Đề tài Ứng dụng công nghệ sinh học thực vật trong nhân giống nho

ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG CNSH TV TRONG NHÂN GIỐNG NHO GIỚI THIỆU CÂY NHO. Đặc Điểm. Nho là một từ để chỉ loại quả thuộc về họ Vitaceae mọc trên các cây dạng dây leo thân gỗ hoặc để chỉ chính các loài cây này. Quả nho mọc thành chùm từ 6 đến 300 quả, chúng có màu đen, lam, vàng, lục, đỏ-tía hay trắng. Khi chín, quả nho có thể ăn tươi hoặc được sấy khô để làm nho khô, cũng như được dùng để sản xuất các loại rượu vang, thạch nho, nước quả, dầu hạt nho Giá Trị Kinh Tế. Theo tài liệu của FAO ,75.866 km² trên thế giới được dùng để trồng nho. Khoảng 71% sản lượng nho được dùng sản xuất rượu vang, 27% để ăn dưới dạng quả tươi và 2% làm nho khô. Thành phần dinh dưỡng trong 100g nho  Protid: 0.6g Lipid: 0.6g Nước: 81g Sợi thực phẩm: 0.7g Phân Bố. Cánh Đồng Trồng Nho Phân loại: Hiện nay có nhiều giống nho được nhân giống thành công và cho năng xuất cao đẵ được trồng ở Việt Nam như: Giống Cardinal (nho đỏ) là giống quan trọng của Việt Nam và các nước quanh vùng như Philippines, Thái Lan v.v... có nhiều ưu điểm : mã đẹp, dễ vận chuyển, sinh trưởng nhanh, chất lượng khá. Giống nho ăn tươi NH01-93: Giống có khối lượng quả to hơn hẳn so với hai giống Cardinal và NH01-48, có mùi hương đặc trưng, quả có màu tím đen, hình ô van rất phù hợp thị hiếu người tiêu dùng. Giống nho ăn tươi NH01-96: Giống có khả năng sinh trưởng và khả năng kháng một số đối tượng sâu bệnh hại chính tương đương so với Cardinal. Khối lượng quả to, năng suất bình quân khá cao, có mùi hương đặc trưng, quả có màu xang vàng. Giống nho NH01-48 là giống nho ăn tươi, khi chín quả có màu xanh, hạt ít (từ 1 đến 2 hạt/quả), độ đường cao, năng suất cao và ổn định. Giống nho làm nguyên liệu chế biến rượu NH02-90 có khả năng sinh trưởng mạnh, chống chịu tốt đối với sâu bệnh hại, năng suất cao. Các chỉ tiêu chất lượng phù hợp cho sản xuất rượu vang theo tiêu chuẩn chất lượng của cơ sở sản xuất vang nho. Nông Dân Trồnh Nho Ở Ninh Thuận Phân bố. Ở nước ta cây nho được xác định là cây chủ lực nên tập trung phát triển ở những khu vực không bị ngập úng, có điều kiện khí hậu và thời tiết đất đai khá phù hợp cho cây nho phát triển như các xã Phước Hậu, Phước Sơn, Phước Nam, Phước Thuận và Phước Dân và một phần khu tưới Tân Giang, Bầu Zôn và Lanh Ra (huyện Ninh Phước), Thành Hải và Ðô Vinh (thị xã Phan Rang - Tháp Chàm). PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG. CHIẾT CÀNH. Chọn cành to đường kính khoảng 12 mm, bóc đi một khoanh vỏ dài 2 - 3 cm, cạo cho hết tầng sinh gỗ rồi bó lại như thường lệ. Nho ra rễ nhanh, chỉ cần một tháng là có thể cắt, đem giâm vào bầu hoặc trồng thẳng. GIÂM CÀNH. Chọn cành ở những gốc nho trẻ, khỏe, không hay ít bệnh. Lấy cành nho ở chân cành to bằng bút chì hoặc hơn. Cành cắt cành dài khoảng 20 cm, có 3, 4 mắt. Đánh dấu đầu dưới và đầu trên cành để cho