhân kháng khuẩn khác. Như vậy, những vấn đề còn tồn tại trong sản xuất vaccine ăn được từ thực vật đã mở ra những hướng nghiên cứu quan trọng cho các nhà khoa học trên con đường tìm kiếm một vaccine giá rẻ, cung cấp đến mọi nơi trên thế giới, đặc biệt ở những nước đang phát triển. Và rõ ràng lĩnh vực mới đầy tiềm năng này đang bước vào giai đoạn phát triển sôi động, đòi hỏi sự hợp tác của nhiều nhà khoa học trên thế giới cùng giải quyết những khó khăn này. Trong đó, việc chuyển giao công nghệ sản xuất vaccine ăn được đến các nước đang phát triển rất cần thiết vì đây; là những quốc gia thực sự cần loại vaccine này.[4] *Một số thành tựu vaccine ăn được 1.Vắc-xin từ khoai tây...chuyển gien! Khoai tây chứa vắc-xin. Loại khoai tây chuyển đổi gien (GM), chứa vắc-xin ngừa viêm gan B, đã thúc đẩy thành công khả năng miễn dịch trong các cuộc thử nghiệm lâm sàng đầu tiên. Trong nghiên cứu, hơn 60% tình nguyện viên ăn khoai tây GM, tương đương ba liều vắc xin. Kết quả là cơ thể họ tạo thêm một lượng lớn kháng thể chống lại virus. Tình nguyện viên ăn khoai tây bình thường không sinh thêm kháng thể. Tuy nhiên, do những người ăn sống khoai tây GM đã được tiêm vắc-xin viêm gan B thông thường nên vắc-xin khoai tây chỉ tăng cường khả năng miễn dịch của họ. Để tạo vắc-xin trong khoai tây, nhóm nghiên cứu do Charles Arntzen thuộc ĐH Arizona (Mỹ) đứng đầu đã bổ sung vào cây khoai tây thông thường một protein của virus viêm gan B. Khi con người ăn khoai tây này, protein sẽ giúp hệ miễn dịch nhận ra và tiêu diệt mọi virus viêm gan B trong tương lai. Theo Arntzen, biến thực phẩm thành nguồn vắc-xin rẻ tiền rất hữu ích đối với các nước nghèo vì không phải bỏ ra nhiều chi phí bảo quản lạnh hoặc mua kim tiêm. Tuy nhiên, điều không may là các nhà phát triển dược phẩm đang từ bỏ việc bào chế vắc-xin trong các loại thực phẩm cơ bản chẳng hạn như chuối, cà chua và khoai tây. Nguyên nhân là họ lo ngại khả năng thực phẩm chứa vắc-xin có thể bị lẫn vào thực phẩm trong siêu thị hoặc cửa hàng. Nếu điều này xảy ra, hậu quả sẽ khôn lường. Thay vào đó, các nhà bào chế thuốc đang tập trung vào sản xuất vắc-xin trong lá cây ăn được song thực vật đó không được bán làm thực phẩm. Nhóm nghiên cứu của Arntzen đang điều tra một số thực vật và hứa hẹn nhất là Nicotiana benthamiana, họ hàng của cây thuốc lá. Lá được thu hoạch, rửa sạch, nghiền rồi ướp lạnh-sấy khô để bảo quản trước khi đóng vào các viên con nhộng. Ướp lạnh- sấy khô có nghĩa là vắc-xin tồn tại trong thời tiết nóng, không cần bảo quản lạnh giống như vắc-xin thông thường. Ngoài ra, đóng vắc-xin thành viên con nhộng đảm bảo liều lượng thống nhất[5] 2. Gạo chứa vaccine chống dịch tả Nhóm nghiên cứu do giáo sư Hiroshi Kiyono thuộc khoa nghiên cứu miễn dịch, Trường đại học Tokyo đứng đầu, đã công bố việc phát triển một loại gạo có chứa vaccine chữa bệnh dịch tả. Tiến bộ này có thể sẽ giảm bớt khó khăn cho việc phân phối vaccine ở những quốc gia đang phát triển trong thời gian sắp tới. Các loại vaccine tiêm thông thường không tạo được phản ứng miễn nhiễm ở những nơi có màng nhầy trong cơ thể. Do vậy loại vaccine mới này sẽ có tác dụng tốt trong việc chống lại tác nhân gây nhiễm thông thường