Đề tài Tổng quan về vi sinh vật nói chung

LỜI CẢM ƠN Em có được kiến thức và sự trưởng thành như ngày hôm nay là nhờ công lao rất lớn của các thầy cô Khoa Công nghệ Hoá học, nhất là các thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Tp. HCM. Do vậy, lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến quý thầy cô – những người đã hết lòng dìu dắt em trên con đường học vấn. Đặc biệt, em xin tỏ sự ghi ơn sâu sắc đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, cô đã tận tình hướng dẫn, quan tâm chỉ dạy để em hoàn thành luận văn này. Con xin cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii MỤC LỤC BẢNG v MỤC LỤC HÌNH vi MỤC LỤC BẢNG Bảng 1.1. Niên biểu về một số cống hiến của L.Pastuer về vi sinh vật học 2 Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu nành 36 Bảng 3.2. Thành phần hóa học trong các thành phần của hạt đậu nành 37 Bảng 3.3. Thành phần các acid amin trong protein đậu nành 38 Bảng 3.4. Thành phần carbohydrat trong đậu nành 39 Bảng 3.5. Thành phần vitamin trong đậu nành 39 Bảng 6.1. Thành phần hoá học của chao 65 Bảng 6.2. Thành phần hoá học của tương 83 Bảng 6.3. Thành phần hóa học một số loại tương ở các tỉnh phía Bắc 83 Bảng 6.4. Thành phần hoá học của Miso 84 Bảng 6.5. Thành phẩn hóa học của Kome Ama Miso 88 Bảng 6.6. Thành phẩn hóa học của Kome Kara Miso 89 Bảng 6.7. Thành phẩn hóa học của Hishiho Miso 90 Bảng 6.8. Thành phẩn hóa học của Mugi Miso 92 MỤC LỤC HÌNH Hình 1.1. Hệ thống phân loại 5 giới sinh vật 4 Hình 1.2. Hệ thống phân loại 6 giới sinh vật 4 Hình 1.3. Hệ thống phân loại 8 giới sinh vật 5 Hình 1.4. Hệ thống 3 lĩnh giới (domain) 6 Hình 1.5. Một số loại virus 8 Hình 1.6. Thước ghi kích thước của các dạng 9 Hình1.7. Các vết tích về sự xuất hiện của vi sinh vật 11 Hình 2.1. Sơ đồ phosphryl hóa – oxy hóa 24 Hình 2.2. Sơ đồ Embden – Meyerhof – Parnas 26 Hình 2.3. Sơ đồ nguyên tắc làm việc của chu trình Krebs 27 Hình 4.1. Khuẩn lạc Aspergillus oryzae 45 Hình 4.2. Apergillus oryzae 45 Hình 4.3. Actinomucor elegans 48 Hình 5.1. Sơ đồ làm mốc thông thường 54 Hình 5.2. Sơ đồ làm mốc kiểu Cự Đà 57 Hình 5.3. Sơ đồ chuẩn bị giống cái lên men sử dụng trong quá trình chế biến đậu ở Hàn Quốc và Nhật Bản 60 Hình 5.4. Qui trình sản xuất giống vi sinh vật 63 Hình 6.1. Quy trình sản xuất chao nước 70 Hình 6.2. Actinormucor elegans phát triển trên bánh đậu 75 Hình 6.3. Quy trình sản xuất nước chấm 76 Hình 6.4. Sơ đồ quy trình sản xuất tương bắc. 70 Hình 6.5. Sơ đồ quy trình sản xuất mốc trung gian 82 Hình 6.6. Rice Miso 88 Hình 6.7. Kome Ama 88 Hình 6.8. Quy trình sản xuất Kome ama Miso 89 Hình 6.9. quy trình sản xuất Kome kara Miso 90 Hình 6.10. quy trình sản xuất Hishiho Miso 91 Hình6.11. Mugi Miso 93 Hình 6.12. quy trình sản xuất Mugi Miso 93 Hình 7.1. Độc tố Aflatoxin B1 96 Hình 7.2. Aspergillus flavus 97 Hình 8.2. Quy trình sản xuất nước tương sạch bằng phương pháp lên men 99 Hình 8.2. Quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men cải tiến 100 Chương 1: TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT NÓI CHUNG 1.1 Sơ lược lịch sử phát triển của vi sinh vật học:[10] Từ cổ xưa, mặc dầu chưa nhận thức được sự tồn tại của vi sinh vật, nhưng loài người đã biết khá nhiều về các tác dụng do vi sinh vật gây nên. Trong sản xuất và trong đời sống, con người đã tích lũy được nhiều kinh nghiệm về các biện pháp lợi dụng các vi sinh vật có ích và phòng tránh các vi sinh vật có hại. Trên những vật giử lại từ thời cổ Hy Lạp, người ta đã thấy minh họa cả quá trình nấu rượu. Những tài liệu khảo cổ chu biết cách đây trên 6000 năm, người dân Ai Cập ở dọc sông Nile đã có tập quán nấu rượu. Ở Trung Quốc rượu đã được sản xuất từ thời đại văn hóa Long Sơn (cách đây trên 4000 năm ) . Việc lên men lactic (muối dưa ) được thực hiện từ những năm 3500 năm trước công nguyên. Muối dưa , làm dấm, làm tương v..v.. đều là những biện pháp hữu hiệu để hoặc sử dụng hoặc khống chế vi sinh vật phục vụ cho việc chế biến và bảo quản thực phẩm. Việc sáng tạo ra các hình thức ủ phân, ngâm phân, ngâm gai, xếp ải, trồng luân canh với cây họ đậu... đều là những biện pháp tài tình mà tổ tiên ta từ lâu đã biết phát huy tác dụng của vi sinh vật trong nông nghiệp. Người có công phát hiện ra thế giới vi sinh vật và cũng là người đầu tiên miêu tả hình thái nhiều loại vi sinh vật là một người Hà Lan, vốn là một người học nghề trong một hiệu buôn vải. Đó là Antonie van Leeuwenhoek (1632 – 1723). Ông đã tự chế ra trên 400 kính hiển vi, trong đó có cái phóng đại được đến 270 lần. Năm 1670 ông nhìn thấy các vi khuẩn và động vật nguyên sinh ông gọi là các “động vật vô cùng nhỏ bé”. Qua đó ông đã miêu tả hình thái và dạng chuyển động của nhiều loại vi sinh vật. Nhiều bài báo của ông đã được công bố trên tạp chí Triết học của học hội hoàng gia Anh và năm 1680 ông được bầu làm thành viên của học hội này Từ thập kỉ 60 của thế kỉ 19 bắt đầu thời kì nghiên cứu về sinh lí học của các vi sinh vật. Người có công lớn trong việc này, người về sau được coi là ông tổ của vi sinh vật học là nhà khoa học người Pháp Louis Pasteur (1822 – 1895). Khó mà tóm tắt được khối lượng các phát hiện đồ sộ mà Luis Pasteur đã cống hiến cho nhân loại. Bảng 1.1: Niên biểu về một số cống hiến của L.Pastuer về vi sinh vật học: Năm Cống hiến 1854 – 1864 Chứng minh nhiều quá trinh lên men (etilic, lastic, axetic...) là do sinh vật gây nên. 1862 Nhận giải thưởng đặc biệt của viện hàng lâm khoa học Pháp về việc phủ định học thuyết Tự sinh (spontaneous-generation hypotheis). 1863 Chứng minh vi khuẩn là nguồn gốc của bệnh than. Phát hiện ra nguyên nhân của bệnh bào tử trùng ở tằm và đề xuất được các biện pháp phòng tránh. 1865 Phát hiện các phẩy khuẩn gây bệnh. 1877 Phát hiện ra các tụ cầu khuẩn gây bệnh. 1880 Phát hiện ra các liên cầu khuẩn gây bệnh. 1880 Tìm ra vacxin chống bệnh dịch tả gà nhờ sử dụng vi khuẩn đã chuyển sang dạng mất độc lực. 1880 Phát hiện não mô cầu khuẩn ( cùng với Chamberland, Roux và Thuillier). 1880 Tìm ra vacxin chống bệnh than. 1881 Phát hiện tụ huyết khuẩn ở lợn ( cùng với Thuillier). 1883 Nghiên cứu vacxin chống bệnh dại. Ngày 6-7-1885 em bé 9 tuổi Joseph Meister là người đầu tiên được cứu sống nhờ vacxin chống dạ của L.Pastuer. 1880 - 1885 Trở thành viện trưởng đầu tiên của bệnh viện Paster ở Paris (cho đến khi qua đời). 1888 Phát hiện não mô cầu khuẩn ( cùng với Chamberland, Roux và Thuillier). Tiếp tục phát huy thành tựu của L.Pasteur, nhiều nhà bác học khác đã khám phá ra hầu hết các vi sinh vật gây bệnh và tìm ra phương pháp phân lập thuần khiết vi sinh vật trên các môi trường đặc. Năm 1892 nhà sinh lý học thực vật người Nga D.I.Ivanovskii (1864 – 1920) chứng minh có sự tồn tại của loại vi sinh vật siêu hiển vi gây ra bệnh khảm ở lá thuốc lá. Đến năm 1897 nhà khoa học người Hà Lan M.W. Beijerinck (1851 – 1931) gọi loại vi sinh vật này là virut. Năm 1928 bác sĩ người Anh Alexander Fleming (1881 – 1955) tách được chủng nấm sinh chất kháng sinh penixilin, mở ra một kỉ nguyên mới cho khả năng đẩy lùi nhanh chóng các bệnh nhiễm khuẩn. Khoa học về enzim hình thành và phát triển nhờ hàng loạt các thành công: năm 1987 B. Bertrand phát hiện ra và đặt tên cho nhóm coenzim; A. Harden và Young cô đặc được một nhóm coenzim gọi là cozimaza vào năm 1905; Sorensen chứng minh ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzim vào năm 1912 ... Tính đến năm 1984 người ta đã biết đến 2477 loại enzim khác nhau và enzim đã có mặt trong rất nhiều hoạt động sản xuất và đời sống con người. Các nhà vi sinh vật còn tạo ra bước ngoặt của di truyền học. Các chủng vi sinh vật được tạo ra nhờ thao tác di truyền sẽ có mặt trong đời sống nhân loại ở mọi lĩnh vực khác nhau. 1.2 Vị trí của vi sinh vật trong sinh giới:[10] Vi sinh vật không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới mà là bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước hiển vi, không thấy rõ được bằng mắt thường, do đó phải sử dụng kính hiển vi thường hoặc kính hiển vi điện tử. Ngoài ra muốn nghiên cứu vi sinh vật người ta phải sử dụng tới phương pháp nuôi cấy vô khuẩn. Từ trước đến nay có rất nhiều hệ thống phân loại sinh vật. Các đơn vị phân loại sinh vật nói chung và vi sinh vật nói riêng đi từ thấp lên cao là  Loài (Species), Chi (Genus), Họ (Family), Bộ (Order), Lớp (Class), Ngành (Phylum), và Giới (Kingdom). Hiện nay trên giới còn có một mức phân loại nữa gọi là lĩnh giới (Domain). Đấy là chưa kể đến các mức phân loại trung gian như Loài phụ (Subspecies), Chi phụ (Subgenus), Họ phụ (Subfamily), Bộ phụ (Suborder),Lớp phụ (Subclass), Ngành phụ (Subphylum). Xưa kia John Ray (1627-1705) và Carl Von Linnaeus (1707-1778) chỉ chia ra 2 giới là Thực vật và Động vật. Năm 1866 E. H. Haeckel (1834-1919) bổ sung thêm giới Nguyên sinh (Protista). Năm 1969 R. H. Whitaker (1921-1981) đề xuất hệ thống phân loại 5 giới : Khởi sinh (Monera), Nguyên sinh (Protista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) và Động vật (Animalia). Khởi sinh bao gồm Vi khuẩn (Bacteria) và Vi khuẩn lam (Cyanobacteria). Nguyên sinh bao gồm Động vật nguyên sinh (Protzoa), Tảo (Algae) và các Nấm sợi sống trong nước (Water  molds). Hình 1.1: Hệ thống phân loại 5 giới sinh vật Gần đây hơn  có hệ thống phân loại 6 giới- như 5 giới trên nhưng thêm giới Cổ vi khuẩn (Archaebacteria), giới Khởi sinh đổi thành giới Vi khuẩn thật (Eubacteria) (P. H. Raven, G. B. Johnson, 2002). Hình 1.2: Hệ thống phân loại 6 giới sinh vật T. Cavalier-Smith (1993) thì lại đề xuất hệ thống phân loại 8 giới: Vi khuẩn thật (Eubacteria), Cổ vi khuẩn (Archaebacteria), Cổ trùng (Archezoa), Động vật nguyên sinh (Protozoa), Sắc khuẩn (Chromista), Nấm (Fungi), Thực vật (Plantae) và Động vật (Animalia). Hình 1.3: Hệ thống phân loại 8 giới sinh vật Theo R. Cavalier-Smith thì : Cổ trùng (như Giardia) bao gồm các cơ thể đơn bào nguyên thuỷ có nhân thật, có ribosom 70S, chưa có bộ máy Golgi, chưa có ty thể (mitochondria) chưa có thể diệp lục (Chloroplast), chưa có  peroxisome. Sắc khuẩn bao gồm phần lớn các cơ thể quang hợp chứa thể diệp lục trong các phiến (lumen) của mạng lưới nội chất nhăn (rough endpplasmic reticulum) chứ không phải trong tế bào chất (cytoplasm), chẳng hạn như Tảo silic , Tảo nâu, Cryptomonas, Nấm noãn.   Năm 1980, Carl R. Woese dựa trên những nghiên cứu sinh học phân tử phát hiện thấy Cổ khuẩn có sự sai khác lớn trong trật tự nucleotid ở ARN của ribosom 16S và 18S. Ông đưa ra hệ thống phân loại ba lĩnh giới (Domain) bao gồm Cổ khuẩn (Archae), Vi khuẩn (Bacteria) và Sinh vật nhân thực (Eucarya). Hình 1.4: Hệ thống 3 lĩnh giới (domain) Cổ khuẩn là nhóm vi sinh vật có nguồn gốc cổ xưa. Chúng bao gồm các nhóm vi khuẩn có thể phát triển được trong các môi trường cực đoan (extra), chẳng hạn như nhóm ưa mặn (Halobacteriales), nhóm ưa nhiệt (Thermococcales, Thermoproteus, Thermoplasmatales), nhóm kỵ khí sinh mêtan (Methanococcales, Methanobacteriales, Methanomicrobiales), nhóm vi khuẩn lưu huỳnh ưa nhiệt (Sulfobales, Desulfurococcales). Monera trong hệ thống 5 giới tương đương với Vi khuẩn và Cổ khuẩn trong hệ thống 8 giới và trong hệ thống 3 lĩnh giới. Nguyên sinh trong hệ thống 5 giới tương đương  với 3 giới Cổ trùng (Archaezoa), Nguyên sinh (Protista-Protozoa) và Sắc khuẩn (Chromista) trong hệ thống 8 giới và tương đương với 5 nhóm sau đây trong hệ thống 3 lĩnh giới (domain): Archaezoa, Euglenozoa, Alveolata, Stramenopila và Rhodophyta. Theo hệ thống 3 lĩnh giới thì : - Archaezoa bao gồm Diplomonad, Trichomonad và Microsporidian. Euglenozoa  ao gồm Euglenoid và Kinetoplastid. - Alveolata  bao gồm Dinoflagellate, Apicomplexan, và Ciliate. Strmenopila bao gồm Tảo silic (Diatoms) , Tảo vàng (Golden algae), Tảo nâu (Brown algae) và Nấm sợi sống trong nước (Water mold) . - Rhodophyta gồm các Tảo đỏ (Red algae). Riêng Tảo lục (Green algae) thì một phần thuộc Nguyên sinh (Protista) một phần thuộc Thực vật (Plantae)   Monera hay 2 lĩnh giới Vi khuẩn và Cổ khuẩn thuộc nhóm Sinh vật nhân sơ (Prokaryote), còn các sinh vật khác đều thuộc nhóm Sinh vật nhân thật (Eukaryote). Kết luận: phần lớn vi sinh vật thuộc về ba nhóm Cổ khuẩn, Vi khuẩn và Nguyên sinh. Trong giới Nấm, thì nấm men (yeast), nấm sợi (filamentous Fungi) và dạng sợi (mycelia) của mọi nấm lớn đều được coi là vi sinh vật. Như vậy là vi sinh vật không có mặt trong hai giới Động vật và Thực vật. Người ta ước tính trong số 1,5 triệu loài sinh vật có khoảng 200000 loài vi sinh vật (100000 loài động vật nguyên sinh và tảo, 90000 loài nấm, 2500 loài vi khuẩn lam và 1500 loài vi khuẩn). Tuy nhiên hàng năm, có thêm hàng nghìn loài sinh vật mới được phát hiện, trong đó có không ít loài vi sinh vật. Virus là một dạng đặc biệt chưa có cấu trúc cơ thể cho nên chưa được kể đến trong số 200000 loài vi sinh vật nói trên. Số virus đã được đặt tên là khoảng 4000 loài. Poliovirus Virus cúm gà H5N1 Virus HIV/AIDS Hình 1.5: Một số loại virus  Trong thực tế, số loài vi sinh vật phải tới hàng triệu loài. Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc TT Công nghệ Sinh học, ĐHQG Hà Nội hợp tác với các nhà khoa học Nhật bản và dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã bước đầu phát hiện được khá nhiều loài vi sinh vật mới được thế giới công nhận. 1.2-Các đặc điểm chung của vi sinh vật :[10] Vi sinh vật có các đặc điểm chung sau đây : 1.2.1)-Kích thước nhỏ bé : Vi sinh vật thường được đo kích thước bằng đơn vị micromet (1mm= 1/1000mm hay 1/1000.000m). virus được đo kích thước đơn vị bằng nanomet (1nn=1/1000.000mm hay 1/1000.000.000m). Kích thước càng bé thì diện tích bề mặt của vi sinh vật trong 1 đơn vị thể tích càng lớn. Chẳng hạn đường kính của 1 cầu khuẩn (Coccus) chỉ có 1mm, nhưng nếu xếp đầy chúng  thành 1 khối lập nhưng có thể lích là 1cm3 thì chúng có diện tích bề mặt rộng tới 6m2 Light microscope : KHV quang học Electron microscope : KHV điện tử Most bacteria: Phần lớn vi khuẩn Hình 1.6: Thước ghi kích thước của các dạng.   1.2.2)-Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh : Tuy vi sinh vật có kích thước rất nhỏ bé nhưng chúng lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá vượt xa các sinh vật khác. Chẳng hạn 1 vi khuẩn lắctic (Lactobacillus)  trong 1 giờ có thể phân giải được một lượng đường lactose lớn hơn 100-10 000 lần so với khối lượng của chúng. tốc độ tổng hợp protein của nấm men cao gấp 1000 lần so với đậu tương và gấp 100 000 lần so với trâu bò.   1.2.3) Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh : Chẳng hạn, 1 trực khuẩn đại tràng (Escherichia coli ) trong các điều kiện thích hợp chỉ sau 12-20 phút lại phân cắt một lần. Nếu lấy thời gian thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 làn, sau 24 giờ phân cắt 72 lần và tạo ra 4 722 366 500 000 000 000 000 000 tế bào (4 722 366. 1017), tương đương với 1 khối lượng ... 4722 tấn. Tất nhiên trong tự nhiên không có được các điều kiện tối ưu như vậy ( vì thiếu thức ăn, thiếu oxy, dư thừa các sản phẩm trao đổi chất có hại...). Trong nòi lên men với các điều kiện nuôi cấy thích hợp từ 1 tế bào có thể tạo ra sau 24 giờ khoảng 100 000 000- 1 000 000 000 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men dài hơn, ví dụ với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút. Với nhiều vi sinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu ( Chlorella ) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc  là 23 giờ...Có thể nói không có sinh vật nào có tốc độ sinh sôi nảy nở nhanh như vi sinh vật.  1.2.4) Có năng lực thích ứng mạnh và dễ dàng phát sinh biến dị : Trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất khác nhau, kể cả những điều kiện hết sức bất lợi mà các sinh vật khác tgường không thể tồn tại được. Có vi sinh vật  sống được ở môi trường nóng đến 1300C, lạnh đến -50C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong, pH thấp đến 0,5 hoặc cao đến 10,7, áp suất cao đến trên 1103 at. hay có độ phóng xạ cao đến 750 000 rad. Nhiều vi sinh vật có thể phát triển tốt trong điều kiện tuyệt đối kỵ khí, có loài nấm sợi có thể phát triển dày đặc trong bể ngâm tử thi với nộng độ Formol rất cao... Vi sinh vật đa số là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống ... do đó rất dễ dàng phát sinh biến dị. Tần số biến dị thường ở mức 10-5-10-10. Chỉ sau một thời gian ngắn đã có thể tạo ra một số lượng rất lớn các cá thể biến dị ở các hế hệ sau. Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất. Nếu như khi mới phát hiện ra penicillin hoạt tính chỉ đạt 20 đơn vị/ml dịch lên men (1943) thì nay đã có thể đạt trên 100 000 đơn vị/ml. Khi mới phát hiện ra acid glutamic chỉ đạt 1-2g/l thì nay  đã đạt đến 150g/ml dịch lên men (VEDAN-Việt Nam). 1.2.5) Phân bố rộng, chủng loại nhiều : Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật... Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh-địa-hoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn n, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe... Trong nước vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải (littoral zone), vùng nước nông (limnetic zone) và ngay cả ở vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ (benthic zone). Trong không khí thì càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực... Hầu như không có hợp chất carbon nào (trừ kim cương, đá graphít...) mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol. dioxin...). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau : quang tự dưỡng (photoautotrophy), quang dị dưỡng (photoheterotrophy), hoá tự dưỡng (chemoautotrophy), hoá dị dưỡng (chemoheterotrophy).tự dưỡng chất sinh trưởng (auxoautotroph), dị dưỡng chất sinh trưởng (auxoheterotroph)...   1.2.6)Vi sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất : Trái đất hình thành cách đây 4,6 tỷ năm nhưng cho đến nay mới chỉ tìm thấy dấu vết của sự sống từ cách đây 3,5 tỷ năm. Đó là các vi sinh vật hoá thạch còn để lại vết tích trong các tầng đá cổ. Vi sinh vật hoá thạch cỗ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay. Chúng được J.William Schopf tìm thấy tại các tầng đá cổ ở miền Tây Australia. Chúng có dạng đa bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2 mm và có thành tế bào khá dày. Trước đó các nhà khoa học cũng đã tìm thấy vết tích của chi Gloeodiniopsis có niên đại cách đây 1,5 tỷ năm và vết tích của chi Palaeolyngbya có niên đại cách đây 950 triệu năm. Vết tích vi khuẩn lam cách đây 3,5 tỷ năm Vết tích Gloeodiniopsis cách đây 1,5 tỷ năm Vết tích Palaeolyngbya cách đây 950 triệu năm Hình 1.7: Các vết tích về sự xuất hiện của vi sinh vật 1.3 Hình thái và cấu tạo tế bào vi sinh vật:[10, 14] 1.3.1 Vi khuẩn: a.Hình thái, kích thước: Vi khuẩn có nhiều hình thái, kích thước và cách sắp xếp khác nhau. Đường kính của phần lớn vi khuẩn trong khoảng 0,2 – 2,0 mm, chiều dài cơ thể khoảng 2,0 – 8,0 mm. Những hình dạng chủ yếu của vi khuẩn là hình cầu, hình que, hình dấu phẩy, hình xoắn, hình có cuống, hình có sợi... b.Thành tế bào: Thành tế bào (cell wall) giúp duy trì hình thấi của tế bào, hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao (flagellum) , giúp tế bào đề kháng với áp suất thẩm thấu, hỗ trợ quá trình phân cắt tế bào , cản trở sự xâm nhập của một số chất có phân tử lớn, liên quan đến tính kháng nguyên , tính gây bệnh, tính mẫn cảm với Thực khuẩn thể (bacteriophage). c.Màng sinh chất:          Màng sinh chất hay Màng tế bào chất ở vi khuẩn cũng tương tự như ở các sinh vật khác. Chúng cấu tạo bởi 2 lớp phospholipid, chiếm 30-40% khối lượng của màng, và các protein (nằm trong, ngoài hay xen giữa màng), chiếm 60-70% khối lượng của màng. Đầu phosphat của phospholipid tích điện, phân cực, ưa nước ; đuôi hydrocarbon không tích điện, không phân cực, kỵ nước. Màng sinh chất có các chức năng chủ yếu sau đây: -     Khống chế sự qua lại của các chất dinh dưỡng, các sản phẩm trao đổi chất -     Duy trì áp suất thẩm thấu bình thường trong tế bào. -     Là nơi sinh tổng hợp các thành phần của thành tế bào và các polyme của bao nhày (capsule). -    Là nơi tiến hành quá trình phosphoryl oxy hoá và quá trình phosphoryl quang hợp (ở vi khuẩn quang tự dưỡng) -      Là nơi tổng hợp nhiều enzym, các protein của chuỗi hô hấp. -      Cung cấp năng lượng cho sự hoạt động của tiên mao d.Tế bào chất : Tế bào chất là phần vật chất dạng keo nằm bên trong màng sinh chất, chứa tới 80% là nước. Trong tế bào chất có protein, acid nucleic, hydrat carbon, lipid, các ion vô cơ và nhiều nhiều chất khác có khối lượng phân tử thấp. Bào quan đáng lưu ý trong TBC là ribosom (ribosome). Ribosom nằm tự do trong tế bào chất và chiếm tới 70% trọng lượng khô của TBC. Ribosom gồm 2 tiểu phần (50S và 30S), hai tiểu phần này kết hợp với nhau tạo thành ribosom 70S. S là đơn vị Svedberg- đại lượng đo tốc độ lắng khi ly tâm cao tốc. e.Thể nhân: Thể nhân ( Nuclear body) ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thuỷ, chưa có màng nhân nên không có hình dạng cố định, và vì vậy còn được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng thuốc nhuộm Feulgen có thể thấy thể nhân hiện màu tím. Đó là 1 nhiễm sắc thể (NST, chromosome) duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi ADN xoắn kép. Thể nhân là bộ phận chứa đựng thông tin di truyền của vi khuẩn. f.Bao nhầy: Thành phần chủ yếu của bao nhầy là polysaccarid, ngoài ra cũng có polypeptid và protein. Trong thành phần polysaccarid ngoài glucose còn có glucozamin, ramnose, acid 2-keto-3-deoxygalacturonic, acid uronic, acid pyruvic, acid axetic... Ý nghĩa sinh học của bao nhầy là: - Bảo vệ vi khuẩn trong điều kiện khô hạn, bảo vệ vi khuẩn tránh bị thực bào (trường hợp Phế cầu khuẩn-Diplococcus pneumoniae) - Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn khi thiếu thức ăn - Là nơi tích luỹ một số sản phẩm trao đổi chất (dextran, xantan...) - Giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( trường hợp các vi khuẩn gây sâu răng như Streptococcus salivarrius, Streptococcus mutans...) g.Tiên mao: Tiên mao (Lông roi, flagella) không phải có mặt ở mọi vi khuẩn, chúng quyết định khả năng và phương thức di động của vi khuẩn. Tiên mao là những sợi lông dài, dưới kính hiển vi quang học chỉ có thể thấy rõ khi nhuộm theo phương pháp riêng. Dưới kính hiển vi điện tử có thể thấy rất rõ cấu trúc của từng sợi tiên mao.  Kiểu sắp xếp tiên mao liên quan đến hình thức di động của vi khuẩn. Tiên mao mọc ở cực giúp  vi khuẩn di động theo kiẻu tiến- lùi. Chúng đảo ngược hướng bằng cách đảo ngược hướng quay của tiên mao. Vi khuẩn di động theo hướng nào thì các tiên mao chuyển động theo hướng ngược lại. Khi tiên mao không tụ lại về một hướng thì vi khuẩn chuyển động theo kiểu nhào lộn. Tốc độ di chuyển của vi khuẩn có tiên mao thường vào khoảng 20-80µm/giây, nghĩa là trong 1 giây chuyển động được một khoảng cách lớn hơn gấp 20-80 lần so với chiều dài của cơ thể chúng. h.Khuẩn mao: Khuẩn mao (hay Tiêm mao, Nhung mao , Fimbriae) là những sợi lông rất mảnh, rất ngắn mọc quanh bề mặt tế bào nhiều vi khuẩn Gram âm. Chúng có đường kính khoảng 7-9nm, rỗng ruột (đường kính trong là 2-2,5nm), số lượng khoảng 250-300 sợi/ vi khuẩn. Kết cấu của khuẩn mao giản đơn hơn nhiều so với tiên mao. Chúng có tác dụng giúp vi khuẩn bám vào giá thể ( nhiều vi khuẩn gây bệnh dùng khuẩn mao để bám chặt vào màng nhầy của đường hô hấp, đường tiêu hoá, đường tiết niệu của người và động vật). i.Bào tử: Một số vi khuẩn cuối thời kì sinh trưởng phát triển sẽ sinh ra bên trong tế bào một thể nghĩ có dạng hình cầu hay hình bầu dục được gọi là bào tử hay nội bào tử. Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra có một bào tử nên đây không phải là loại bào tử có chức năng sinh sôi nảy nở như ở nấm. Bào tử có tính kháng nhiệt, kháng bức xạ, kháng hóa chất, kháng áp suất thẩm thấu. j.Hình thức sinh sản Vi khuẩn chỉ sinh sản vô tính (asexual reproduction), không sinh sản hữu tính (có tái tổ hợp di truyền). Cụ thể hơn, chúng sinh sản bằng cách chia đôi (binary fission), hay trực phân. Trong quá trình này, một tế bào mẹ được phân thành 2 tế bào con bằng cách tạo vách ngăn đôi tế bào mẹ. Tuy nhiên, mặc dù không có sinh sản hữu tính, những biến đổi di truyền (hay đột biến) vẫn xảy ra trong từng tế bào vi khuẩn thông qua các hoạt động tái tổ hợp di truyền. Do đó, tương tự như ở các sinh vật bậc cao, kết quả cuối cùng là vi khuẩn cũng có được một tổ hợp các tính trạng từ hai tế bào mẹ. Có ba kiểu tái tổ hợp di truyền đã được phát hiện ở vi khuẩn: - Biến nạp (transformation): chuyển DNA trần từ một tế bào vi khuẩn sang tế bào khác thông qua môi trường lỏng bên ngoài, hiện tượng này gồm cả vi khuẩn chết, - Tải nạp (transduction): chuyển DNA của virus, vi khuẩn, hay cả virus lẫn vi khuẩn, từ một tế bào sang tế bào khác thông qua thể thực khuẩn (bacteriophage) - Giao nạp (conjugation): chuyển DNA từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua cấu trúc protein gọi là pilus (lông giới tính). Vi khuẩn, sau khi nhận được DNA từ một trong những cách trên, sẽ tiến hành phân chia và truyền bộ gene tái tổ hợp cho thế hệ sau. 1.3.2 Nấm men: a. Hình thái và cấu trúc: - Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. - Tùy loài nấm men mà tế bào có hình cầu, hình trứng, hình oval, hình elip, hình sao thổ, hình cái liềm, hình thoi, hình tam giác ... - Các loài nấm men có khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả. Khuẩn ty giả chưa thành sợi rỏ rệt mà mà chỉ là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. - Thành tế bào nấm men dày khoảng 25 nm. Đa số nấm men có thành tế bào cấu tạo bởi glucan và mannan. Trong thành tế bào nấm men còn chứa khoảng 10% protein (tính theo khối lượng khô). - Dưới lớp thành tế bào là lớp màng tế bào chất. Màng tế bào chất có ba tầng kết cấu khác nhau. Cấu tạo chủ yếu là protein (chiếm 50% khối lượng khô), phần còn lại là lipit (40%) và một ít polisaccarit. - Nhân của tế bào nấm men được bao bọc bởi màng nhân như ở các vi sinh vật nhân thật khác. Màng nhân của nấm men có cấu trúc hai lớp và có rất nhiều lỗ thủng. - Ti thể của nấm men cũng giống với các nấm mốc và các vi sinh vật có nhân khác. ADN của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng phân tử là 50x106 Da ( gấp 5 lần so với ADN ti thể động vật bậc cao). ADN của ti thể nấm men chiếm 15 – 23% tổng lượng ADN của tế bào nấm men. - Các tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện không bào. Trong không bào có chứa các enzim thủy phân, poliphophat, ion kim loại, các sản phẩm trao đổi chất trung gian. Ngoài tác dụng một kho dự trữ, không bào còn có chứa năng điều hòa áp suất thẩm thấu của tế bào. b. Sinh sản và chu kỳ sống: Nấm men có nhiều phương pháp sinh sôi nảy nở khác nhau: - Sinh sản vô tính: + Nảy chồi: phương pháp sinh sản phổ biến nhất ở nấm men. + Phân cắt + Bằng bào tử: bào tử đốt, bào tử bắn, bào tử áo. Sinh sản hữu tính: bằng bào tử túi. Chu kỳ sống của nấm men phân ra thành ba loại hình: - Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) có thể tiếp hợp với nhau để tạo ra tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n). Sau quá trình giảm phân sẽ sinh ra các bào tử túi (thường là 4 bào tử túi). Bình thường khi không có sinh sản hữu tính chúng vẫn tiếp tục nảy chồi để sinh sôi nảy nở. - Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sản theo lối phân cắt. Hai tế bào khác dấu ở gần nhau sẽ tiếp hợp với nhau và sau quá trình phân cắt ba lần, lần đầu giảm nhiễm sẽ tạo ta tám bào tử túi. Tế bào mang tám bào tử này trở thành túi. Khi túi vỡ các bào tử túi sẽ thoát ra ngoài và khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển trở lại thành các tế bào dinh dưỡng. - Thể dinh dưỡng chỉ có thể tồn tại dưới dạng lưỡng bội (2n) sinh sản theo lối nảy chồi khá lâu. Bào tử túi đơn bội tiếp hợp từng đôi với nhau ngay cả từ khi còn nằm trong túi. Giai đoạn đơn bội tồn tại dưới dạng bào tử túi nằm trong túi và không thể sống một cách độc lập. 1.3.3 Nấm mốc: Nấm mốc là tên chung để chỉ các nhóm nấm không phải là nấm men cũng không phải là các nấm lớn có quả thể như nấm rơm, nấm rạ ... Nấm mốc là một nhóm vi sinh vật lớn có cấu trúc hình sợi phân nhánh nhiều lần. Sợi nấm còn gọi là khuẩn ty. Khi phát triển chúng chằng chịt với nhau thành hệ sợi nấm (khuẩn ty thể) mắt thường có thể nhìn thấy được. Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên (đất, nước, không khí...) với vai trò phân giải các hợp chất hữu cơ. Một số loài gây bệnh, gây hư hỏng thực phẩm, ngoài ra một số loài còn tiết ra độc tố vào thức ăn. Tuy nhiên, trong số chúng có những nhóm có vai trò tích cực trong quá trình chế biến thực phẩm góp phần làm đa dạng hoá các sản phẩm chế biến như: tương, chao, nước chấm... a. Một số đặc điểm về cấu trúc tế bào nấm mốc: - Kích thước lớn. - Bên ngoài có thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân phân hóa. - Màng nhân có cấu tạo hai lớp và trên màng có nhiều lỗ nhỏ. Trong nhân có hạch nhân. Bên trong tế bào nấm còn có không bào, ti thể, mạng lưới nội chất, bào nang... - Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp nón, không tăng trưởng và có tác dụng ce chở cho phần ngọn của sợi nấm. Đây là phần mà chất nguyên sinh không có nhân và ít chứa các cơ quan tử. Phần này rất dễ tách rời với các phần còn lại của ngọn sợi nấm vì dưới chóp nón là một phần có thành rất mỏng. Dưới nữa là phần tạo ra thành tế bào. Các sợi nhỏ trên thành tế bào xếp ngang (chéo góc với trục sợi nấm). Dưới nữa là phần tăng trưởng. Thành của phần này có cấu trúc sợi dạng mạng lưới. Ngọn sợi nấm tăng trưởng được là nhờ phần này. Dưới nữa là phần thành cứng hay còn gọi là phần thành thục của sợi nấm. Thành tế bào ở phần này ngoài các sơi ngang còn được tăng cường bởi các sợi dọc. Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm. Giữa hai phần nói trên là một yếu và dễ gãy. Ở phần tăng trưởng của sợi nấm chứa đầy chất nguyên sinh với nhiều nhân, nhiều cơ quan tử, nhiều enzim, nhiều axit nucleic. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và sự phân nhánh của sợi nấm. - Nấm mốc là những vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Có thể chia nấm mốc thành 3 lớp chính dựa theo tổ chức hình thái: Lớp phycomycetes (Lớp nấm tảo) Sợi không có vách ngăn ngang, có động bào tử. Gồm hai lớp phụ: Lớp phụ Oomycetes (Nấm noãn) Lớp phụ Zygomycetes (Nấm tiếp hợp) Bộ Mucorales Họ Mucoraceae với hai giống đại diện là Mucor va Rhizopus. Lớp Basidiomycetes (Lớp nấm đảm ) Sinh sản hữu tính theo kiểu tạo bào tử đảm (basidiospore). Gặp ở các nấm lớn có tai nấm: nấm rơm, nấm hương. Lớp Deuteromycetes (Lớp nấm bất toàn – Fungi imperfect) Không có khả năng sinh sản hữu tính, gồm 3 bộ: Bộ nấm bông (Moniliales). Trong bộ này có 4 họ. Họ nấm bông (Moniliaceae) Sợi nấm không màu hoặc có màu nhạt, codini rời đại diện là giống Aspergillus, Penicilium. Họ nấm bông sẩm (Dematiceae) Sợi nấm có màu tối, thường gặp trong thiên nhiên. Giống Alterneria Họ nấm đệm (Tuberculariaceae) Cuống sinh bào tử ngắn, có đại bào tử. Giống Fusarium Họ Cryptoccaceae (Nấm men giả ) b. Hình thức sinh sản của nấm mốc Nấm mốc có ba hình thức sinh sản chủ yếu - Sinh sản dinh dưỡng: khi gặp điều kiện thuận lợi từ một khuẩn ty riêng lẽ hoặc bào tử áo sẽ nẩy mầm và phát triển thành khuẩn ty mới. Có hai hình thức:sinh sản dinh dưỡng bằng sợi nấm, sinh sản dinh dưỡng bằng bào tử áo - Sinh sản vô tính bằng vào tử: các bào tử kín hoặc bào tử trần khi chín sẽ rơi vãi ra ngoài gặp điều kiện thuận lợi sẽ nẩy mầm tạo khuẩn ty mới. Đó là hình thức sinh sản bằng bào tử kín hoặc bào tử đính. Đây là hình thức sinh sản quan trọng nhất trong sự phát triển nòi giống do sản xuất ra một lượng cá thể lớn và xảy ra nhiều lần trong mùa sinh sản. - Sinh sản hữu tính : Nhóm nấm bậc thấp (Phycomycetes ) tạo ra bào tử tiếp hợp (Zygospore) và bào tử noãn (Oospore). Nhóm nấm túi (Ascomycetes) tạo ra bào tử túi (Ascospore). 1.4 Vai trò của vi sinh vật:[10] Vi sinh vật sống trong đất và trong nước tham gia tích cực vào quá trình phân giải các xác hữu cơ, biến chúng thành CO2 và các hợp chất vô cơ dùng làm thức ăn cho cây trồng (P, K, S, Ca...). Các vi sinh vật cố định nitơ thực hiện việc biến khí nitơ (N2) trong không khí thành hợp chất nitơ (NH3, NH4+) cung cấp cho cây cối. Vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất khó tan chứa P, chứa K, chứa S và tạo ra các vòng tuần hoàn trong tự nhiên. Vi sinh vật sống trong đất và trong nước còn tham gia vào quá trình hình thành chất mùn. Trong đất, chất mùn là kho dự trữ thức ăn cho cây trồng và là yếu tố kết dính để tạo ra cấu tượng của đất. Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân giải các phế thải công nghiệp, phế thải công nghiệp, đô thị và vì vậy có vai trò hết sức quan trọng trong việc bảo vệ môi trường. Vi sinh vật còn có vai trò quan trọng trong ngành năng lượng. Trong các nguồn năng lượng mà con người hi vọng sẽ khai thác mạnh mẽ trong tương lai có năng lượng thu được từ sinh khối. Sinh khối là khối lượng chất sống của vi sinh vật. Thực vật và một số vi sinh vật có thể tự tạo ra chất hữu cơ của sinh khối từ khí CO2 và nước. Vi sinh vật là động lực để vận hành các bể khí sinh học (biogas). Từ 1 tấn phân chuồng được đưa vào lên men có thể làm sản sinh ra 70 – 73 m3 khí sinh học, cho năng lượng tương đương 45l xăng. Vi sinh vật là lực lượng sản xuất trực tiếp của ngành công nghiệp lên men. Vi sinh vật có các kiểu trao đổi chất phong phú, có năng lực trao đổi chất mạnh mẽ, do đó có thể sản sinh ra rất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau. Nhiều sản phẩm đã được sản xuất lớn ở quy mô công nghiệp. Từ đầu thập kỉ 70 của thế kỉ này người ta bắt đầu thực hiện thành công thao tác di truyền ở vi sinh vật. Trong công nghệ thực phẩm, vi sinh vật có vai trò quan trọng trong các sản phẩm thực phẩm lên men. Hiện nay vi sinh vật được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều sản phẩm lên men như bia, rượu, tương, chao, thủy sản lên men, rau quả lên men.... Ngoài ra, vi sinh vật cũng có ứng dụng to lớn trong công nghiệp sản xuất chế phẩm enzim. Các chế phẩm enzim này có ứng dụng to lớn trong công nghiệp thực phẩm, y học... Tất nhiên còn phải kể đến không ít các vi sinh vật có hại. Chúng gây bệnh cho người, cho gia súc, gia cầm, cây trồng.... Chúng làm hư hao hoặc biến chất lương thực, thực phẩm, nguyên vật liệu, hàng hóa. Chương 2: TỔNG QUAN VỀ VI SINH VẬT TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN 2.1 Khái niêm chung:[15] Sự lên men hiểu theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của các enzim của vi sinh vật. Dựa vào cơ chế của quá trình, có thể chia ra: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Lên men yếm khí là quá trình phân giải bằng enzim các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các chất đơn giản mà không có sự tham gia của oxy phân tử. Ví dụ, lên men rượu, lên men latic .... Lên men hiếu khí cũng là quá trình phận giải đường thành các hơp chất đơn giản nhưng cần có oxy tự do. Ví dụ, lên men axetic, lên men xitric, ... Trong sản xuất lên men, người ta thường dùng các vi sinh vật khác nhau: nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Các sản phẩm thu được của quá trình lên men cũng khác nhau và đa dạng. Dựa vào tính chất của sản phẩm người ta thường chia ra: công nghiệp lên men cổ điển và công nghiệp lên men hiện đại. Công nghiệp lên men cổ điển là những ngành sản xuất lên men qua đó người ta thu được những sản phẩm có phân tử lượng nhỏ hơn chất “khởi thủy” trong nguyên liệu. Một đặc điểm nữa của lên men cổ điển là có thể thay thế bằng phương pháp hóa học. Ví dụ như sản xuất rượu, axetonbutylic, ... Thực chất của quá trình là những phản ứng dị hóa. Với công nghiệp lên men hiện đại, các sản phẩm thu được phức tạp hơn, khác xa về bản chất với chất “khởi thủy” trong nguyên liệu và không thể thay thế bằng phương pháp hóa học. Về thực chất, các quá trình ở đây là những phản ứng tổng hợp. Ví dụ, sản xuất vitamin, kháng sinh, axit amin, protein bằng con đường sinh tổng hợp. 2.2 Bản chất của các quá trình lên men:[15, 16] Lên men là quá trình oxy hóa – khử sinh học để thu năng lượng và các hợp chất trung gian Để thực hiện được các hoạt động sống như sinh trưởng, sinh sản và phát triển của mình, vi sinh vật đòi hỏi phải có năng lượng. Lên men là quá trình cung cấp năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh vật. Nhưng tế bào sống chỉ sử dụng năng lượng dưới dạng hóa năng tàng trữ trong mạch cacbon và được giải phóng ra trong các phản ứng enzim do sự chuyển electron từ mức năng lượng này sang mức năng lượng khác. Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong các quá trình lên men là những phản ứng chuyển hydro. Nhưng sự chuyển hóa hydro cũng tương tự với sự chuyển electron bởi vì nguyên tử hydro có thể tách ra thành proton H+ và electron. Các enzim xúc tác quá trình tách nguyên tử hidro ra khỏi cơ chất gọi là enzim dehydrogenaza. Như vậy lên men là quá trình oxy hóa – khử có enzim xúc tác hay nói cách khác là quá trình oxy hóa – khử sinh học. Trong quá trình đó, các nguyên tử cacbon của cơ chất bị oxy hóa đến CO2, còn các nguyên tử hydro tách ra khỏi cơ chất, đầu tiên được chuyển đến NAD+, sau đó từ NADH2 trong điều kiện yếm khí hydro có thể được chuyển đến những sản phẩm trung gian khác nhau hoặc đến chất tiếp nhận được tổng hợp nên chỉ nhằm mục đích đó, nghĩa là để tái sinh lại NAD+. Tùy thuộc vào chất tiếp nhận hydro cuối cùng mà phân biệt hô hấp lên men và hô hấp yếm khí. Lên men là quá trình để thu năng lượng, quá đó hydro tách ra khỏi cơ chất được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại đó. Phụ thuộc vào sản phẩm nào được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta phân ra lên men rượu, lên men lactic hay len men butyric, v.v. Lên men khác với hô hấp yếm khí và sự oxy hóa không hoàn toàn. Hô hấp yếm khí cũng tiến hành trong điều kiện không có oxy tham gia nhưng hydro lại được chuyển qua mạch hô hấp mà đến chất tiếp nhận cuối cùng là như nitrat hoặc sulfat. Trong tế bào vi sinh vật luôn luôn có các hợp chất phospho giàu năng lượng và khi phân ly những hợp chất sẽ cung cấp cho cơ thể những năng lượng cần thiết. Một trong những hợp chất phospho giàu năng lượng quan trọng đó là ATP. Khi lên men ATP liên tục được tạo thành từ ADP và phân tử phosphat vô cơ. Sau đó ATP lại bị phân giải để giải phóng ra năng lượng và phosphat vô cơ. Trong tế bào vi sinh vật, sự tạo thành và sự thủy phân ATP được kết hợp với những phản ứng khác. Bằng cách như vậy vi sinh vật sử dụng rất có hiệu quả năng lượng đã được thoát ra. 2.3 Cơ chế điều hòa phản ứng hóa học trong các quá trình lên men:[15, 16] Lên men là quá trình oxy hóa – khử có enzim xúc tác. Vì vậy, cơ chế có vai trò quyết định trong việc điều hòa các phản ứng hóa học, ở đây, phải là cơ chế tác dụng trên mức độ enzim. Về nguyên tắc có hai phương pháp điều hòa các phản ứng enzim. Điều hòa bằng những yếu tố ảnh hưởng đến việc sinh tổng hợp ra enzim và điều hòa bằng những nhân tố ảnh hưởng đến độ hoạt độ của enzim. Nhưng điều hòa theo nguyên tắc đầu thường là chậm hay gọi là điều chỉnh thô. Kiểu điều hòa theo nguyên tắc thứ hai nhanh hơn, có hiệu quả hơn và kinh tế hơn do đó người ta gọi là điều chỉnh tinh. * Điều hòa bằng cách tác động đến hoạt độ của enzim: a. Đối với một phản ứng enzim đơn giản, một giai đoạn Giả sử có phản ứng: được xúc tác bởi enzim Xaza. Chúng ta dễ dàng thấy vận tốc phản ứng phụ thuộc vào nồng độ cơ chất, nồng độ enzim Xaza, nhiệt độ pH, các chất hoạt hóa và các chất kiềm hãm. Thay đổi một trong những nhân tố này sẽ làm thay đổi vận tốc phản ứng hay nói cách khác sẽ điều chỉnh được phản ứng. Trong những nhân tố đó việc thay đổi nồng độ cơ chất có ý nghĩa quan trọng hơn cả. Vận tốc của phản ứng enzim được biểu diễn bởi phương trình Michaelis-Menten: Dĩ nhiên, khi nồng độ cơ chất thấp hơn lượng mà enzim cần để kết hợp thì hoạt độ của một lượng enzim không đổi sẽ hoàn toàn phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Khi enzim đã bão hòa cơ chất thì vận tốc phản ứng sẽ không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất mà chỉ phụ thuộc vào nồng độ enzim và hoạt độ xúc tác của nó: . Như vậy, tham gia vào hằng số k bây giờ chỉ còn lại pH, nhiệt độ và các điều kiện khác. Khi nhiệt độ và pH thay đổi không đáng kể và nồng độ cơ chất tối ưu thì hoạt độ của Xaza chỉ phụ thuộc vào chất kìm hãm hay chất hoạt hóa có trong môi trường. Trong trường hợp này thậm chí thay đổi một lượng rất nhỏ các chất này cũng có ảnh hưởng lớn đến vận tốc phản ứng. b. Đối với một chuỗi phản ứng enzim: Đối với một hệ phản ứng enzim thì ngoài những nhân tố trên còn thêm những nhân tố phụ nữa. Vì mỗi phản ứng trong hệ còn phụ thuộc vào kết quả của những phản ứng còn lại. Giả sử có hệ phản ứng: Giả sử enzim Vaza rất nhạy cảm đối với sư thay đổi pH, còn sản phẩm Z cuối cùng là một chất axit. Ta sẽ thấy cùng với sự tăng hàm lượng Z thì độ axit của dung dịch tăng lên và ảnh hưởng đến hoạt độ của Vaza do đó vận tốc tạo thành X từ V bị giảm. Lượng X giảm thì Y và Z cũng giảm theo. Z giảm thì độ axit của dung dịch giảm. Độ axit giảm, lập tức tác dụng của Vaza lại tăng. Lương Z và độ axit tăng thì hoạt độ của Vaza lại giảm. Cuối cùng sẽ đạt đến trạng thái cân bằng bền. Như vậy, sự tạo thành Z là yếu tố điều chỉnh hoạt động của Vaza và ngược lại vận tốc tác dụng của Vaza lại quyết định lượng Z tạo thành. Kiểu điều chỉnh như thế người ta gọi là cơ chế phản hồi, cơ chế nuôi ngược. Hệ thống phản ứng có cơ chế nuôi ngược có thể biểu diễn như sau: (+H+) Vaza Xaza Yaza Có hai kiểu nối ngược. Nếu sản phẩm cuối cùng của phản ứng Z kìm hãm hoạt độ của Vaza, ta sẽ có nối ngược âm. Nhưng nếu sản phẩm cuối cùng Z làm giảm pH, lại hoạt hóa Vaza thì ta có nối ngược dương. Tuy nhiên nguyênn tắc chung của tất cả các phản ứng có nối ngược: vận tốc của phản ứng được điều chỉnh bằng sản phẩm không tham gia trực tiếp vào phản ứng đó. c. Điều chỉnh bằng vận tốc của phản ứng chậm nhất trong hệ: Chúng ta trở lại với hệ phản ứng enzim ở trên. Để đơn giản, chúng ta coi vận tốc của phản ứng trong điều kiện thuận lợi nhất là cực đại và dĩ nhiên sẽ khác nhau. Giả sử phản ứng V ® X = 100 đơn vị bất kỳ X ® Y = 10 đơn vị bất kỳ Y ® Z = 1 đơn vị bất kỳ Như vậy phản ứng xúc tác bởi Vaza 10 lần nhanh hơn phản ứng với sự tham gia của Xaza và 100 lần nhanh hơn phản ứng với sự xúc tác của Yaza. Ta dễ dàng thấy Vaza sản xuất ra X 10 lần lớn hơn lượng có thể sử dụng bởi Xaza, trong khi đó Xaza lại sản xuất ra Y 10 lần nhiều hơn lượng được sử dụng bởi Yaza. Vì trong quá trình phản ứng tạo thành một lượng dư rất lớn X và Y mà các enzim Xaza và Yaza không sử dụng hết. Như vậy vận tốc chuyển hóa V ® Z chỉ bị hạn chế bởi vận tốc phản ứng . Vậy vận tốc của hệ phản ứng enzim do vận tốc của phản ứng chậm nhất trong hệ quyết định d. Điều chỉnh do sự chuyển hóa năng lượng: Hoạt động sống của tế bào vi sinh vật thể hiện đầy đủ khi có năng lượng. Lúc đó, tế bào không những phải điều chỉnh các phản ứng cần năng lượng mà cả những phản ứng sản xuất ra năng lượng. Dự trữ năng lượng chủ yếu của tế bào được tập trung và kiểm tra ở trong ti thể nhờ có ATP tổng hợp được khi oxy hóa các chất trong mạch chuyển hydro. Như vậy, lượng ATP tích tụ được do kết quả của sự oxy hóa quyết định lượng năng lượng thu được bởi tế bào. Sự phân giải hợp chất cao năng đó thành ADP và phosphat vô cơ sẽ giải phóng ra năng lượng để chi dùng cho các quá trình trao đổi. Ti thể phải có một hệ thống kiểm tra nội tại riêng để đảm bảo cho được nhịp độ đốt cháy các “nhiên liệu”. Sơ đồ của hệ thống kiểm tra đó hay là sơ đồ các công đoạn trong quá trình oxy hóa có thể biểu diễn như sau: Các phản ứng chậm Cơ chất(dạng oxy hóa) Cơ chất(dạng khử) NAD – H2 NAD Xit.a3(dạng khử) Xit.a3(dạng oxy hóa) [O] H2O Mạch chuyển hydro Phản ứng chậm Các phản ứng nhanh Hình 2.1: Sơ đồ phosphryl hóa – oxy hóa e. Điều chỉnh bằng các yếu tố cấu trúc của tế bào: Các cấu tử dưới tế bào cũng có vai trò quan trọng trong viêc điều chỉnh các hoạt động của tế bào vi sinh vật như điều hòa tổng hợp các chất trao đổi và tích lũy năng lượng hữu ích. Người ta biết nhiều bào quan độc lập và màng đã tham gia trực tiếp vào nhiệm vụ điều chỉnh đó. Trong tế bào, nếu lượng ti thể gồm khoảng 500 – 1000 thì lượng riboxom có đến vài trăm nghìn và thay đổi phụ thuộc vào trạng thái vật lí của tế bào. Số lượng phân tử enzim trong tế bào có khoảng gần 1 tỉ. Song mỗi một bào quan chỉ chứa những enzim và cơ chất đặc hữu của mình. Cơ chất định vị trong một bào quan nào đó sẽ không đến được đối với những enzim tương ứng có trong những bào quan khác. Hoặc chẳng hạn các enzim thủy phân thường cư trú ở trong liboxom và chỉ trong trường hợp rất đặc biệt mới có thể thoát ra ngoài. Người ta cũng nhận thấy rằng, màng của tế bào cũng như các bào quan khác có khả năng chọn lọc rất cao. Màng có thể chỉ cho ion này đi vào mà không cho đi ra hoặc ngược lại. 2.4 Các chu trình lên men[15, 16] Lên men là quá trình trao đổi chất. Qua con đường trao đổi chất mà cung cấp năng lượng và nguyên vật liệu để tạo nên các cấu tử của tế bào. Trong trao đổi chất một số chu trình phản ứng có vai trò hết sức quan trọng. Trong số đó sơ đồ Embden – Meyerhof – Parnas và đặc biệt là chu trình Krebs có vị trí trung tâm. Vì những chu trình này đáp ứng được các yêu cầu về nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nguồn các chất khử là những yếu tố rất cần thiết để duy trì các hoạt động sống của tế bào. 2.4.1 Sơ đồ Embden – Meyerhof – Parnas: Chặng đường đi từ glucoza đến hợp chất C3 và đến axit piruvic được gọi là sơ đồ Embden – Meyerhof – Parnas hay là con đường fructoza – 1,6 – diphosphat. Cân bằng của quá trình: Glucoza ® 2piruvat + 2ATP + 2NADH(H+) Hình 2.2: Sơ đồ Embden – Meyerhof – Parnas 2.4.2 Chu trình pentozaphosphate: Ý nghĩa của chu trình này là ở chỗ cung cấp được nhiều NADPH2 (NADPH2 là chất cho electron, nghĩa là chất cung cấp năng lượng, mỗi phân tử bị oxy hóa tổng hợp được ba phân tử ATP) bằng một số phản ứng rất ít. Mỗi phân tử glucoza bị oxy hóa hoàn toàn đến CO2 và nước ở trong chu trình này tạo ra được 12 phân tử NADPH2. Như vậy về mặt năng lượng cũng xấp xỉ như oxy hóa glucoza qua piruvat với chu trình Krebs. Ý nghĩa của chu trình pentozaphosphat còn ở chỗ cung cấp cho các quá trình tổng hợp các chất đầu quan trọng như pentozaphosphat, eritrozaphosphat, aldehit 3-phosphatglixerinic. Các pentoza là những chất tiền thân cần thiết để tổng hợp các nucleotit và axit nucleic. Cân bằng vật liệu của chu trình: Glucoza-6-phosphat ® 1pentozaphosphat + 1CO2 + 2NADPH2. 2.4.3 Chu trình tricacboxylic (Krebs): a. Sơ đồ nguyên tắc làm việc của chu trình: 3 4 2 6 5 O2 O2 O2 O2 CO2 CO2 1 piruvic O2 CO2 (O2 chỉ các giai đoạn oxy hóa) 1 – axetyl CoA CH3COS.CoA 2 – axit oxalaxetic COOHCH2COCOOH 3 – axit xitric COOHCH2COH(COOH)CH2COOH 3a – axit izoxitric COOHCH(OH)CH(COOH)CH2COOH 4 – axit α-xetoglutaric COOHCH2CH2COCOOH 5 – axit suxinic COOHCH2CH2COOH 6 – axit fumaric COOHCH=CHCOOH 6a – axit malic COOHCHOHCH2COOH Hình 2.3: Sơ đồ nguyên tắc làm việc của chu trình Krebs Sau một vòng của chu trình, phân tử 1 bị đốt cháy đến CO2 và H2O, còn phân tử 2 thì được hồi phục. Chu trình được lập đi lập lại nhiều lần cho đến khi tất cả các phân tử piruvic có mặt đều bị oxy hóa đến CO2 và nước. Bốn giai đoạn oxy hóa sau [(3)®(4),(4)®(5),(5)®(6),(6)®(2)], không phải axetat bị oxy hóa mà là sản phẩm ngưng tụ của axetylCoA với axit oxalaxetic. Nằm trong các hợp chất như thế (axit xitric, axit izoxitric, ...) axit piruvic mới bị oxy hóa tuần tự cho đến khi chỉ còn axit oxalaxetic. Như vậy axit oxalaxetic đóng vai trò như một chất khơi mào phản ứng. Thiếu một chất bất kì trong các phẩm vật trung gian của chu trình thì hoạt động tiếp theo của chu trình sẽ ngừng trệ nếu như một chất khác của chu trình không được tái sinh với vận tốc bằng vận tốc mất đi của chất đầu. Thường axit oxalaxetic và axit malic tạo thành trong các phản ứng dưới đây được dùng để duy trì cân bằng trong chu trình: Phosphoenolpiruvic + CO2 axit oxalaxetic Phosphoenolpiruvic + CO2 + ADP axit oxalaxetic + ATP Axit piruvic + CO2 + NADPH2 axit malic + NADP b.Tác dụng của chu trình: Chu trình Krebs là một lò để thiêu cháy các bộ xương cacbon Qua sơ đồ trên ta thấy chu trình Krebs như một lò đốt thiêu cháy những hợp chất nhất định: hợp chất thành viên của của chu trình. Một chất nào đó có thể bị đốt cháy đến CO2 và H2O nếu nó có khả năng chuyển thành một chất bất kì trong sáu hợp chất kể trên. Muốn được oxy hóa trong chu trình, đường (gluxit) phải chuyển thành axit piruvic, axit béo (lipit) phải chuyển thành axetat hoặc axetylcoenzim A, các axit amin (protein) như glixin, alanin, glutamat, ... phải chuyển thành những chất tương ứng : glioxilat, piruvat, α-xetoglutarat. Rõ ràng chu trình Krebs là trung tâm của các quá trình trao đổi chất nói chung và lên men nói riêng. Chu trình Krebs là nguồn coenzim khử và nguồn năng lượng dự trữ to lớn Qua sơ đồ phản ứng, ta thấy khi oxy hóa axit piruvic đến CO2 và H2O, có năm giai đoạn tạo thành các coenzim khử : Oxy hóa axit piruvic thành axetylCoA và CO2 tạo thành 1 mol NADH2. Oxy hóa axit izoxitric thành α-xetoglutaric và CO2 tạo thành 1 mol NADH2. Oxy hóa axit α-xetoglutaric thành suxinylCoA và CO2 tạo thành 1 mol NADH2. Oxy hóa axit suxinic thành fumaric tạo thành 1 mol FADH2. Oxy hóa axit malic thành oxalaxetic tạo thành 1 mol NADH2. Trong chu trình Krebs không tổng hợp trực tiếp ra ATP mà hình thành ra năm phân tử NADH2 và FADH2. Khi oxy hóa một mol NADH2 thì tổng hợp lên được 3 mol ATP, còn một mol FADH2 chỉ tổng hợp được 2 mol ATP. Các coenzim khử được tạo thành trong chu trình còn dùng để khử các liên kết kép, các nhóm cacbonyl, imit, ... trong các phản ứng khử khác nhau cần thiết cho tế bào. Chu trình Krebs là nguồn cung cấp các bộ xương cacbon để tổng hợp nên các chất trao đổi cần thiết của tế bào Chúng ta đều biết các axit amin đều bắt nguồn từ những chất tiền thân. Những chất tiền thân này thường là những chất thành viên của chu trình. 