Đề tài Vi sinh vật có lợi trong bia

LỜI MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật và sự phát triển của kinh tế nhiều thành phần, các ngành khoa học đã phát triển mạnh trong đó Công Nghệ Vi Sinh mà tiền thân của nó là Công Nghệ Len Men cổ điển đã trải qua nhiều chặng đường phát triển đầy khó khăn, phức tạp với nhiều phát minh và cả những nỗi lầm, những kỳ công và sự ngộ nhận. Đến ngày nay Vi Sinh với những ứng dụng của Vi Sinh Vật đã giúp ích rất nhiều trong các lĩnh vực như Công Nghiệp, Nông Nghiệp … Trong Công Nghệ SX Bia cũng vậy nhờ có những Vi Sinh Vật mà ngày nay chúng ta mới có những thức uống, những loại bia thượng hạng để phục vụ nhu cầu con người. Trong Công Nghệ SX Bia, quá trình lên men là một trong những yếu tố quyết định đến thành phẩm. Nhờ có những Vi Sinh Vật mà quá trình lên men mới được thực hiện. Để hiểu rõ hơn về vấn đề này chúng em tiến hành làm tiểu luận với đề tài “ Hệ Vi Sinh Vật có lợi trong bia”. Nhằm mục đích tìm hiểu quá trình lên men và những vi sinh vật trong quá trình lên men của Bia, hiểu rõ hơn về những hoạt động của vi sinh vật .Và những lợi ích của Vi Sinh Vật đối với đời sống và khoa học kỹ thuật. Phần I: TỔNG QUAN VỀ BIA 1.1.Khái niệm Bia là một loại nước uống chứa cồn được sản xuất bằng quá trình lên men của đường lơ lửng trong môi trường lỏng và nó không được chưng cất sau khi lên men. Nói một cách khác, bia là loại nước giải khát có độ cồn thấp, bọt mịn xốp và có hương vị đặc trưng của hoa houblon. Đặc biệt CO2 hòa tan trong bia có tác dụng giải nhiệt nhanh, hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa, ngoài ra trong bia còn chứa một lượng vitamin khá phong phú (chủ yếu là vitamin nhóm B như vitamin B1, B2, PP…). Nhờ những ưu điểm này, bia được sử dụng rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới với sản lượng ngày càng tăng. Đối với nước ta bia đã trở thành loại đồ uống quen thuộc với sản lượng ngày càng tăng và đã trở thành ngành công nghiệp mũi nhọn trong ngành công nghiệp nước ta. 1.2. Lịch sử Hình 1.1 Một vại bia lager, có màu vàng óng và bọt ở phía trên Bia là một trong các đồ uống lâu đời nhất mà loài người đã tạo ra, có niên đại ít nhất là từ thiên niên kỷ thứ 5 trước công nguyên và đã ghi chép và đã ghi chép lại trong các thư tịch cổ của Ai Cập cổ đại và Lưỡng Hà. Việt kiểm định các bình gốm cổ phát hiện ra rằng bia đã được sản xuất khoảng 7.000 năm trước ở khu vực ngày nay là Iran và là một trong số các công nghệ sinh học đã biết, trong đó các quy trình sinh học của sự lên men được áp dụng Năm 1516,WilliamVI, Công tước sứ Bavaria, đã thông qua Reinheitsgebot ( Luật tinh khiết). Gebot quy định rằng thành phần của bia chỉ được bao gồm nước, lúa mạch hoa bia, với men bia được bổ sung sau phát kiến của Louis Pasteur vào 1857. Luật của người Bavaria đã được áp dụng cho cả nước Đức như một phần của nước Đức thống nhất năm 1871 thành đế chế Đức dưới thời Otto von Bismarck, và kể từ đó đã được cập nhập để phản ánh xu hướng hiện đại trong sản xuất bia rượu. năm 1953 Morton Wcoutts người New Zealand đã phát triển kỹ thuật lên men liên tục. Morton lấy bằng sáng chế công nghệ của ông và nó là một cuộc cách mạng trong công nghiệp bia do đó nó làm giảm thời gian ủ và sản xuất bia trước đây là 4 tháng xuống còn chưa đầy 24 giờ. Công nghệ của ông vẫn còn được sử dụng bởi nhiều nhà sản xuất bia lớn nhất thế giới ngày nay, bao gồm cả Guinness. Ngày nay, công nghiệp bia là công việc kinh doanh khổng lồ toàn cầu. Trong khi bia chủ yếu là đồ uống có cồn, thì một số biến thái của nó cũng tồn tại, xuất phát từ thế giới phương Tây, là các loại bia đi qua công đoạn xử lý để loại bớt cồn, sản xuất ra cái gọi là bia không cồn. 1.3. Các loại bia Có nhiều loại bia khác nhau, mỗi loại bia được goi là thuộc về một kiểu bia cụ thể nào đó. Kiểu bia là loại mác dán miêu tả hương vị tổng thể và thông thường là nguồn gốc của bia. Yếu tố chính để xác định loại bia là men bia sử dụng trong quá trình lên men. Phần lớn kiểu bia thuộc một trong hai họ lớn: ale - sử dụng lên men nổi hoặc lager - sử dụng lên men chìm.Trong đó lager được tiêu thụ nhiều nhất có nguồn gốc từ vùng Trung Âu. Bia đen porter Zywiec bia vàng Hoavener Hình 1.2 Loại bia lager Hình 1.3 Các loại bia được sử dụng rộng rãi ở Việt Nam 1.4. Sơ đồ quy trình sản xuất Hình 1.4 Sơ đồ quy trình sản xuất bia Đai mạch: Là nguyên liệu có tính truyền thống để sản xuất bia. Đại mạch cũng giống như những ngũ cốc khác bao gồm 2 thành phần chính là glucid và protein nhưng đại mạch có hàm lượng cao hơn so với các loại ngũ cốc khác và quan trọng nhất là tỷ lệ glucid / protein cân đối thích hợp cho việc sản xuất bia. Gồm có 3 bộ phận: vỏ hạt, phôi và nội nhũ. Trong đó vỏ hạt chiếm 8 – 15 % vỏ hạt, phôi gồm 2.5 – 5 % trọng lượng hạt (gồm 7% chất béo, 5 – 6 % saccharose,7 – 7.5 % pentozan v.v..), nội nhũ chiếm 45 – 68 % trọng lượng hạt, Có 2 loại đại mạch: đại mạch 2 hàng và đại mạch nhiều hàng Trong công nghệ sản xuất bia sử dụng đại mạch 2 hàng Nghiền: Mục đích là phá vỡ cấu trúc tinh bột của hạt, nghiền hạt thành nhiều mảnh nhỏ để tăng bề mặt tiếp xúc với nước, thúc đẩy quá trình hồ hóa và thủy phân nhanh và triệt để hơn. Đối với gạo: nghiền càng mịn càng tốt, khả năng tiếp xúc với enzym càng cao, hiệu quả thủy phân càng triệt để. Đối với malt: nghiền không được quá mịn vì trong quá trình nấu và lọc các chất trong vỏ trấu sẽ chiết vào dịch nha ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đường hóa: là quá trình chuyển tối đa những chất không hòa tan dự trữ trong malt, thông qua các enzym amylaza, proteaza có sẵn trong malt qua thủy phân. Mục đích: chiết tối đa các chất có thể hòa tan trong nguyên liệu và thủy phân các chất có phân tử lượng cao, tạo thành những chất đơn giản, hòa tan được với nước tạo thành dịch đường hóa. Lọc dịch đường hóa: là quá trình tách dịch đường ra khỏi bã. Houblon: thuộc họ dây leo, trong sản xuất bia sử dụng hoa cái chưa thụ phấn. Houblon làm cho bia có vị đắng dịu, hương thơm đặc trưng, có khả năng tạo và giữ bọt, có khả năng làm bia trong, giúp bia chuyển màu v.v... Lắng: nhằm mục đích tách cạn và tỏa nóng Làm lạnh dịch nha: mục đích: đưa nhiệt độ về nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men theo yêu cầu kỹ thuật đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình bão hòa CO2. Làm lạnh bằng thiết bị hạ nhiệt khung bản Lên men: Lên men chính: nhằm chuyển hóa đường trong dịch nha thành ethanol, cacbondioxide cùng với các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian từ quá trình trao đổi chất của nấm men. Lên men phụ: chuyển hóa lượng đường còn sót lại của quá trình lên men chính để tạo thành CO2. Và những biến đổi quan trọng như sự chín của bia non và những đặc điểm cảm quan như độ trong, hương vị và màu sắc. Phần II: VI SINH VẬT CÓ LỢI TRONG BIA Ngày nay với sự phát triển của khoa hoc công nghệ, ngành bia ngày càng phát triển chất lượng bia ngày càng nâng cao. Để đạt được điều đó nhờ những vi sinh vật với sự hoạt động tích cực của chúng đã góp phần không nhỏ vào chất lượng bia ngày nay. Nấm Men là một sinh vật điển hình. 2.1. Chủng loại nấm men trong công nghệ thực phẩm và trong sản xuất bia. 2.1.1. Tổng quan Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt là những khu vực trồng nho và các nơi trồng nhiều hoa quả. Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu. Từ lâu người ta đã sử dụng nấm men để sản xuất bia. Nấm men sinh sôi nhanh tế bào chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, đặc biệt hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào nên nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein và được ứng dụng rất nhiều trong sản xuất, Tuy nhiên cũng có loại nấm men gây hại cho nguời và gia súc, làm hư hỏng thực phẩm. Candida albicans Cryptococcus neoformans Hình 2.1 Một vài nấm men gây bệnh cho người 2.1.2. Nấm men trong công nghệ thực phẩm Trong công nghệ thực phẩm nấm men dùng để sản xuất cồn, rượu, bia, nước giải khát lên men. Sự tạo ra CO2 trong quá trình hô hấp có ý nghĩa trong việc làm nở bột được ứng dụng trong sản xuất bánh mì và các loại bánh có cấu trúc xốp nhẹ. Một số loại nấm men khác mà trong tế bào có chứa hàm lượng lớn lipid hay enzyme cũng được dùng trong sản xuất thịt nhân tạo. Các giống nấm men thường gặp trong thực phẩm: Tộc Saccharomyceteae: bao gồm giống Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Hansenula, Debaryomyces, Schwanniomyces, các nấm men này thường được ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia, rượu, nước uống lên men, công nghệ enzyme dùng trong thực phẩm. Tộc Nadsonieae:gồm giống Saccharomycoides, Hanseniaspora, Nadsonia. Nhóm này không có ý nghĩa trong công nghệ thực phẩm, một trong số chúng có khả năng gây hỏng thực phẩm. Tộc Candidoideae: gồm Candida và Trichosporon các loại này thường được dùng trong sản xuất chế phẩm hổn hợp protein – vitamin. Nấm men được ứng dụng rất nhiều trong sản xuất vì thế mà tuỳ vào mục đích sản xuất sinh khối khác nhau ta chọn những chủng giống khác nhau sao cho phù hợp. 2.1.3 Nấm men trong công nghệ sản xuất bia Nấm men trong công nghệ sản xuất bia là các chủng mà có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hơp chất nitơ ( acid amin, peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng. Hiện nay trong sản xuất bia người ta dùng hai chủng chủ yếu là: Saccharomyces Cerevisiae ( lên men nổi) Saccharomyces Carlsbergensis (lên men chìm) Trong quá trình lên men nổi có ưu điểm là quá trình hoạt hoá xảy ra vẹn toàn hơn do bề mặt diện tích tiếp xúc của nấm men cao nhưng cách lên men này có khuyết điểm là nấm men nổi lơ lửng trong dịch lên men và chỉ lắng xuống đáy thành một lớp xốp khi quá trình lên men kết thúc vì thế trong phương pháp này lọc men ra khỏi bia rất khó đòi hỏi công nghệ lọc phải có kỹ thuật cao. Trong quá trình lên men chìm có ưu điểm là trong quá trình hoạt hoá các nấm men lắng xuống đáy bồn làm cho việc lọc bia dễ dàng nhưng do nấm men lắng xuống đáy bồn làm cho bề mặt tiếp xúc bị thu hẹp dẫn đến hoạt hoá của bia không được đều. Hiện nay trong công nghệ sản xuất bia người ta thường dùng phương pháp lên men chìm là chủ yếu. 2.1.4.Đặc điểm hình thái của nấm mem Đặc điểm chung Nấm men thường có dạng hình tròn, hình trứng, như Saccharomyces Cerevisiae, hình elip như Saccharomyces Ellipsoideus, hình quả chanh như Saccharomyces Apiculatus, hình ống dài như Pichia . Nói chung hình dáng của nấm men ở các loài khác nhau là khác nhau. Trong cùng một loài hình dáng tế bào cũng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiện nuôi cấy và tuổi của tế bào. Để quan sát hình thái và đo kích thước của tế bào nấm men người ta thường sử dụng môi trường mạch nha dịch thể hoặc môi trường thạch. Thời gian nuôi cấy là 3 ngày ở nhiệt độ 25 – 300C. Nấm men có kích thước từ 4 - 20µm thậm chí 25µm. Trong đó chiều rộng tế bào thường từ 3 – 5µm và chiều dài từ 5 - 10µm. Kích thước này có thể thay đổi tùy thuộc vào loài giống và điều kiện môi trường sống. Trong môi trường lỏng nhiều loài nấm men có khả năng sinh ra một lớp màng bao bọc như tấm voan mỏng, còn trong môi trường đặc tế bào nấm men có hình dạng khác nhau. Nấm men có màu trắng đục, vàng hoặc hồng nhạt. Bề mặt tế bào thường khô và căng. Đặc điểm hình thái của nấm men bia Nấm men chìm(lager): Hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi. Hình dạng chủ yếu là hình cầu. Hình 2.1 Hình dạng nấm men chìm Nấm men nổi( ale ): tế bào nấm men mẹ và con sau khi nảy chồi thường dính lại với nhau tạo thành chuỗi tế bào nấm men. Hình dạng chủ yếu là hình cầu hoặc ovan với kích thước 7-10 micromet. Hình 2.2 Hinh dạng nấm men nổi Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm xuất phát từ sự quan sát quá trình lên men. Nấm men nổi, lơ lửng lên trên bề mặt dịch trong,trong khi đó nấm men chìm lại có xu hướng lắng xuống đáy của thiết bị khi kết thúc quá trình lên men chính. Dựa vào khả năng kết lắng mà người ta còn chia nấm men chìm ra làm hai loại: nấm men bụi và nấm men kết bông. Nấm men bụi là nấm men có khả năng phân li mịn trong dịch lên men và lắng từ từ khi kết thúc quá trình lên men chính. Nấm men kết bông cố khả năng kết dính vào nhau trong thời gian ngắn khi kết thúc quá trình lên men chính tạo thành một khối bông lớn lên lắng rất nhanh xuống đáy của thiết bị. 2.2. Đặc tính sinh lý của nấm men Các loại nấm men có thể là các vi sinh vật hiếu khí bắt buộc hoặc là các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Hiện nay người ta vẫn chưa thấy có nấm men thuộc loại kỵ khí bắt buộc. Khi thiếu ôxy, các loại nấm men tạo ra năng lượng cho chúng bằng cách chuyển hóa các cacbohyđrat thành điôxít cacbon và êtanol (rượu) hoặc axít lactic. Trong sản xuất rượu, bia thì người ta thu lấy êtanol, còn trong việc sản xuất bánh mỳ thì điôxít cacbon tạo ra độ xốp cho bánh mỳ và phần lớn êtanol bị bay hơi. Ví dụ: đã đơn giản hóa quá trình phân hủy glucoza như sau: C6H12O6 (glucoza) →2C2H5OH + 2CO2 Các thuộc tính sinh l‎ý học có ích của men đã dẫn tới việc sử dụng chúng trong công nghệ sinh học. Quá trình lên men các loại đường bởi men là ứng dụng lâu đời và rộng rãi nhất của công nghệ này. Men bánh mì được sử dụng để sản xuất bánh mì, men bia được dùng để sản xuất bia, và men cũng được sử dụng trong sản xuất rượu vang. Men cũng là một trong số các sinh vật mẫu được sử dụng rộng rãi nhất trong nghiên cứu di truyền học và tế bào sinh học. Sự khác nhau giữa nấm men nổi và nấm men chìm là khả năng lên men các loại đường trisacarit, ví dụ raffinoza. Trong nấm men chìm có enzym có thể sử dụng hoàn toàn đường raffinoza trong khi đó nấm men nổi chỉ sử dụng được 1/3 đường sacaroza. Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi chất khi lên men và khả năng hình thành bào tử. Quá trình trao đổi chất của nấm men chìm chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men, còn của nấm men nổi xảy ra mạnh trong quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấm men nổi thu được nhiều hơn nấm men chìm. Nấm men chìm có nồng độ enzym thấp hơn nấm men nổi. Khả năng tạo bào tử của nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn nấm men nổi. 2.2.1. Trao đổi chất Nấm men là một loại vi sinh vật mang tính thực vật, nó có khả năng phân giải các loại đường để lên men và hô hấp. Trong quá trình hô hấp, nó cần phải có O2 nấm men sẽ chuyển các loại đường lên men được và các chất phụ cơ, aldehyde, cồn,… thành nước và CO2 Trong môi trường yếm khí, quá trình oxy hoá xảy ra không hoàn toàn sinh ra cồn và CO2. Phần lớn các nấm men đều lên men được các loại đường disaccharice và các hexose. Nhưng trong nấm men chìm có enzym có thể sử dụng hoàn toàn đường raffinoza trong khi đó nấm men nổi chỉ sử dụng được 1/3 đường sacaroza. Ngoài ra chúng còn khác nhau về khả năng hô hấp, khả năng trao đổi chất khi lên men và khả năng hình thành bào tử. Quá trình trao đổi chất của nấm men chìm chủ yếu xảy ra trong quá trình lên men, còn của nấm men nổi xảy ra mạnh trong quá trình hô hấp, vì vậy sinh khối nấm men nổi thu được nhiều hơn nấm men chìm. Nấm men chìm có nồng độ enzym thấp hơn nấm men nổi. Khả năng tạo bào tử của nấm men chìm lâu hơn và hạn chế hơn nấm men nổi Đối với chất đạm, nấm men chỉ sử dụng được muối NH3 và polypeptide đơn giản. Những loại đạm phức tạp hơn không thể thấm qua màng tế bào của nấm men được. Thông thường chất đạm không bị hấp phụ hoàn toàn bởi nấm men. Nấm men chỉ sử dụng được nhóm NH3 hoặc amin để tổng hợp chất đạm cho bản thân nó và thải ra chất còn lại. Nấm men có thể sử dụng được ure, nitrate. Đối với việc sử dụng nitrate cần phải thông O2 vô nhiều, nếu không thì nitrate bị khử thành nitrite, là chất độc của nó. Trong quá trình lên men bia bình thường, thì sự hấp thụ đạm nhanh hơn là lên men các loại đường. Khi tổng hợp đạm xong, nấm men thải ra chất đạm khác, càng đến cuối cùng càng thải ra nhiều hơn là hấp phụ. Đối với chất khoáng thì nấm men còn có K – Mg – Ca – Fe – PO4 – Cl. Nấm men sau khi trao đổi chất sẽ làm giảm pH xuống 4 – 4,4, trong khi đó pH bên trong tế bào nấm men thì chỉ đạt 5,9 – 6. Nếu trong môi trường không có chất đệm như bia thì pH môi trường sẽ bị nấm men hạ thấp xuống 3 (hoặc 2). Nấm men nổi thuộc lọai Saccaromyces cerevisiae: lọai này chỉ phát triển và lên men ở nhiệt độ từ 12-130C trở lên Nấm men chìm thuộc lọai Saccaromyces carlsbergensis, phát triển tốt ở ngay nhiệt độ thấp 6-70C. Lọai này đang được sử dụng rộng rãi ở nước ta. 2.2.2.Đặc điểm sinh lý và sinh hoá: Lên men 13 loại đường Đồng hóa 46 nguồn carbon. Có thể dùng bộ kít chẩn đoán nhanh ID 32C (Bio Mérieux SA, Marchy-l’Étoile…) Tính chống chịu với 0,01%  hoặc 0,1% cycloheximide (có thể bao gồm trong bộ kit ID 32C). Đồng hoá 6 nguồn nitơ: nitrate, nitrite, ethylnamine hydrochloride, L-lyzine, cadaverine dihydrochloride, creatine Sinh trưởng khi thiếu hụt một số vitamin (myo-Inositol, calcium pantothenate, biotin, thiamine hydrochloride, pyridoxin hydrochloride, niacin, folic acid, p-aminobenzoic acid. Sinh trưởng tại các nhiệt độ khác nhau: 250C, 300C, 350C, 370C, 420C. Tạo thành tinh bột. Sản sinh acid từ glucoza Thủy phân Urê Phân giải Arbutin Phân giải lipid Năng lực sản sinh sắc tố Sinh trưởng trên môi trường chứa 50 % và 60 % glucoza Hóa lỏng gelatine Phản ứng với Diazonium Blue B Phát triển trên môi trường chứa acid acetic 1 % Để xác định loài mới còn cần phân tích thành phần acid béo của tế bào, thành phần đường trong tế bào, phân tích hệ coenzyme Q, tỷ lệ G+C, đặc tính huyết thanh miễn dịch, giải trình tự ADN và lai ADN... Những chủng đột biến dùng trong sản xuất bia đen hoặc bia hơi ngọt: Từ những chủng thuộc nhóm: S.Carlsbergensis và S.Uvarum có thể gây đột biến để tạo thành những chủng mới có khả năng sử dụng cho các sản phẩm bia đen hoặc bia hơi ngot. Những chủng này thường có khả năng kết dính không lớn, xong khi bia đã kết thúc len men và được làm lạnh tốt thì quá trinh lắng trong xảy ra dễ dàng. 2.3. Cấu tạo của nấm men. Men bia là một loại cơ thể đơn bào, có hình trứng hay hình bầu dục, đường kính khoảng 5-10 µm. Trong tế bào nấm men có chứa các chất như: đạm chiếm 45-70%, chất béo chiếm 2-5%, chất khoáng ( chủ yếu là phosphate ) chiếm 8%, ngoài ra còn có một số loại vitamin như: vitamin B1,B2, một ít vitamin C ,tiền tố D và một số chất phân giải đạm, đường phục vụ cho quá trình lên men, hô hấp, tổng hợp. VD: Enzyme phân giải đạm: proteaza,peptidaza…. Enzyme phân giải đường: α-amylaza →dextrin (C6H10O5)n b-amylaza→maltoza (C6H12O6)n Hình 3.1 Một số hình ảnh của tế bào nấm men Tế bào nấm men được cấu tạo từ màng tế bào, thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nguyên sinh chất và nhân. Hình 3.2: Cấu trúc tế bào nấm men Màng tế bào ( màng nhầy ): là lớp chất dạng keo, có thành phần hóa học chủ yếu là nước ( chiếm 98% ) và polysaccharite. Màng tế bào là một màng bán thấm có chức năng thẩm thấu các hạt phân tử đạm, đường nhỏ thuộc loại dinh dưỡng của tế bào. Nó có chức năng bảo vệ tế bào và là nơi tích lũy chất dinh dưỡng cho tế bào nấm men. Thành tế bào: dày 25nm, có cấu trúc nhiều lớp và có thành phần hóa học chủ yếu là glucan ( D- glucose ), mannan ( D-manoza ) chiếm 90% trọng lượng vỏ, ngoài ra thành tế bào còn có các chất khác như: protein (6-7% ), hexozamin, một ít lipid, lipophotphat, các chất chứa kitin. Thành tế bào có chức năng cố định hình dạng tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, có vai trò trong việc bắt màu thuốc nhuộm khi nhuộm màu gram (ví dụ thuốc nhuộm gram :gluco, xanh metylen, fuchsine…) Màng nguyên sinh chất: nằm sát thành tế bào, dày 7-8nm, dược cấu tạo bởi ba lớp: trong đó có hai lớp phân tử protein ( chiếm 50% trọng lượng khô của màng và 10-20% của tế bào ), và một lớp kép photpholipid ( chiếm 20-30% trọng lượng khô của màng ).Màng nguyên sinh chất có vai trò vận chuyển các chất dinh dưỡng cho tế bào, duy trì áp suất thẩm thấu, làm giá thể cho một số enzyme ( ví dụ permeaza để vận chuyển các chất vào tế bào và enzyme tổng hợp các chất như photpholipid) Nguyên sinh chất :nằm toàn bộ trong tế bào nguyên sinh chất ( trừ nhân ). Đây là vùng dịch thể đồng nhất khi tế bào còn non và có cấu trúc lổn nhổn khi tế báo già. Nguyên sinh chất của tế bào nấm men có các cơ quan con như: Lưới nội chất : là một hệ thống có nhiều màng, nhiều ống phân nhánh phức tạp nằm bao bọc xung quanh nhân. Lưới nội chất có chức năng vận chuyển các vật chất cho tế bào và các cấu tử khác, nó đưa protein nối vào các nhiễm sắc chất và vận chuyển protein đi nuôi cơ thể. Lưới nội chất có hai loại: loại nhám để gắn các hạt ribosome, còn loại trơn thì tham gia vào quá trình sinh tái tổng hợp lipid. Bộ máy golgi : là hệ thống các túi mỏng xếp chồng lên nhau , có tác dụng chứa các sản phẩm bị phân cắt như: protein, lipid và vận chuyển chúng vào tế bào. Bộ máy golgi gần như là cơ quan vận chuyển của tế bào. Ty thể : là những thể hình cầu , hình que, hình sợi và có kích thước 0,2- 0,3 × 0,41 mm. Nó được bao bọc bởi hai lớp màng: màng ngoài nhẵn, màng trong có hình lượn sóng hay hình răng lược bên