Đề tài Tổng quan về peptit có hoạt tính sinh học

LÔØI MÔÛ ÑAÀU P eptit coù hoaït tính sinh hoïc (Bioactive peptide) laø moät lónh vaät ñang ñöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc nghieân cöùu. Vôùi nhöõng tính naêng ñaëc bieät, peptit coù hoaït tính sinh hoïc ñöôïc öùng duïng taát nhieàu trong y hoïc vaø thöïc phaåm. Ñöôïc söï höôùng daãn nhieät tình cuûa coâ Traàn Bích Lam, em ñaõ nghieân cöùu ñeà taøi Ñoà aùn moân hoïc “Toång quan veà Biopeptide”. Vôùi nhöõng coá gaéng cuûa baûn thaân vaø söï chæ daãn aân caàn cuûa coâ, em ñaõ hoaøn thaønh nhieäm vuï ñöôïc giao. Tuy nhieân, ñaây laø moät ñeà taøi coøn môùi meû, taøi lieäu tham khaûo chöa nhieàu neân coøn nhieàu thieáu soùt. Raát mong ñöôïc söï ñoùng goùp cuûa thaày coâ vaø caùc baïn ñeå ñeà taøi naøy theâm phaàn hoaøn thieän. Moät laàn nöõa, em xin chaân thaønh caûm ôn coâ Traàn Bích Lam, quyù thaày coâ trong Boä moân vaø caùc baïn raát nhieàu. Chöông 1: GIÔÙI THIEÄU P eptit laø caùc phaân töû sinh hoïc ñöôïc caáu truùc töø moät vaøi cho ñeán haøng chuïc amino axit. Noù laø moät daïng protein maïch ngaén coù chöùa ít hôn 50 amino axit. Tuy nhieân, ngöôøi ta vaãn goïi nhöõng phaân töû sinh hoïc chöùa moät löôïng khoâng lôùn caùc amino axit laø peptit. Lieân keát peptit laø lieân keát giöõa ñaàu – COOH cuûa amino axit naøy vôùi ñaàu – NH2 cuûa amino axit keá tieáp baèng vieäc loaïi ñi moät phaân töû nöôùc ñeå taïo thaønh lieân keát: – CO – NH – Khi moät soá amino axit lieân keát vôùi nhau thoâng qua lieân keát peptit thì taïo ra oligopeptit. Khi coù nheàu amino axit noái vôùi nhau thì taïo ra chuoãi polypeptit. Moät phaân töû protein coù theå coù moät, hai hay nhieàu chuoãi polypeptit. Trong phaân töû protein ngoaøi lieân keát peptit, caùc amino axit coøn lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát disulfid. Lieân keát disulfid coù vai troø quan troïng trong vieäc taïo caáu hình khoâng gian cho moät soá loaïi protein, ñaëc bieät caùc protein coù nhöõng chöùc naêng sinh hoïc quan troïng nhö caùc hoocmon, caùc khaùng theå vaø moät soá protein khaùc. Peptit coù tính chaát lyù hoùa khoâng khaùc nhieàu so vôùi amino axit vì ñeàu chöùa nhoùm – NH2 vaø nhoùm – COOH töï do. Söï sai khaùc chuû yeáu laø do maïch beân R cuûa goác amino axit tham gia trong chuoãi peptit. Chính söï khaùc nhau giöõa caùc maïch beân R, khaùc veà soá löôïng vaø loaïi amino axit trong peptit laøm cho ñieåm ñaúng ñieän, khoái löôïng khaùc nhau. Veà maët hoùa hoïc, peptit tham gia caùc phaûn öùng ñaëc tröng cuûa 2 nhoùm – NH2 vaø – COOH. Lieân keát peptit coù theå bò beû gaõy hoaøn toaøn trong moâi tröôøng HCl 6N, ôû nhieät ñoä 1100C, trong 24 giôø hoaëc ôû trong dung dòch kieàm. Trong ñieàu kieän naøy, caùc amino axit ñöôïc taùch ra ôû daïng töï do. Ñaây laø coâng ñoaïn khoâng theå thieáu ñöôïc trong phöông phaùp phaân tích ñònh löôïng amino axit. Ñeå xaùc ñònh trình töï caùc amino axit, ngöôøi ta caàn gaén hoùa chaát ñaùnh daáu vaøo caùc ñaàu N vaø C cuûa amino axit. Thoâng thöôøng ngöôøi ta gaén chaát dabsylchlorid vaøo ñaàu N cuûa peptit. Sau ñoù tieán haønh thuûy phaân baèng HCl 6N ôû 1100C trong 24 giôø vaø tieán haønh taùch ñöôïc rieâng töøng loaïi amino axit laàn löôït theo thöù töï. Keát quaû thu ñöôïc amino axit töï do taùch ra vaø coù chöùa chaát ñaùnh daáu ñaõ ñöôïc gaén vaøo ñaàu N cuûa noù. Caùc lieân keát peptit coøn bò caét bôûi caùc enzym protease. Enzym protease coù maët ôû caùc teá baøo vaø moâ laøm nhieäm vuï phaân giaûi caùc phaân töû protein. Nhieàu peptit coù hoaït tính sinh hoïc ñaëc bieät ñang ñöôïc söû duïng roäng raõi trong thöïc tieãn y hoïc. Peptide coù hoaït tính sinh hoïc (bioactive peptide/ biologically active peptide) laø nhöõng peptide maø ngoaøi giaù trò dinh döôõng chuùng coøn coù moät soá aûnh höôûng ñaëc bieät ñeán chöùc naêng sinh lyù cuûa cô theå. Tính chaát naøy ñöôïc quy ñònh bôûi thaønh phaàn vaø thöù töï cuûa caùc amino acid trong peptide. Mellander (1950) laø ngöôøi ñaàu tieân ñöa ra thuaät ngöõ peptide coù hoaït tính sinh hoïc khi oâng nhaän thaáy caùc peptide bò phosphoryl hoùa coù nguoàn goác töø casein hoaït ñoäng nhö chaát mang caùc chaát khoaùng. Nhöõng nghieân cöùu veà peptide ñaõ coù nhöõng böôùc tieán ñaùng keå trong vaøi thaäp nieân gaàn ñaây. Nhöõng hieåu bieát veà taùc duïng vaø cô cheá taùc duïng cuûa peptide ñaõ laøm cho noù ngaøy caøng nhaän ñöôïc nhieàu söï quan taâm ñaëc bieät trong lónh vöïc y döôïc. Ngoaøi ra, peptide coù hoaït tính sinh hoïc coøn ñöôïc söû duïng trong caùc loaïi thöïc phaåm chöùc naêng, nhaát laø caùc thöïc phaåm chöùc naêng coù nguoàn goác töø söõa. Hình1.1: Aûnh höôûng cuûa caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc leân cô theå Khaû naêng chöõa beänh cuûa peptit laø raát cao. Ñeán baây giôøi treân thò tröôøng ñaõ coù 9 saûn phaåm söû duïng peptit vaø treân 100 coâng ty ñang saûn xuaát ra nhieàu saûn phaåm peptit môùi vaø ñöa vaøo thöû nghieäm. Peptit – hoocmon tham gia vaøo caùc quaù trình trao ñoåi chaát, vaän chuyeån thoâng tin hoùa hoïc giöõa caùc teá baøo moâ vaø caùc cô quan. Insulin laø peptit – hoocmon ñieån hình, laø phaân töû khaù lôùn, coù 51 amino axit taïo thaønh 2 chuoãi polypeptit noái vôùi nhau baèng caàu disulfid (-S-S). Glucagon laø moät peptit – hoocmon bao goàm 29 amino axit ñöôïc toång hôïp töø tuyeán tuïy, coù taùc ñoäng ngöôïc vôùi insulin Corticotropin laø peptit – hoocmon bao goàm 39 amino axit, ñöôïc taïo ra töø phaàn tröôùc cuûa tuyeán yeân, coù vai troø kích thích hoaït ñoäng cuûa voû tuyeán thöôïng thaän. Ngoaøi ra, coøn coù nhieàu loaïi peptit maïch ngaén coù phoå hoaït ñoäng roäng. Ví duï: loaïi peptit toång hôïp hoùa hoïc L. Aspatyl phenylalanin methylester laø chaát ngoït hôn ñöôøng toùi haøng traêm laàn hieän ñang ñöôïc duøng roäng raõi trong coâng nghieäp vaø cheá bieán thöïc phaåm ñeå thay theá ñöôøng. Peptit maïch ngaén töï nhieân bao goàm 9 amino axit do vuøng