khỏi lẫn, ví dụ bằng các vết cắt khác nhau. Buộc cành thành từng bó nhỏ, chiều dài gần bằng nhau, có chân cành phải cùng về một phía. Dùng giấy ni lông buộc mùn cưa ẩm cho bọc quanh chân cành rồi đặt vào một chỗ mát, có bóng râm nhẹ một hay hai tuần lễ khi mô sẹo sẽ hình thành, mắt bắt đầu nở thì đem cắm vào bịch. Đất bịch gồm 1 phần cát, một phần phân mùn và 1 phần đất mặt tưới giữ ẩm, phun thuốc trừ sâu bệnh nếu cần. Khoảng sau một tháng có thể trồng vào vị trí cố định. GHÉP CÀNH. Ghép mắt hoặc hình khiên hoặc hình cửa sổ đều dễ. Ghép cành trên gốc ghép đã chẻ đôi dọc theo tâm gốc cũng dễ sống. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam chưa có yêu cầu ghép, vả lại cũng chưa ai biết trong điều kiện nhiệt đới Việt Nam, giống nho nào dùng làm gốc ghép thì tốt. PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI. KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG IN VITRO. (Mô hình nhân giống nho Bidaneh Sefid của đ ại học Tehran năm 2005. cho khả nămg sản xuất ra 8000 cây nho sạch virus sau 4 tháng) Tạo nho sạch virus bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Mẫu vật là đỉnh sinh truởng có độ dài từ 5-10 mm được lấy từ cây sạch virus, đựơc khử trùng bằng ethanol 70% trong 30 giây. Sau đó đỉnh sinh trưởng đựơc khử trùng trong môi truờng muối 0.1 % có chứa 0.1% Tween 20 trong 3 phút. Sau khi khử trùng bề mặt, đỉnh sinh truởng đuợc rửa nhẹ bằng nuớc cất vô trùng 3 lần lầnlượt trong 5,10,15 phút. Đỉnh được cắt và tách rời thành những mảnh nhỏ trên dĩa petri đã đuợc vô trùng, sau đó thêm vào 10 ml môi truờng MS có bổ sung 2 mg/l BA và 30g/l sucrose . Dùng parafilm dán kín đĩa petri lại, để vào phòng nuôi cấy giữ ở nhiêt độ 280C và chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang trong suốt 16h, sau đó hạ nhiệt độ xuống 240C và giữ trong bóng tối suốt 8h. Sau 4 tuần nuôi cấy trong môi truờng lỏng đạt kích thuớc trung bình 10-15 mm. Kỹ thuật nhân giống. Tạo chồi. Hình 2: Sau 6 tuần có thể thấy đuợc từ mỗi cụm chồi có 18-24 chồi. Hình 1: Mẫu sau khi đuợc chuyển sang môi truờng MS lỏng sau 3 tuần nuôi cấy. Mẫu sau đó đuợc chuyển sang môi truờng MS có bổ sung 2mg/l BA và 6.5 g/l sucrose đat đến kích thước 20-25 mm sau 3 tuần. Sau 6 tuần có thể thấy đuợc từ mỗi cụm chồi có 18-24 chồi. Cây con lúc này được tách riêng rẽ từ cụm chồi và đuợc nuôi cấy trong môi trường tương tự. Vươn thân và nhân giống. Môi trường cho vươn thân tương tự như môi trường nhân giống nhưng không bổ sung cytokinin. Nên sử dụng môi trường lỏng có bổ sung than hoạt tính 0.5-1%, 30g/l đường sucrose. Tạo rễ và thuần hóa. Quá trình tạo rễ và quá trình thuần hóa thường đi đôi với nhau. Sự tạo rễ chịu ảnh hưởng từ việc sử dụng và cách xử lý auxin, chất lượng chồi, tuổi sinh lý, giống cây và nhiệt độ môi trường. Hình 3 & Hình 4: Mẫu sau khi được nuôi cấy ở MT không chứa hormon trong 3 tuần và 6 tuần Chồi ngọn cho phép sinh