trong có chứa dịch hữu cơ. Ty thể được coi là trạm năng lượng của tế bào, nó thực hiện oxy hóa toàn bộ các hợp chất hữu cơ thành năng lượng ATP, giải phóng năng lượng ATP, tham gia tổng hợp một số chất như protein, lipid, hydratcacbon là những chất tham gia vào cấu tạo của tế bào. Không bào: là những khối có hình trứng hay hình củ khoai, bên trong có chứa các hạt như: lipid, glucogen ,một số hạt tinh bột … Không bào có chức năng điều hòa áp suất thẩm thấu, tham gia vào quá trình trao đổi chất, dự trữ các chất dinh dưỡng cho tế bào. Các không bào này sẽ to lên khi môi trường lên men bị thiếu chất dinh dưỡng hoặc khi nó bị già bị già cỗi. Lyzosome : là những khối cầu có đường kính 0,2 - 0,4 nm, có khi lên tới 1 – 2nm. Nó được tạo bởi màng lipoprotein. Trong lyzosome có chứa enzyme thủy phân nên nó có vai trò tiêu hóa nội bào. Ribosome : là những hạt nhỏ , đường kính từ 15 – 20 nm, bên trong có chứa 40 - 60 % ARN, 35 - 60 % protein, một ít lipid và một số men như: ribonucleaza… Nhân: nhân có hình tròn hoặc bầu dục, nhân của tế bào nấm men đã có màng nhân. Màng nhân gồm có hai lớp: màng trong và màng ngoài, ở giữa hai màng là lớp phospholipids, và có lớp viền protein ở màng ngoài. Trên màng có nhiều lổ thủng ( ở tế bào nấm men già, trên mỗi tế bào có khoảng 200 lổ, chiếm 6 - 8 % diện tích màng). Trong nhân: có chứa các chất nhân, hạch nhân và các nhiễm sắc thể Nhân có vai trò : mang hệ thống thông tin di truyền chứa trong AND, điều khiển việc tổng hợp protein, enzyme và các hoạt động sống khác của tế bào. Ở nấm men Saccharomyces Cerevisiae có một loại plasmid hay còn được gọi là 2µm plasmid, có vai trò trong thao tác chuyển gen của kỹ thuật di truyền. Loại plasmid này là một AND vòng có chứa 6300 đồi base. 2.4. Sinh sản của nấm men Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men. Khi đó thành tế bào mở ra để tạo ra một chồi (bud). Chồi phát triển thành tế bào con và có thể tách khỏi tế bào mẹ ngay từ khi còn nhỏ hoặc cũng có thể vẫn không tách ra ngay cả khi lớn bằng tế bào mẹ. Nhiều khi nhiều thế hệ vẫn dính vào một tế bào đầu tiên nẩy chồi và tạo thành một cành nhiều nhánh tế bào trong giống như cây xương rồng. Chồi có thể mọc ra theo bất kỳ hướng nào (nẩy chồi đa cực- multilateral budding) hoặc chỉ nẩy chồi ở hai cực (nẩy chồi theo hai cực- Bipolar budding) hoặc chỉ nảy chồi ở một cực nhất định (nẩy chồi theo một cực – monopolar budding). Nấm men chìm: hầu hết các tế bào khi quan sát thì nảy chồi đứng riêng lẻ hoặc cặp đôi, có dạng hình cầu. Nấm men nổi: tế bào mẹ và con sau khi nảy chồi thì dính lại với nhau tạo thành chuỗi các tế bào nấm men, có dạng hình cầu hoặc oval với kích thước 7-10 mm Nấm men còn có hình thức sinh sản phân cắt như vi khuẩn. Có thể hình thành một hay vài vách ngăn để phân cắt tế bào mẹ thành những tế bào phân cắt (fission cells). Điển hình cho kiểu phân cắt này là các nấm men thuộc chi Schizosaccharomyces. Ở một số nấm men thuộc ngành Nấm đảm, có thể sinh ra dạng bào tử có cuống nhỏ (sterigmatoconidia) hoặc bào tử bắn (ballistoconidia hay ballistospore). Bào tử có cuống nhỏ thường gặp ở các chi nấm men Fellomyces, Kockovaella và Sterigmatomyces, khi đó chồi sinh ra trên một nhánh nhỏ và tách ra khi nhánh bị gẫy. Bào tử bắn được sinh ra trên một gai nhọn của tế bào nấm men và bị bắn ra phí đối diện khi thành thục. Nếu cấy các nấm men sinh bào tử bắn thành hình zích zắc trên thạch nghiêng  hoặc trên đĩa Pertri thì sau một thời gian nuôi cấy sẽ thấy xuất hiện trên thành ống nghiệm hoặc nắp đĩa Pertri có một hình zích zắc khác được hình thành bởi các bào tử bắn lên. Bào tử bắn là đặc điểm của nấm men thuộc các chi Bensingtonia, Bullera, Deoszegia, Kockovaella, Sporobolomyces.... Một số nấm men còn có một hình thức sinh sản vô tính nữa, đó là việc hình thành các bào tử đốt (arthroconidia hay arthrospore). Khi đó sẽ hình thành các vách ngăn ở đầu các nấm men dạng sợi, sau đó tách ra thành các bào tử đốt. Loại này gặp ở các nấm men thuộc cả hai ngành: Nấm túi và Nấm đảm.Thường gặp nhất là ở các chi nấm men Galactomyces, Dipodascus (dạng vô tính là Geotrichum) và Trichosporon. Nấm men còn có thể tạo thành dạng tản (thallus) dưới dạng khuẩn ty (sợi nấm- Hyphae) hay  khuẩn ty giả (giả sợi nấm – Pseudohyphae) Dạng sinh sản hữu tính ở nấm men là dạng các bào tử túi (Ascospore) được sinh ra từ các túi (Asci). Có thể xảy ra sự tiếp hợp (conjugation) giữa hai tế bào nấm men tách rời hoặc giữa tế bào mẹ và chồi. Còn có cả sự biến nạp trực tiếp trong 1 tế bào sinh dưỡng (vegetative cell), tế bào này biến thành túi không qua tiếp hợp (unconjugated ascus). Thường trong mỗi túi có 4 hay đôi khi có 8 bào tử túi. Trong một số trường hợp lại chỉ có 1 – 2 bào tử túi. Bào tử túi ở chi Saccharomyces có dạng hình cầu, hình bầu dục; ở chi Hanseniaspora và loài Hansenula anomala  có dạng hình mũ ; ở loài Hansenula saturnus bào tử túi có dạng  quả xoài giữa có vành đai như dạng Sao Thổ. Một số bào tử túi có dạng kéo dài hay hình xoắn…Bề mặt bào tử túi có thể nhẵn nhụi, có thể xù xì hoặc có gai… Bào tử màng dày (hay bào tử áo- chlamydospore) là dạng bào tử giúp nấm men vượt qua được điều kiện khó khăn của ngoại cảnh, chứ không phải là hình thức sinh sản. Một số nấm men còn có thể sinh vỏ nhày. 2.5. Phát triển nấm men Phần III. KỸ THUẬT LÊN MEN 3.1. Sản Xuất Nhân Giống Men Bia 3.1.1. Nguyên Liệu Sản Xuất Dù nấm men được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm hay trong qui mô công nghiệp đều phải được cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng và phát triển.Chất dinh dưỡng chủ yếu cho quá trình phát triển của nấm men là rỉ đường. Có hai loại rỉ đường:rỉ đường mía và rỉ đường củ cải. Rỉ đường mía: là phụ phẩm thu được trong công nghiệp ép mía thành đường sau khi đã thu saccharose. Có thể nói, rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp. Rỉ đường có chứa một lượng đáng kể các hợp chất chứa nitrogen, vitamin và các hợp chất vô cơ thuận lợi cho quá trình nuôi cấy nấm men. Thành phần của rỉ đường: phụ thuộc vào phương pháp sản xuất đường, điều kiện bảo quản đường cũng như phụ thuộc vào giống mía và điều kiện trồng trọt của cây mía. Trong rỉ đường mía có: 15-25% nước, 80-85% chất khô hoà tan. Thành phần của chất khô: Đường: thường được gọi là đường tổng số hay đường lên men đươc (chiếm hơn 50%): trong đó đường saccharose chiếm 30-35%, đường khử chiếm 15-20%( glucose, fructose) Thành phần chất khô còn lại (nhỏ hơn 50%), trong đó 30-32% chất hữu cơ, 18-20% chất vô cơ. Ngoài ra trong rỉ đường mía còn có chứa nhiều loại vitamin, trong đó đáng lưu ý hơn cả là biotin. Rỉ đường củ cải: là nước cốt sinh ra trong quá trình sản xuất đường từ củ cải đường. Thành phần của rỉ đường củ cải: Saccharose: 48% Rafinose: 1% Đường chuyển hoá khác:1% Các axit hữu cơ:2% Rỉ đường củ cải chứa nhiều loại vitamin, trong đó hàm lượng biotin thấp hơn trong rỉ đường mía. Xử lý đường bị thiếu hay bị xấu: Nếu rỉ đường không đủ chất dinh dưỡng cho nấm men( chẳng hạn như nhu cầu nấm men đối với Mg > 0,15% cao hơn nồng độ có trong rỉ đường) thì ta cần bổ sung cho đầy đủ nấm men. Nếu rỉ đường bị xấu, tuỳ thuộc vào yếu tố ảnh hưởng mà có những phương pháp xử lí khác nhau: Rỉ đường chứa vi khuẩn tạo Nitric: cho Chotetraccyline từ 1-5g trên 1m3 dung dịch rỉ đường pha loãng để làm trong đường thời gian 1h. Rỉ đường có SO2: Clo 11g/110g SO2 trong 60 phút. Rỉ đường có acid bay hơi cao: Dung H3PO4 thay vì H2SO4 để làm trong rỉ đường. Rỉ đường có độ màu cao(2 ml dd Iốt 0.1N): pha loãng ít nhất 20 lần. Canxi cao(lớn hơn 1%):pha loãng với nước theo tỉ lệ 1:3, hạ pH đến 4.5 để 4h ly tâm loại kết tủa. 3.1.2. Sản Xuất Nấm Men Bia 3.1.2.1. Qui trình sản xuất: Sacharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn.Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất được sản xuất với qui mô lớn trên thế giới. Nguyên liệu chính dung để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra một số hoá chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ không đủ. Quá trình nuôi dưỡng men Saccharomyces là quá trình hiếu khí, vì vậy người ta phải thổi vào bồn một lượng khí lớn. Trong quá trình nuôi cấy nấm men người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồn lên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men. Nếu lượng mật nạp vào nhiều quá nấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khiến nồng độ cồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu mật nạp vào quá ít thì nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng cho sinh trưởng. Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó. Nếu sản xuất nấm men bánh mì thì năng lực sinh khí trong bột là thông số cần kiểm soát, nếu nấm men dung cho công nghiệp cồn thì khả năng sản xuất cồn, khả năng chịu nồng độ cồn cao là quan trọng. Hiện nay, nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra các chủng nấm men phù hợp với các công dụng của nó và cho năng suất cao (dựa trên 1 kg nguyên liệu chính). Tuy nhiên công nghệ kiểm soát quá trình lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chất lượng và sản lượng cao. Quy trình sản xuất nấm men có thể được tóm tắt như sau: Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm Nuôi cấy men giống trong nhà máy Ly tâm men giống Nuôi cấy men thương mại Ly tâm men thương mại Lọc men Đóng gói sản phẩm men tươi hoặc sấy khô để có sản phẩm men khô. Sản phẩm men tươi có thời hạn sử dụng ngắn, chỉ vài tuần và phải trũ lạnh, sản phẩm men khô có thời hạn sử dụng dài hơn, thường trên một năm nếu được hút chân không và được trữ trong điều kiện thường. Quá trình sản xuất men sẽ tiêu tốn rất nhiều nước và thải ra môi trường một lượng lớn nước thải với hàm lượng COD và BOD cao đòi hỏi các nhà máy phải trang bị hệ thống xử lý nước thải. 3.1.2.2. Giữ giống men bia: Những nồi men bia thuần khiết được tách ra từ một tế bào , nuôi cấy và bảo quản sao cho giữ được những tính chất quí ban đầu của chúng. Trong bảo quản quá trình sống của men giống xảy ra rất chậm và hạn chế sự phát triển của chúng. Giữ được trạng thái tìm sinh này có thể áp dụng nhứng phương pháp bảo quản ở nhiệt độ thấp từ 2-40C, đông khô ở dạng bào tử hoặc kỵ khí.Bảo quản giống thưần khiết ở 5-80C trong bảo hoà CO2 cò thể giữ được những tính chất ban đầu, nâng cao được khả năng lên men và cải thiện được mùi vị của bia. 3.1.2.3. Nuôi cấy nấm men bia Nuôi cấy men bia trong sản xuất cũng theo nguyên tắc tăng dần thể tích và số lượng tế bào để đảm bảo khả năng lên men:giống từ ống nghiệm cấy qua các bình, các thùng rồi chuyển vào thùng lên men chính. Nếu nhà máy có thiết bị Greyner thì việc nhân giống sẽ từ ống nghiệm qua các bình Carlsberg , lên men ở 7-80C trong 5-6 ngày và tiếp tục tăng dần qua 200-300 lit rồi đưa vào thiết bị này cho lên men ở 80C trong 3 ngày, sau đó đưa vào các thùng lên men. 3.1.2.4. Sử dụng lại men sau khi lên men chính Cặn men ở các thùng lên men chính sau khi đã chuyển dịch vào lên men phụ chia làm ba lớp: Lớp dưới cùng là những tế bào già, có lực lên men yếu. Lớp giữa là những tế bào trẻ hơn có khả năng lên men mạnh. Lớp trên cùng là những tế bào có kích thước nhỏ , khả năng kết lắng kém cùng với những vẩn cặn protein và houblon. Chỉ nên dùng lại lớp men giữa sau khi đã xử lý, có nhiều cách xử lý men này trong sản xuất. Đơn giản nhất là cho cặn men qua rây có kích thước nhỏ để loại bỏ những tạp chất lớn, sau đó rửa bằng nước. Cho cặn men vào các thùng hở hoặc kín rồi để men lắng xuống phía duới, bỏ phần nước ở trên, rửa 1-2 lần trong 24h. Nước rửa là nước đun sôi để nguội không có tạp khuẩn, nên tiến hành rửa men trong nhà lạnh với nhiệt độ tốt nhất là 10C.Trước khi đưa vào lên men có thể hoạt hoá giống men đã rữa bằng cáchcho vào dịch đường malt có mật độ đường khoảng 5-7%, để tĩnh ở phòng lên men chính cho đến khi phát triển mạnh thì tiếp vào lên men. Nếu men bị nhiêm tạp thi cần phải được xử lý bắng axit H2SO4 0.4% hoặc H3PO4 0,6%.Cho men vào dung dịch axit để yên một giờ rồi đổ cẩn thận vào bình sạch, bỏ cặn bẩn. Dịch men được trung hoà bằng NaOH cho đến khi pH đạt 4,8-5,2. Men lắng xuống đáy được rửa bằng nước sôi để nguội rồi đem dùng cho lên men. Cũng có thể làm sạch men như sau:dùng dịch chiêt houblon bằng kiêm 2% có chứa 500-700 mg/l izohumulon hoà với cặn men. Trong điều kiện này khoảng 24h hoạt lực men không giảm còn các vi sinh vật tạp nhiễm bị chết. ª Ví Dụ Về Hệ Nhân Giống Nấm Men Thuần Khiết Khép Kín Của GEA Diessel  Hansen nhà là khoa học đầu tiên phát triển công nghệ nhân giống nấm men bia thuần khiết từ năm 1881. Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhân giống nấm men bia ngày càng hoàn thiện và được xây dựng thành một quy trình chuẩn. Hiện nay, có nhiều quy trình nhân giống men khác nhau, phụ thuộc vào từng quy mô sản xuất và điều kiện công nghệ, một trong những quy trình được quan tâm, ứng dụng phát triển là hệ nhân giống nấm men thuần khiết khép kín của GEA Diessel Hình 3.3 Hệ Nhân Giống Nấm Men Thuần Khiết Khép Kín Của GEA Diessel Hệ thống nhân giống nấm men thuần khiết khép kín ở cấp trung gian Trung tâm nhân giống nấm men bia trung gian là một hệ thống khép kín bao gồm: Một tank cấu tạo hai vỏ có thể làm lạnh và gia nhiệt. Bơm tự động, đồng hồ điện tử, hệ sục khí và van kép. Hệ thống ống dẫn nhiệt và làm lạnh. Tổng thể tích của tank chứa là 80hl, nhưng nó chỉ sử dụng 35hl, nhằm mục đích tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thông khí. Ưu điểm chính của thiết bị nhân giống này là cấu tạo đơn giản. Có một tank chứa, một máy bơm, một van kép, nên thiết bị dễ vận hành và chi phí bảo dưỡng thấp. Thiết bị nhân giống được nối với đường ống chuyển dịch đường sau lạnh nhanh. Van kép được cài đặt chương trình tự động đóng mở để kiểm soát quá trình bổ sung dịch đường vào tank nhân giống. Việc thanh trùng được tiến hành trên cơ sở phân tích các chỉ tiêu vi sinh của dịch đường. Hệ thống CIP phải được tách rời ngay lập tức ra khỏi thiết bị nhân giống để loại trừ khả năng nhiễm hoá chất tẩy rửa, đặc biệt là đối với hệ thống CIP được