Đề tài Ứng dụng vi sinh vật trong sản xuất thạch dừa

ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THẠCH DỪA Phần 1: Mở đầu Ngày nay trên thế giới những nước trồng dừa và sản xuất các sản phẩm từ dừa nhiều nhất như: Philippin, Indonesia, Malaysia, Ấn Độ, Việt Nam,… vấn đề đang được quan tâm là lượng nước dừa hàng năm thải ra từ các nhà máy cơm dừa nạo sấy là rất lớn và đó là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễn trầm trọng. Do đó, việc tận dụng nước dừa già vào sản xuất là nhu cầu cấp thiết để giải quyết vấn đề môi trường và làm tăng giá trị sử dụng của dừa. Trong số các thành tựu đạt được, thì vấn đề sử dụng nước dừa già để sản xuất thạch dừa là một hướng giải quyết có hiệu quả và có triển vọng. Hình 1: Thạch dừa Thạch dừa ( Nata de coco ) là một loại thức ăn phổ biến được tạo ra từ sự lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum. Đây là một trong số các loại thực phẩm thương mại đầu tiên ứng dụng từ cellulose vi khuẩn. Sản phẩm thạch dừa là một món ăn tráng miệng dai, trong suốt và ăn rất ngon, có bản chất hóa học là polysaccharide nên không có giá trị dinh dưỡng cao nhưng có đặc tính kích thích nhu động ruột làm cho việc điều hòa bài tiết được tốt hơn. Chế phẩm từ dừa này có tác dụng phòng ngừa ung thư và có thể giữ cho da được mịn màng. Phần 2: Nội dung: 1. Giới thiệu về nguyên liệu trái dừa: a. Thành phần của trái dừa: Dừa là cây thuộc họ Palmas, bộ Spadiciflorales. Cây dừa thường ra hoa từ năm 7 – 12 tuổi sau khi trồng. Từ thụ phấn đến khi trái chín là 12 -13 tháng. Khi chín trái dừa nặng 1.2 – 2 kg. Hình 2: Trái dừa Bảng : Thành phần và khối lượng các bộ phận trên trái dừa nặng 1.2 kg Bộ phận Trọng lượng ( kg ) % Khối lượng Vỏ 0.4 33 Gáo 0.18 12 Nước dừa 0.26 25 Cơm dừa 0.36 30 Dầu dừa 0.12 Bã dừa 0.06 Ẩm 0.18 b. Cấu trúc của thạch dừa: - Bản chất của thạch dừa là một màng nhày có cấu trúc là hemicellulose. Do thạch dừa có bản chất là polysaccharide ngoại bào nên có khả năng ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau. Cho đến nay, việc ứng dụng thạch dừa mới chỉ dừng lại ở những nghiên cứu chế biến thành những sản phẩm kẹo, jelly, các sản phẩm giải khát. - Hàm ẩm của thạch dừa: Theo kết quả nghiên cứu khi khảo sát cấu trúc thạch dừa của các thầy cô Phan Tiến Mỹ Quang, Đống Thị Anh Đào, Nguyễn Ánh Tuyết bộ môn công nghệ hoá học và dầu khí trường Đại Học Bách Khoa TPHCM, thì thạch dừa là một mạng polymer sinh học, có khả năng giữ nước rất lớn. Miếng thạch dừa sau khi sấy ở 900C thì mỏng như tờ giấy, bề mặt láng bóng và rất dai chắc. Kết quả xác định hàm ẩm của thạch dừa là 99%, thể hiện rõ bản chất háo nước của thạch dừa ( do chuỗi polymer của mạng thạch dừa chứa các nhóm –OH nên rất dễ dàng tạo liên kết hidro với nước). - Cấu trúc mạng polysaccharide của thạch dừa: Thạch dừa có cấu trúc mạng là các polysaccharide, chúng sắp xếp không theo trật tự, không theo quy luật, chúng đan xen vào nhau rất chằng chịt theo mọi phía. Do trong quá trình lên men, các vi khuẩn Acetobacter xylinum đã chuyển động hỗn loạn không theo quy luật. Đó là nguyên nhân tạo nên tính dai và chắc về mọi phía của miếng thạch. Bên cạnh đó, mạng luôn luôn ngậm một lượng nước đáng kể (99%). Thành phần monosaccharide chính của thạch dừa là socboza nằm ở dạng L-socboza, thường chứa trong vi khuẩn lên men dịch trái cây. Công thức cấu tạo của L-socboza là : CH2OH-CO-HOCH-HCOH-HOCH-CH2OH. 2. Vi sinh vật trong sản xuất thạch dừa: a. Đặc điểm giống vi khuẩn Acetobacter: - Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế. -Vi khuẩn Acetobacter : - Dạng hình que, tuỳ điều kiện nuôi cấy (t0, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra. - Kích thước thay đổi tuỳ loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0μm). - Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chu mao), hoặc không di động (không có tiên mao). - Không sinh nha bào tử. - Hiếu khí bắt buộc. - Chịu được độ acid cao. - Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột. - Tế bào đứng riêng lẽ hoặc kết thành từng chuỗi. - Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tuỳ loại: o Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc. o Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc. o Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo. o Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã. o Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành váng không chắc chắn. - Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ và phân giải pepton. Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, P, S …ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ. Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha, nước trái cây…là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn Actobacter.. - Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vit B1, vit B2, oxy hoá sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vit C)… Hình 3: Vi khuẩn Acetobacter xylinum : b. Phân loại vi khuẩn Acetobacter: - Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn trông giống Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter của J-Frateur-1950. Sau đây là một số loài quan trọng nhất: - Acetobacter schutzenbachii: Trực khuẩn khá dài, tạo thành váng dày, và không bền vững, có khả năng tích lũy trong môi trường đến 11.5% acid acetic do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp nhanh (phương pháp của Đức). - Acetobacter suboxydans: Tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hoá glucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose. Loại vi khuẩn này muốn phát triển bình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para aminopenzoic, acid panthoteric, acid nicotinic. - Acetobacter orleansen: Trực khuẩn dài trung bình không di động. Gặp điều kiện nhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra. Tạo ra váng rất dày trên môi trường dịch thể. Có thể phát triển được có nồng độ rượu cao (10%-12%) và làm tích luỹ đến 9.5% acid acetic. Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vang thành giấm (phương pháp của Pháp). Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-30oC. - Acetobacter xylinum: Trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày.Váng có chứa hemicellulose nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm Iod sẽ bắt màu xanh.Có thể tích luỹ 4.5% acid acetic trong môi trường. Thường gặp loài vi khuẩn này cùng với nấm men trong “nấm chè”, còn gọi là “thuỷ hoài sâm”, một loại sản phẩm giải khát bổ dưỡng theo cách làm của người Trung Hoa. Đó là một loại nước chua có vị thơm dùng để pha nuớc giải khát trong các gia đình người Trung Hoa, trên mặt nước có một váng vi sinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè và đường. - Acetobacter aceti: Trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng chuỗi dài. Váng cùa vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm Iod, chúng có thể phát triển trong môi trường có nồng độ rượu khá cao 11% và có thể tích luỹ đến 6% acid acetic trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 