truởng từ những chồi riêng rẽ sau 6 tuần. Chồi tốt nhất dài khoảng 1.5 cm được chọn để nuôi cấy thẳng đứng vào ống đã khử trùng và không chứa hormon sinh truởng. Trong 12 ngày rễ sẽ phát triển và sau 3 tuần tạo thành cây nho sạch virus. Những cây này tiếp tục được nuôi trong nhà kính và được chuyển sang giai đoạn thuần hoá. Trong giai đoạn thuần hóa, cây con cần được duy trì tình trạng tự dưỡng, giảm ẩm độ từ 90% xuống còn 30-50%, lá dày lên và rễ phát triển. sau đó được chuyển vô chậu và đưa ra vuờn uơm. Hình 5: Nho sạch virus sau 3 tuần nuôi cấy trong môi trường MS không chứa hormon. Vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ không khí mát, độ ẩm cao…. Cây con thường được cấy trong các luống ươm có cơ chế dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm. trong những ngày đầu cần phải được phủ nilon để giảm quá trình thoát hơi nước ở lá. Trong thời gian này rễ mới sẽ xuất hiện, cây con sẽ được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên lá để rút ngắn thời gian ra rễ. Nhân giống in vivo. Cây con sau khi chuyển sang luống ươm hay cấy trực tiếp vào bầu đất khỏang thời gian sau ra rễ, sau đó được phun dinh dưỡng hỗn hợp N-P-K. Cây con được sử dụng như là cây mẹ và được tiếp tục nhân giống trên luống ươm. Hình 6: Cây nho non sau 20 tuần nuôi cấy. Cây con bầu đất. Cây con từ ống nghiệm hay trên luống ươm sau khi phát triển khỏe, được cấy vào bầu đất. Bầu đất có cơ cấu xốp, đầy đủ chất dinh dưỡng, ngoài ra hàng tuần phun thêm dinh dưỡng khoáng. Cây được đặt ở nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ không khí thoát, để cây phát triển nhanh và khỏe mạnh. Trồng cây ra ruộng. Cây con sau khi đạt được kích thước về chiều cao, số lá, đường kính thân thích hợp. Sẽ được chuyển ra trồng trên đồng ruộng. Chọn lọc cây đầu dòng. Những cây được chọn đầu dòng sẽ đưa vào nhân giống, trở lại bằng nuôi cấy mô. Tạo ra cây có năng suất cao và ổn định. HƯỚNG ÁP DỤNG. Tạo Nho Kháng Virus. Virus có thể gây tổn thất cho toàn bộ vụ mùa của người trồng nho. Virus thường gặp là virus gây kết lá dạng quạt trên nho (Grapevine fanleaf virus-GFLV). Virus GFLV xâm nhiễm nho và gây ra bệnh kết lá hình quạt, làm cho lá bị vàng và biến dạng, trái nho nhỏ hơn và vì vậy làm giảm năng xuất. Lá nho nhiễm GFLV Nếu chúng xâm nhiễm vào các cây nho, ngay cả các loại thuốc trừ sâu cũng thường không có hiệu quả. Hơn nữa, những hoá chất này thường có hại đối với môi trường. Do vậy xu hướng hiện nay là phát triển các cây nho có khả năng tạo ra kháng thể chống lại virus vì vậy chúng không bị virus xâm nhiễm. Tác động của GFLV len lá và quả nho \\ Các nhà nghiên cứu tại Viện sinh học phân tử Fraunhofer và Trung tâm sinh thái học ứng dụng IME ở Aachen đang tạo ra một số cây kháng virus GFLV bằng kỹ thuật di truyền nhằm tạo ra các cây đã được biến đổi để sản xuất ra kháng thể. Các kháng thể này ‘nhận biết’ virus và ngăn sự lây lan và gây hại của chúng trong cây. Những cây nho kháng virus (Ảnh: Fraunhofer-Gesellschaft) Xử Lý GA3 Tạo Nho Không Hạt. Xử lí GA3 trước khi hoa nở và sau khi đậu quả. CƠ CHẾ Do phấn hoa và noãn dị thường. Ngăn chặn quá trình thụ phấn thụ tinh. KT XỬ LÝ Xử lí GA3 thời kì hoa và sau khi đậu quả. Sử dụng GA3 xử lí sau khi hoa nở.  