2.5 Điều kiện quá trình lên men:[15, 16] 2.5.1 Các cấu tử của môi trường lên men: a.Nguồn gluxit: Nguồn gluxit cần thiết cho vi sinh vật để tạo năng lượng cung cấp khung cacbon để sinh tổng hợp các cấu tử cho tế bào. Trong quá trình sống, vi sinh vật cần có năng lượng để duy trì các hoạt động như: Duy trì hệ thống khi nhiệt độ môi trường xung quanh cao hơn. Sinh tổng hợp các chất xây dựng tế bào. Nếu hệ thống tạo khí lớn hơn yêu cầu cần thoát khí lúc này vi sinh vật đòi hỏi phải có năng lượng Vi sinh vật cần có năng lượng để đảm bảo độ bền cơ học cho các tế bào vi sinh vật ở trạng thái trương. Năng lượng cần thiết cho sự chuyển động của các tiên mao, sợi nấm. b.Phosphat: Phosphat có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ thống sinh học. Dạng sử dụng thường là phosphat kali, phosphat amon hoặc có thể dùng lượng nhỏ dưới dạng hợp chất hữu cơ. Hàm lượng môi trường thường là 0,1 – 0,5%. c.Nitơ: Nitơ là thành phần nguyên tố tạo nên axit amin, protein, axit nucleic và các chất khác. Dạng thường dùng là amoni (ion) hoặc nitrat hoặc hợp chất nitơ có nguồn gốc hữu cơ khác. d.Các nguyên tố khác: Các nguyên tố vi lượng như Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, Si, ... rất cần thiết cho đời sống vi sinh vật. Các nguyên tố khoáng tham gia vào cấu trúc enzim và là yếu tố sinh trưởng của vi sinh vật. e.Vitamin: Vitamin rất cần thiết cho vi sinh vật khi lên men như Vitamin B1, B2, PP, B6, ... Các Vitamin tham gia vào cấu trúc các enzim, nhất là các enzim tham gia trong các chu trình và quá trình oxy hóa Bitotin (Vitamin H) rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. 2.5.2 Các tác nhân bên ngoài: a. Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến cấu trúc của protein, enzim, do đó ảnh hưởng đến hoạt động của enzim và ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Ngoài ra nhiệt độ môi trường lên men còn có tác dụng lên các phương diện sau: Tốc độ tạo thành và giải phóng sản phẩm. Trạng thái vật lí của hệ thống như sự hợp thể hoặc sự tạo thành hạt của hệ sợi. Đảm bảo lọc chất lỏng khỏi sinh khối dễ dàng hơn. Nhiệt độ còn điều hòa chất lượng của nước giải khát, bia trong quá trình lên men (len men bia ở nhiệt độ thấp). Do nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật nên trong thực tế có thể từ một chủng vi sinh vật nếu điều kiện nhiệt độ lên men khác nhau sẽ cho sản phẩm khác nhau. b.Ảnh hưởng của pH môi trường: pH của môi trường ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Do vậy pH ảnh hưởng lớn đến quá trình lên men. 2.5.3 Tác nhân gây lên men - vi sinh vật: Vi sinh vật là nhân tố chủ yếu gây lên men, song khả năng lên men mỗi loại vi sinh vật là khác nhau, ngay cả trong cùng một loại vi sinh vật cũng không giống nhau nếu điều kiện lên men khác nhau. Do vậy trong công nghiệp cần tuyển lựa những chủng có hệ enzim đặc trưng cho quá trình sản xuất nào đó. Vi sinh vật thường sử dụng gây lên men là nấm men, nấm mốc, vi khuẩn. Chương 3: GIỚI THIỆU MỘT SỐ SẢN PHẨM LÊN MEN TRUYỀN THỐNG 3.1 Đặc điểm chung của thực phẩm lên men truyền thống:[1] - Các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống là một trong các loại sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới. Đó là một loại thực phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc. Công nghệ sản xuất các sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống được thực hiện của cả dân tộc và được truyền đạt từ đời này qua đời khác. - Hiện nay, các sản phẩm lên men truyền thống đã không còn được sản xuất hoàn toàn theo phương pháp thủ công nữa. Cùng với sự phát triển của xã hội, các công nghệ sản xuất các sản phẩm lên men truyền thống cũng được cải tiến để đáp ứng không chỉ về chất lượng và còn đáp ứng cả về số lượng cho người tiêu dùng. Chính vì thế các sản phẩm lên men truyền thống đã đi từ sản xuất thủ công chuyển dần sang sản xuất hàng loạt theo phương pháp công nghiệp. - Công nghệ và sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống có tính phổ cập khá nhanh trong mấy năm gần đây. Do sự giao lưu văn hóa dân tộc khác nhau đã xích lại gần nhau hơn trong việc tìm hiểu văn hóa riêng của nhau. Trong đó có cả các mặt hàng thực phẩm lên men. - Đặc điểm cuối cùng của các sản phẩm lên men truyền thống và công nghệ sản xuất ra chúng là sẽ mãi mãi trường tồn cùng dân tộc, nó sẽ được cải tiến, hoàn thiện dần theo thời gian. 3.2 Thực phẩm lên men bởi nấm mốc:[1, 3, 16] 3.2.1 Vai trò của nấm mốc trong lên men thực phẩm: a.Sinh tổng hợp enzim: Các enzim này tham gia thủy phân protein, gluxit, chất béo thành các phân tử nhỏ hơn, đồng thời tạo nên sự biến đổi đặc tính thực phẩm như mùi vị, màu sắc, cấu trúc, tạo nên sản phẩm cuối cùng phù hợp người tiêu dùng. b.Đặc điểm phát triển của nấm mốc: Các loại nấm mốc thường phát triển mạnh mẽ trên bề mặt thực phẩm, tiết ra enzim tham gia làm biến đổi cơ chất trong thực phẩm tạo thành các sản phẩm đặc trưng cho mùi vị của sản phẩm. c.Sinh tổng hợp chất màu: Trong quá trình phát triển trên bề mặt thực phẩm, nấm mốc còn sinh ra hợp chất mang màu, chẳng hạn màu đỏ monascorubin (C12H24O5), monascoflavin (C17H22O4) màu vàng. d.Bảo vệ sản phẩm: Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, một số nấm mốc sinh ra độc tố Flatoxin và Mycotoxin. Trong quá trình sử dụng nấm mốc vào lên men sản xuất thưc phẩm, chỉ cho phép sử dụng các loại nấm mốc không có khả năng sinh độc tố. Tuy vậy, độc tố lại sinh ra do các vi sinh vật khác có sẵn trên thưc phẩm. Một số loại nấm mốc không sinh độc tố nhưng có khả năng ức chế sự phát triển, sự sinh bào tử và sinh độc tố của các vi sinh vật này. 3.2.2 Một số thực phẩm lên men bởi nấm mốc: như Tempe,Tauco, chao, ... Tempeh: Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng nhiều và phổ biến nhất là đậu nành. Tempeh cung cấp một nguồn đạm thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hoá và an toàn. Nó thường được ăn chỉ khi sau khi nấu hoặc rán, chiên trong dầu. Mốc chức năng chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lấn át các dòng tạm nhiễm khác như Aspergillus spp. Hoạt động enzim của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzim thuỷ phân chất béo, enzim thuỷ phân các hơp chất các-bon và phosphatase. Nhờ hoạt động của các enzim này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự tiêu hoá dễ dàng. 3.3 Thực phẩm lên men bởi vi khuẩn:[1, 3, 16] 3.3.1 Vai trò của vi khuẩn trong lên men thực phẩm a.Vai trò sinh khối và tạo sản phẩm lên men nhờ quá trình trao đổi chất: Một trong những chứa năng quan trọng của vi khuẩn là sinh khối và sản sinh sản phẩm lên men nhờ quá trình trao đổi chất - vi khuẩn hấp thu các chất dinh dưỡng có phân tử lượng nhỏ như axit amin, peptit ngắn, axit béo, vitamin...và các đường lên men. Trong tế bào của vi khuẩn quá trình trao đổi chất tạo thành sản phẩm lên men và thải vào môi trường. Tùy thuộc vào sản phẩm nào chiếm ưu thế ta co quá trình lên men sản phẩm đó. Các quá trình lên men trao đổi chất cũng tham gia tạo mùi vị tạo đặc trưng cho sản phẩm b.Tạo hương cho sản phẩm lên men: Một số vi khuẩn trong quá trình hoạt động ngoài vai trò lên men tạo sản phẩm đặc trưng còn có vai trò tạo hương thơm cho nhiều loại sản phẩm. Các chất hữu cơ tham gia vào quá trình tạo thành hương thơm cho thực phẩm như: các axit bay hơi, các amin bay hơi c.Khả năng sinh độc tố: Một số loại vi khuẩn có khả năng sinh ra độc tố cho sản phẩm, cho nên trong quá trình lên men chỉ cho phép sử dụng các chủng vi khuẩn không sinh ra độc tố. Trong một số trường hợp, trên môi trường lên men có nhiều loại vi khuẩn, có loại sinh độc tố, có loại không sinh độc tố nhưng người ta thấy hàm lượng độc tố hầu như không có, đó là hiện tượng ức chế đối kháng d.Đặc tính phát triển: Vi khuẩn có đặc tính khác với nấm mốc là chúng sinh trưởng phát triển ngay trong lòng môi trường lên men 3.3.2 Một số thực phẩm lên men bởi vi khuẩn:[1, 3, 16] a.Muối chua rau quả (rau quả lên men): Muối chua rau, quả là một quá trình lên men lactic mà nguyên liệu là rau, quả, đường, muối và gia vị. Các sản phẩm muối chua tiêu biểu: bắp cải, cải bẹ, cà, cà chua, dưa leo... Tác nhân vi sinh vật là vi khuẩn latic. b.Thủy sản lên men: Nguyên liệu để sản xuất sản phẩm thủy sản lên men phần lớn là cá nhỏ, tôm nhỏ. Thủy sản lên men được chế biến theo phương pháp: trộn thủy sản với muối sau đó cho lên men. Sản phẩm thủy sản lên men thường có dạng chế phẩm nước sốt hoặc paste. Dạng sản phẩm paste như mắm ruốc, mắm tôm, mắm nêm... Dạng sản phẩm nước sốt như nước mắm. Nước mắm là sản phẩm lên men từ các loại cá, là sản phẩm truyền thống của dân tộc Việt Nam. Khi xác định hệ vi sinh vật trong nguyên liệu cũng như hệ vi sinh vật trong khối cá đang lên men người ta thấy có mặt rất nhiều vi khuẩn thuộc Bacillus subtilis, Bacillus mensentericcus, E.coli, Pseudomonas sp, Clostridium sp... c.Nem chua: Nem chua là một sản phẩm lên men từ thịt tươi được sản xuất và tiêu thụ ở nhiều ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Đây là một sản phẩm được sản xuất hoàn toàn thủ công Bản chất của lên men là một quá trình chuyển hóa đường (cho thêm vào khi chế biến) thành axit lactic nhờ hoạt động của vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus và Microccocus. Trong đó nhiều nhất và đóng vai trò quan trọng nhất là Lactobacillus. 3.4 Thực phẩm lên men bởi nấm men:[16] 3.4.1 Vai trò của nấm men: Cũng như vi khuẩn sản phẩm lên men nhờ quá trình trao đổi chất của nấm men trong môi trường chứa đường lên men và những chất dinh dưỡng cần thiết khác. 3.4.2 Một số sản phẩm lên men bởi nấm men: Đặc trưng sự lên men bởi nấm men là sản xuất rượu và bia. 3.5 Thực phẩm lên men bởi nấm mốc và nấm men:[16] Đặc trưng cho thực phẩm lên men bởi nấm mốc và nấm men là Ragi, một phụ gia thực phẩm. Các nấm mốc phân lập được từ Ragi là Mucoz, Rhizopus. Các nấm men phân lập được từ Ragi là Candida, Endo mycopsis và Saccharomyces. 3.6 Thực phẩm lên men bởi vi khuẩn và nấm men:[3,16] 3.6.1 Rượu vang: Rượu vang là đồ uống chứa alcolhol và các axit hữu cơ, trong đó chủ yếu là axit latic. Ngoài ra rượu vang còn chứa một số các chất dinh dưỡng khác như Vitamin, khoáng, chất mùi và màu. Rượu vang được sản xuất bằng phương pháp lên men dịch quả với tác nhân vi sinh vật là nấm men và vi khuẩn. Các loại vi sinh vật được sử dụng lên men rượu vang như: Saccharomyces cerevisiae và Leuconostoc ocnos. Hai loại vi sinh vật này có vai trò tạo ra các sản phẩm như alcolhol và axit lactic. 3.6.2 Nước chiết thực vật lên men: Sản phẩm nước chiết thực vật lên men được phổ biến trên thế giới. Ở một số nước dùng nước chiết cây cọ lên men thành sản phẩm đồ uống có alcolhol. Các loại vi sinh vật tìm thấy trong sản phẩm này là Zymomonas spp, vi khuẩn lactic và số lượng nhỏ nấm men. 3.7 Thực phẩm lên men nhờ nấm mốc và vi khuẩn:[16] Đặc trưng cho thực phẩm lên men bởi nấm mốc và vi khuẩn là tương, miso, ... Các quá trình xảy ra khi lên men: Thủy phân protein của đậu nành thành các sản phẩm đơn giản dưới tác dụng của hệ enzim của nấm mốc. Thủy phân tinh bột thành glucoza dưới tác dụng của a,β amylaza và glucoamylaza của nấm mốc. Lên men latic, axetic do hệ vi khuẩn có trong đậu nành. 3.8 Các sản phẩm lên men từ đậu nành và các hạt ngũ cốc: 3.8.1 Khái quát chung về đậu nành:[1, 7, 8] 3.8.1.1 Giới thiệu về cây đậu nành: Đậu nành là một loại cây trồng ngắn ngày, có nhiều tác dụng như: cung cấp thực phẩm cho người, nguyên liệu cho công nghiệp, thức ăn cho gia súc, nông sản xuất khẩu. Cây đậu nành với tên khoa học là Glycin max(L) Merrill, là một trong số cây trồng có lịch sử lâu đời nhất của loài người. Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda(1993) và về sau nhiều nhà khoa học khác cũng đã thống nhất rằng, đậu nành có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc) xuất phát từ một loại đậu nành dại, thân mảnh, dạng dây leo, tên khoa học G. soja Sieb & Zucc (t. Hymovits, 1970). Trong một số công trình nghiên cứu, các nhà khoa học dùng tên G.usuriensis để thay cho tên trên. Từ Trung Quốc, đậu nành lan truyền dần khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản, vảo khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu nành đã được đưa vào Triều Tiên và sau đó được phát triển sang Nhật. Đến giữa thế kỉ 17, đậu nành mới được nhà thực vật học người Đức Engelbert Caempfer đưa về Châu Âu và đến năm 1954 đậu nành mới được du nhập vào Mỹ. Đậu nành là cây lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất của thế giới, đứng hàng thứ tư sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Năm1994, sản lượng bột protein và bột lấy dầu từ đậu nành trên toàn thế giới tương ứng là 80,2 triệu tấn và 78,1 triệu tấn. Do khả năng thích ứng khá rộng nên nó được trồng khắp năm châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất là châu Mỹ 73,03% tiếp đến là châu Á 23,15%… Hằng năm trên thế giới trồng khoảng 54 – 56 triệu ha đậu nành (1990 – 1992) với sản lượng khoảng 13–114 triệu tấn. Thời kỳ năm 1990 – 1992 so với thời kì từ năm 1979 – 1981, sản lượng đậu nành đă tăng lên 26,1% còn diện tích sử dụng tăng 8,8% (FAO, 1992). Hiện nay 88% sản lượng đậu nành thế giới được tập trung ở 4 quốc gia: Mỹ (52%), Brazil (17%), Argentina (10%), Trung Quốc (9%). Phần còn lại phân bố ở các nước sau: Canada, Ấn Độ, Indonesia, Nhật, Bắc & Nam Triều Tiên, Mexico, Paraguay, Rumani và Nga. 3.8.1.2 Giá trị dinh dưỡng của đậu nành: Đậu nành được nhiều nhà khoa học xem như là chìa khóa để giải quyết nạn thiếu protein trong dinh dưỡng của con người. Theo Đỗ Tất Lợi, đậu nành còn được dùng để chữa bệnh tiểu đường, suy nhược thần kinh, suy nhược dinh dưỡng … Chất lượng đậu nành của nước ta tương đối tốt, protein khoảng 38–40%, trọng lượng 1000 hạt: 90–120g, hạt vàng hoặc xanh, rốn hạt nâu hoặc đen. Một số giống mới chọn gần đây có cải thiện hơn về chất lượng: hạt vàng, tròn, rốn trắng, ít nứt, trọng lượng 1000 hạt: 180–270g protein 43–47%. Bảng 3.1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g hạt đậu nành (theo Sinha Sk, 1979): Loại hạt Calorie Protein (g) Lipid (g) Glucid (g) Xơ (g) Tro (g) Hạt xanh 436 40,8 17,9 35,8 6,0 5,3 Hạt trắng 444 39,0 19,6 35,5 4,7 5,5 Hạt vàng 439 38,0 17,1 40,3 4,9 4,6 Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều. Hạt đậu nành có ba bộ phận: Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt. Phôi chiếm 2%. Tử diệp chiếm 90%. Bảng 3.2: Thành phần hóa học trong các thành phần của hạt đậu nành (theo Kitrigin, 1981): Thành phần hạt Lipid % Protein % (Nx6,25) Hydrate cacbon % Tro % Tử diệp 23 43 29,0 5 Phôi 11 41,1 43,0 4,4 Vỏ hạt 1 8,8 86,0 4,3 Thành phần hóa học của đậu nành thay đổi tùy loại đậu, thời tiết, đất đai, điều kiện trồng trọt. Có loại chứa hàm lượng protein lớn hơn 50%, lipid lớn hơn 22%. * Protein và thành phần acid amin : Hàm lượng protein tổng dao động trong hạt đậu nành từ 29,6–50,5%, trung bình là 36–40%. Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein): albumin (6–8%), globulin (25–34%), glutelin(13–14%), prolamin chiếm lượng nhỏ không đáng kể. Về giá trị protein, đậu nành đứng hàng đầu về đạm nguồn gốc thực vật và không những về hàm lượng protein cao mà cả về chất lượng protein. Protein đậu nành dễ tan trong nước và chứa nhiều acid amin không thay thế như lysin, tryptophan. Trừ methionin và cystein hơi thấp còn các acid amin khác của đậu nành có thành phần giống thịt. Bảng 3.3: Thành phần các acid amin trong protein đậu nành: Loại acid amin Phần trăm% Isoleucine 1,1 Leucine 7,7 Lysine 5,9 Methionine 1,6 Cystein 1,3 Phenylalanine 5,0 Threonine 4,3 Tryptophane 1,3 Valine 5,4 Histidin 2,6 * Lipid : Chất béo trong đậu nành dao động từ 13,5–24%, trung bình 18%. Chất béo đặc trưng chứa khoảng 6,4–15,1% acid béo no (acid stearic, acid acid archidonic) và 80–93,6% acid béo không no (acid enoleic acid linolenic, acid linolenic, acid oleic). Trong dầu đậu nành còn chứa một lượng nhỏ phosphatid, đặc biệt nhiều lecinthin có tác dụng làm cơ thể trẻ lâu, sung sức, tăng trí nhớ, tái sinh mô, cứng xương, tăng sức đề kháng. * Carbohydrates: Glucid trong đậu nành khoảng 22–35,5%, trong đó 1–3% tinh bột. Carbohydrates được chia làm 2 loại: loại tan trong nước chiếm khoảng 10% và loại không tan trong nước. Bảng 3.4: Thành phần carbohydrat trong đậu nành : Loại Phần trăm % Cellulose 4,0 Hemicellulose 15,4 Stachyose 3,8 Rafinose 1,1 Saccharose 5,0 Các loại đường khác 5,1 * Chất tro: Chất tro trong đậu nành từ 4,5–6,8%. Nếu tính theo phần trăm chất khô toàn hạt thì thành phần tro như sau : P2O5 0,6–2,18% SO3 0,41–0,44% K2O 1,91–2,64% Na2O 0,38% CaO 0,23–0,63% Cl 0,025% MgO 0,22–0,55% Chất khác 1,17% Ngoài ra còn có các nguyên tố khoáng khác: Al, Fe, I, Mn, Cu, Mo… * Vitamin: Đậu nành chứa nhiều vitamin khác nhau, trừ vitamin C và vitamin D. Bảng 3.5: Thành phần vitamin trong đậu nành Vitamin Hàm lượng Vitamin Hàm lượng Thiamin 11–17,5 % Inociton 2300 mg% Riboflavin 3,4–3,6 % Vitamin A 0,18–2,43 % Niacin 21,4–23 mg/g VitaminE 1,4 mg% Pyrydin 7,1–12 mg/g Vitamin K 1,9 mg% Biotin 0,8 mg/g Vitamin B1 0,54 mg% A.patothentic 13–21,5 mg/g Vitamin B2 0,29 mg% A.folic 1,9 mg/g Vitamin PP 2,3 mg% * Một số enzyme trong đậu nành: Urease: chống lại sự hấp thụ các chất đạm qua hàng ruột do đó không nên ăn đậu nành sống. Lipase: thủy phân glyceric tạo thành glycerin và acid béo. Phospholipase: thủy phân ester của acid acetic. Amylase: thủy phân tinh bột, b-amylase có trong đậu nành với số lượng khá lớn. Lipoxygenase: xúc tác phản ứng chuyển H2 trong acid béo. 3.8.2 Các sản phẩm chế biến từ đậu nành:[1, 5, 7, 8] 3.8.2.1 Đậu phụ: Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành. Đậu phụ không chỉ được sản xuất ở Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản và các nước Đông Nam Á và cả ở những nước ở Châu Âu như Hà Lan, Pháp... Đậu phụ có nhiều dạng khác nhau, chính vì thế mà cũng có tên gọi khác nhau. Tất cả các dạng và tên gọi khác nhau trên đều chia làm ba loại: - Loại mềm. - Loại cứng - Loại đậu phụ lụa. 3.8.2.2 Chao: Chao là sản phẩm lên men được sản xuất từ đậu nành. Vì qua quá trình lên men, nên chao có giá trị dinh dưỡng và hệ số tiêu hóa cao hơn nhiều so với đậu phụ. Chao có nhiều sản phẩm khác nhau như chao nước, chao đặc, chao bánh và chao bột. Do quá trình lên men, các enzim của vi sinh vật tham gia thủy phân protein thành các axit amin, lipit thành các este thơm nên chao có giá trị dinh dưỡng cao và có mùi vị rất đặc trưng. 3.8.2.3 Nước chấm: Nước chấm là tên chung chỉ các loại gia vị dạng lỏng chứa chủ yếu là axit amin, muối ăn và hương vị đặc trưng. Nước chấm được sản xuất từ các nguyên liệu giàu protein và bằng hai phuong pháp: - Vi sinh vật. - Hóa học. 3.8.2.4 Tương: Tương là một sản phẩm lên men từ các nguồn nguyên liệu giàu gluxit và giàu đạm. Đây là một dạng thực phẩm cổ truyền của Việt Nam. Tương là một loại thực phẩm gắn liền với văn hóa dân tộc ta từ xưa cho đến nay và mãi mãi về sau. Đã có những địa phương làm tương nổi tiếng như Bần Yên Nhân (Hưng Yên), Cự Đà (Hà Đông) và Nam Đàn (Nghệ An). 3.8.2.5 Hishiho miso: một loại miso - Tên chung: MISO ngọt. - Tên địa phương Nhật: Hishiho miso. - Đặc tính vật lí: màu hồng vàng, vị ngọt hơi mặn và vị thịt đặc trưng. - Vi sinh vật: Aspergillus oryzae, Pediococars halophilus, Saccharomycer rouxii, Streptococcus sp. - Thời gian bảo quản và sử dụng là 1 – 2 tháng ở 200C. - Hiện nay, Nhật sản xuất 80 – 90% bằng quy mô công nghiệp với số lượng 60.000 tấn/năm 3.8.2.6 Hama natto: - Tên chung: Natto đậu nành. - Tên địa phương Nhật: Hama natto. - Đặc tính vật lí: Thể rắn, màu đen và có vị rất mặn. - Vi sinh vật: Apergillus oryaze, Saccharomyces rouxii, Pediococcus halophilus, A. sojae.. - Sản xuất công nghiệp 90%. Chương 4: ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT DÙNG TRONG LÊN MEN ĐẬU NÀNH 4.1 Vi sinh vật thường có trong lên men đậu nành: Thành phần chính của đậu nành là protein, gluxit nên trong lên men đậu nành chủ yếu là các quá trình thủy phân protein, gluxit thành các phân tử nhỏ hơn dưới tác dụng của các enzim. Các enzim này chủ yếu do các nấm mốc sinh tổng hợp. Hai enzim chủ yếu là amylaza và proteaza: - Amylaza thủy phân tinh bột đường và các dextrin có phân tử lượng nhỏ. - Proteaza thủy phân protein thành các axit amin và các peptit có phân tử lượng nhỏ. Các loài nấm mốc: Mucor, Aspergillus, Rhizopus thường có hoạt tính amylaza và proteaza cao, phát triển nhanh nên thường được dùng trong các sản phẩm lên men đậu nành. Ngoài ra, trong quá trình lên men đậu nành còn có các vi sinh vật sản sinh sản phẩm lên men nhờ quá trình trao đổi chất. Các vi sinh vật này thường là vi khuẩn, vi khuẩn hấp thu các chất dinh dưỡng có phân tử lượng nhỏ như axit amin, axit béo, peptit ngắn, các đường lên men và tạo thành sản phẩm lên men thải vào môi trường. Điển hình như vi khuẩn lactic chuyển hóa đường thành axit latic, kết quả làm cho thực phẩm có vị chua của axit latic. Một số vi khuẩn khác qua quá trình trao đổi chất tạo hương cho sản phẩm. Trong quá trình lên men truyền thống các sản phẩm từ đậu nành có giai đoạn ngâm nước đậu. Trong nước đậu có vi khuẩn Bacillus subtilic phát triển, vi khuẩn này có tính kháng khuẩn nên gây ức chế các vi sinh vật có hại trong sản phẩm. Tóm lại, trong lên men đậu nành, vi sinh vật chủ yếu là nấm mốc và vi khuẩn. Nấm men thì thường được dùng trong các thức ăn nhanh và nước giải khát có cồn. Các sản phẩm lên men truyền thống từ đậu nành ở Việt Nam là: tương, nước chấm và chao. 4.2 Vi sinh vật trong sản xuất tương:[1, 4, 5, 7, 16] Để làm mốc tương trước đây người ta vẫn nhờ vào các bào tử nấm mốc có trong không khí, đất, nước hoặc trong các dụng cụ nhiễm vào khối bột và phát triển. Các nghiên cứu các loại mốc tương này, có ít nhất 28 loài nấm mốc khác nhau, thuộc 11 giống, 2 lớp của hệ thống phân loại. Những loại nấm mốc này đều thuộc loại hoại sinh. Trong hệ nấm mốc 10 loài sau thường gặp với số lượng lớn trên mốc tương : Mucor mucode, M.rouxii, Rhizopus nigricans, Aspergillus oryzae, A.flavus, A.niger, Penicillum prolatum, P.expansum, Monilia sitophila, Trichoderma lignorum ... Trong quá trình ủ mốc thủ công, sau khi ủ 1,5-2 ngày ta thấy trên xôi bắt đầu mọc mốc trắng, xám nhạt. Đó là hệ sợi của các loại nấm mốc khác nhau. Khoảng một ngày sau bào tử nấm mốc trở nên có màu. Qua màu sắc này, bằng mắt thường, ta có thể phân biệt những loài nấm mốc nào đã phát triển. Mốc đen xám với hệ sợi như mạng nhện là do Mucor, Rhizopus, Syneephalastrum. Mốc đen hoặc đen nâu là do Aspergillus niger. Mốc xanh chủ yếu do Penicillum và Trichoderma lignorum. Mốc đỏ gạch là Monilia sitophila. Những loại mốc đen đỏ này đều không thích hợp cho sản xuất tương. Mốc tương thích hợp thì cần các yêu cầu : phát triển nhanh, có hoạt tính amylase và protease cao, màu sắc đẹp, không cho mùi mốc mạnh, không hình thành độc tố và các chất kháng sinh có hại. Thì người ta thấy rằng chủng nấm mốc Aspergillus oryzae đáp ứng được những điều này. Người ta còn gọi loại mốc này là mốc vàng hoa hòe hay hoa cau. Ngoài ra trong sản xuất tương, còn có sự xuất hiện của vi khuẩn Bacillus subtilic trong giai đoạn ngâm nước đậu. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilic: - Vi khuẩn Bacillus subtilic là một loài thuộc chi Bacillus, thuộc họ Bacillacaea. - Bacillus subtilic là trực khuẩn Gram dương có kích thước 2-3 x 0,7-0,8 µm, nội bào tử ở trung tâm có kích thước 1,5-1,8 x 0,8µm. - Ở điều kiện 100oC, bào tử của Bacillus subtilic chịu được 180 phút, có tính ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ. - Bao nhầy của Bacillus subtilic cấu tạo bởi polipeptit, chủ yếu là axit poliglutamic. - Tiên mao của Bacillus subtilic mọc khắp xung quanh bề mặt tế bào. - Ngoài những đặc trưng trên, Bacillus subtilic có cấu tạo, đặc điểm như của một vi khuẩn đã trình bày ở 1.3.1. 