34oC. - Acetobacter pasteurianum: Hình dạng tương tự như loại trên nhưng váng vi khuẩn có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc Iod. c. Phân lập vi khuẩn Acetobacter: Vi khuẩn Acetobacter có thể được phân lập từ giấm, rượu, bia, hoa quả, chuối chín, váng giấm...Ví dụ: muốn phân lập vi khuẩn Acetobacter từ không khí, người ta pha rượu thành dung dịch 5-6% (hoặc theo kinh nghiệm dân gian, chỉ cần lấy một phần rượu hòa với 7 phần nước lã, đựng trong cốc miệng rộng, giữ ở tủ ấm 30OC trong 2-3 ngày. Rượu sẽ đục và trên bề mặt xuất hiện một váng mỏng. Lấy váng mỏng này pha loãng ra, và phân lập trên môi trường thạch dĩa. Để ức chế sự phát triển của các loại nấm men Mycoderma (thường phát triển đồng thời với sự phát triển của vi khuẩn Acetobacter), người ta bổ sung vào môi trường phân lập 1-1.5% acid acetic. Do những ưu điểm vượt trội của chủng Acetobacter xylinum đã được nêu ở trên nên Acetobacter xylinum đựoc ứng dụng trong sản xuất thạch dừa. d. Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum: * Đặc điểm: Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn từ Philippin. Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn acetic. Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae. - A.xylinum là loại vi khuẩn dài khoảng 2μm, đứng riêng lẽ hoặc xếp thành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicellulose khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm Iod và H2SO4. - A.xylinum sinh trưởng ở pH < 5. to = 28-32oC và có thể tích lũy 4.5% acid acetic. Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn, nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạt động của vi khuẩn. * Sinh lý, sinh hóa: Acetobacter .xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào. Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme. Enzyme này có thể polyme hoá glucose thành cellulose. Acetobacter .xylinum tạo nên lớp cellulose dày là do môi trường nuôi cấy nước dừa có bổ sung các chất dinh dưỡng cần thiết. Cellulose là những polisaccharide không tan trong nước mà tan trong môi trường kiềm. Đó cũng là thành phần chính của màng tế bào thực vật. Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môi trường lỏng. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide. Lượng các oligo và các polysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào.Tất cả các oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide. Đơn vị monosaccharide được thêm vào tham gia phản ứng ở dạng nucleotide, monosaccharide được hoạt hoá thường là dẫn xuất của các uridin diphosphat (UDP-X) nhưng đôi khi cũng với các nucleotide, purin và các pirimidin khác. Sự tổng hợp diễn ra theo các phản ứng sau: …X-X-X-X- + UDP-X = …X-X-X-X-X + UDP n nhánh (n+1) nhánh Cơ chế quá trình sinh tổng hợp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharide phân nhánh hiện chưa rõ. Người ta cho rằng thứ tự các gốc đường và tính đặc trưng tham gia của chúng vào chuỗi polysaccharide phụ thuộc vào các enzyme transferase. Acetobacter xylinum sống thích hợp ở nhiệt độ 28-32oC. Ở nhiệt độ này quá trình hình thành các sản phẩm trong đó có thạch dừa là tốt nhất. 2.Quy trình sản xuất thạch dừa. Mô hình quy trinh sản xuất thạch dừa b. Giải thích quy trình: Bước 1: Chuẩn bị môi trường - Nước dừa già được thu nhận ở các nhà máy sản xuất cơm dừa nạo sấy. Thành phần gồm: đường, protein, dầu béo, khoáng ,vitamin…hoà tan và một số tạp chất khác. - Dùng vải lọc để loại bỏ tạp chất.Vải lọc được cố định trên