qua màng nhầy, ví dụ virus dịch tả, E. coli, virus gây suy giảm hệ miễn dịch ở người, virus cúm và SARS. Các nhà nghiên cứu Nhật Bản đã có thể tạo ra phản ứng miễn nhiễm ở chuột, đồng Với một bát cơm từ lúa chuyển gien, vừa no bụng lại vừa trị được bệnh. thời tránh phản ứng dị ứng với chính loại gạo này. Ngoài ra, loại gạo chuyển hoá gen này có thể được trữ ở nhiệt độ thông thường mà không gặp nguy cơ nhiễm khuẩn. Mặc dù thế, việc sử dụng loại gạo được biến đổi để tạo nên phản ứng vaccine không có nghĩa rằng đây là loại vaccine ăn được. Các nhà khoa học không muốn công chúng nghĩ rằng ăn gạo này sẽ được chủng ngừa. Thay vào đó, vaccine này sẽ được cung cấp dưới dạng viên nhộng hoặc viên nén có chứa bột gạo và được xem là thuốc chứ không phải thực phẩm. 3.Thuốc lá chuyển gen có chứa vắc-xin chống dịch hạch Nguyên nhân gây bệnh dịch hạch là loại vi khuẩn có tên Yersinia pestis, hiện nay bệnh dịch này vẫn có nguy cơ xảy ra ở 1 số vùng ở châu Phi, châu Á, châu Mỹ và Liên Xô cũ, đặc biệt là những nơi con người sống gần với các loài gặm nhấm. Y. pestis nguy hiểm nhất khi bị hít vào trong phổi, vì nó có thể phá hủy phổi của người bệnh, dẫn đế n cái chết. Kháng sinh có thể được sử dụng để chữa bệnh dịch hạch, nhưng các biện pháp chữa trị chỉ có hiệu quả nếu bệnh được phát hiện sớm. Một vài chủng Y. pestis có thể kháng thuốc kháng sinh, nên các nhà khoa học phải tìm kiếm các biện pháp sản xuất hàng loạt các loại vắc-xin mới. Luca Santi và Hugh S. Mason đã khám phá ra loại vắc-xin phòng bệnh dịch hạch trong lá cây thuốc lá. Trong một nghiên cứu gần đây, các nhà khoa học đã phân tích sự biểu thị của 2 prôtêin của Y.pestis trên cây trồng: kháng nguyên F1, tạo thành 1 phần của vỏ bao ngoài tế bào Y.pestis, kháng nguyên V, có tham gia vào quá trình gây bệnh, và hỗn hợp của F1 và V. Các gen của 2 kháng nguyên này được đưa vào tế bào cây thuốc lá bằng khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau đó các prôtêin được tạo thành được phân tích tính kháng nguyên và thử nghiệm trên chuột bạch. Các nhà nghiên cứu thấy rằng: 1) cả 3 loại kháng nguyên trên đều biểu lộ ở mức độ cao trên lá cây thuốc lá; 2) cả 3 loại prôtêin đều tạo ra phản ứng miễn dịch ở chuột thí nghiệm; 3) sau khi xịt liều Y pestsis có chứa 100% độc tố vào chuột, những con chuột được sử dụng vắc-xin có tỉ lệ sống rất cao sau 21 ngày, trong khi những con chuột giả miễn dịch (sham-immunized) đều chết sau 6 ngày. [6] 4. Vacxin giúp ngăn ngừa ung thư: Vắcxin từ thực vật giúp ngăn ngừa ung thư cổ tử cung Các nhà khoa học đang phát triển các loại chuối và khoai tây chứa văcxin chống virut papilloma (HPV) gây ra các căn bệnh lây nhiễm qua tình dục và đồng thời là nguyên nhân chủ yếu của các ca ung thư cổ tử cung ở phụ nữ. Các nhà nghiên cứu ở Đại học Rochester đang tiến hành thử nghiệm các giống mới có chứa văcxin và hiện nay đang trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng. Bệnh do HPV là nguyên nhân phổ biến gây ung thư ở phụ nữ tại các nước đang phát triển, chiếm tới hơn 80%. Phát triển loại văcxin để phòng ngừa căn bệnh này có giá trị to lớn. Các nhà khoa học đang tiến hành cho chuột ăn khoai tây từ công nghệ sinh học và hy vọng chúng sẽ có