naõo döôùi ñoài tieát ra vaø döï tröõ ôû thuøy sau tuyeán yeân, coù khaû naêng kích thích daï con co boùp hoaëc peptit ngaén bradykinin goàm 9 amino axit coù taùc duïng öùc cheá hieän töôïng söng taáy caùc moâ. Moät peptit ngaén khaùc laø enkephalin ñöôïc taïo ra ôû naõo boä laø chaát coù taùc duïng giaûm ñau. Beân caïnh ñoù coøn nhieàu loaïi peptit – hoocmon khaùc coù taùc duïng khaùc nhau ñoái vôùi hoaït ñoäng soáng cuûa cô theå. Hoùa hoïc toå hôïp ñaõ ñoùng goùp raát nhieàu cho vaán ñeà nghieân cöùu caùc peptit coù hoaït tính sinh hoïc. Tuy nhieân coù moät haïn cheá raát lôùn ñoái vôùi nhöõng peptit coù giaù trò sinh hoïc vì nhu caàu cuoäc soáng ñoøi hoûi moät soá löôïng lôùn. Vaø Primm ñaõ giaûi quyeát ñöôïc vaán ñeà naøy: töø caùc peptit sinh hoïc coù nguoàn goác töï nhieân, baèng phöông phaùp sinh hoïc vaø nhieàu phöông phaùp khaùc, oâng ñaõ phaùt trieån chuùng vôùi qui moâ coâng nghieäp aùp duïng trong caùc lónh vöïc nhö y döôïc, hoùa hoïc chuaån ñoaùn vaø thöïc phaåm noâng nghieäp. Baèng caùch ñoù, caùc peptit tieáp tuïc ñöôïc caûi tieán ñeå ñaït ñöôïc nhöõng tính chaát toát nhaát duøng ñeå chöõa beänh. Lôïi theá lôùn khi duøng peptit caûi tieán laø do noù coù giaù trò sinh hoïc raát cao vaø haïn cheá ñöôïc tính ñoäc. Beân caïnh ñoù chi phí toång hôïp cuõng thaáp hôn. Primm ñaõ ñöa ra caùc böôùc löïa choïn nhö sau: Phaùt hieän ra chuoãi nhoû nhaát gaây ra aûnh höôûng sinh hoïc baèng caùch kieåm tra vaø toång hôïp töø ñoaïn baét ñaàu cuûa chuoãi peptit. Phaùt hieän ra caáu hình hoaït ñoäng sinh hoïc baèng caùch xaùc ñònh caáu taïo vaø caáu truùc hoaït ñoäng lieân quan. Söï saép xeáp cuûa peptit chöùa trong caáu hình ñoù baèng söï hoã trôï cuûa maùy tính. Toång hôïp hoùa hoïc Ñònh giaù giaù trò sinh hoïc vaø döôïc lyù, sau ñoù laäp laïi böôùc 3 – 5. Primm ñaõ khai thaùc töø nhöõng hieåu bieát veà peptit hoùa hoïc hieän taïi ñeå phaùt trieån, saûn xuaát vaø baùn ñoäc quyeàn nhöõng peptit ñöôïc aùp duïng trong nhieàu lónh vöïc chöõa beänh nhö tìm ñöôïc phaân töû peptit môùi duøng chöõa beänh HIV hay söï phaùt trieån caùc chaát ñoái khaùng neurokinin… Hieän nay, ngöôøi ta coù theå thu nhaän caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc baèng nhieàu phöông phaùp: thuûy phaân protein (duøng enzyme tröïc tieáp hoaëc thoâng qua quaù trình leân men cuûa vi sinh vaät), toång hôïp hoùa hoïc, kyõ thuaät gen. Gaàn ñaây, nhöõng cô sôû döõ lieäu veà trình töï cuûa caùc amino acid trong peptide coù hoaït tính sinh hoïc ngaøy caøng ñöôïc phaùt trieån, töø ñoù ta coù theå xaùc ñònh nhöõng peptide coù hoaït tính sinh hoïc tieàm aån trong protein. Ngoaøi ra, do chuùng ta ñaõ bieát ñöôïc vò trí thuûy phaân cuûa caùc enzyme thuûy phaân protein nhö pepsin, trypsin, chymotrypsin, do ñoù söï giaûi phoùng caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc trong quaù trình thuûy phaân noùi chung vaø tieâu hoùa noùi rieâng laø coù theå döï ñoaùn ñöôïc. Chöông 2: CAÙC PEPTIDE COÙ HOAÏT TÍNH SINH HOÏC TRONG THÖÏC PHAÅM T a coù theå phaân loaïi peptide coù hoaït tính sinh hoïc theo chöùc naêng cuûa chuùng; tuy nhieân haàu heát caùc chöùc naêng chöa ñöôïc hieåu roõ veà cô cheá taùc ñoäng cuûa chuùng vaø moät peptide laïi coù theå coù nhieàu chöùc naêng khaùc nhau; do ñoù trong baøi naøy chuùng ta seõ phaân loaïi döïa treân nguoàn goác thöïc phaåm. Ñoái vôùi caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc tìm thaáy trong moãi loaïi thöïc phaåm chuùng ta seõ noùi veà nhöõng tính chaát cuûa chuùng. Ngöôøi ta thöôøng thaáy caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù trong 2 nguoàn thöïc phaåm laø söõa vaø ñaäu naønh. Söõa Maëc duø protein cuûa caùc ñoäng vaät vaø thöïc vaät khaùc coù chöùa caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc tieàm aån (naèm trong protein), nhöng hieän nay protein töø söõa vaãn laø nguoàn cung caáp peptide coù hoaït tính sinh hoïc chính. Söõa coù nhieàu chaát coù hoaït tính sinh hoïc vaø coù taùc ñoäng coù lôïi nhieàu maët leân cô theå. Haàu heát protein cuûa söõa coù raát ít hoaëc khoâng coù hoaït tính sinh hoïc khi ôû traïng thaùi ban ñaàu, tuy nhieân qua quaù trình tieâu hoùa hoaëc thuûy phaân thì noù giaûi phoùng ra raát nhieàu peptide coù hoaït tính sinh hoïc. Protein trong söõa boø chieám khoaûng 2.9-5% khoái löôïng [11]. Protein naøy bao goàm: Casein (75-85%), bao goàm: -casein (47-57%) -casein (25-35%) -casein (8-15%) -casein (3-7%) Protein hoøa tan (15-25%), thaønh phaàn bao goàm: Teân protein Haøm löôïng (% toång khoái löôïngprotein trong söõa) Kieåu gen Phaân töû löôïng (Da) Ghi chuù -lactoglobulin 7 – 12% A, B, C, D, Dr 18.000 Phaân töû goàm 162 goác axit amin -lactalbumin 2 – 5 A, B 14.200 Phaân töû goàm 123 goác axit amin Proteose-peptone 2 – 4 400 – 40.000 Laø saûn phaåm thuûy phaân töø -casein Immunoglobulin 1,9 – 3,3 IgG1, IgG2 IgA IgM 162.000,152.000 400.000 950.000 Serum-albumin 0,7 – 1,3 66.300 Phaân töû goàm 542 goác axit amin Moät soá hình tieáp theo seõ cho chuùng ta bieát thaønh phaàn vaø thöù töï cuûa caùc amino acid coù trong moät vaøi loaïi protein coù trong söõa. Trong baøi naøy, khi ta noùi ñeán 1 ñoaïn peptide naøo ñoù, ví duï ñoaïn 60-62 cuûa -cn thì ta coù theå nhìn vaøo hình 2.1 ñeå bieát ñoaïn peptide naøy coù caáu taïo laø Met-Glu-Ala, do ñoù ñeå ñôn giaûn, trong nhöõng phaàn sau ta chæ caàn vieát soá thöù töï cuûa peptide maø khoâng caàn vieát coâng thöùc cuûa peptide. Baûng 2.1: Thaønh phaàn amino acid cuûa moät soá loaïi casein trong söõa (Swaisgood, 1982) Baûng 2.2: Thaønh phaàn amino acid cuûa moät soá protein hoøa tan trong söõa (Whitney vaø coäng söï, 1976) Amino acid Soá goác amino acid trong Amino acid Soá goác amino acid trong -LG (kieåu gen A) -LB (kieåu gen B) -LG (kieåu gen A) -LB (kieåu gen B) Asp 11 9 Val 10 6 Asn 5 12 Met 4 1 Thr 8 7 Ile 10 8 Ser 7 7 Leu 22 13 Glu 16 8 Tyr 4 4 Gln 9 5 Phe 4 4 Pro 8 2 Trp 2 4 Gly 3 6 Lys 15 12 Ala 14 3 His 2 3 ½ cys 