dùng chung cho nhiều thiết bị khác. Chủng giống nấm men thuần khiết được nhân giống trong hệ Carlsberg và quá trình này cũng được tự động hóa và hoàn toàn khép kín, bởi vậy, nguy cơ nhiễm khuẩn được loại trừ tuyệt đối. Dịch đường trong tank chứa sẽ được khuấy đảo tuần hoàn bằng máy bơm, nhằm mục đích tạo sự đồng đều và độ thông khí cần thiết. Sử dụng hệ thống Diessel CS3 để điều khiển nhu cầu nhiệt độ, thời gian và hàm lượng oxy hòa tan trong dịch đường phục vụ cho quá trình nhân giống. Lượng giống nấm men thuần chủng được tiếp vào tank chứa và phối trộn với dịch đường theo tỷ lệ thích hợp. Quy trình nhân giống nấm men khép kín Chủng nấm men bia thuần khiết thuộc loài nấm men chìm được nhân giống trong phòng thí nghiệm và trạm nhân giống như sau: Quy mô phòng thí nghiệm: Chủng nấm men bia thuần khiết phân lập từ ống gốc được nhân giống ở cấp 400 ml. Quá trình nhân giống được tiến hành ở nhiệt độ 200C trong thời gian 48 giờ và lắc liên tục. Kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh của nấm men và tiến hành tiếp giống vào hệ nhân giống Carlsberg chứa 16lít dịch đường. Quá trình sục khí vô trùng với lưu lượng nhỏ được tiến hành liên tục ở nhiệt độ 200C trong 48 giờ. Quy mô trạm nhân giống trung gian Dịch nhân giống từ bình Carlsberg được chuyển vào tank nhân giống theo hệ thống đường ống vô trùng khép kín. Quá trình nhân giống trung gian được tiến hành trong 48 giờ ở điều kiện nhiệt độ 170C cùng với việc sục khí thích hợp bằng hệ bơm tuần hoàn.Trong giai đoạn 16 tiếng cuối cùng của quá trình nhân giống, nhiệt độ được giữ cố định ở 14oC. Kết thúc quá trình nhân giống, mật độ nấm men đạt khoảng 160 - 180 triệu tế bào/1ml. Tỷ lệ tế bào sống đạt 99,8%.Toàn bộ quá trình kéo dài 144 giờ, bao gồm cả giai đoạn nhân giống trên phòng thí nghiệm. Men giống được tái sử dụng, quy trình được rút ngắn thời gian bằng việc bổ sung dịch nước nha mới vô trùng với dịch men sữa, đảm bảo các chỉ tiêu vi sinh và hóa sinh Kết luận: Từ 16 lít dịch men giống thuần khiết trong hệ Carlsberg, thiết bị nhân giống trung gian của GEA Diesel có thể tạo ra 35hl dịch men giống với mật độ tế bào lên đến 170 triệu/1ml trong 48 giờ. Thiết bị chiếm ít không gian, dễ vận hành và bảo dưỡng. 3.2. Yêu cầu chất lượng nấm men bia: Một nòi nấm men được dung để sản xuất nấm men phải đáp ứng những yêu cầu sau: Khả năng và tốc độ lên men trong điều kiện nhiệt độ thấp với dịch đường malt. Có khả năng kết lắng đối với những loài nấm men lên men chìm. Nấm men đưa vào sản xuất có tỷ lệ chết 10% Lượng nấm men phải đạt từ 10-20 triệu tế bào/ml dịch giống Nấm men phải có khả năng chuyển hóa đường đôi, đường đơn, peptid, acid amin và giải phóng CO2 , rượu etylic, nhiệt độ. Nấm men phải thuần chủng Tính ổn định trong sản xuất: Tạo ra hương vị và chất lượng sản phẩm đặc trưng Các chỉ tiêu trong quá trình lên men chính: Các yêu cầu trong giai đoạn lên men chính gồm các chỉ tiêu sau đây: Trước khi lên men: Nước nha phải có độ đường trên 10.5 (đo bằng đường kế) thì bia mới đạt tiêu chuẩn. Độ chua của nước nha không quá 1 (tính bằng số mililit dung dịch NaOH 0.1N tiêu tốn cho 10ml bia) Nấm men phải tuyệt đối khỏe mạnh,thuần khiết. Sau khi lên men: Độ dường trung bình trong 1 ngày do nấm men ăn phải từ 1 – 2 độ. Độ chua của dung dịch không quá 1.4 (tính bằng số mililit dung dịch NaOH tiêu tốn cho 10 ml bia) Áp suất trong các bồn không quá 0,5 kg/m3. Nhiệt độ trong dung dịch phai khống chế từ 12 – 140C không được để nhiệt độ quá cao. Thời gian trong giai đoạn này 6 – 10 ngày. Trong giai đoạn lên men khu vực lên men lúc nào cũng phải sạch sẽ và thông thoáng, để tránh các vi sinh vật có hại ảnh hưởng đến quá trình lên men. Các chỉ tiêu trong quá trình lên men phụ: Độ đường lúc này chỉ còn 2.7 Độ chua cung không quá 1.4 Độ mặn tối đa là 0.63 Nhiệt độ ở giai đoạn nay được không chế từ 0 – 20C Áp suất trong bồn không quá 1.5kg/cm2 Khi ta thả men dưới bồn men phải có dạng đặc xệt muốn như vậy ta phải hạ nhiệt độ xuống để men có thể lắng toàn bộ xuống đáy bồn. Thời gian lên men phụ khoảng vài tuần để men có thể lắng toàn bộ xuống đay bồn và ta có thể lấy toàn bộ số men ra cho bia trong hơn. Đây là giai đoạn ủ chín bia nên ở giai đoạn này thời gian càng kéo dài thì chất lượng bia càng ngon hơn. 3.3. Kỹ thuật lên men: đây là một khâu quan trọng trong quá trình sản xuất bia. Mục đích : Lên men các loại đường có trong dịch lên men dưới tác dụng enzym nấm men. Khi lên men sẽ làm thay đổi thành phần hóa học của dịch lên men tạo thành một loại nước uống gọi là bia, đồng thời hoàn thiện chất lượng cho bia. Trong quá trình lên men bia chia làm hai thời kỳ: lên men chính và lên men phụ. @ Thời kỳ lên men chính: trong thời kỳ này xảy ra sự biến đổi cơ chất mạnh mẽ nhất, gần như toàn bộ đường chuyển thành rượu etylic, manitol, galatiol và amin thành rượu bậc cao. Tiến hành lên men kín trong các thiết bị lên men, nhiệt độ 6-100C, lên men chính còn tạo ra axit hữu cơ, este, CO2, rượu cao ảnh hưởng đến việc hình thành hương thơm của bia. Ví dụ: Tyrozol là một trong những cấy tử quyết định hương thơm của bia. Lên men chính ngoài việc hình thành các thành phần quan trọng của bia, còn tham gia tạo mùi, vị đặc trưng cho bia, từ đây cũng là thời kỳ sản sinh ra chất diaxetyl. Nhiều dẫn liệu cho thấy: sự hình thành diaxetyl chủ yếu ở giai đoạn lên men chính. Cơ chất ban đầu là do sản phẩm trung gian trong quá trình trao đổi chất của nấm men và vi sinh lây nhiễm như Pediococcus, Aerobacter. Hàm lượng diaxetyl đạt cao nhất vào ngày thứ 2 hoặc thứ 3 của quá trình lên men chính, giảm dần trong quá trình lên men phụ (quá trình tàng trữ bia). Hàm lượng diaxetyl phụ thuộc vào hàm lượng axit amin có trong dịch lên men, nếu hàm lượng axit amin cao sẽ cho hàm lượng diaxetyl giảm, tuy nhiên hàm lượng diaxetyl còn phụ thuộc vào nhiệt độ lên men, sự lây nhiễm vi khuẩn, … Diaxetyl trong bia thấp hơn trong rượu nhưng nó gây ảnh hưởg xấu đến mùi vị của bia, đồng thời có tính độc với người tiêu dùng. Các nhà khoa học đã phân tích được hàm lượng diaxetyl và nhận thấy với nồng độ 0,5 ppm đã làm cho bia có hương vị không hài hoà. Hàm lượng diaxetyl trong rượu khoảng 1 ppm nhưng không ảnh hưởng đến sản phẩm rượu. Trong thời kỳ này cũng xảy ra các phản ứng tạo màu và mùi với chất tanin trong hoa huplong là một hỗn hợp phức tạp của các hợp chất phenol thực vật. Dưới tác dụng của các enzim oxy hoá ở các giai đoạn lên men, các hợp chất phenol đều bị oxy hoá và chuyển thành các octoquinon tương ứng. các octoquinon này sẽ thực hiện phản ứng cộng với các axit amin. Sau đó sản phẩm cộng này bị oxy hoá lần nữa tạo các ocquinon tương ứng. Chính các octoquinon này tác dụng với các axit amin còn lại để tiến hành các quá trình diamin hoá, khử CO2 và giải phóng ra các andehyt bay hơi có mùi thơm tạo mùi thơm đặc trưng cho bia. Trong thời kỳ này gồm có sự biến đổi về mặt sinh học, hóa sinh và hóa lý của nấm men. Qúa trình sinh học: đây là giai đoạn sinh trưởng và phát triển của nấm men. Trong nước nha lúc