rổ lọc. Dịch nước dừa sau khi lọc được thu vào thùng chứa. Cặn trên vải lọc được tách ra ngoài. - Bổ sung dinh dưỡng: SA,(NH4)2HPO4, đường glucose là nguồn cung cấp Nitơ, khoáng… tao môi trường tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp sản phẩm. Môi trường sau khi bổ sung dinh dưỡng được thanh trùng bằng cách đun sôi khoảng 10- 15’ để tiêu diệt các vi sinh vật có trong môi trường. Sau đó làm nguội. - Dùng acid acetic 40% chỉnh về pH = 3 - 3,5, chỉnh nhiệt độ đến 28-31°C (pH, nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men). Bước 2: Lên men. Đổ môi trường vào các dụng cụ, cấy giống theo tỷ lệ 1:10. Đậy thau, chậu bằng vải mỏng hoặc giấy báo. Giữ nhiệt độ phòng ở 28-31oC trong vòng 48 giờ.Trong thời gian này tránh khuấy động môi trường để tránh ảnh hưởng đến lớp thạch đang hình thành. Bước 3: Thu nhận và hoàn thiện sản phẩm. - Dùng vợt đề vớt khối cellulose ra khỏi dịch lên men. Sau đó rửa khối cellulose bằng nước lạnh. - Dùng máy cắt để cắt khối cellulose tạo các miếng nhỏ, đều đặn. - Ngâm sản phẩm trong dung dịch Na2CO3 3-5% trong 10’ để trung hoà acid acetic còn sót bên trong thạch. Sau đó xả lại bằng nước lạnh. - Đun sôi để làm trong sản phẩm và tao độ dai bằng cách bổ sung chất tạo dai. - Ngâm đường tạo đ ộ ngọt và tăng độ trong cho sản phẩm. - Bổ sung màu, mùi để hoàn thiện giá trị cảm quan. * Cơ chế tạo thành sản phẩm: - Ổ điều kiện tối ưu, 1lit nước dừa (chứa khoảng 110g saccharose) sẽ tạo thành khoảng 483g thạch dừa thô, chưa qua xử lý với độ ẩm khoảng 96-98%. - Quá trình hình thành cellulose được nhà bác học Muhlethaler sử dụng kính hiển vi điện tử để nghiên cứu và cho rằng: Đầu tiên các tế bào vi khuẩn sẽ tiết ra chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, tiếp đó là sự hình thành các sợi cellulose được polime hoá từ các đơn phân glucose ở vị trí α-1,6 dưới tác dụng của enzym có trong bao nhầy. Các sợi này ngày càng dày lên và được kết nối với nhau tạo thành lớp cellulose bên trong bao nhầy.Lớp cellulose này sau đó được thoát ra khỏi tế bào hoàn toàn. - Dung dịch môi trường ban đầu có dạng huyền phù mịn, chuyển sang dạng rời rạc, sau đó kết lại thành khối lớn hơn dạng gel chứa các tế bào vi khuẩn trong đó. Bộ khung của gel là mạng lướI cellulose với thành phần chủ yếu là nước. Nó được hình thành ở mức tối đa chỉ 30 phút sau khi có sự tiếp xúc giữa vi khuẩn Acetobacterium xylium với glucose và oxy. * Môi trường sản xuất : - Chuẩn bị giống: Giống Acetobacter xylinum được nuôi trong môi trường thạch nghiêng, thành phần gồm: SA 8g DAP 2g Saccharose 20g Agar Nước dừa 1000ml Các ống nghiệm chứa môi trường thanh trùng ở 121 0 C trong 20 phút. Cấy giống , để trong tủ ấm 3- 4 ngày. Tiến hành nhân giống, có thể qua 1 cấp hoăc hai cấp hoặc nhiều hơn tuỳ theo qui mô sản xuất. Thành phần môi trường nhân giống như trên nhưng không có Agar gọi là môi trường dịch thể. Môi trường được khử trùng ở 100 0C trong 30 phút . Để nguội đến 300C, cấy giống theo tỉ lệ 10%. Lắc hay sục khí trong thời gian 18- 20 giờ. Sau đó giống được đưa vào sản xuất. - Môi trường và hóa chất sử dụng: * Hoá chất. Acid acetic. Agar Cao thịt Glucose Saccharose Sulphate amon Pepton Phosphate amon * Môi trường: trong quá trình sản xuất thạch dừa, nhà sản xuất thường sừ dụng 3 môi trường: môi trường sản xuất, môi trường giữ giống và môi trường nhân giống. - Môi trường sản xuất: thường là môi trường lỏng, gổm có môi trường nước dừa già, môi trường nước cốt dừa, môi trường hỗn hợp và môi trường cao thịt. • Môi