5 8 Arg 3 1 Trong thaønh phaàn cuûa taát caû caùc casein coù haøm löôïng caùc amino acid khoâng phaân cöïc khaù cao (35-45%) nhö Val, Leu, Ile, Pro, Phe. Trong soá ñoù haøm löôïng proline laø khaù cao: 17, 10, 35, 20 goác proline trong moät mol , , , -casein (moãi loaïi casein naøy coù 199, 207, 209, 169 goác amino acid trong phaân töû). Söï coù maët moät löôïng lôùn proline trong phaân töû casein laøm cho phaân töû casein coù raát ít caáu truùc xoaén vaø caáu truùc laù xeáp . Ñieàu naøy laøm cho casein deã bò thuûy phaân maø khoâng caàn phaûi laøm cho noù bò bieán tính tröôùc (ví duï baèng nhieät hay acid) [11]. Tuy nhieân casein laïi chöùa raát ít caùc amino acid chöùa löu huyønh, ñieàu naøy laøm giaûm ñi giaù trò sinh hoïc cuûa noù. vaø -casein khoâng chöùa cysteine hay cystine, trong khi ñoù vaø -casein chöùa 2 goác cysteine trong phaân töû maø thoâng thöôøng toàn taïi döôùi daïng caàu disulphide. Casein, maø ñaëc bieät laø -casein coù raát nhieàu Lys, ñaây laø amino acid raát caàn thieát maø trong nhieàu protein thöïc vaät coù raát ít [11]. Hình 2.1: Thöù töï amino acid trong -casein söõa boø (Swaisgood, 1992) Hình 2.2: Thöù töï amino acid trong -casein söõa boø (Swaisgood, 1992) Hình 2.3: Thöù töï amino acid trong -casein söõa boø (Swaisgood, 1992) Hình 2.4: Thöù töï amino acid trong -casein söõa boø (Swaisgood, 1992) Veà chöùc naêng, ngöôøi ta coù theå chia peptide coù hoaït tính sinh hoïc töø söõa thaønh nhieàu loaïi [10,16]: Peptide aûnh höôûng leân heä thaàn kinh Peptide lieân keát vôùi khoaùng Peptide ñieàu hoøa heä mieãn dòch Peptide aûnh höôûng ñeán heä tuaàn hoaøn Ngoaøi ra coøn coù caùc peptide coù caùc chöùc naêng khaùc (ví duï nhö laøm co cô, choáng ñoâng maùu… ) nhöng caùc peptide naøy chæ chieám haøm löôïng raát nhoû hoaëc coù aûnh höôûng khoâng ñaùng keå neân khoâng ñöôïc ñeà caäp ñeán trong baøi. Coù nhöõng peptide coù nhieàu chöùc naêng (ví duï vöøa aûnh höôûng leân heä tuaàn hoaøn, vöøa aûnh höôûng leân heä thaàn kinh), neân söï phaân loaïi treân cuõng chæ mang tính chaát töông ñoái. Caùc peptide aûnh höôûng leân heä thaàn kinh Khaùi nieäm Cho ñeán nay vaãn chöa coù moät ñònh nghóa chính xaùc veà caùc peptide aûnh höôûng leân heä thaàn kinh (neuropeptide – NP). Ngöôøi ta goïi teân caùc peptide naøy chuû yeáu laø döïa vaøo keát quaû nhöõng quan saùt veà aûnh höôûng cuûa noù leân caùc hoaït ñoäng sinh lyù cuûa cô theå (teân goïi coù tính chaát lòch söû) hôn laø do nhöõng hieåu bieát chi tieát veà cô cheá taùc ñoäng cuûa chuùng. Ví duï, trong moät thôøi gian khaù daøi, ngöôøi ta bieát CCK (cholecytokinin) nhö laø hormon ôû heä tieâu hoùa, nhöng ñeán naêm 1975 ngöôøi ta laïi phaùt hieän noù coù trong naõo cuûa chuoät, taùc ñoäng ñeán heä thaàn kinh chuoät [24]. Nhöõng NP coù tính chaát töông töï nhö morphin (nhö laøm giaûm ñau, deã nguû) ñöôïc goïi laø “opioid peptide / opiate peptide – OP” . Caùc OP coù nguoàn goác töø protein thöïc phaåm ñöôïc goïi laø “exorphin”. Caùc OP coù nguoàn goác töø casein ñöôïc goïi laø “casomorphin”; töông töï, OP coù nguoàn goác töø -casein goïi laø -casomorphin, ñaây laø moät trong nhöõng OP töø söõa ñaàu tieân ñöôïc phaùt hieän(Smacchi 1998), töø -LA goïi laø -lactorphin, töø serum albumin goïi laø serorphin [10,18]. Tuy nhieân, ngöôøi ta cuõng tìm thaáy trong protein söõa moät soá peptide coù tính chaát ngöôïc laïi (ñoái vôùi heä thaàn kinh) vôùi caùc OP treân; nhöõng peptide naøy coù töø söï thuûy phaân -casein vaø-casein vaø ñöôïc goïi laø “casoxin”, noù aûnh höôûng leân chaát thuï caûm loaïi vaø , nhöng khaû naêng öùc cheá cuûa chuùng thì keùm hôn naloxone [10,18]. Tính chaát Trong caùc exorphin thöôøng coù goác tyrosine ôû ñaàu N vaø coù caùc goác amino acid chöùa voøng thôm (nhö tyrosine vaø phenylalanine) ôû vò trí thöù 3 hoaëc thöù 4 (ñoái vôùi -casein vaø 1 vaøi -cn thì coù 1 goác arginine ñöùng tröôùc tyrosine ôû ñaàu N), caáu truùc naøy giuùp cho peptide keát hôïp toát vôùi caùc cô quan thuï caûm (receptor). Ví duï [10,4]: -casomorphin: peptide ñoaïn 60-69 trong -cn (Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-His-Asn-Ser-OH) kích thích cô quan thuï caûm kieåu (-type receptor) (coù taùc duïng ñoái vôùi caùc bieåu hieän caûm xuùc, maát caûm giaùc ñau, haïn cheá vaän ñoäng cuûa ruoät vaø heä hoâ haáp). -casomorphin: peptide ñoaïn 90-96 trong -cn (Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu-OH) coù tính chaát kích thích cô quan thuï caûm kieåu (coù taùc duïng ñoái vôùi caùc bieåu hieän caûm xuùc vaø söï maát caûm giaùc ñau). Ngoaøi ra coøn coù caùc ñoaïn khaùc nhö 90-95, 91-96. -lactorphin: ñoaïn 50-53 cuûa -LA (Tyr-Gly-Leu-Phe-OH) coù tính chaát kích thích cô quan thuï caûm kieåu . Caùc OP naøy coù taùc duïng ñieàu hoøa caùc haønh vi cö xöû, laøm gia taêng hieän töôïng maát caûm giaùc ñau, keùo daøi thôøi gian vaän chuyeån cuûa thöùc aên trong ruoät, gia taêng söï haáp thuï caùc amino acid, chaát ñieän ly vaø nöôùc; kích thích tieát insulin vaø somastotatin (Meisel 1997b; Xu 1998). -lactorphin: ñoaïn 102-105 cuûa -LG (Tyr-Leu-Leu-Phe-OH) coù tính chaát kích thích cô quan thuï caûm kieåu . Tính chaát töông töï -lactorphin. Casoxin: caùc ñoaïn peptide töø 25-34, 35-41, 57-60 vaø 58-61 cuûa -cn . Khi ñöôïc ñöa vaøo maùu, nhöõng peptide naøy coù theå ñi tôùi naõo hay caùc cô quan khaùc vaø theå hieän nhöõng tính chaát töông töï nhö thuoác phieän hoaëc morphine. Ñoù coù theå laø lyù do khieán cho nhöõng ñöùa treû sô sinh trôû neân deã nguû sau khi uoáng söõa. Ngöôøi ta ñaõ laøm thí nghieäm vôùi caùc con beâ sô sinh cho thaáy -casomorphin ñöôïc vaän chuyeån nguyeân veïn qua thaønh ruoät vaøo maùu, sau ñoù noù gaây aûnh höôûng leân heä thaàn kinh gaây neân hieän töôïng buoàn nguû vaø traàm tónh (Clare 2000). Caùc peptide lieân keát vôùi khoaùng Phospho trong söõa coù khoaûng 900mg/lít, coù theå phaân thaønh caùc loaïi [11]: Voâ cô: phosphate hoøa tan vaø ôû daïng dung