các phản ứng miễn dịch tự bảo vệ. [7] -Chuối "sản xuất" văcxin viêm gan B Các nhà công nghệ sinh học đã phát triển được một loại văcxin viêm gan B tương tự với văcxin truyền thống, nhưng được tạo ra từ chuối với chi phí thấp. Phát triển này có thể cứu sống hàng trăm nghìn người. Năm 2003, ước tính có khoảng 300 triệu người mang virut viêm gan và một phần số này đã tử vong. Alexander V. Karasev, trưởng nhóm nghiên cứu văcxin tại trường Đại học Thomas Jefferson ở Philadelphia cho biết: "Khi được phát triển đầy đủ, các loại văcxin từ thực vật có thể rẻ hơn rất nhiều so với các loại văcxin hiện có. Ngày nay, chi phí miễn dịch hoàn toàn viêm gan B cho một người có thể tốn 450 đô la. Trong tương lai, nhờ có văcxin từ thực vật, chi phí sẽ giảm và văcxin có thể đủ cho nhiều người. Lựa chọn chuối để ‘sản xuất’ văcxin vì đây là thực phẩm rẻ, có ở nhiều nơi trên thế giới và là một trong số thức ăn đầu tiên của trẻ em. . Ở các nước đang phát triển - nơi mà các thiết bị làm lạnh và khử trùng khan hiếm và đắt đỏ thì loại văcxin từ chuối có thể giúp ngăn ngừa tử vong vì đây là giải pháp hiệu quả so với các loại văcxin truyền thống giá cao. [7] -Văcxin từ cà chua giúp chống các bệnh về hô hấp Cà chua có thể được sử dụng để chứa văcxin phòng ngừa RSV - loại virut tiềm tàng gây ra các bệnh hô hấp thường tấn công trẻ em. RSV khiến cho gần 90.000 người phải nhập viện và 4.500 trẻ sơ sinh và trẻ em tử vong mỗi năm. Bộ Nông nghiệp Mỹ đang tài trợ cho một nhóm các nhà khoa học ở Đại học Illinois nhằm nâng cao tính năng di truyền của cà chua, thậm chí là cả táo nhằm tạo ra loại văcxin chống lại các căn bệnh này. Văcxin sẽ tạo khả năng bảo vệ màng nhầy bằng cách kích thích các kháng thể kháng lại các protêin của RSV khi chúng xâm nhập lần đầu vào cơ thể qua đường mũi, họng và miệng. Dự án còn triển khai nhiều năm nữa song các thử nghiệm ban đầu trong PTN đối với chuột đang có những triển vọng[7] 5.Vacxin cai thuốc lá: Loại vacxin mới này tên là NicVAX, có khả năng tạo ra kháng thể chống nicotin trong máu người nghiện thuốc lá, không cho nó lên não, làm mất cảm giác thích thú và do đó ngăn được việc nghiện. Kháng thể này có thể tồn tại trong máu một vài năm. Trong thời gian này, việc hút thuốc trở lại sẽ không làm cho người hút cảm thấy thích thú. Bình thường, vì phân tử nicotin (chất độc chủ yếu của thuốc lá) quá bé nên hệ thống miễn dịch của cơ thể không nhận ra được để chống lại. Các nhà nghiên cứu đã liên hợp nicotin với một protein lớn hơn gọi là pseudomonas toxoid. Nhờ đó, hệ miễn dịch nhận diện được kẻ thù và sản xuất ra các kháng thể chống lại nó. Các nhà nghiên cứu đã tiêm cho động vật vacxin này rồi cho nicotin vào đường tĩnh mạch của con vật đó. Kết quả là ở những con này, lượng nicotin bị giữ lại trong máu cao gấp 8,5 lần so với những con vật không dùng vacxin. Đặc biệt, lượng nicotin được phân bố trong não chúng cũng ít hơn 64% so với những con vật không dùng vacxin. Như vậy, NicVAX đã ngăn cản nicotin lên não. [8] 6.Loại gạo chữa dị ứng chứa vacxin ăn được: Dị ứng là một vấn đề sức khoẻ đáng chú ý, ảnh hưởng đến hơn 15% trẻ em và người lớn ở trên thế giới. Dị ứng có thể xảy ra ở da, bộ máy hô hấp và ruột, có thể nặng