trường nước dừa già: Nước dừa già:10 lit. (NH4)2SO4: 20g. (NH4)2HPO4: 20g. Saccharose : 700g pH: 3-3.5(chỉnh bằng acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút). • Môi trường nước cốt dừa: Dừa nạo : 250g vắt thành 10 lit nước cốt. (NH4)2SO4: 20g (NH4)2HPO4: 20g Saccharose : 700g pH: 3-3.5(chỉnh bằng acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút). • Môi trường hỗn hợp: Nuớc dừa già: 10 lit Nước cốt dừa: 0.4 lit (NH4)2HPO4: 20g. Saccharose : 700g pH: 3-3.5(chỉnh bằng acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút). • Môi trường cao thịt- pepton Cao thịt: 10g Pepton: 10g Glucose: 70g. Nước: 1 lit. pH: 3-3.5(chỉnh bằng acid acetic 40%), môi trường được thanh trùng bằng cách đun sôi nhẹ trong thời gian 15-20 phút). - Môi trường giữ giống: thường là môi trường thạch pepton- cao thịt. Môi trường cao thịt được bổ sung 2% agar, nấu cho tan hòan toàn, sau đó phân phối vào các ống nghiệm, thanh trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút rồi chỉnh pH 3-3.5 bằng acid acetic nồng độ 40% lúc môi trường chưa kịp đặc, sau đó để nguội cho môi trường đặt lại. Môi trường đặc này dùng để phân lập và giữ giống. - Môi trường nhân giống: thường là môi trường nước dừa già có bổ sung muối dinh dưỡng. 3. Một số biến động trong quá trình lên men: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men : Một trong những điều kiện quan trọng để có được sự hoạt động sống của VSV là độ acid của môi trường. Acetobacter xylinum là một loài chịu acid nên môi trường được điều chỉnh về pH 3.5-4 bằng acid acetic nồng độ 40%. Nhận thấy trong 4 ngày đầu pH tăng dần từ 3.78 đến 3.91. Sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị 3 * Các quá trình đồng hóa và dị hóa của vi sinh vật có liên quan đến việc tạo thành các acid hữu cơ như là sản phẩm trung gian và những sản phẩm cuối cùng của sự trao đổi chất. Nếu nguồn C không được vi khuẩn sử dụng hết thì có thể có sự tích lũy acid hữu cơ tương tứng trong dịch nuôi cấy. Sự tích lũy và tỷ lệ acid hữu cơ phụ thuộc vào từng chủng trong mỗi loài vi khuẩn , vào thành phần của môi trường ,vào sự thông khí và các nhân tố khác. Đối với Acetobacter xylinum việc lên men đi liền với hình thành các acid dicacboxylic không bay hơi (acid malic.fumaric,sucxinic), các ketoacid (acid oxaloacetic, pyruvic) như là các sản phẩm trung gian và các acid mono carboxylic bay hơi (acid propionic, acetic, đôi khi cả acid formic) như là các sản phẩm cuối cùng. 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men : - Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 . Tỉ lệ thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đối với sự sinh trưởng và phát triển của A. xylinum. Nhân tố (NH4)2SO4 là một trong những nhân tố ảnh hưởng lớn đến sự phát trinể của A. xylinum. (NH4)2SO4 là nhân tố quan trọng cung cấp nguồn nitơ cho tế bào phát triển. Để xác định được ảnh hưởng của (NH4)2SO4 tới quá trình tạo màng nhày, Đặng Thị Kim Dung - Trường ĐH Sư Phạm HN2 đã tiến hành như sau: Trước tiên cấy hai chủng vi khuẩn A.xylinum.sp T7 và A.xylinum A24 trên môi trường cơ bản và thay đổi nồng độ của (NH4)2SO4 ở 8 nồng độ khác nhau: 0.25 ; 0.2; 0.15; 0.1; 0.08; 0.05; 0.03; 0.01 (%). Môi trường nuôi cấy tĩnh sau 20 ngày đem xác định độ dày của màng nhày ở các giá trị nồng độ (NH4)2SO4 khác nhau. Kết quả kiểm tra cho thấy độ dày màng tăng từ ngày thứ 5 trở đi và đạt giá trị cực đại ở ngày thứ 20. Ở giá trị nồng độ (NH4)2SO4 là 0.08% thì hàm lượng hemicellulose tạo ra là cao nhất. Kết