dòch keo Höõu cô: trong phospholipid, casein vaø ñöôøng phosphate, nucleotide Casein chöùa khoaûng 0.85% phospho; trong ñoù , vaø -cn chöùa töông öùng laø 1.1, 0.6, 0.16% phospho. Neáu tính theo mol thì , , vaø -cn chöùa töông öùng 8(9), 10-13, 5(4), vaø 1(2,3) mol phospho trong 1 mol phaân töû protein. Phospho coù vai troø raát quan troïng trong söõa[11]: Veà maët dinh döôõng, noù coù theå keát hôïp vôùi caùc chaát khoaùng nhö Ca2+, Zn2+… Laøm taêng tính hoøa tan cuûa casein Laøm taêng tính beàn nhieät cho casein Coù aûnh höôûng tôùi quaù trình ñoâng tuï ñeå saûn xuaát phoâ mai. Ôû ñaây chuùng ta quan taâm ñeán khaû naêng lieân keát vôùi khoaùng cuûa phospho trong söõa. Phospho lieân keát hoùa trò vôùi protein khaù beàn vöõng. Lieân keát naøy chæ bò phaù vôõ khi coù cheá ñoä xöû lyù nhieät cao, pH cao vaø söû duïng phosphatase. Phosphate chuû yeáu taïo lieân keát ester vôùi serine (vaø moät ít vôùi threonine) taïo monoester: Söï phosphoryl hoùa xuaát hieän trong maøng membrane cuûa theå Golgi cuûa teá baøo ñoäng vaät höõu nhuõ, ñöôïc xuùc taùc bôûi serine-specific casein kinase. Sau khi ñöôïc giaûi phoùng, nhöõng peptide ñöôïc phosphoryl hoùa naøy (casein phosphopeptide) lieân keát vôùi caùc ion, chuû yeáu laø Ca2+, moät ít Zn 2+, Fe2+, Cu2+, Mn 2+. Töø thöù töï caùc amino acid trong phaân töû protein (casein) vaø töø caùc thí nghieäm thöïc teá, ngöôøi ta nhaän thaáy haàu heát CPP (calcium-binding phosphopeptides) coù chöùa 3 nhoùm serine phosphate vaø theo sau bôûi 2 goác glutamic (Ser-Ser-Ser-Glu-Glu) [10, 11, 25, 30]. CPP laø 1 trong nhöõng chaát beàn vöõng nhaát ñoái vôùi söï thuûy phaân cuûa enzyme trong ruoät, vaø haàu heát noù ñöôïc tìm thaáy döôùi daïng phöùc vôùi canxi phosphate [10]. Söï keát hôïp vôùi Ca2+ taïo neân khaû naêng hoøa tan cao hôn vaø do ñoù Ca2+ deã daøng ñöôïc haáp thu hôn. Töø ñoù, CPP coù theå coù taùc duïng coù ích cho vieäc giuùp xöông cöùng chaéc. Ngoaøi ra, CPP cuõng giuùp laøm giaûm hieän töôïng saâu raêng thoâng qua vieäc taùi taïo canxi cho men raêng vaø öùc cheá söï baùm dính cuûa caùc vi khuaån hình thaønh böïa raêng. Do coù tính chaát naøy, chuùng ñöôïc öùng duïng ñeå ñieàu trò caùc beänh veà raêng vaø ñöôïc cho vaøo trong kem ñaùnh raêng (Darragh 2002). 2.1.3 Caùc peptide aûnh höôûng leân heä mieãn dòch cuûa cô theå Cho ñeán nay thì ngöôøi ta vaãn chöa hieåu roõ raøng cô cheá laøm cho caùc peptide coù aûnh höôûng leân heä mieãn dòch cuûa cô theå (immunopeptide-IP). Moät soá peptide töø söõa coù theå aûnh höôûng ñeán caû heä mieãn dòch vaø söï sinh saûn cuûa teá baøo. Baûng 2.3 Moät soá peptide aûnh höôûng leân heä mieãn dòch cuûa cô theå coù trong söõa Nguoàn goác Peptide -cn Ñoaïn 191-193: Leu-Leu-Tyr-OH; ñoaïn 63-68: Pro-Gly-Pro-Ile-His (Pro)-Asn-OH, ñoaïn 193-209 [10] -cn Ñoaïn 194-199: Thr-Thr-Met-Pro-Leu-Trp-OH -LG Ñoaïn 22-25: Leu-Ala-Met-Ala-OH; ñoaïn 25-40, 78-83, 92-100 -LA Ñoaïn 51-53: Gly-Leu-Phe-OH; ñoaïn 1-5, 61-68, 75-80, 17-31, 104-109, Ta nhaän thaáy trong caùc peptide naøy coù chöùa raát nhieàu goác amino acid khoâng phaân cöïc (öa beùo) nhö: Leu, Phe, Ala, Val, Pro,Trp, Ile. Caùc -casokinin cuõng coù aûnh höôûng leân heä mieãn dòch (ngoaøi vieäc öùc cheá ACE). Naêm 1989, Migliore-Samour vaø coäng söï ñaõ phaùt hieän ra moät soá peptide coù nguoàn goác töø protein hoøa tan (whey) khaû naêng kích thích thöïc baøo ôû ngöôøi vaø ñaïi thöïc baøo ôû chuoät baûo veä cô theå chuoät choáng laïi vieäc nhieãm Klebsiella pneumoniae. Chuoät söû duïng caùc peptide töø söõa leân men bôûi Lactobacillus helveticus cho thaáy raèng coù söï gia taêng cuûa IgA vaø giaûm kích thöôùc caùc khoái u döôùi da (Leblanc 2002). Moät soá IP töø söõa cuõng coù khaû naêng laøm giaûm söï nhieãm truøng ôû caùc beänh nhaân giai ñoaïn ñaàu cuûa beänh AIDS (Meisel, 1998). Gaàn ñaây ngöôøi ta ñaõ chöùng minh ñöôïc raèng trong quaù trình thuûy phaân bôûi caùc enzyme cuûa heä tieâu hoùa, caùc IP ñöôïc giaûi phoùng töø whey protein isolate (Mercier vaø coäng söï 2004). GMP vaø moät soá peptide coù töø noù ñaõ ñöôïc bieát laø coù khaû naêng ñieàu hoøa heä mieãn dòch, ví duï nhö noù ñieàu hoøa vieäc saûn xuaát ra khaùng theå IgG (Monnai vaø coäng söï 1998; Manso & Lo pez-Fandino, 2004). Trong nhoùm peptide naøy, ta coù theå noùi ñeán moät soá peptide coù khaû naêng khaùng khuaån. Casecidin laø moät trong nhöõng peptide ñaàu thuoäc loaïi naøy maø ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän ñöôïc (coù ñöôïc khi cho thuûy phaân casein bôûi chymosin ôû pH trung tính, laø thaønh phaàn cuûa -cn vaø -cn, coù phaân töû löôïng khoaûng 4000-6000 Da). Peptide naøy coù khaû naêng öùc cheá moät soá vi khuaån Gram (+) nhö Staphylococcus, Sarcina, Bacillus subtilis, Diplococcuspneumoniae, vaø Streptococcus pyogenes [10]. Peptide casocidin-I (ñoaïn 165-203 cuûa -cn) coù khaû naêng öùc cheá Staphylococcus carnosus vaø E.coli. Peptide isracidin (ñoaïn 1-23 cuûa -cn coù ñöôïc nhôø thuûy phaân bôûi chymosin vaø chymotrypsin) coù khaû naêng öùc cheá Staphylococcus aureus vaø Candida albicans [10]. Caùc peptide aûnh höôûng leân heä tuaàn hoaøn Trong loaïi peptide naøy, ngöôøi ta thöôøng quan taâm ñeán caùc peptide coù khaû naêng laøm giaûm huyeát aùp do hieän nay coù raát nhieàu ngöôøi maéc beänh cao huyeát aùp. Angiotensin I converting enzyme (ACE- peptidyldipeptide hydrolase, EC 3.4.15.1) coù lieân quan ñeán heä rennin-angiotensin, coù lieân quan ñeán huyeát aùp vaø cuõng lieân quan ñeán caân baèng muoái vaø nöôùc. ACE chuyeån angiotensin I thaønh angiotensin II (moät chaát coù khaû naêng laøm co maïch maùu (vasoconstrictor)), ñoàng thôøi phaân huûy bradykinin (moät chaát coù khaû naêng laøm giaõn maïch maùu (vasodilator)). Chính vì vaäy vieäc öùc cheá enzyme naøy seõ daãn ñeán vieäc choáng laïi hieän töôïng cao huyeát aùp. Hình 2.5: Heä renin-angiotensin, söï töông taùc giöõa caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc vôùi