lên vì nhiều loại tác nhân bên ngoài môi trường khác nhau, như tiếp xúc với phấn hoa, sợi, hoặc một số loại phân tử nhất định có mặt trong thực phẩm. Sử dụng các loại thuốc tổng hợp là phương pháp phổ biến nhất để chữa trị dị ứng, Tuy nhiên ông Hidenori Takagi ở Tsukuba, Nhật Bản và các đồng nghiệp đang tìm kiếm một phương pháp chữa trị khác, thông qua tìm hiểu: một loại vắc xin ăn được dựa trên lúa gạo‘’Rice-based edible vaccine’’ nhờ vào việc biểu thị “multiple T cell epitopes”, kích thích chống lại sự ức chế đối với “Th2-mediated IgE responses ”. Nghiên cứu của họ được đăng trên số mới nhất của Kỷ yếu trực tuyến của Viện hàn lâm khoa học quốc gia.  Các nhà nghiên cứu đã sử dụng các epitope trội tìm thấy trong chất gây dị ứng có trong phấn cây tuyết tùng Nhật Bản. Epitopes là những trình tự amino acid có thể kích thích một phản ứng miễn nhiễm một cách thầm lặng. Người ta tìm cách dung hợp gien này với gien điều khiển protein dự trữ “glycinin” chuyển nạp vào cây lúa, các nhà khoa học đã có thể tạo ra giống lúa có 0,5% prôtêin của hạt gạo có chứa hỗn hợp glycinin và epitope. Khi thử nghiệm gạo chuyển gen này trên trên chuột, các nhà khoa học thấy rằng các con chuột ăn loại gạo này thể hiện hàm lượng histamine thấp hơn, và không phát triển hiện tượng dị ứng do phấn hoa. Loại prôtêin này tồn tại ổn định trong hạt gạo trong vòng 6 tháng, ngay cả khi tồn trữ trong phòng có nhiệt độ cao.[9] 7.Tạo lúa chuyển gien chứa vaccine Các nhà khoa học Nhật Bản vừa tạo ra một loại lúa chuyển gien chứa vaccine ngừa bệnh sốt mùa hè - một bệnh dị ứng do phấn hoa hoặc bụi gây ra. Các cuộc thử nghiệm trên chuột cho thấy loại vaccine dưới dạng lúa ăn này đã ngăn được phản ứng miễn dịch gây dị ứng. Cụ thể là chuột được ăn lúa chuyển gien nói trên hắt hơi ít hơn khi tiếp xúc với phấn hoa, so với những con không được ăn lúa (nhóm đối chứng). Họ đã tạo ra vaccine bằng cách dùng những mẩu protein nhất định. Những mẩu này liên quan tới dị ứng và được tìm thấy trong phấn hoa của cây thông liễu Nhật Bản - nguyên nhân phổ biến gây sốt mùa hè tại nước này. Bằng cách bổ sung vật liệu di truyền từ những protein nói trên vào bộ gien lúa, họ đã tạo ra được loại lúa chứa các protein phấn hoa. Sau đó, họ cho một nhóm chuột ăn lúa hàng ngày, trong khoảng vài tuần rồi cho chúng phơi nhiễm với phấn hoa của cây thông liễu. Kết quả là chúng tạo ra ít histamine hơn - hoá chất gây các triệu chứng sốt mùa hè - và hắt hơi ít hơn so với nhóm chuột đối chứng.[9] Định hướng nghiên cứu vaccine ăn được ở Việt Nam Hiện nay, Việt Nam đã sản xuất được 9/10 vaccine phục vụ chương trình tiêm chủng mở rộng và được UNICEF công nhận là quốc gia thứ hai thanh toán xong bệnh bại liệt. Nhưng ở nước ta, vaccine ăn được vẫn là vấn đề khá mới mẻ và chưa có tài liệu nào đề cập sâu về loại vaccine này. Bên cạnh đó, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật trên thế giới, các nhà khoa học Việt Nam đã đạt được nhiều thành công trong việc nâng cao giá trị và phẩm chất cây bằng nhiều phương pháp khác nhau như chuyển gen Bt kháng sâu vào bông, gen kháng đạo ôn vào lúa.. Tuy nhiên, chưa có báo cáo nào về nghiên cứu sản xuất kháng nguyên trong thực vật, nhất là cây ăn được. Hiện nay, viện công nghệ sinh học đang chủ trì thực hiện đề tài trọng điểm của chương trình nghiên cứu khoa học cơ bản với nội dung chuyển các gen gây bệnh của virus dại vào đối tương cây lạc. Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã đề xuất và triển khai thực hiện đề tài sản xuất vaccine ăn được có nguồn gốc thực vật ở Wolffia (bèo tấm) thông qua Agrobacterium. Nhiều nghiên cứu về đặc tính sinh học của Wolffia cho thấy đây là thực vật có tốc độ sinh trưởng nhanh theo kiểu nảy chồi, đặc biệt nó có hàm lượng dinh dưỡng cao, là loại thức ăn rất tốt cho gia súc và có thể làm thức ăn tươi cho người ở một số nước trên thế giới. Wolffia mang đầy đủ đặc điểm cần thiết của hệ thống sản xuất protein hiệu quả cao và là đối tượng lí tưởng cho nghiên cứu vaccine ăn được.[10] 1.Tạo vắc-xin viêm gan B "ăn được" từ trái cà chua Các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học Nhiệt đới TP.HCM hiện đang tiến hành nghiên cứu vắc-xin ngừa viêm gan B ăn được từ các bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ... Trong đó có cây cà chua. Nước ta là vùng lưu hành cao của bệnh viêm gan do siêu vi B (HBV). Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10 - 15% dân số (trên dưới 10 triệu người). Bệnh lây lan theo hướng đa dạng và phức tạp, có thể dẫn đến xơ gan và ung thư gan. Cách tốt nhất là phòng ngừa và một trong các biện pháp phòng ngừa quan trọng là chủng ngừa.  Tại Viện Sinh học nhiệt đới TP.HCM, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Một nhóm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Gen, đang tiến hành nghiên cứu vắc-xin ngừa viêm gan B ăn được từ các bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ... Trong đó có trái cà chua. Hiện nay, trên thế giới cũng đã có nhiều công bố khoa học, dùng công nghệ chuyển gien đã mã hóa protein HBsAg vào nhân và lục lạp tế bào, vào một số cây trồng,... Theo nhóm nghiên cứu, một thành phần quan trọng của HBV là protein HBsAg giúp cho HBV bám dính vào mảng tế bào và sau đó đi vào tế bào và huyết tương người bệnh. Huyết tương có chứa HBsAg là nguồn vật liệu quan trọng để sản xuất thuốc chủng ngừa có nguồn gốc huyết tương. Các nhà khoa học đã chiết tách phần protein tinh khiết đó và nghiên cứu khả năng đáp ứng miễn dịch ở cơ thể động vật bằng cách tiêm chích protein tinh khiết hoặc ăn trực tiếp sản phẩm cây chuyển gien. Qua các kết quả trên, nhóm nghiên cứu của Phòng Công nghệ Gen - Viện Sinh học nhiệt đới nhận thấy, protein kháng nguyên HBsAg sử dụng qua đường tiêu hóa có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch tốt. Điều này mở ra một triển vọng nghiên cứu chuyển nạp gien này vào các cây trồng có bộ phận ăn tươi như quả, lá, thân, củ... Với phương pháp chuyển gien bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, kết quả nghiên cứu của Viện Sinh học nhiệt đới đã nhận được một số loại cây trong đó có cây cà chua mang gien mã hoá kháng nguyên bề mặt vi-rút viêm gan B. [11] Tài Liệu tham khảo: [1] Tạp chí công nghệ sinh học 2005, vol 3 [2] [3] [4] [5](TheoNewScientist,BBC [6] [7] [8] [9] agbiotech VietNam) [10] [11]ViệtNamNet-Xử lý tin: Trọng An Nhóm 2: Thanh, Dung, Hiếu, Liên, Thảo, Hà, Sương