quả này được giải thích như sau: Mỗi loài vi sinh vật có một ngưỡng hấp thụ thích hợp các chất dinh dưỡng khác nhau là khác nhau. (NH4)2SO4 là nguồn cung cấp nito cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn A. xylinum. Nồng độ (NH4)2SO4 là 0.25; 0.2; 0.15; 0.1 % có thể là cao quá đối với yêu cầu của Acertobacter xylinum do đó không hấp thụ hết lượng sulphate amone, lượng còn lại trong môi trường sẽ ức chế sự phát triển của tế bào vi khuẩn. Vì vậy, lượng hemicellulose tạo ra thấp hơn so với môi trường có nồng độ (NH4)2SO4 là 0.08%. Còn nồng độ sulphate amone là 0.05; 0.03; 0.01% có thể là thấp hơn so với yêu cầu cho sự phát triển của vi khuẩn nên lượng hemicellulose tạo thành thấp hơn cả. Mặt khác, nitơ còn có mặt trong nhiều thành phần cấu tạo như acid nucleic, phospholipid, một số coenzyme quan trọng như ATP, ADP, NADP, FAD và một số vitamin tham gia vào quá trình tạo thành hemicellulose. Nếu hàm lượng các chất đó quá cao hay quá thấp sẽ ảnh hưởng đến tính chất lý hoá của môi trường, vì vậy ảnh hưởng tới quá trình tạo thành hemicellulose của vi khuản acertobacter xylinum, vì thế độ dày màng giảm so với mức 0.08%. - Ảnh hưởng của (NH4)2PO4(NH4)2PO4 vừa là nguồn cung cấp nitơ, vừa là nguồn cung cấp phospho cho quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Acetobacter xylinum. Sự ảnh hưởng của (NH4)2PO4 tương tự như ảnh hưởng của (NH4)2SO4 - Ảnh hưởng của các loại đường Trạng thái thạch dừa tạo thành chịu ảnh hưởng nhiều của đường. Acetobacter xylinum có thể sử dụng glucose , sucrose , lactose , maltose , dextrin và galactose do đó ứng với mỗi lọai đường khác nhau mà ta sử dụng sẽ cho ra thạch dừa có trạng thái khác nhau. 5. Kiểm tra và đánh giá chất lượng sản phẩm. a. Kiểm tra sản phẩm thô: * Phần cái : - Trong điều kiện tối ưu pH = 5.0 , T = 28-31oC , 1 lít nước được bổ sung 100g đường , 5g (NH4)2HPO4 , 8 ml acid acetic băng thu được 483g thạch dừa thô. - Độ ẩm thạch dừa thu được vào khoảng 96-98.6%. - Trạng thái thạch dừa tạo thành chịu ảnh hưởng nhiều của đường. Acetobacter xylinum có thể sử dụng glucose , sucrose , lactose , maltose , dextrin và galactose do đó ứng với mỗi lọai đường khác nhau mà ta sử dụng sẽ cho ra thạch dừa có trạng thái khác nhau. Bảng 5 : Ảnh hưởng của các loại đường khác nhau đến sự hình thành thạch dừa trong nước dừa ở pH = 5.0 Đường Độ dày – Trạng thái Khối lượng thạch dừa sau 15 ngày lên men (g) Glucose Sucrose Lactose Maltose Dextrin Galactose Không bổ sung đường Dày – chắc Dày – chắc Màng mỏng – mềm Màng mỏng – mềm Màng mỏng – mềm Màng mỏng – mềm Màng mỏng – mềm 198.50 193.79 84.50 86.35 81.20 50.45 50.00 - Dựa vào bảng nghiên cứu trên ta thấy khi sử dụng glucose cho quá trình lên men sẽ cho khối lượng thạch dừa cao nhất và trạng thái thạch dừa thu được cũng rất tốt.Tuy nhiên khi người ta làm thí nghiệm sử dụng sucrose ở các nồng độ khác nhau cho quá trình lên men thì người ta thấy rằng sucrose ở nồng độ 10% sẽ cho khối lượng thạch dừa cao nhất.Trong thực tế sản xuất người ta thường sử dụng sucrose do giá thành rẻ và cho năng suất khá cao. Bảng 6 : Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến trạng thái cấu trúc của thạch dừa. Nồng độ sucrose (%) Độ dày – Trạng thái Khối lượng thạch dừa sau 15 ngày lên men (g) 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 Trung bình – chắc Trung bình – chắc Trung bình – chắc Trung bình – chắc Dày – chắc Trung bình – chắc Trung bình – chắc 112.08 146.45 165.76 187.54 198.58 188.78 185.65 Bảng 7 : Kết quả khảo