caùc cô quan thuï caûm vaø nhöõng aûnh höôûng. ACE hoaït ñoäng nhö moät dipeptidyl carboxypeptidase, noù loaïi dipeptide töø ñaàu C cuûa cô chaát (coù ñaàu C töï do). Noù öu tieân keát hôïp ñoái vôùi cô chaát coù caùc amino acid kò nöôùc ôû 3 vò trí cuoái, vaø coù 1 ít aùi löïc ñoái vôùi cô chaát coù amino acid coù 2 nhoùm carboxy ôû ñaàu C (Glu, Asp) hoaëc coù Proline ôû vò trí aùp choùt. Ngöôøi ta thaáy raèng ACE coù Glu, Tyr vaø Arg ôû taâm hoaït ñoäng. Hình 2.6: Moâ hình taâm hoaït ñoäng cuûa ACE vaø töông taùc cuûa noù vôùi cô chaát peptide (Bunning, 1987) Chaát öùc cheá ACE ñaàu tieân ñöôïc phaùt hieän trong noïc raén Bothrops jararaca vaøo naêm 1970. Trong noïc raén naøy coù caùc peptide öùc cheá ACE coù töø 5-13 goác amino acid trong phaân töû, trong soá ñoù coù peptide Glu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro laø coù hoaït tính cao nhaát in vivo. Moät peptide khaùc laø bradykinin-potentiating peptide 5a (BPP5a) Glu-Lys-Trp-Ala-Pro coù thöù töï 3 amino acid cuoái ôû ñaàu C raát phuø hôïp cho vieäc keát hôïp vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa ACE, tuy nhieân peptide naøy laïi deã bò phaân huûy trong ñieàu kieän in vivo. Do ñoù, ngöôøi ta ñaõ thay theá goác Trp trong phaân töû baèng goác Phe ñeå coù ñöôïc phaân töû beàn hôn nhöng vaãn coù hoaït tính öùc cheá ACE maïnh. Vaø cuõng töø ñoù, haàu heát caùc thuoác öùc cheá ACE ñöôïc söû duïng ñeàu coù caáu truùc töông töï hay lieân quan ñeán tripeptide Phe-Ala-Pro. Hình 2.7: Giaû thuyeát veà söï töông taùc cuûa peptide vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa ACE Hình 2.8: Giaû thuyeát veà söï töông taùc cuûa Captopril vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa ACE Hình 2.9: Giaû thuyeát veà söï töông taùc cuûa Enalaprilat vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa ACE Hai hình treân cho thaáy 2 loaïi thuoác öùc cheá ACE coù caáu truùc töông töï nhö peptide Ala-Pro vaø Phe-Ala-Pro. Captopril töông töï nhö Ala-Pro, trong ñoù Alanin öùng vôùi peptide ñöôïc thay theá bôûi nhoùm coù –HS (sulfhydryl) coù khaû naêng töông taùc maïnh hôn ion Zn2+ trong enzyme. Coøn ñoái vôùi Enalaprilat thì töông töï nhö Phe-Ala-Pro nhöng Enalaprilat lieân keát maïnh hôn vôùi ACE nhôø nhoùm carboxyl so vôùi nhoùm carbonyl trong tripeptide. IC50 cuûa Enalaprilat vaø Captopril laàn löôït laø 2.8 vaø 9.7 nM, töùc laø hoaït tính raát maïnh. Caùc peptide öùc cheá ACE coù nguoàn goác töø casein goïi laø “casokinin” vaø töø whey goïi laø “lactokinin” . Coù raát nhieàu peptide öùc cheá ACE ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong protein thöïc phaåm, ñaëc bieät laø protein töø söõa. Caùc peptide khaùc nhau thì theå hieän hoaït tính khaùc nhau. So vôùi caùc peptide ñi töø casein thì caùc peptide ñi töø huyeát thanh söõa ít ñöôïc nghieân cöùu hôn. Tính chaát: Nhö treân ñaõ noùi, peptide öùc cheá ACE thöôøng coù 3 amino acid kò nöôùc ôû vò trí cuoái vaø nhaát laø goác amino acid cuoái cuøng(ñaàu C). Goác amino acid cuoái cuøng ôû ñaàu C thöôøng laø Pro, tuy nhieân noù cuõng coù theå laø Lys hoaëc Arg, 2 amino acid naøy (öa nöôùc) tích ñieän döông ôû nhoùm -amino. Ngöôøi ta nhaän thaáy coù moái lieân heä giöõa caáu truùc cuûa peptide vôùi khaû naêng öùc cheá ACE laø hoaït tính öùc cheá ACE cuûa dipeptide coù Pro ôû ñaàu C thì cao hôn so vôùi khi ñaàu C laø Tyr, vaø Tyr > Phe. Khi ñöôïc ñöa vaøo cô theå thì peptide coù Tyr ôû ñaàu C coù taùc ñoäng chaäm hôn nhöng keùo daøi hôn so vôùi peptide coù Phe ôû ñaàu C (Suetsuna, 1998). Vieäc coù caùc amino acid kò nöôùc trong phaân töû vaø nhaát laø protein laøm cho caùc peptide naøy coù khaû naêng choáng laïi söï thuûy phaân toát hôn. Trp-Ala-Pro laø peptide coù caáu truùc thích hôïp nhaát cho vieäc keát hôïp vôùi taâm hoaït ñoäng cuûa ACE. Baûng 2.4: Moät soá peptide coù taùc duïng laøm giaûm huyeát aùp ñaõ ñöôïc nghieân cöùu in vivo Saûn phaåm, nguoàn Peptide Tham khaûo Thuûy phaân -casein baèng trypsin Caùc saûn phaåm thuûy phaân Sekiya et al. (1992) Söõa chua -casein, -casein, Val-Pro-Pro /Ile-Pro-Pro Hata et al. (1996) Söõa chua Val-Pro-Pro /Ile-Pro-Pro Seppo et al. (2003) Söõa chua Val-Pro-Pro, Ile-Pro-Pro Mizushima et al. (2004) Söõa chua (Dahi) -casein Ashar and Chand (2004) Baûng 2.5: Aûnh höôûng öùc cheá ACE vaø giaûm huyeát aùp cuûa moät soá peptide thu nhaän töø quaù trình thuûy phaân whey protein bôûi moät soá enzyme Maãu ACE inhibitory activity (%) Decreased SBP0 (mm Hg) Whey protein (ban ñaàu) 0.0 -38 ± 2 pepsin 83.7 -47 ± 3 trypsin 56.7 -51 ± 4 - chymotrypsin 76.0 -40 ± 4 proteinase K 95.7 -55 ± 3 actinase E 55.7 -55 ± 4 thermolysin 98.6 -42 ± 4 papain 86.5 -47 ± 4 Möùc ñoä giaûm huyeát aùp sau 6h söû duïng. Ñaäu naønh Ñaäu naønh cuõng laø moät nguoàn thöïc phaåm giaøu protein, noù cuõng coù nhieàu tieàm naêng cung caáp caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc. Trung bình, ñaäu naønh coù chöùa 40% protein, goàm nhieàu loaïi protein. Theo ExPASy thì hieän nay ngöôøi ta nhaän thaáy coù toång coäng 1411 protein. Thaønh phaàn protein chuû yeáu laø - conglycinin vaø glycinin, chieám töø 65% - 80% toång löôïng protein. Ngoaøi ra cuõng coù nhieàu loaïi enzyme trong ñaäu naønh (lipoxygenase, chalcone synthase, catalase, urease) tuy nhieân noù chæ chieám moät löôïng nhoû khoaûng 1%. Baûng 2.6: Moät vaøi protein trong ñaäu naønh Phaân ñoaïn (S) Haøm löôïng (%) Thaønh phaàn Phaân töû löôïng (Da) 2 15 Chaát öùc cheá trypsin 7860-21500 7 35 Cytochrome C -amylase Lipoxygenase Hemagglutinines Globulin -conglycinine 12000 62000 102000 110000 140000 175000 11 40 320000-350000 15 10 Polymer cuûaglycinine 600000 Glycinin (goàm 6 tieåu phaàn) khoâng chöùa carbohydrate, trong khi ñoù - conglycinin (goàm 6 tieåu phaàn) laø moät glycoprotein coù chöùa khoaûng 4-5% carbohydrate (chuû yeáu laø mannose vaø N-acetyl-D-glucosamine). Moät soá protein khaùc cuõng coù theå bò phosphoryl