4.3 Vi sinh vật trong sản xuất nước chấm:[1] Trong sản xuất công nghiệp, điều cần thiết phải tạo được giống vi sinh vật thuần chủng. Giống vi sinh vật đưa vào sản xuất phải đảm bảo các điều kiện sau: - Có ảnh hưởng tốt đến sự tạo hương. - Có hoạt lực proteaza cao. - Không được chứa độc tố Aflatoxin. Giống nấm mốc dùng trong sản xuất nước chấm có thể là: A. Oryzae, A. Sojae, A. teriol, A. mellieus, A. niger, A. ochracus ... Đặc điểm của Apergillus oryzae:[17, 28, 30] - Cuống nấm không có vách ngăn, sợi nấm có vách ngăn. Chỗ phình ra của cuống có các tế bào hình chai. Lúc tế bào còn non thì các tế bào hình chai này nhìn thấy rỏ, lúc tế bào già thì tế bào hình chai bắn ra mọi nơi, chỉ còn lại cuống phình to. - Nấm đa bào, bào tử hở. - Khuẩn lạc trên môi trường Czapek (nhiệt độ nuôi cấy 270C, 10 ngày tuổi) có đường kính 5 – 6 cm, màu lục, vàng lục, lục nâu sau chuyển thành nâu lục, nâu. - Khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia tỏa tròn, phần lớn 150 – 300 đến 400 – 500 mm đường kính. - Giá bào tử trần nhẵn hoặc ráp, thường dài 1,0 – 2,5 cm, có thể tới 4 – 5 cm. Bọng đỉnh giá hình gần cầu, 40 – 50 mm đường kính, hoặc mang cuống thể bình và thể bình, hoặc chỉ mang thể bình. - Cuống thể bình 4-5 x 12-15 mm. Thể bình mọc trực tiếp trên bọng đỉnh giá 3-5 x 12-15 mm, thể bình mọc trên cuống thể bình 3,0-3,5 x 8-10 mm. - Bào tử trần phần lớn hình cầu, đôi khi hình elip 4,5 – 7,0 mm đường kính hoặc 8 – 10 mm trục lớn, nhẵn hoặc ráp, có gai mịn. Hình 4.1: Khuẩn lạc Aspergillus oryzae Hình 4.2: Apergillus oryzae Các điều kiện nuôi cấy A.oryzae như sau : - Độ ẩm môi trường là khoảng 55-58% thích nhất cho sự hình thành enzyme. Độ ẩm cho sự hình thành bào tử là khoảng 45%. Cần giữ cho độ ẩm môi trường không bị giảm . Độ ẩm tương đối của không khí từ 80% trở lên đến bão hoà đều thích hợp cho nấm mốc . - Ảnh hưởng không khí : A.oryzae là sinh vật hoàn toàn hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi có đầy đủ oxi. Để đáp ứng điều kiện này môi trường nuôi phải xốp, rải thành lớp không dày quá 2,5-3 cm, phòng nuôi phải thoáng . - Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho mốc phát triển và hình thành enzyme là khoảng 28-320C. Nhiệt lượng do nấm mốc toả ra mạnh nhất là từ giờ thứ 14 - 19 . Do nhiệt môi trường toả ra có thể lên tới 400C, cần giữ nhiệt độ từ 28-320C. - Thời gian nuôi mốc hầu hết các chủng A.oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 30-36 rồi sau đó cực đại protease từ giờ thứ 36-40. Thời gian nuôi mốc giống thường hết 60-70h . - pH : thích hợp cho A.oryzae là môi trường axít yếu 5.5 -6.5. Các môi trường từ cám gạo ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên không cần điều chỉnh . Trong tế bào của Aspergillus oryzae có chứa ít nhất là 23 enzim: α – Amilaza, β – Amilaza, Maltaza, Lactaza, Proteaza, Peptidaza, Dipeptidaza, Renin, Pectinaza, Pectozanaza, Lipaza, Xellulaza, Pirophosphataza, Phosphomonoesteraza, Phophodiesteraza, Tannaza, Catalaza, Nucleaza, Fitaza, Trehalaza, Amidaza, Xitaza, Sulfataza. (theo Tauber 1949) 4.4 Vi sinh vật trong sản xuất chao: [1, 4, 5, 18] Giống tốt nhất trong sản xuất chao là Actinomucor elegans. Việc chọn giống để sản xuất chao rất quan trọng. Tiêu chuẩn đối với một chủng vi sinh vật để sản xuất chao như sau: - Khuẩn ty thể của nấm phải tròn, bóng, có màu trắng hoặc màu hơi vàng để chao sản xuất ra có màu đặc trưng. - Cấu trúc của sợi nấm phải chặt, dày, tạo một lớp màng vững chắc trên mặt bánh đậu để giữ được hình dạng ban đầu. - Không tạo ra mùi vị khó chịu do nấm bị nhiễm. - Tạo được enzyme có hoạt tính thủy phân đạm cao. Vì thế muốn chao có chất lượng tốt, sản phẩm ổn định, trong sản xuất phải có vi sinh vật thuần chủng và tạo các điều kiện tối thích như nhiệt độ, độ ẩm, môi trường, pH, … để phát huy hết tính ưu việt của chúng. Từ lâu người ta cho rằng sự lên men chao là một hiện tượng tự nhiên. Nhưng từ năm 1929, người ta tin sự lên men này là do vi sinh vật. Wai (1929) đã phân lập được một loại mốc thuộc dòng Mucor , và ông đặt tên là Mucor sufu (mốc chao). Ông tin rằng mốc này do nguồn gốc rơm rạ mà ra, vì người ta thường dùng rơm rạ để ủ chao. Nhìn chung, sợi nấm của giống Mucor dày hơn của giống Rhizopus. Vì thế, giống Mucor tạo một lớp màng dày và bám chặt vào bề mặt chao. Tuy nhiên, nhiệt độ phát triển của Rhizopus khoảng 12°C, ở nhiệt độ này, vi khuẩn khó phát triển. Còn nhiệt độ phát triển của Mucor khoảng 15–20°C. Wai (1968) cho rằng loài Actinomucor elegans được sử dụng rộng rãi nhất và là một trong những loài tốt nhất cho việc sản xuất chao. Ngoài ra còn có các loài M. hiemalis, M. silvaticus, M. praini. Một vấn đề của các nhà sản xuất hiện nay khi sử dụng Actinomucor repens (elegans) là khi thời tiết nóng lên (nhất là vào mùa hè) thì các hoạt động của vi sinh vật này bị ức chế, gây ảnh hưởng đến sản xuất. Tuy nhiên, một tiến sĩ Trung Quốc là Bei–Zhong Han, đã tìm ra rằng Rhizopus oligosporus lại hoạt động bình thường ở mức nhiệt độ cao như thế. Tuy nhiên, sản phẩm chao sẽ có màu xám hơn. Đặc điểm của Actinomucor elegans:[25, 26, 27] - Actinomucor elegans được tìm thấy khắp trên thế giới, nhưng được tìm thấy lần đầu tiên ở trong các chất nền tự nhiên ở những vùng nhiệt và cận nhiệt đới. Đặc biệt loài này không bao giờ được phân lập từ những nguồn nhân tạo. Actinomucor elegans có sợi nấm đơn bào, không có vách ngăn,trong suốt. - Khuẩn lạc của Actinomcor elegans phát triển rất nhanh và thành một mảng như bông. Ban đầu khuẩn lạc có màu trắng, sau 4 ngày, đường kính khuẩn lạc khoảng 75 mm và có màu xanh ô liu đến vàng sẫm. Phân tích dưới kính hiển vi, ta thấy sự phân nhánh cuống bào tử. Trên cuống bào tử ban đầu, cách túi bào tử trên cùng một đoạn ngắn, mọc ra một cuống bào tử thứ hai. - Mọi túi bào tử đều có hình tròn, đường kính 16 – 72 mm, màu nhạt, màu kem đến vàng sẫm, có nhiều bào tử và có gai. - Thể bình hình oval (4-6 x 30-34mm) nhưng không có đế. Những cuống bào tử nhánh có màu vàng kem nhạt đến sẫm, có vách ngăn, đường kính 4 – 18 mm. Điều kiện nuôi cấy Actinomucor elegans Nhiệt độ và độ ẩm tương đối của không khí tối ưu cho sự phát triển của Actinomucor elegans là 250C và 90 – 97%. Những giờ đầu phải nuôi ở độ ẩm 90%, sau 14 – 16 giờ nuôi trên bề mặt đậu xuất hiện những khuẩn ty màu trắng ta phải đưa hàm ẩm lên 95% Phòng nuôi mốc phải có thiết bị điều chỉnh nhiệt độ, giữ được ẩm và nền phòng phải có khả năng thoát nước. Actinomucor elegans là sinh vật hiếu khí, chỉ phát triển bình thường khi có đầy đủ oxi. Để đáp ứng điều kiện này môi trường nuôi phải thoáng, cụ thể là 100kg bánh đậu dùng để nuôi mốc cần có dung tích 6 – 7 m3 khí trên diện tích 2m2. Hình 4.3: Actinomucor elegans Hình 4.4: Khuẩn lạc Actinomucor elegans Chương 5: CÔNG NGHỆ TẠO GIỐNG VI SINH VẬT 5.1 Vai trò của giống:[2] Trong công nghệ vi sinh vật, giống đóng vai trò rất quyết định. Giống quyết định đến năng suất sinh học của của nhà máy. Một giống tốt bao giờ cũng cho năng suất sinh học cao. Các sản phẩm thu được trong quá trình sản xuất sẽ vừa có chất lượng cao vừa có số lượng nhiều. Trong trường hợp này, tính nổi trội trong một sản phẩm có ý nghĩa rất lớn cả về kĩ thuật cũng như kinh tế. Khi ta có một giống vi sinh vật có khả năng tạo ra một sản phẩm lên men nào đó với số lượng lớn hơn các sản phẩm lên men khác sẽ giúp ta giảm chi phí cho quá trình sản xuất. Giống quyết định chất lượng sản phẩm sinh học. Một giống tốt là giống cho chất lượng sản phẩm hơn hẳn những giống khác, từ đó năng khả năng cạnh tranh trong thương trường. Giống quyết định vốn đầu tư cho sản xuất. Một giống tốt sẽ giúp ta không phải chi phí cho đầu tư xây dựng thêm nhiều nhà máy cũng như giảm những chi phí trong sản xuất rất nhiều Giống quyết định giá thành sản phẩm. Một giống tốt thường cho năng suất và chất lượng sản phẩm cao và như vậy giá thành tất nhiên sẽ hạ hơn so với một giống có năng suất và chất lượng sản phẩm thấp. 5.2 Yêu cầu giống vi sinh vật:[2] Trong các công nghệ lên men truyền thống, người ta thường sử dụng các giống tự nhiên. Ở nhiều trường hợp, các giống có nguồn gốc tự nhiên thường cho ra chất lượng sản phẩm khá tốt. Tuy nhiên cũng có rất nhiều trường hợp, các giống có nguồn gốc tự nhiên không cho sản phẩm có chất lượng ổn định và năng suất sinh học thường không cao. Các giống từ nguồn gốc tự nhiên chủ yếu được sử dụng vào quá trình thu nhận các sản phẩm của quá trình dị hóa. Còn trong các công nghệ thu nhận sản phẩm từ quá trình đồng hóa, ít khi người ta sử dụng giống vi sinh vật từ nguồn gốc tự nhiên. Trong công nghệ lên men hiện đại, người ta phải sử dụng các giống đã được biến đổi nguồn gốc di truyền để nâng khả năng chuyển hóa vật chất của chúng, đồng thời nhằm mục đích ổn định chất lượng và năng suất sản phẩm. Như vậy, giống vi sinh vật sử dụng trong công nghệ lên men hiện đại phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử dụng. Các yêu cầu cơ bản đối với giống dùng trong lên men hiện đại gồm: Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao hơn các sản phẩm phụ khác Giống phải cho năng suất sinh học cao. Năng suất sinh học quyết định cả vốn đầu tư và giá thành sản phẩm. Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy đang hoạt động. Sản phẩm của quá trình lên men do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối vi sinh vật giống. Giống vi sinh vật sử dụng trong các quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, không được nhiễm các vi sinh vật lạ. Giống vi sinh vật phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với với điều kiện sản xuất công nghiệp, trong đó có sự ổn định nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, hoạt tính của nước. Còn trong tự nhiên các điều kiện nuôi cấy hay điều kiện sống của vi sinh vật thiếu ổn định Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp. Tính chất này rất quan trọng, vì nếu bị nhiễm các vi sinh vật lạ, thì giống dùng trong sản xuất phải có khả năng lấn áp sự phát triển của vi sinh vật lạ. Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn. Đặc điểm này giúp ta tăng nhiều chu kỳ sản xuất. Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản. 5.3 Kỹ thuật tạo giống dùng trong sản xuất công nghiệp:[2] 5.3.1 Phân lập giống trong tự nhiên: Thiên nhiên là nguồn vô tận cho phân lập các giống vi sinh vật. Tuy nhiên, không phải ở chỗ nào ta cũng có thể nhận được các chủng vi sinh vật như mong muốn. Có nơi tập trung rất nhiều vi sinh vật loại này, lại có nơi tập trung rất nhiều vi sinh vật loại khác. Vi sinh vật thường phân bố trong thiên nhiên không đều. Chúng thường tập trung ở những nơi giàu chất dinh dưỡng và điều kiện phát triển thuận lợi. Các vi sinh vật trong tự nhiên ít khi cho năng suất sinh học cao, muốn có giống tốt ta phải cải tạo giống này. Phần lớn các vi sinh vật sử dụng trong sản xuất công nghiệp hiện nay là những giống đã được biến đổi hệ thống di truyền. Do đó, các giống được phân lập trong điều kiện tự nhiên chỉ là những mốc giống, từ đó ta tiến hành các biện pháp nâng cao chất lượng giống để đáp ứng những yêu cầu về giống cho sản xuất. Một đặc điểm khác của vi sinh vật trong tự nhiên cần quan tâm khi tiến hành tạo giống là các giống được phân lập trong điều kiện tự nhiên thường chưa thích hợp với sản xuất theo quy mô công nghiệp. Trong điều kiện tự nhiên, các yếu tố về nhiệt độ, pH, độ ẩm môi trường, độ ẩm không khí thay đổi liên tục. Ngược lại trong điều kiện sản xuất công nghiệp, các điều kiện trên thường khá ổn định. Do đó giống thu nhận được từ điều kiện tự nhiên phải qua một giai đoạn huấn luyện thích nghi, đáp ứng được yêu cầu đặt ra. Việc chọn giống từ điều kiện tự nhiên thật sự là một công việc tìm kiếm các chủng đột biến tự nhiên có những tính trạng di truyền trội phù hợp với mục tiêu đề ra. Trong thiên nhiên luôn xảy ra các quá trình biến dị, trong đó có rất nhiều biến dị có lợi cho quá trình sản xuất. Điều khó khăn là những biến dị này thường là những biến dị ngẫu nhiên không định hướng, chúng lại luôn luôn lẫn với những vi sinh vật không biến dị. Hơn nữa số lượng các đột biến trong thiên nhiên thường không nhiều, do đó việc lựa chọn từ đó cho ra những cá thể theo mong muốn riêng là một điều khó khăn. Tuy nhiên việc tuyển chọn trong điều kiện tự nhiên chủ yếu là tạo giống ban đầu, sau đó nhà nghiên cứu về giống còn phải tiến hành các bước tiếp theo để nâng cao chất lượng giống. Khi giống đạt được những yêu cầu cụ thể và đảm bảo được tính ổn định, người ta mới dám đưa vào sản xuất. Các bước tiến hành tạo lập giống từ điều kiện tự nhiên như sau: Tìm vị trí để phân lập giống. Vị trí để phân lập giống phải là nơi hay vật phẩm có sự tập trung khá cao về mật độ giống vi sinh vật mà ta quan tâm. Chọn đúng vị trí hay vật phẩm dùng để phân lập coi như bước đầu khẳng định khả năng thành công của công việc. Sau khi xác định được vị trí hay vật phẩm để phân lập, người ta cân một gam hay một ml (nếu là vật phẩm dạng lỏng) đem phân lập. Chuẩn bị các ống nghiệm chứa các môi trường tập trung. Môi trường tập trung là môi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng có khả năng thích hợp cho nhiều vi sinh vật cùng loài. Ở đó các vi sinh vật cùng loài sẽ phát triển rất mạnh, các vi sinh vật của các loài khác sẽ không phát triển hoặc phát triển rất kém. Mục đích của việc sử dụng môi trường tập trung là loại dần những vi sinh vật mà ta không quan tâm. Sau khi pha loãng với mức độ pha loãng nhất định vật phẩm phân lập ta cấy chúng trong những ống nghiệm hoặc vào hộp petri có môi trường tập trung Song song đó ta chuẩn bị môi trường đặc hiệu và sau khi các vi sinh vật đã phát triển mạnh trên các hộp môi trường tập trung, ta chuyển chúng sang môi trường đặc hiệu. Môi trường đặc hiệu là môi trường chỉ cho phép các vi sinh vật mà ta quan tâm phát triển còn các vi sinh vật khác sẽ bị ức chế không phát triển được. Bước