sát Nồng độ sucrose (%) TRẠNG THÁI THẠCH DỪA Hiệu suất (%) Khối lượng (g) Độ dày (cm) 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 432 467 490 513 546 589 627 653 698 721 735 697 625 548 486 0.4 0.5 0.55 0.6 0.7 1.1 1.5 1.8 2.1 2.4 2.7 2.1 1.6 1.1 0.6 43.2 46.7 49 51.3 54.6 58.9 62.7 68.3 69.8 72.1 73.5 69.7 62.5 54.8 48.6 Kết quả trên thu được khi thí nghiệm trên môi trường nước dừa già có bổ sung các chất dinh dưỡng như (NH4)2SO4 0.8%, (NH4)2HPO4 0.2% , tỷ lệ cấy giống 10%,thời gian lên men là 12 ngày. - Nguồn N sử dụng cho quá trình lên men có thể là (NH4)2HPO4 hoặc (NH4)2SO4.Do đó khối lượng thạch dừa tạo thành cũng phụ thuộc vào hàm lượng (NH4)2HPO4 và (NH4)2SO4 sử dụng. Bảng 8 : Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2HPO4 đến sự hình thành thạch dừa Nồng độ NH4H2PO4 (%) Khối lượng trung bình của thạch dừa thô từ 400 ml canh trường sau 15 ngày (g) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 110.0 128.70 135.50 148.65 168.20 - Ngoài các yếu tố trên nhiệt độ lên men cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự hình thành sản phẩm. Bảng 9 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hình thành thạch dừa trong nước dừa ở pH = 5.0 . Nhiệt độ (oC) Trạng thái thạch dừa Khối lượng trung bình sau 15 ngày lên men (g) 15 20 25 28-31 35 40 Không phát triền Màng mỏng – mềm Trung bình – chắc Dày – chắc Đặc sệt , no nata Đặc sệt , no nata 0.00 87.50 128.82 195.02 0.00 0.00 Như vậy yêu cầu đối với thạch dừa sau lên men là phải đạt được : - Cấu trúc : độ dày (1.5-3 cm), dai , chắc. - Màu sắc : trắng ngà. * Phần nuớc : - Độ pH ảnh hưởng nhiều đến năng suất cũng như sự hình thành sản phẩm. Bảng 10 : Ảnh hưởng của pH đến sự hình thành thạch dừa : pH Độ dày – Trạng thái Khối lượng thạch dừa sau 15 ngày lên men (g) 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 No nata formation No nata formation Màng mỏng – mềm Trung bình – mềm Dày – chắc Dày – chắc Dày – chắc Dày – chắc Trung bình – chắc Màng mỏng – mềm No nata formation No nata formation _ _ 92.60 148.52 188.32 193.89 184.20 173.70 163.85 86.90 _ _ - Sự thay đổi pH trong quá trình lên men : một trong những điều kiện quan trọng để có được sự hoạt động sống của VSV là độ acid của môi trường.Acetobacter xylinum là một lòai chịu acid nên môi trường được điều chỉnh về pH 3.5-4 bằng acid acetic nồng độ 40%.Nhận thấy trong 4 ngày đầu pH tăng dần từ 3.78 đến 3.91.Sau đó giảm dần đến ngày thứ 10 thì đạt giá trị 3.35. - Các quá trình đồng hóa và dị hóa của vi sinh vật có liên quan đến việc tạo thành các acid hữu cơ như là sản phẩm trung gian và những sản phẩm cuối cùng của sự trao đổi chất.Nếu nguồn C không được vi khuẩn sử dụng hết thì có thể có sự tích lũy acid hữu cơ tương tứng trong dịch nuôi cấy.Sự tích lũy và tỷ lệ acid hữu cơ phụ thuộc vào từng chủng trong mỗi loài vi khuẩn , vào thành phần của môi trường ,vào sự thông khí và các nhân tố khác.Đối với Acetobacter xylinum việc lên men đi liền với hình thành các acid dicacboxylic không bay hơi (acid malic.fumaric,sucxinic), các keto acid ( acid oxaloacetic , pyruvic) như là các sản phẩm trung gian và các acid monocarboxylic bay hơi ( acid propionic,acetic,đôi khi cả acid formic)như là các sản phẩm cuối cùng. - Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men : Nồng độ chất khô thích hợp cho quá trình hình thành thạch dừa là 11.5-12oBx.Nếu nồng độ chất khô cao quá ,VSV có thể không sử dụng hết gây lãng phí đồng thời có thể gây ức chế họat động VSV.Nếu nồng độ chất