hoùa vaø/hoaëc glycosyl hoùa [30]. Protein ñaäu naønh chöùa 11 amino acid caàn thieát cho cô theå, nhöng noù laïi ít amino acid chöùa löu huyønh (nhaát laø Met) [19]. Trong caùc saûn phaåm thuûy phaân cuûa ñaäu naønh hoaëc trong thöïc phaåm töø ñaäu naønh leân men thì protein chæ bò thuûy phaân moät phaàn, bôûi vì caùc protease khoâng theå phaù vôõ glycoprotein, phosphoprotein, nhöõng protein bò bieán ñoåi sau khi dòch maõ. Ñeå thu ñöôïc nhieàu peptide, moät soá thí nghieäm ñaõ söû duïng alkaline phosphatase vaø endoglycosidase ñeå xöû lyù tröôùc, sau ñoù môùi duøng protease ñeå thuûy phaân. Trong caùc thí nghieäm cuûa mình, Astwood, Leach vaø Fuchs (1996) ñaõ nhaän thaáy - conglycinin khaù beàn vôùi söï thuûy phaân baèng acid vaø trypsin. Vieäc dephosphoryl hoùa vaø deglycosyl hoùa tröôùc khi thuûy phaân protein seõ giuùp quaù trình thuûy phaân xaûy ra thuaän lôïi hôn, ñaëc bieät laø ñoái vôùi - conglycinin. Moät soá glycosidase ñöôïc söû duïng nhö: N-glycanase, O-glycanase, a-mannosidase vaø endoglycosidase H. Glycinin laø tieàn chaát cuûa haàu heát caùc peptide maø ngöôøi ta taùch ñöôïc; trong khi ñoù, - conglycinin thì chæ bò thuûy phaân moät phaàn thaäm chí ngay caû khi noù ñaõ ñöôïc loaïi boû 4% nhöõng vuøng bò glycosyl hoùa. choáng taêng huyeát aùp dipdptidyl-aminopeptidase IV inhibitor ñieàu hoøa heä mieãn dòch lieân quan ñeán heä thaàn kinh choáng oxi hoùa choáng ñoâng maùu, choáng laïi chöùng hay queân . . : coù taùc duïng khaùc (öùc cheá, lieân keát, ñieàu hoøa…) Baûng 2.7: Ví duï veà moät soá peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nguoàn goác töø ñaäu naønh Nguoàn goác Caùch thu nhaän Peptide Hoaït tính Tham khaûo Soy protein isolate (SPI) Duøng proteases: pepsin, papain, vaø chymotrypsin vaø 1 soá proteases: alcalase, Protamex, vaø Flavourzyme Möùc ñoä thuûy phaân SPI töø 1.7% ñeán 20.6% Choáng oxi hoùa. Caû thaønh phaàn thuûy phaân vaø chöa ñöôïc thuûy phaân laøm giaûm thiobarbituric acid (töø 28-65%), tröø maãu ñöôïc thuûy phaân baèng papain. Maãu ñöôïc thuûy phaân baèng chymotripsin vaø flavourzyme (0.5 giôø) coù tính öùc cheá quaù trình oxi hoùa lipid maïnh nhaát. Pena-Ramos Vaø Xiong 2002 Soybean protein concentrate, crocksoy 70, ñöôïc trích ly baèng coàn 80%. Pepsin töø heo, trypsin töø tuyeán tuïy cuûa boø, hoaëc chæ trypsin Caùc peptide coù phaân töû löôïng khaùc nhau ñöôïc taùch bôûi quaù trình sieâu loïc Taêng söï haáp thu vaø phaân giaûi low-density lipoproteins bôûi “HepG2 cell receptors” Arnoldi 2001 Boät ñaäu naønh hoaëc boät mì Papain hoaëc pronase Caùc peptide ñöôïc taùch bôûi sieâu loïc Kích thích söï phaùt trieån (thí nghieäm vôùi chuoät) Franek 2000 Soy protein taùch beùo Thermolase X-Met-Leu-Pro-Ser-Tyr- Ser-Pro-Tyr Choáng ung thö Kim 2000 Boät ñaäu naønh taùch beùo Alcalase Caùc thaønh phaàn ñöôïc taùch nhôø nhöïa trao ñoåi cation Laøm giaûm huyeát aùp Wu vaø Ding 2000 Soy protein Protease D3 (1) Tyr-Val-Val-Phe-Lys (2) Pro-Asn-Asn-Lys-Pro-Phe-Gln (3) Asn-Trp-Gly-Pro-Leu-Val (4) Ile-Pro-Pro-Gly-Val-Pro-Tyr-Trp-Thr (5) Thr-Pro-Arg-Val-Phe. Laøm giaûm huyeát aùp Khodera vaø Nio 2002 Ñaäu naønh Protease töø Bacillus subtilis PGTAVFK Choáng taêng huyeát aùp IC50 = 26.5M Kitts 2003 Glycinin ñaäu naønh Peptide töø glycinin ñaäu naønh LPYPR Laøm giaûm löôïng cholesterol Yoshikawa 2000 -conglycinin Laáy töø phaàn cuûa -conglycinin Soymetide-13: MITLAIPVNKPGR; Soymetide-9: MITLAIPVN; Soymetide-4: MITL Kích thích heä mieãn dòch bôûi “FPR receptor”, Soymetide-9: coù hoaït tính cao nhaát khi thöïc hieän thí nghieäm in vitro Yoshikawa 2000 Protein töø ñaäu naønh bieán ñoåi gen Proteinase S; alcalase; trypsin LPYPR Choáng oxi hoùa, choáng cao huyeát aùp Korhonen 2003 Saûn phaåm ñaäu daïng paste ñöôïc leân men cuûa Haøn Quoác Leân men HHL Choáng taêng huyeát aùp IC50 = 2.2M Shin 2001 Peptide aûnh höôûng ñeán heä tuaàn hoaøn Peptide coù tính chaát choáng oxi hoùa Moät vaøi amino acid nhö Tyr, Met, His, Lys vaø Trp coù tính chaát choáng oxi hoùa. Caùc tripeptide coù chöùa Tyr hoaëc Trp ôû ñaàu C thì coù hoaït tính daäp taét caùc goác töï do raát maïnh, trong khi ñoù, hoaït tính daäp taét peroxynitrite thì yeáu. Ngöôøi ta nhaän thaáy caùc peptide coù tính chaát choáng oxi hoùa coù theå keát hôïp vôùi caùc chaát choáng oxi hoùa khaùc, ví duï caùc hôïp chaát phenol, laøm taêng maïnh khaû naêng choáng oxi hoùa. Quaù trình xöû lyù nhieät khoâng laøm aûnh höôûng ñeán tính chaát choáng oxi hoùa cuûa caùc peptide, ñieàu ñoù cho thaáy thaønh phaàn caáu taïo cuûa peptide thì quan troïng hôn so vôùi hình daïng cuûa noù (trong vieäc choáng oxi hoùa) (Matoba 2002). Caùc peptide chöùa His ñöôïc cho laø coù theå hoaït ñoäng nhö laø metal-ion chelator, coù khaû naêng daäp taét caùc oxi hoaït ñoäng vaø caùc goác hydro töï do töø ñoù daãn tôùi khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa peptide Peptide choáng ung thö Baèng chöùng veà moái quan heä giöõa caùc peptide/protein cuûa ñaäu naønh vaø khaû naêng choáng ung thì chöa ñöôïc roõ raøng. Brit vaø coäng söï (2001) ñaõ keát luaän raèng flavone vaø isoflavonone trong ñaäu naønh coù tính chaát choáng ung thö, tuy nhieân caàn phaûi coù nhöõng nghieân cöùu sau nöõa ñeå laøm saùng toû baûn chaát cuûa söï töông taùc cuûa nhöõng thaønh phaàn naøy vôùi peptide/protein ñeán khaû naêng choáng ung thö. Hoaït tính choáng ung thö cuûa protein ñaäu naønh ñaõ ñöôïc ñeà caäp ñeán töø nhöõng naêm 1990. Ví duï, trypsin inhibitor ñaõ ñöôïc cho laø coù khaû naêng öùc cheá teá baøo ung thö ovarian (Kobayashi 2004). Vaø coù nhieàu khaû naêng hoaït tính choáng ung thö cuûa ñaäu naønh coù ñöôïc töø caùc peptide cuûa noù. Ví duï, caùc peptide coù ñöôïc töø söï thuûy phaân protein ñaäu naønh ñaõ taùch beùo, thuûy phaân baèng thermolase, sau ñoù ñöôïc tinh saïch baèng ethanol vaø saéc kyù loïc gel, cho thaáy giaù trò IC50 0.16mg/ml in vitro (thí nghieäm treân chuoät). Ôû noàng ñoä 1 mg/ml noù