Cơ chế của GA3 đối với việc tạo nho không hạt. Do phấn hoa và noãn dị thường. GA3 có thể tạo ra quả không hạt. Sử dụng GA3 ở một thời gian nhất định trước khi nở hoa thì sẽ tạo nên sự phát dục dị thường của hạt phấn và noãn và tạo ra được quả không hạt như mong muốn. Sử dụng GA3 xử lí trước khi hoa nở, dẫn đến quả không hạt có 3 tác dụng chủ yếu sau: Thay đổi kiểu phát hoa, sự nở hoa. Sử dụng GA3 giúp cho việc giúp hoa sớm nở, sự phát dục của hạt phấn và noãn với sự nở hoa không cùng nhau, khi hoa nở thì đã không đuổi kịp thời kì phát dục (sự phát dục đã trưởng thành). GA3 làm thay đổi quá trình phân phối dinh dưỡng của chùm hoa. Ngăn chặn quá trình thụ phấn thụ tinh Bất luận là noãn có phát dục bình thường hay không,chỉ cần không để quá trình thụ phấn thụ tinh xảy ra, thì kết quả sẽ cho ta là quả không hạt. Những giống nho có hoa cái, đồng thời được ứng dụng các chất điều tiết để triệt tiêu hoa đực (khử đực), những giống hoa lưỡng tính bất dục; đồng thời trước khi hoa nở ta tiến hành cách li với các giống nho khác để tránh hiện tượng truyền phấn thụ tinh, sau đó dùng GA3 và các chất điều tiết sinh trưởng khác xử lý, sẽ đạt được 100% là quả không hạt. Kĩ thuật xử lí quả không hạt: Có 3 phương pháp xử lý. Xử lí GA3 trước khi hoa nở và sau khi đậu quả. Theo nghiên cứu thì xử lí lần đầu tốt nhất là xử lí trước khi hoa nở 14 ngày với nồng độ 100ppm. Xử lí quá sớm sẽ làm cho chùm hoa ở trạng thái kéo dài quá mức, xử lí quá muộn sẽ dẫn đến quả có hạt với số lượng càng nhiều hơn. Có thể chia làm 2 đợt xử lý. Xử lý lần 1: Khi cụm hoa (kiểu phát hoa) có nụ hoa phát triển cách cuống khoảng 2 cm thì xử lí là tốt nhất. Tác dụng là tạo ra quả không hạt. Xử lý lần 2: Sau khi hoa nở khoảng 10 ngày là lý tưởng nhất, nồng độ GA3 là 100mg/l. Nếu diện tích xử lí lớn có thể xử lí sau khi hoa nở 7-10 ngày và phải xử lí xong, muộn nhất không quá 20 ngày. Xử lí GA3 thời kì hoa và sau khi đậu quả. Phương pháp căn bản là trước khi hoa nở 2-3 ngày ta sử dụng 10-25mg/l GA3 xử lí 1 lần. Đối với những giống sinh trưởng mạnh dùng kĩ thuật xử lí này cũng đậu quả rất tốt nhưng hiệu quả đạt quả không hạt không cao, bởi vậy, trên thực tế ứng dụng ta có thể linh hoạt áp dụng xử lí trước khi hoa nở 2-5 ngày có thể nâng cao tỷ lệ đậu quả không hạt; xử lí lần thứ 2 muộn hơn một chút (sau khi hoa nở 10-12 ngày) nồng độ cũng dùng 10-25mg/l. Sử dụng GA3 xử lí sau khi hoa nở. Những giống có nhiễm sắc thể không hoàn chỉnh, khi tràng hoa đã rụng, bầu nhuỵ xuất hiện sau 3-5 ngày, ta dùng 50-100mg/l GA3 xử lí 1 lần thì có thể đạt được nho không hạt.