này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cho nấm men phát triển như: hydratcacbon, đạm, các muối khoáng, các vitamin… Sau khi chuyển nấm men giống vào nước nha, qua thời gian ngắn của thời kỳ tiềm phát, nấm men nảy chồi và phát triển rất nhanh. Trong quá trình này ta sục khí O2 vào nấm men hô hấp để tăng sinh khối của tế bào nấm men. Khi hết quá trình phát triển tức lúc này số lượng các dưỡng chất trong dung dịch nước nha đã gần hết, nấm men phát triển chậm lại và bắt đầu lắng xuống đáy bồn lúc này ta bắt đầu chuyển qua thời kỳ lên men phụ. Qúa trình hóa sinh: Qúa trình lên men chính là quá trình chuyển các chất đường và các dextrin có phân tử thấp thành rượu etylic, CO2, và một số sản phẩm phụ khác tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng thành phẩm. Ở quá trình này nấm men hấp thụ đường và dextrin và chuyển hóa thành rượu etylic, khí cacbonic và các sản phẩm phụ (như rượu bậc cao). Sản phẩm của quá trình này là bia non. Trong quá trình sống, nấm men thông qua con đường trao đổi chất và năng lượng trong điều kiện thích hợp để chuyển các glucid có phân tử lượng thấp thành rượu etylic và CO2 theo sơ đồ phản ứng sau: C6H12O6 " C2H5OH + CO2 + H2O + Q (năng lượng). Sự lên men các loại đường khác nhau diễn ra theo một tuần tự nhất định do sự thẩm thấu của các loại đường này vào tế bào nấm men. Saccharoza cũng được chuyển hóa ngay ở giai đoạn đầu của quá trình lên men nhưng phải nhờ enzyme β – fructofuranosidaza (enzyme này có trong nguyên sinh chất của tế bào nấm men) thủy phân thành đường đơn fructoza và glucoza. Khi trong dịch lên men không còn fructoza và glucoza nữa thì lúc này nấm men bắt đầu sử dụng đến maltoza (maltoza là thành phần chính trong dịch nha, có thể chiếm đến 50% tổng lượng hydratcacbon). Dưới tác dụng của enzyme α – glucosidara, maltoza chuyển hoá thành glucoza. Maltoza hầu như được tiêu hao hết trong quá trình lên men chính. Các sản phẩm thứ cấp của quá trình này được tích tụ như glycerin, acetaldehyt, acid pyruvic, acid acetic, acid lactic, diacetyl, 2,3 – butylenglycol và một lượng ít acetoin, acid citric. Song song với quá trình này là quá trình lên men rượu bậc cao từ các acid amin như: tryptophylic, propylic, isoamylic, amylic, izomutylic, tirosol (tirosol được tạo từ tirosin có vị đắng mạnh và là thành phần chính sinh ra mùi thơm của bia). Bên cạnh đó quá trình này cũng hình thành một số hợp chất không có lợi như: C4 (acetone, diacetyl và 2,3 – butylenglycol), diacetyl là hợp chất không có lợi trong bia, gây nên mùi khó chịu. Qúa trình hóa lý: Trong quá trình lên men chính, những biến đổi về mặt sinh học, hóa sinh trong môi trường lên men bia kéo theo những biến đổi về mặt hóa lý, sự biến đổi đầu tiên la sự thay đổi pH. pH của môi trường lúc đầu khi mới cấy men là 5,3 – 6. Nhưng khi kết thúc quá trình lên men chính chỉ còn 4,2 – 4,5. Sở độ pH của môi trường giảm là do trong quá trình lên men hình thành các acid hữu cơ và CO2, mà chủ yếu là acid tatric và acid latic. Vào ngày thứ ba của quá trình lên men độ pH giảm nhanh nhất. Thế oxy hóa khử rH2 giảm còn nhanh hơn so với độ pH. Lúc đầu trước khi cấy men rH2 của môi trường cao hơn 20, nhưng ngay bắt đầu lên men mạnh, rH2 chỉ còn khoảng 10 – 11. Sự thay đổi này là do số lượng các sản phẩm õi hóa giảm đi, số lượng sản phẩm của quá trình khử ngày càng nhiều. Mấn men phát triển kìm hãm các quá trình oxi hóa, chúng hấp thụ oxi hòa tan trong nước nha, tiêu hao oxi cho các phản ứng trao đổi chất. Đồng thời sự tích tụ CO2 trong môi trường cũng làm chậm lại quá trình oxi hóa. Gía trị rH2 càng thấp thì chất lượng bia càng cao, ngược lại rH2 cao thì bia non sẽ sẫm màu, bia thành phẩm có vị lạ và có thể bị đục. Ngoài ra, còn có một số loại hóa lý khác cần chú ý là sự đông tụ các chất protein và sự hình thành bọt. Qúa trình lên men tạo nên cồn, các este và làm pH môi trường giảm tạo điều kiện cho các protein đông tụ và lắng kết với quá trình lắng men. Khí CO2 được tạo lên trong quá trình lên men, lúc đầu hòa tan vào dịch lên men, sau tăng dần, tách ra ở dạng các túi khí và được protein, pectin, nhựa hoa houlon là những chất tạo màng giúp cho các túi khí CO2 dính lại với nhau, hình thành lên bọt. @ Thời kỳ lên men phụ: sản phẩm sau khi lên men chính gọi là bia non. Bia non được bơm vào thiết bị lên men kín để lên men phụ. Lên men phụ quyết định đến vị, độ bọt, độ bền của bia. Các quá trình diễn ra tiếp tục của lên men chính nhưng mức độ chậm chạp hơn. Mục đích chính của lên men phụ còn là để cacboxyl quá bão hoà bằng CO2 để tăng vị và khả năng tạo bọt, ức chế phát triển của vi sinh vật ngoại có hại. Qúa trình lên men phụ còn làm cho bia trở thành sản phẩm hoàn chỉnh hơn, mùi thơm, vị đặc trưng được tăng cường. Ngoài các mục đích trên, lên men phụ còn có tác dụng phân huỷ diaxetyl, làm cho diaxetyl giảm xuống tới mức quy định là £ 2mg/lít. Đó cũng là một chỉ tiêu quan trọng để xác định điểm kết thúc của quá trình lên men phụ. Phản ứng này diễn ra rất chậm, do vậy quá trình lên men phụ thường phải kéo dài. Ngày nay nhiều công trình nghiên cứu rút ngắn thời gian lên men phụ bằng cách các công trình này đã đưa ra loại enzym α - Acetolactic decacboxylaza (ALDC). Khi bổ sung enzym này vào ngay trong giai đoạn lên men chính làm chuyển biến α - Acetolactic thành Acetoin một cách nhanh chóng. Như vậy các nghiên cứu đã thay thế phản ứng chậm bằng phản ứng nhanh nhờ enzym α - Acetolactic decacboxylaza. Từ đó rút ngắn quá trình lên men phụ. Qúa trình sinh học: Do trong dung dịch các chất dinh dưỡng cần thiết cho nấm men phát triển đã bị tiêu thụ gần hết, ngoài ra trong dung dịch lúc này còn rất ít O2 mà đa số toàn là CO2 nên men từ từ ngừng phát triển. Do áp suất, nhiệt độ trong bồn hạ xuống nên men bắt đầu lắng xuống đáy bồn. Nói chung trong giai đoạn này các quá trình sinh học biến đổi chậm cho nên ngừng hẳn. Qúa trình hóa sinh: Tiếp tục lên men phần chất khô còn lại sau khi lên men chính, làm tăng mùi cho bia và bảo hòa CO2. Trong suốt quá trình lên men phụ ở nhiệt độ thấp diacetyl sẽ dần dần giảm đi (diacetyl là sản phẩm phụ của quá trình lên men, gây cho bia có hương vị khó chịu). Trong suốt quá trình nổi bọt, CO2 góp phần đẩy O2 ra làm giảm thế oxy hóa khử: hạn chế các vi sinh vật hiếu khí phát triển, thành hiện tượng oxy hóa làm giảm chất lượng bia. Qúa trình “chín bia” khi mùi vị bã hèm bia biến mất, vị ngọt sẽ biến mất khi đã lên men hết lượng chất khô còn lại. Vị đắng gắt sẽ dần mất hết do sự tác dụng tương hỗ giữa các protein và tanin hình thành nên các phức chất, kết tủa. Vị cay tê sẽ biến mất và nấm men sẽ lắng xuống đáy khi quá trình lên men phụ kết thúc. Qúa trình hóa lý: Trong quá trình lên men phụ, do nhiệt độ hạ xuống, áp suất tăng lên làm cho CO2 hòa tan vào trong dung dịch bia tốt hơn. Khi CO2 hòa tan vào trong dung dịch lập tức tham gia phản ứng tạo acid cacbonic. Phân tử của acid cacbonic sẽ hấp phụ lên bề mặt của các phân tử protein vì chúng tích điện khác dấu, các hạt protein dạng calloit ở môi trường