coù aûnh höôûng tôùi söï sinh tröôûng vaø sinh saûn cuûa teá baøo nhôø khaû naêng giöõ teá baøo trong pha G2/M. Lunasin laø moät peptide coù töø phaàn 2S albumin cuûa ñaäu naønh. Noù coù chöùa 43 amino acid, coù ñuoâi laø 9 goác aspartic, noù coù khaû naêng baùm dính vaøo teá baøo. Lunasin coù khaû naêng baùm dính vaøo non-acetylated H3 vaø H4 histone vaø ngaên caûn chuùng acetyl hoùa. Ngöôøi ta tin raèng chính cô cheá naøy laøm cho noù coù khaû naêng choáng ung thö (de Lumen 2005). Peptide ñieàu hoøa heä mieãn dòch Moät peptide (MITLAIPVNKPGR) coù hoaït tính kích thích hoaït ñoäng cuûa caùc baïch caàu. Peptide naøy ñöôïc taùch ra töø quaù trình thuûy phaân protein ñaäu naønh baèng trypsin. Noù coù nguoàn goác töø phaàn cuûa -conglycinin. Methionine ôû ñaàu N cuûa peptide caàn thieát cho hoaït tính cuûa noù, trong khi ñoù, amino acid thöù 3 keå töø ñaàu N laïi coù aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa peptide (Thr < Phe < Trp). Ñoái vôùi phaàn cuûa -conglycinin thì amino acid ñaàu tieân laø Ile, amino acid thöù 3 laø Lys thì ngöôøi ta khoâng nhaän thaáy hoaït tính cuûa peptide coù nguoàn goác töø noù. Qua quaù trình ñoät bieán, ngöôøi ta ñaõ thay theá amino acid thöù nhaát cuûa phaàn naøy baèng Met vaø amino acid thöù 3 baèng Thr / Phe / Trp, töø ñoù ngöôøi ta nhaän thaáy peptide thu ñöôïc coù hoaït tính kích thích hoaït ñoäng cuûa baïch caàu (Maruyama 2003). [30] Moät soá peptide coù tính chaát choáng oxi hoùa, choáng laïi söï oxi hoùa caùc acid beùo chöa no. Chuùng laøm maát caùc goác töï do, keát hôïp taïo phöùc vôùi ion kim loaïi maø coù khaû naêng xuùc taùc cho söï oxi hoùa. Tyrosine vaø histidine raát deã bò aûnh höôûng bôûi söï oxi hoùa, noù coù raát nhieàu trong thaønh phaàn cuûa caùc peptide töø ñaäu naønh. Methionine, lysine vaø tryptophan cuõng coù tính chaát töông töï. Khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa peptide ñöôïc gia taêng khi coù maët goác proline trong phaân töû, noù laø taêng khaû naêng töông taùc vôùi caùc acid beùo chöa no (Dziuba 1999a). 2.3 CAÙC THÖÏC PHAÅM KHAÙC Baûng 2.8: Caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nguoàn goác töø moät soá thöïc phaåm Nguoàn goác Caùch thu nhaän Peptide Hoaït tính Tham khaûo Rubisco töø rau spinach Toång hôïp; pepsin vaø leucine aminopeptidase (LAP) Rubiscolin-5 YPLDL, Rubiscolin-6 YPLDLF IC50 = 51.0M vaø 24.4M khi thí nghieäm vôùi chuoät Yang 2001 Gluten Laáy töø gluten Gluten exophin: GEA5:GYYPT GEA4:GYYP GEB5:YGGWL GEB4:YGGW GEC: YPISL GEA5 theå hieän hoaït tính -opiois cao hôn GEA4. GEB5 > GEB4 > GEC > GEA. Yoshikawa 2003 Luùa mì Pepsin, chymotrypsin vaø trypsin VK, FY, YQY, PSY Öùc cheá ACE, IC50 = 140g/ml (tröôùc khi thuûy phaân IC50 = 360g/ml) IC50 = 13, 25, 4, 16M töông öùng Liam 2002 Albumin töø gaïo trypsin Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg. Ñieàu hoøa heä thaàn kinh Kitts vaø Weiler 2003 -Zein Thermolysin LQP, LLP, LSP, LAA, FY Öùc cheá ACE, IC50 = 1.9, 57, 1.7, 13vgb, 25M töông öùng Yamamoto 2003 Protein isolates töø hoa höôùng döông Duøng pepsin roài duøng tieáp pancreatin FVNPQAGS Öùc cheá ACE, IC50 = 5.7M Megias 2004 Caù bonito Thermolysin (LKP)MN Öùc cheá ACE Yoshikawa,2000 Thòt gaø Thermolysin Ile-Lys-Trp vaø Leu-Lys-Pro Choáng cao huyeát aùp Korhonen vaø Pihlanto 2003 Protein caù moøi Bacillus licheniformis alkaline protease The ethanol fraction obtained with a chromatographic resin Öùc cheá ACE, IC50 = 15g/ml Matsui 1993 Ovalbumin cuûa tröùng gaø *Chymotrypsin vaø trypsin * Pepsin * RADHPF (ñoaïn 359-364 cuûa ovalbumin) * FRADHPFL Ñieàu hoøa vieäc co daõn maïch maùu. Matoba 1999 Söõa ong chuùa Tröôùc tieân duøng pepsin, keá ñeán duøng trypsin vaø chymotrypsin Caùc saûn phaåm sau thuûy phaân Öùc cheá ACE, IC50 = 90g/ml Matsui 2002 Baûng 2.9: Moät vaøi peptide coù hoaït tính öùc cheá ACE [14] Nguoàn protein Thöù töï acid amin IC50 (M) Giaûm SBP (mmHg ôû [mg/kg BW])O Tham khaûo gelatin GPAGAZ + GPPGAZ 8 Oshima et al., 1979 -zein LRP 0.3 15 [30]a Miyoshi et al., 1991a Moâ cô heo MNP 67 Arihara et al., 2001 Ñaäu xanh 0.1 Pedroche et al., 2002 wakame YNKL 21 50 [50] Suetsuna vaø Nakano,2000. Toûi FY 4 25 [200] Suetsuna, 1998 Luùa kieàu maïch YQY, PSY 4 30 [100]b Li et al., 2002 Söõa ong chuùa DGL 2 23 [1000] Matsui et al., 2002c Maàm luùa maïch I(VY) 0.5 (5) 19 [5]a (18 [50]) Matsui et al., 1999; Matsui et al., 2000 Caù bonito (LKP)NM 2 (0.3) 14 [15] (16 [9]) Fujita vaø Yoshikawa,1999. Hemoglobin maùu heo FQKVVA 6 30 [50] Mito et al., 1996 Ruoät caù bonito IRPVQ 1 19 [100] Karaki et al., 1993 Ñaäu naønh DLP 5 38 [100]b* Wu vaø Ding, 2001;2002. Cyclo (His-Pro) (CHP) laø 1 dipeptide maïch voøng coù nhieàu chöùc naêng sinh hoïc. Nhö nhieàu di-tripeptide khaùc, CHP coù theå ñöôïc haáp thuï trong ruoät non khi vaøo cô theå. CHP-LI ( cyclo (His-Pro)-like immunoreactivity) ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong 1 soá thöïc phaåm. Baûng 2.10: CHP-LI trong moät soá thöïc phaåm Loaïi thöïc phaåm CHP-LI (pmol/g thöïc phaåm) Haøm löôïng /100g Protein (g) Chaát beùo (g) Glucid (g) Mì oáng 76 13.0 2.9 73 Hot dog 73 12.5 27.6 1.8 Thòt ñuøi heo 131 14.4 14.4 <1 Tröùng gaø 23 12.8 11.5 0.7 Baùnh mì (traéng) 88 7 3.5 49 Caù ngöø 2058 84 7 0 Söõa nguyeân kem 6 3.2 3.7 4.6 Nöôùc maém 5209 21.1 1.2 0 Toâm khoâ 6576 83.1 7.06 3.7 Nguoàn goác chính xaùc cuûa CHP-LI trong thöïc phaåm thì khoâng ñöôïc roõ raøng, nhöng coù nhieàu baèng chöùng cho thaáy noù hình thaønh töø quaù trình thuûy phaân protein trong quaù trình cheá bieán thöïc phaåm hôn laø do söï thuûy phaân bôûi enzyme trong thöïc phaåm. Moät vaøi peptide coù khaû naêng laøm co cô trôn, vieäc naøy ñöôïc phaùt hieän khi ngöôøi ta nghieân cöùu in vitro khi söû duïng 1 ñoaïn ruoät hoài. Ví duï: albutensin A töø serum albumin söõa boø, -lactotensin töø -lactoglobulin vaø oryzatensin töø gaïo [14]. Moät soá peptide coù khaû naêng öùc cheá caùc enzyme, ví