Đề tài Ứng dụng của sắc kí hấp phụ hiệu năng cao

11/26/10 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC DÂN LẬP VĂN LANGKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌCLỚP K13S02 ĐỀ TÀI: Ứng dụng của sắc kí hấp phụ hiệu năng cao GVHD: Ths. Cao Ngọc Minh Trang SVTH: Nhóm 2 11/26/10 I. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11/26/10 1. ĐỊNH NGHĨA HPLC là phương pháp sắc kí được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký cột (column chromatography). Thay vì để dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400 atm để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn 11/26/10 2. PHÂN LOẠI SẮC KÍ HPLC Sắc kí phân bố hiệu năng cao Sắc kí hấp phụ hiệu năng cao Sắc kí trao đổi ion hiệu năng cao Sắc kí lỏng hiệu năng cao trên gel Sắc kí ái lực hiệu năng cao Săc kí các đồng phân quang học 11/26/10 II. HỆ THỐNG MÁY SẮC KÍ HPLC 11/26/10 Degasse Pump Tiêm mẫu Column Detector Hệ thống máy sắc ký HPLC 11/26/10 1. BÌNH ĐỰNG DUNG MÔI Hiện nay thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm vào cao áp. Cho phép chúng ta sử dụng 4 bình chứa dung môi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và tổng tỉ lệ dung môi của 4 đường là 100% Tuy nhiên trong thực tế ta ít sử dụng 4 đường dung môi cùng một lúc. Mà chỉ sử dung tối đa 3 hoặc 2 đường dung môi để pha động luon được pha trộn đồng nhất hơn 11/26/10 Bình chứa dung môi được làm bằng chất liệu trơ, thường bằng thủy tinh Luôn có nắp bảo vệ để bụi không rơi vào Nắp có lỗ hở để bình luôn thông với khí trời Trong bình có ống dẫn dung môi từ bình vào ống sắc kí, ở đầu này có gắn một nút lọc bằng kim loại với mục đích lọc dung môi và cũng để giữ ống luôn ở dưới mặt thoáng của chất lỏng 11/26/10 2. BỘ KHỬ KHÍ Mục đích của bộ khử khí nhằm loại bỏ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động Nếu trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót bọt nhỏ thì: - Tỉ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak không đúng - Trong trường hợp có quá nhiều bọt khí thì có thể bơm sẽ không hút được dung môi khi đó áp suất không lên và máy sắc kí sẽ ngừng hoạt động. 11/26/10 3. PUMP CAO ÁP Mục đích : Bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc kí. Pump phải tạo được áp suất cao khoảng250-500 at và bơm phải tạo dòng liên tục từ 0,1-9,999ml/phút Tốc độ bơm là thông số đã được cài dặt trước. Hiện nay có 2 pump piston để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục 11/26/10 4. BỘ PHẬN BƠM MẪU Máy HPLC có hệ thống bơm mẫu đặt biệt: ống chứa mẫu, là van có hai cổng, giúp định hướng dòng chảy của pha động chỉ có thể đi trên một trong hai con đường khác nhau. Mẫu khảo sát được chính vào máy theo 2 cách: tiêm bằng tay hoặc tiêm tự động 11/26/10 5. CỘT SẮC KÍ Cột pha tĩnh thông thường được làm bàng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10-30cm, đường kính trong 1-10mm, hạt chất nhồi khoảng Φ= 5-10µm Với chất nhồi cột Φ= 1,8-5µm có thể dùng cột ngắn (3-10cm) và nhỏ (đường kính trong 1-4,6mm) loại cột này có hiệu năng tách cao 11/26/10 6. ĐẦU DÒ Là bộ phận phát hiện ra các chất khi chúng rời khỏi cột và cho các tín hiệu ra khỏi sắc kí đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp và thỏa mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích. 11/26/10 A=K.C A là tín hiệu dò được C nồng độ chất phân tích K là hằng số thực nghiệm của đầu dò Một số loại đầu dò: đầu dò huỳnh quang, đầu dò hấp thụ tia tử ngoại, đầu dò ampe kế… 11/26/10 7. BỘ PHẬN GHI TÍN HIỆU Các loại máy cũ thì sử dụng hệ thống ghi đơn giản có thể vẽ sắc kí đồ, thời gian lưu, diện tích của peak… Thế hệ máy mới dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể kưu lại các thông số theo yêu cấu của người sử dụng In kết quả ra giấy: sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ 11/26/10 II. SẮC KÍ HẤP PHỤ HIỆU NĂNG CAO 11/26/10 1. ĐỊNH NGHĨA Quá trình sắc kí dựa trên sự hấp phụ mạnh yếu khác nhau của pha tĩnh đối với các chất tan và sự rửa giải của một pha động để kéo chất tan ra khỏi cột. Sự tách một hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của một chất hấp thụ. Pha động là chất lỏng hoặc khí tùy theo hợp chất cần sắc ký mà chúng ta sử dụng dung môi thích hợp. Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn, nhuyễn mịn, có tình trơ được nhồi trong 1 cái ống. Những hạt trơ này cũng giống như những hạt rắn trong sắc ký phân chia, nhưng không có phủ chất lỏng ở bên ngoài, bản thân hạt rắn là pha tĩnh. 11/26/10 CƠ CHẾ Trong sắc ký hấp phụ, các chất của hỗn hợp sẽhấp phụ hoặc dính lên bề mặt của chất rắn ph tĩnh. Các hợp chất khác nhau sẽ có những mức độ hấp phụ khác nhau lên pha tĩnh, hệ quả là trong quá trình pha động di chuyển, chúng sẽ tách xa nhau ra. 11/26/10 Sự hấp phụ xảy ra là do sự tương tác lẫn nhau giữa các phân tử phân cực. Do sự tương tác giữa những phân tử có mang các nhóm phân cực đối với pha tĩnh rắn là chất rất phân cực. Do nối hydrogen, nối Vanderwaal….. 11/26/10 11/26/10 2. PHÂN LOẠI Sắc kí hấp thụ pha thuận (NP-HPLC): pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực Sắc kí hấp thụ pha đảo (RP-HPLC): pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực 11/26/10 IV. ỨNG DỤNG SẮC KÍ HẤP PHỤ HIỆU NĂNG CAO ĐỂ PHÁT HIỆN MELAMINE TRONG SỮA 11/26/10 1. MELAMINE Melamin là một bazơ hữu cơ ít tan trong nước có công thức hóa học là C3H6N6, danh pháp theo IUPAC là 1,3,5-triazine-2,4,6-triamine. 11/26/10 Đây là một loại hoá chất hữu cơ, thường ở dạng tinh thể màu trắng, rất giàu nitrogen. Nitrogen được dùng như tiêu chuẩn để xác định lượng đạm có trong thực phẩm.  11/26/10 Melamin khi phản ứng với formaldehit tạo thành keo melamin. Melamin cũng được sử dụng trong ngành công nghiệp phân bón. Khi trộn lẫn với một số nhựa, chúng tạo thành hỗn hợp có khả năng chống cháy do khi cháy chúng giải phóng ra một lượng khí nitơ. 11/26/10 Gần dây melamine được tìm thấy trong sữa. Người ta cho thêm melamine vào để làm cho nồng độ đạm (nitrogen) của sữa đạt tới tiêu chuẩn. Xét nghiệm không phân biệt được đâu là đạm tự nhiên trong sữa và đâu là nitrogen của melamine. 11/26/10 Ảnh hưởng của melamine đến sức khỏe? Tình trạng của trẻ em Trung Quốc dùng sữa nhiếu melamine đã cho thấy tác động của hóa chất này lên con người gần giống với kết quả thử nghiệm trên súc vật.  Đặc biệt, sự kết hợp của melamine với cyanuric a-xit (cũng có trong sữa bột) sẽ tạo thành muối tinh thể đóng trong các ống thận nhỏ gây bít tắc, sỏi thận, ảnh hưởng đến sự tạo tạo nước tiểu và gây suy thận, tử vong. Một số nghiên cứu trên súc vật cho thấy melamine có khả năng gây ung thư. 11/26/10 Nghiên cứu còn cho thấy melamine có khả năng hủy hoại hệ thống miễn dịch của con người. Melamine thường gây ngộ độc mãn tính do khó tan trong nước và cần thời gian dài để thải trừ. Tổn thương hệ sinh sản, sỏi bàng quang, sỏi thận và ung thư bàng quan là những hậu quả của việc sử dụng melamine trong thời gian dài. 11/26/10 2. Cách tiến hành phân tích melamine trong sữa bằng SKHPHNC HPLC là phương pháp xét nghiệm melamine trong thực phẩm được sử dụng phổ biến trên thế giới từ khá lâu. Nồng độ có thể phát hiện : theo các báo cáo phương pháp này có thể phát hiện melamine với nồng độ khoảng vài chục ppb. 11/26/10 Một máy phân tích melamine dùng kỹ thuật HPLC sẽ gồm các khối : đưa mẫu vào, cột hấp phụ, máy dò, máy tính phân tích. 11/26/10 Quá trình tiến hành 11/26/10 - Lấy mẫu đại diện theo Tiêu chuẩn, xử lý mẫu thích hợp- Thêm TCA 1%, lắc siêu âm 10 phút (pH=1-2)- Ly tâm - Làm sạch qua SPE Chuẩn bị mẫu 11/26/10  Điều kiện HPLC- Pha động Buffer: acetonitrile = 85:15 Buffer: 10mM citric acid, 10mM sodium octane, pH = 3.0 - Tốc độ chảy: 0,25mL/min. - Nhiệt độ cột 40 độC- Thể tích bơm mẫu 20 µl   Điều kiện chạy máy 11/26/10 Trong quá trình này chúng ta cần lưu ý một số điểm sau Đưa mẫu vào: bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao. Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố : + Áp suất đầu vào + Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt) + Thành phần dung môi + Nhiệt độ cột. 11/26/10 Máy dò (Detector) Có nhiều phương pháp để nhận biết các thành phần trong hỗn hợp sau khi đi qua cột. Phương pháp hay được sử dụng là phương pháp hấp thụ tia cực tím (tia UV). Các hợp chất hữu cơ thường hấp thụ tia UV, mỗi chất hấp thụ mạnh nhất đối với một bước sóng nhất định. Chiếu tia UV xuyên qua dòng hỗn hợp ở đầu ra, ở phía đối diện đặt một máy dò ta có thể đo được mức độ hấp thụ tia UV. Từ đó có thể tính toán nồng độ các chất. Nên nhớ dung môi cũng hấp thụ tia UV, vì vậy nên lựa chọn các bước sóng sao cho thích hợp. TIÊU CHUẨN MELANIN TRONG SỮA Giới hạn chất melamine trong sữa bột cho trẻ em là 1mg/kg, các loại thực phẩm khác và thức ăn cho gia súc là 2,5mg/kg. Theo Ủy ban tiêu chuẩn thực phẩm - ủy ban chung của WHO và FAO   11/26/10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ – Nguyễn Kim Phi Phụng_nhà xuất bản ĐHQG TP.HCM Các website www.vnexpress.net www.hoahocngaynay.com www.dantri.com.vn 11/26/10