cuối cùng là kiểm tra những đặc điểm của vi sinh vật mà ta quan tâm Mục đích là tuyển chọn từ những vi sinh vật cùng loài những cá thể có đặc điểm đặc trưng mà ta mong muốn. 5.3.2 Phân lập giống trong điều kiện sản xuất. Khác với giống được phân lập trong điều kiện tự nhiên, các giống vi sinh vật phân lập trong điều kiện sản xuất có những ưu điểm riêng: Giống được phân lập trong điều kiện sản xuất có những giống đã qua quá trình sản xuất, đã có khả năng thích ứng với điều kiện sản xuất (trong khi đó giống trong điều kiện tự nhiện chỉ quen với các điều kiện không ổn định của của thiên nhiên). Đặc điểm đã quen với điều kiện sản xuất rất có ý nghĩa trong quá trình sản xuất vì đặc tính đảm bảo tính ổn định của giống trong điều kiện nhân tạo. Giống được phân lập trong quá trình sản xuất thường là những giống đã được qua biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hóa cao hơn hẳn những chủng nguyên gốc. Do đó, việc phân lập chúng và tạo lập được giống từ đây sẽ có năng suất và chất lượng sản phẩm sinh học cao. Trong các điều kiện sản xuất (dịch đang lên men, nước thải, chất thải ) thường tồn tại khá tập trung những giống vi sinh vật mà ta quan tâm. Những giống này đang trong quá trình sản xuất và sẽ theo chất thải, nước thải ra ngoài. Như vậy trong nước thải, chất thải mật độ các vi sinh vật này nhiều nhất trong tất cả các mẫu vật mà ta đã quan tâm. Nhiều nghiên cứu rất thành công trong việc sử dụng nước thải, chất thải này để phân lập lại. Ví dụ, để có giống dùng trong sản xuất bia, ta sẽ lấy mẫu nước thải trong nhà máy bia hoặc bã men sau khi lọc, ép để làm vật phẩm cho quá trình phân lập. Làm như vậy sẽ có khả năng thu nhận kết quả khả quan hơn các mẫu vật phân lập từ nguồn khác. Như vậy trong công việc phân lập giống vi sinh vật từ quá trình sản xuất có những bước sau: Chọn những vị trí và mẫu vật phân lập: Trong quá trình sản xuất, giống vi sinh vật có thể bị thoái hóa. Trong tổng thể, có rất nhiều cá thể bị thoái hóa nhưng không phải tất cả, trong đó, có nhiều cá thể vẫn giữ được những đặc tính mà ta quan tâm. Do đó nhiệm vụ là: từ tập hợp vi sinh vật có trong quá trình sản xuất đó ta phân lập ra những giống còn giữ được những đặc điểm ban đầu. Địa điểm và mẫu vật đem phân lập ở điều kiện sản xuất bao gồm: Dịch đang tiến hàng lên men Nước thải của nhà máy Chất thải của nhà máy Trong đó dịch đang lên men cho xác suất thu nhận được kết quả cao hơn. Sau khi xác định được vị trí và vật phẩm dùng để phân lập, ta chỉ còn thực hiện những bước sau giống như các bước trong phân lập giống từ điều kiện tự nhiên. 5.3.3 Phân lập giống trong những ống giống đã thoái hóa. Các ống giống là tập hợp các tế bào vi sinh vật có cùng một nguồn gốc di truyền. Tuy nhiên, do điều kiện bảo quản bất bình thường mà ống giống thay đổi một số đặc điểm sinh hóa, từ đó khó ứng dụng trong sản xuất. Tuy nhiên cũng phải nhận thấy rằng, trong hàng tỷ tế bào có trong ống giống đó không phải tất cả đã bị thoái hóa mà còn rất nhiều cá thể vẫn bảo tồn được đặc tính ban đầu. Việc ứng dụng cả ống giống này vào trong sản xuất sẽ làm tăng năng suất và chất lượng sản phẩm. Thực chất của việc phân lập giống trong những ống nghiệm đã thoái hóa là quá trình tuyển chọn lại giống từ các ống giống. Công việc này hoàn toàn không phức tạp vì vị trí và vật phẩm phân lập rất rõ ràng. Vấn đề còn lại là tiến hành các quá trình phân lập giống như quá trình phân lập giống từ điều kiện tự nhiên. Công việc này là công việc rất thường xuyên ở nhiều phòng thí nghiệm và phòng kỹ thuật trên thế giới. Nhờ đó mà người ta luôn duy trì được giống tốt cho sản xuất. 5.4 Sản xuất mốc giống trong sản xuất tương:[1, 5, 7] 5.4.1 Phương pháp sản xuất mốc tương thủ công(dân gian): - Làm mốc tương : làm mốc tương là giai đoạn đầu và cũng là giai đoạn đòi hỏi hiểu biết kĩ thuật đầy đủ nhất trong sản xuất tương . - Cách làm mốc thông thường : Hình 5.1: Sơ đồ làm mốc thông thường - Nguyên liệu : Gạo nếp hoặc ngô khoai. Có thể làm mốc tương từ gạo nếp cái hoặc nếp con, 30-33kg cho 100 lít tương. Thông thường nếp càng tốt thì tương càng ngon. Nếp không nên giã quá kĩ làm mất vitamin B1 . - Đồ chín : gạo nếp đem vo, đãi cho sạch trấu, sạn. Ngâm nước ngang mặt khoảng một đêm (8-12 h) . Ngâm gạo có tác dụng làm cho gạo trương lên, hấp phụ một lượng nước cần thiết. Như thế khi nấu hạt gạo sẽ dễ chín đều cả trong lẫn ngoài. Gạo ngâm xong thì vớt ra cho ráo rồi cho vào đồ. Hàm lượng nứơc ngâm trong gạo thường đạt tới 34-36%. Trong điều kiện sản xuất gia đình ta thường cho nếp vào dụng cụ gọi là chỗ nấu xôi. Chõ thường làm bằng đất nung có hình ống, phía trên để hở, phía đáy có nhiều lỗ nhỏ. Chõ được đặt vào nồi nước chỗ tiếp xúc được trát kín bằng vôi. Khi nước sôi, hơi sẽ bốc qua những lỗ nhỏ làm chín gạo. Hàm lượng ẩm của xôi đã chín thường là 45-52%. - Ủ mốc : là giai đoạn quan trọng nhất trong sản xuất tương. Mốc tốt sẽ có nhiều đường, màu vàng đẹp, khi trộn nước đậu sẽ thuỷ phân tốt, làm cho tương ngọt, không chua, màu sắc đẹp . - Ủ mốc thông thường : Xôi được đồ chín được đổ ra nong hay thúng cho nguội, sau đó rải vào nong thành lớp mỏng 2-2.5 cm. Một vài nơi thường để nguội xôi trong thúng qua đêm rồi mới rãi vào nong, tuy nhiên không cần thiết như vậy. Khi rãi xôi vào nong không nên mỏng quá làm xôi chóng khô, cũng không nên quá dày làm xôi bị bọng nước, mốc khó phát triển. Vừa rãi đều vừa dấp nước, bóp cho xôi tơi ra. Lượng nước thêm vào làm xôi có độ ẩm khoảng 55% thích hợp cho nấm mốc mọc. Rãi xôi xong ta lấy lá nhãn, lá sen hoặc bao tải phủ lên trên. Khi phủ bằng lá, nước thường đọng nhiều và trượt xuống thành giọt làm xôi ướt không đều, mốc dễ chua hoặc đen, vì vậy nên phủ bằng vải hoặc bao tải thì tốt hơn, dưới nong mốc có thể lót rơm. Nên ủ mốc nơi kín, tránh nắng hoặc gió quá làm mốc bị khô. Nhiệt độ không khí thích hợp cho ủ mốc là 30-32ºC. Sau khi ủ hai ngày đêm sợi mốc bắt đầu mọc đều. Lúc này không nên bóp mốc, nếu thấy mốc khô thì rãi lên ít nứơc, đảo lên cả cả từng tảng mốc. Sau 3-4 ngày bào tử bắt đều hình nhiều làm mốc trở nên có màu. Cần xem xét thường xuyên loại bỏ mốc màu không tốt. Sau 4-5 ngày nếu ủ tốt thì hạt xôi nào cũng có mọc mốc, nhiều bào tử, mốc trở nên nhẹ hơn, có vị ngọt. Lúc này ta có thể bóp mốc cho tơi đều và ủ thêm một ngày nữa là được. Như vậy toàn bộ thời gian ủ mốc, tính từ lúc san đều xôi vào nong thành lớp đến khi lên được là khoảng 5 ngày. Nếu mốc mọc hơi chậm thì khoảng 6-7 ngày. Mốc đã được đem đi ngã tương hoặc muối mốc. Không nên để lâu hơn vì sẽ làm giảm độ ngọt cũng như hoạt động các enzyme trong mốc đã giảm - Cách làm mốc mật : Hình 5.2: Sơ đồ làm mốc kiểu Cự Đà ( mốc mật ) - Ủ mốc kiểu Cự Đà ( mốc mật ) : Xôi sau khi đồ xong ủ như trên, nhưng sau khi ủ được khoảng 3 ngày thì lấy ra bóp cho mốc rời thành hạt. Đổ vào rá vo nhanh 3-4 phút cho hết bụi bào tử, đừng làm cho mốc bị nát. Để vài giờ cho ráo nước rồi ủ vào thúng hoặc nong thành đống cao 0.3-0.5 m, nén vừa phải. Dưới thúng hoặc nong lót rơm, trên đậy bao tải. Do hô hấp của nấm mốc khối ủ sẽ tự bốc nóng và sau khoảng 8-10 h, nhiệt độ thường lên tới 50C hoặc cao hơn. Cần giữ cho nhiệt độ không lên cao quá 60C và không thấp dưới 50C. Trong điều kiện này nấm mốc rất ít phát triển thêm, không sinh bào tử, mà chủ yếu enzyme amylase và protease được hình hành sẽ làm thuỷ phân tinh bột và protit. Mốc sau khi vo xong và để ráo có độ ẩm khoảng 50-60% nhiệt độ khối ủ 50-60C đều là những điều kiện rất thích hợp cho enzyme hoạt động. - Cách muối mốc : Muối mốc : Mốc sau khi ủ xong nếu chưa sử dụng liền thì sẽ muối mốc để hãm mốc ở giai đoạn tốt nhất : có lượng đường và enzyme ở giai đoạn cao . Cách ướp muối rất đơn giản. Mốc ủ thông thường thì đem bóp cho tơi để loại bớt bào tử nấm mốc. Cho vào vại sành lần lượt một lượt mốc rồi đến lượt muối. Đổ nước vào khoảng xăm xắp mặt , trộn đều cho tan muối. Đối với mốc mật thì chỉ cần bóp nát rồi thêm muối và nứơc . Mốc đã muối hàng ngày nên trộn đều và phơi nắng. Trong quá trình muối mốc nở ngậm nước nở ra. Các enzyme dù bị muối kìm hảm nhưng vẫn thuỷ phân nhẹ làm mốc trở nên ngọt hơn, nhuyễn có màu sắc đẹp. Mốc này có thể bảo quản trong 1 năm. 5.4.2 Phương pháp sản xuất mốc tương công nghiệp: - Mục đích là tạo được lượng giống đủ cho sản xuất với bào tử đạt được là cao nhất. Đồng thời giống nấm mốc phải được thuần khiết về chủng loại. Giai đoạn làm mốc giống cần phải tiến hành ba bước: Nuôi cấy giống trong ống thạch nghiêng hay là giữ giống trong ống nghiệm. Nuôi cấy trong bình tam giác (nhân giống nhỏ). Nuôi cấy trong sàng, nia. a.Nuôi cấy trong ống thạch nghiêng: Khi lấy ống thạch có giống được cấy truyền sang ống thạch khác. Các ống này vừa được dùng để bảo quản giống vừa được dùng vào trong sản xuất, ống giống phải tuyệt đối đảm bảo thuần khiết không được lẫn bất kì một loài vi sinh vật nào khác. Môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy nấm mốc cần phải đầy đủ các chất dinh dưỡng. Môi trường gồm thạch và dung dịch các chất dinh dưỡng. b.Nuôi cấy trong bình tam giác: Nuôi cấy nấm mốc trong bình tam giác là phương pháp nhân giống trong khâu sản xuất, từ đây sẽ nhân giống trên khay, mành hoặc các dụng cụ cần thiết khác. Thường sử dụng các bình tam giác có dung tích 0,3 – 0,5 hoặc 1 lít có cổ rộng ở giai đoạn này, có thể dùng gạo tẻ loại tốt không mốc, không mọt. Tiến hành nấu cơm như bình thường, làm sao cho hạt cơm chín đều không bị nhão và đồng thời không khô quá. Độ ẩm khoảng 45 – 55 %. Dỡ ra, để nguội bóp rời ra từng hạt rồi cho vào bình tam giác thành một lớp dày 1cm, đậy nút bông và buộc giấy chống ẩm. Thanh trùng 1 atm trong 30 – 45 phút. Hoặc ta có thể dùng môi trường ngô mảnh trộn nước đều trong khay hoặc nong để khoảng 1 – 2 giờ cho nước ngấm đều. Bóp thật tơi rồi cho vào bình tam giác có độ dày 1cm và đem khử trùng 1atm trong 60 phút. Sau khi chuẩn bị được môi trường trong bình thủy tinh, ta tiến hành gieo cấy giống vi sinh vật. Trước tiên cần phải chuẩn bị lấy 5ml nước vô trùng vào trong các ống nghiệm. Sau đó đổ nước vô trùng cho bào tử hòa trong nước đồng thời cấy truyền chúng sang bình tam giác. Trung bình cứ một ống giống có thể cấy truyền thành 2 – 3 bình tam giác, có dung tích khoảng 1 lít. Lắc đều cho giống phân bố đồng đều trong môi trường và tiến hành nuôi chúng trong nhiệt độ thích ứng. Thường nuôi khoảng 5 – 6 ngày là được. Yêu cầu cơ bản trong giai đoạn này là làm sao đảm bảo tạo hết sức nhiều bào tử và phát triển mạnh khỏe. Trường hợp nào thấy bình bị nhiễm thì phải loại bỏ ngay. c. Nhân mốc giống trên mành, sàng (nhân giống lớn): Đây là giai đoạn cuối cùng trong quá trình nhân mốc giống. Môi trường dùng để nhân giống trong giai đoạn này là ngô mảnh. Cũng có thể dùng một số dạng môi trường khác thay thế được. Ngô mảnh trộn nước để yên cho ngấm nước khoảng 3 – 4 giờ rồi đem hấp chín. Thời gian hấp có thể kéo dài 3 – 4 giờ. Nếu dùng gạo thì thời gian hấp nhanh hơn. Nguyên liệu sau khi hấp xong phải chín đều không được quá bết hoặc quá khô. Độ ẩm còn lại khoảng 45 – 50% là vừa. Sau khi hấp nguyên liệu xong, tiến hành làm nguội nhanh đến 26 – 380C thì tiến hành trộn mốc giống vào tỷ lệ mốc giống là 0,5 – 1% hoặc có thể cao hơn. Để tiến hành cho đều ta có thể dùng một lượng môi trường đã đem thanh trùng trộn trước với mốc giống sau đó từ lượng này đem trộn đều vào khối môi trường. Hoặc ta có thể dùng nước vô trùng cho vào bình tam giác đánh cho thật đều rồi đem trộn với môi trường đã thanh trùng. Sau khi trộn đều đem rải ra mành, khay thành khối có chiều dày 0,3m để tránh môi trường đỡ bị khô. Khay, mành được đặt vào phòng điều hòa nhiệt độ ở 30 – 320 C, độ ẩm 85 – 100%. Thời gian ủ trong khoảng 6 – 8 giờ. Sau 3 – 4 giờ lại trộn đều một lần để điều hòa nhiệt độ và không khí, sau 6 – 8 giờ ta tiến hành tải mỏng ra với lớp dày 1,5 – 2 cm. Sau khi nuôi 34 – 36 giờ nhiệt độ khối nuôi bắt đầu giảm cần phải điều chỉnh nhiệt (lên 34 – 350C) để duy trì sự hình thành bào tử của nấm mốc. Thời gian nuôi trên khay, mành thường kéo dài 60 giờ. Nếu thấy mốc hình thành bào tử chậm có thể kéo dài thời gian 70 – 72 giờ. Sau khi nuôi giống xong có thể sử dụng mốc này ngay trong sản xuất hoặc đem sấy khô tới độ ẩm 8% đem bảo quản và dùng dần hoặc cung cấp cho các nơi sản xuất. Chú ý trong quá trình sấy không được nâng nhiệt độ quá 400C. Sau khi sấy xong cho mốc giống vào các bọc nilon để chống ẩm. Chú ý làm sao tránh không gây nhiễm bào tử các loài khác. Bao mốc giống được bảo quản nơi khô ráo, tránh ánh nắng và cũng có thể bảo quản l