bia tích điện dương, trong lúc một đầu của phân tử acid cacbonic tích điện âm. Acid cacbonic còn có khả năng phân hủy thành HCO3 – và H +. Ion HCO3 – cũng có thể được hấp phụ lên các hạt protein dạng calloit. Nhờ kích thước của từng hạt nhỏ và tổng điện tích bề mặt của các hạt rất lớn, nên các hạt giữ trên mình một lượng lớn các acid cacbonic. Kết quả là trong bia có các chất calloit hòa tan có hoạt tính hoạt động bề mặt, các chất này hấp phụ lên bề mặt các túi khí CO2, tạo nên một màng bảo vệ giúp cho các túi khí này không nhập lại với nhau. Nhờ vậy mà bia có một lớp bọt mịn, đẹp mắt, tạo cảm giác dễ chịu trong bia. Trong quá trình này, những hợp chất không bền là este của acid cacbonic được hình thành, chính những hợp chất này làm cho khí CO2 thoát ra khỏi bia một cách từ từ khi bia bị đột ngột mất áp suất cao trong dụng cụ chứa. các este này chỉ được hình thành khi lên men phụ tiến hành trong thiết bị kín, có áp suất dư (tức là áp suất cao hơn áp suất khí quyển). Acid cacbonic có thể liên kết với glycerin, glycol, hoặc liên kết với acid lactic, acetoin, 2,3-butylenglycol. Trong thời gian ủ chín bia, xảy ra một số quá trình oxy hoa khử một số thành phần của bia như: aldehid, các acid, các loại rượu, các chất màu, acetoin, diacetyl…Các quá trình oxy hoa có ý nghĩa rất quan trọng vì nhờ các quá trình này mà lượng diacetyl có thể giảm đi khoảng 50%, chúng chuyển thành aceton. Do vậy, để đánh giá chất lượng giai đoạn ủ chín bia, ta đánh giá chất lượng diacetyl và mức độ loại bỏ các hợp chất hữu cơ lưu huỳnh có trong bia là một trong những chỉ tiêu cơ bản. 3.4 .Thành phần dinh dưỡng và giá trị dinh dưỡng của bia: 3.4.1.Các thành phần hóa học của bia. Nước chiếm từ 80-89%. Chất hòa tan chiếm từ 5.5-10.7% trong đó: Đường và dextrin : 2.7-5%. Tỉ lệ rượu : 3.5-6% Glyxerin: 0.1-0.3% Chất khoáng :0.14-0.38% Axit hữu cơ: 0.15-0.4% Chất tro: 0.2% Đạm đã phân hủy: 0.3% (như albumo, peptin, axit amin) Vitamin trong bia :4-4.3% Hàm lượng axit amin: 18-30mg/100ml Ngoài ra trong bia còn có các enzim khác nhau. Chất hòa tan trong bia chủ yếu là gluxit tan (trong đó 70% là dextrin) ngoài ra còn có pentoza, sản phẩm caramen hóa. Đạm hòa tan chiếm 8-10% chất tan, trong đó protit trọng lượng phân tử cao chiếm 30-40%, trọng lượng phân tử trung bình chiếm 50-60%, peptit và axit chiếm 20-30%. 3.4.2. Giá trị dinh dưỡng của bia. Bia có độ ngọt nhẹ và có gaz(CO2), hương vị đặc biệt thơm ngon và bổ dưỡng vì ngoài thành phần rượu bia còn có rất nhiều thành phần bổ dưỡng khác như chất đạm( nitơ hòa tan) ,Vitamin B, đường tan, dextrin, chất tạo hương vị đắng chat đặc trưng(hoa Houblon), chất màu… Do vậy khi uống bia với liều lượng thích hợp sẽ rất có lợi cho sức khỏe, kích thích tiêu hóa tốt, ăn ngon miệng, giảm mệt mỏi, tỉnh táo. Thành phần dinh dưỡng của bia được so sánh như sau: Về chất đạm 1lit bia tương đương: 120g bơ, 25g thịt bò và 60g bánh mì. Về chất đường 1 lit bia tương đương 150g bánh mì Về nhiệt lượng 1 lit bia cung cấp khoảng 500-600cal. Năng lượng này do protit và gluxit cung cấp, còn 50% do rượu cung cấp 3.4.3. Giá trị cảm quan và chữa bệnh của bia. Bia là loại nước giải khát lên men có dộ cồn thấp, giàu chất dinh dưỡng được sản xuất từ các nguyên liệu chính như: đại mạch ươm mầm, hoa Houblon, men và nước. Đặc trưng của bia so với các thức uống khác có bọt kéo dài trong thời gian khí CO2 trong bia bốc ra, cho nên bia có tính cảm quan hấp dẫn con người. Hương đặc trưng có vị đắng dịu, lớp bọt trắng mịn xốp là loại nước giải khát có nồng độ nhẹ thích hợp với phụ nữ. Với hàm lượng CO2 khá cao (4-5g/l) giúp giảm nhanh cơn khát và hệ Enzym khá phong phú đặc biệt là Enzym kích thích tiêu hóa Amyaza. Do đó Bia trở thành thức uống phổ biến trên thế giới và ngày càng phát triển mạnh mẽ và sản lượng ngày càng tăng. Ngoài tác dụng giải khát bia con mang đến cho con người 3 chất kích thích tiêu hóa: men, CO2 và rượu Chất men là do lúa mạch mang đến, nó giúp tiêu hóa nhanh thức ăn trong bào tử Khí CO2 kích thích tiêu hóa tốt, thường dung trong Y học vì đặc tính làm tăng cường các men do bào tử và ruột tiết ra. Sau khi CO2 vào cơ thể, cơ thể sẽ thu nhiệt và bay hơi do đó người uống có cảm giác mát dễ chịu kèm theo vị the ở đầu lưỡi. Độ rượu tương đối thấp khoảng 3-6% có khả năng dễ tiêu hóa mà không gây ảnh hưởng đến bộ máy tiêu hóa như các loại rượu và thức uống có nồng độ cao. Bia còn giúp bộ phận bài tiết nước tiểu, thanh lọc tốt những cặn bã, giúp bài tiết các chất độc hại trong cơ thể. Bia cũng chứa nhiều nguyên tố vi lượng là chất khóa chỉ hiện diện rất ít trong cơ thể nhưng lại đóng vai trò tối quan trọng cần thiết trong tất cả các phản ứng hóa học điều hành các cơ quan. Một lit bia cung cấp 40-50g đường các loại cùng với prôtêin và luputin. Chất lượng luputin trong Houblon có đặc tính an thần giúp cho người uống dễ ngủ, giảm stress. Trong khoa trị liệu cách đây vài thế kỉ, các dân tộc Châu Âu có tính dược điều trị như ngâm củ bạch chỉ giác mỏng với bia làm thuốc chống chữa bệnh cảm sốt, nhức đầu, đau răng, cầm máu. Người ta còn dùng rau cần tây tươi hoặc sấy khô xắt nhỏ ngâm với bia làm thuốc uống để lợi tiểu và chữa cao huyết áp. 3.4.4. Tác hại của bia đối với cơ thể Nếu mỗi ngày chúng ta uống lượng vừa đủ thì sẽ rất tốt. Nhưng nếu uống một lượng nhiều (có nồng độ cồn etylic cao) nó có tác hại viêm mạc của bào tử và ruột làm gan không đủ khả năng hóa giải làm hại gan, ảnh hưởng đến hệ tiêu hóa, thần kinh bị kích thích thị giác rối loạn. Bia ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người béo phì, tiểu đường, rối loạn tiêu hóa tim mạch. Cho nên việc uống bia phải sao cho đúng mực nhằm bảo vệ sức khỏe của bản thân và gia đình. K ẾT LUẬN Ngày nay đời sống con người ngày càng cải thiện, khoa học ngày càng phát triển nhằm phục vụ đời sống con người.Công Nghệ Sinh Học cống hiến cho nhân loại rất nhiều thành tựu. Năm 1590, Zacharias Janssen (1580 - 1638) là người Hà Lan đầu tiên phát minh ra kính hiển vi đến năm 1676, Antony Van Leeuwenhoek (1632 - 1723) hoàn thiện kính hiển vi và khám phá ra thế giới vi sinh vật (mà ông gọi là Anmalcules). Nhờ có kính hiển vi mà chúng ta có thể nhìn thấy được rất nhiếu vi sinh vật mà mắt thường không thể nào thấy được. Và Qua những bài giảng về Vi Sinh Vật của cô Đàm Sao Mai. Chúng em đã hiểu rõ về vai trò của vi sinh vật trong thực phẩm cũng như trong đời sống tầm quan trọng của chúng. Đồng thời qua đề tài tiểu luận “ Hệ Vi Sinh Vật Có Lợi Trong Bia”. m à chúng em đã biết điều l àm lên sự thành công của bia, một thức uống phổ biến ngày nay. Trang bi cho chúng em những kiến thức sau này. TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Đình Hòa. Công nghệ sản xuất malt và bia. NXB khoa học và kỹ thuật 2002 Hồ Sưởng. Công Nghệ Sản Xuất Bia. NXB Khoa học Kĩ Thuật Hà Nội 1992 Lê Thanh Mai.Các Phương Pháp Phân Tích Ngành Công Nghệ Lên Men. Khoa học Kĩ Thuật Hà Nội Lương Đức Phẩm. Công nghệ vi sinh vật. NXB nông nghiệp Hà Nội 1998 Trần Thị Thanh. Công Nghệ Vi Sinh. NXBGD 2007