khô quá thấp sẽ không đủ để cung cấp cho quá trình sống của VSV. b. Kiểm tra sản phẩm chế biến : * Phần cái : - Thạch dừa được ngâm trong nước đường có bổ sung mùi của các loại trái cây như vải , nhãn , dâu , ... - Kích thước thạch dừa nên đạt : 1 x 2 x 2.5 (cm) - Màu sắc : trắng sữa. - Cấu trúc : dai,chắc. - Mùi vị : mang mùi trái cây tùy thuộc vào từng loại sản phẩm. * Phần nước: - Tỷ lệ cái : nước là 50 : 50. - Nước đường có vai trò tạo vị ngọt và là môi trường bảo quản thạch dừa. - Hàm lượng đường vào khoảng 30-45%. - pH đạt khoảng 4.5 - 5.5. - Nước phải trong và mang mùi đặc trưng riêng của từng sản phẩm. 6. Kết luận: Cây dừa vừa là cây công nghiệp có dầu, vừa là cây ăn quả, được trồng lâu đời và gắn bó với đời sống hàng ngày của người dân. Trong chúng ta, chắc không ai lạ gì được thưởng thức nước trái dừa non. Khi đi đường nắng gắt, ghé vào một quán giải khát, nếu có yêu cầu họ sẽ làm cho bạn một ly nước dừa. Dùng con dao thật sắc, vạt một mảnh ở đầu vỏ dừa, đổ nước dừa vào ly. Xong, bổ đôi quả dừa, dùng muổng nạo một lớp cơm dừa còn non cho vào ly. Thêm một tí muối bột. Nhiều người chỉ muốn dùng nước dừa nguyên chất, không cần đường hay đá lạnh để cảm nhận hết cái ngọt ngào tự nhiên của nước quả dừa non. Nói theo các nhà dinh dưỡng, ly nước dừa có đầy đủ các chất bổ dưỡng và nhiều vitamin cần thiết. Điều quan trọng là sự tinh khiết, vệ sinh an toàn thực phẩm. Nước dừa là chất giải khát và giải nhiệt hiệu quả nhất!Nước dừa già có thể chế biến thành thạch dừa, một món ăn rất phổ biến. Hiện nay công nghệ sản xuất với qui mô lớn, cung cấp thạch dừa cho thị trường trong và ngoài nước. Quy trình làm thạch dừa là dùng nước dừa già, sau khi đun sôi, để nguội, bổ sung một số hóa chất gồm axit axêtic, amôn sunfat, điamôn photphat, đường. Điều chỉnh dung dịch cho lên men từ có sự hiện diện của vi khuẩn Acetobacter xylinum sẽ thu được thạch dừa.Cơm dừa tươi nạo rồi vắt lấy nước cốt mà ta thường gọi là nước sữa dừa được các bà mẹ, bà chị nội trợ dùng trong nấu canh, nấu chè, nấu cari, cả các loại bánh, chủ yếu là tăng độ béo của thực phẩm. Khi khô, họ xay và ép để lấy dầu dừa. Dầu dừa là một nguyên liệu chính để sản xuất xà phòng qua phản ứng xà phòng hóa với xút. Cũng từ dầu dừa, sau khi tinh lọc, hydro hóa để sản xuất margarin dùng làm thực phẩm. Sọ dừa cứng được nung trong tháp kín, sẽ cho sản phẩm là than hoạt tính dùng làm chất hấp phụ trong công nghiệp hóa học. Cuối cùng là vỏ dừa được dùng sản xuất các sản phẩm mỹ nghệ như thảm xơ dừa, dây dừa… phục vụ cho tiêu dùng và xuất khẩu. Cây dừa là một loại cây có dầu nói chung, hiện nay cũng cần được Nhà nước đầu tư để cải tạo giống, đưa giống mới có năng suất cao để thay thế giống cây già cỗi, xây dựng thành công nghiệp chế biến các sản phẩm từ dừa: tinh dầu dừa, cơm dừa nạo sấy, than hoạt tính, chỉ xơ dừa… tạo công ăn việc làm cho một bộ phận dân cư để có mức thu nhập ổn định. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1.Nguyễn Đức Lượng – “ Cơ Sở Vi Sinh Vật Công Nghiệp “- Tập 3 – NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 2. Nguyễn Văn Uyển – “ Công Nghệ Sinh Học Và Một Số Ứng Dụng Tại Việt Nam “– Tập 1 – NXB Nông Nghiệp , 1994 3. Trần Phú Hòa – LVTN “ Nghiên Cứu Về Thạch Dừa “Đại Học Bách Khoa TP.HCM , 1992. 4. Kiều Hữu Ảnh – “ Vi Sinh Vật Công Nghiệp “- NXB Khoa Học Và Kỹ Thuật. 5. Webside: http:// tamleftcseminar.googlepages.com/Thachdua.doc http:// vietsciences.free.fr và http:// vietsciences.net Nguyễn Lân Dũng http:// www google.com.vn.