duï prolyl endopeptidase maø coù aûnh höôõng ñeán chöùng hay queân (Dziuba 1999a), vaø amio- vaø endopeptidase cuûa vi khuaån lactic vaø Pseudomonas fluorescens ( Smacchi 1998). Chöông 3: CAÙC PHÖÔNG PHAÙP THU NHAÄN PEPTIDE COÙ HOAÏT TÍNH SINH HOÏC P eptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nhieàu öùng duïng trong thöïc phaåm vaø döôïc phaåm. Ngöôøi ta coù theå thu nhaän ñöôïc caùc peptide naøy baèng nhieàu phöông phaùp khaùc nhau, moãi phöông phaùp coù nhöõng öu, nhöôïc ñieåm rieâng vaø phuø hôïp cho töøng loaïi peptide. Phöông phaùp toång hôïp hoùa hoïc Lieân keát peptide ñöôïc hình thaønh töø söï keát hôïp giöõa nhoùm carboxy cuûa amino acid thöù nhaát vôùi nhoùm amino cuûa amino acid thöù hai vaø loaïi ñi moät phaân töû nöôùc. Söï hình thaønh lieân keát peptide döôùi ñieàu kieän oân hoøa chæ coù theå xaûy ra khi nhoùm carboxy cuûa amino acid ñöôïc hoaït hoùa; ñoàng thôøi, amino acid coøn laïi taán coâng vaøo nhoùm carboxy naøy (theo cô cheá aùi nhaân) vaø töø ñoù hình thaønh dipeptide. Khaùc vôùi nhieàu loaïi hôïp chaát höõu cô khaùc, caùc phaûn öùng toång hôïp (ñieàu cheá) peptide raát phöùc taïp. Khoâng theå toång hôïp ñöôïc peptide mong muoán nhôø phaûn öùng truøng ngöng caùc phaân töû aminoacid khaùc nhau vì seõ taïo ra hoãn hôïp caùc peptide. Ví duï tröôøng hôïp ñôn giaûn nhaát laø ngöng tuï 2 phaân töû amino acid seõ taïo ra tôùi 4 dipeptide: Gly + Ala Gly-Gly Gly + Ala Ala-Ala Gly + Ala Gly-Ala Gly + Ala Ala-Gly Do vaäy ñeå toång hôïp moät peptide coù traät töï xaùc ñònh caùc ñôn vò amino acid trong phaân töû thì caàn phaûi “baûo veä” nhoùm amino hay nhoùm carboxyl naøo ñoù khi khoâng caàn chuùng tham gia phaûn öùng taïo ra lieân keát peptide. Do ñoù, quaù trình toång hôïp peptide thì caàn phaûi traûi qua 3 böôùc: Böôùc 1: Baûo veä nhoùm amino hay carboxy naøo ñoù maø chuùng khoâng caàn tham gia phaûn öùng taïo lieân keát peptide. Böôùc 2: Hình thaønh lieân keát peptide. Goàm 2 böôùc nhoû: Amino acid maø coù nhoùm amino ñöôïc baûo veä phaûi ñöôïc hoaït hoùa nhoùm carboxy ñeå coù theå chuyeån thaønh daïng trung gian coù hoaït tính cao. Hình thaønh lieân keát peptide (Hai böôùc nhoû naøy coù theå dieãn ra lieân tuïc hay taùch rôøi thaønh 2 böôùc) Böôùc 3: Taùch rôøi caùc nhoùm baûo veä (moät phaàn hoaëc toaøn boä). Maëc duø caàn phaûi taùch caùc nhoùm naøy sau khi toaøn boä chuoãi peptide ñöôïc hình thaønh, nhöng ngöôøi ta thöôøng taùch choïn loïc trong quaù trình toång hôïp ñeå coù theå tieáp tuïc quaù trình truøng ngöng. Nhoùm baûo veä caàn phaûi thoûa maõn moät soá tieâu chuaån sau: Deã gaén vaøo phaân töû amino acid. Baûo veä ñöôïc nhoùm chöùc trong ñieàu kieän hình thaønh caùc lieân keát peptide. Trong quaù trình thöïc hieän khoâng xaûy ra hieän töôïng racemic hoùa Deã loaïi ra maø khoâng aûnh höôûng ñeán söï toàn taïi cuûa caùc lieân keát peptide vaø caùc nhoùm baûo veä baùn vónh vieãn. Baûo veä nhoùm amino Nhoùm amino thöôøng ñöôïc baûo veä bôûi nhoùm benzyloxicarbonyl (C6H5–CH2–COO–coøn goïi laø carbobenzoxi) baèng caùch cho aminoacid phaûn öùng vôùi benzyl clofomiat (C6H5 – CH2 – COO – Cl, carbobenzoxi clorua) trong dung dòch kieàm. Sau khi toång hôïp ñöôïc peptide, nhoùm baûo veä seõ ñöôïc loaïi ra khoûi phaân töû peptide nhôø phaûn öùng hydro phaân. Baûng 3.1: Ví duï veà moät soá nhoùm coù taùc duïng baûo veä nhoùm N-amino Baûo veä nhoùm carboxyl Nhoùm carboxyl thöôøng ñöôïc baûo veä baèng caùch chuyeån thaønh metyl hay etyl hoaëc benzyl este. Nhoùm este deã thuûy phaân hôn nhoùm peptide neân ñöôïc loaïi ra khoûi phaân töû peptide baèng caùch thuûy phaân bôûi dung dòch kieàm. Rieâng nhoùm benzyloxi (C6H5 – CH2O –) coøn ñöôïc loaïi nhôø phaûn öùng hydro phaân. Baûng 3.2: Ví duï veà moät soá nhoùm coù taùc duïng baûo veä nhoùm C-carboxy Quaù trình toång hôïp peptide trôû neân phöùc taïp hôn bôûi moät soá amino acid coù caùc nhoùm chöùc khaùc caàn phaûi baûo veä ( 10 amino acid: Ser, Thr, Tyr, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Sec (selenocysteine (kyù hieäu baèng 1 chöõ caùi laø U)) vaø Cys). Do ñoù, caàn phaân bieät moät soá nhoùm chöùc caàn ñöôïc baûo veä taïm thôøi vaø moät soá nhoùm chöùc caàn phaûi ñöôïc baûo veä “baùn vónh vieãn”. Nhöõng nhoùm coù nhieäm vuï baûo veä taïm thôøi (intermediary / temporary / transient group) nhöõng nhoùm chöùc amino hay carboxy coù lieân quan ñeán söï hình thaønh lieân keát peptide sau naøy, nhöõng nhoùm naøy caàn phaûi ñöôïc “thaùo ra” döôùi ñieàu kieän sao cho khoâng laøm aûnh höôûng ñeán söï oån ñònh cuûa caùc lieân keát peptide ñaõ ñöôïc hình thaønh vaø caùc nhoùm baûo veä baùn vónh vieãn. Caùc nhoùm baûo veä baùn vónh vieãn thöôøng ñöôïc thaùo ra ôû cuoái quaù trình toång hôïp peptide hoaëc coù theå laø ôû moät soá giai ñoaïn trung gian cuûa quaù trình. Trong quaù trình toång hôïp peptide, moät soá phaûn öùng xuaát hieän maø coù lieân quan ñeán nhöõng nhoùm chöùc maø thöôøng ñöôïc lieân keát vôùi taâm khoâng ñoái xöùng, do ñoù seõ coù nguy cô bò racemic hoùa. Söï taùch rôøi caùc nhoùm baûo veä thöôøng laø böôùc cuoái cuøng cuûa quaù trình toång hôïp peptide ngoaïi tröø dipeptide. Vì söï taùch choïn loïc chæ söû duïng khi ta muoán taêng chieàu daøi maïch peptide. Tuøy thuoäc vaøo muïc ñích ta muoán maø nhoùm baûo veä ñaàu N-amino seõ ñöôïc taùch choïn loïc hay nhoùm baûo veä ñaàu carboxy seõ ñöôïc taùch choïn loïc. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha raén Giôùi thieäu: Trong nhöõng giai ñoaïn ñaàu cuûa hoùa hoïc toång hôïp peptide, nhöõng phaûn öùng toång hôïp peptide ñeàu thöïc hieän trong dung dòch. Vieäc toång hôïp peptide trong dung dòch toán raát nhieàu coâng söùc, noù ñoøi hoûi phaûi coù kieán thöùc vöõng vaøng ñeå coù theå choïn muïc tieâu vaø nhoùm baûo veä, phöông phaùp keát noái cuõng nhö giaûi quyeát vaán ñeà hoøa tan trong dung moâi höõu cô. Moät trong nhöõng öu ñieåm chính cuûa phöông phaùp toång hôïp trong dung dòch laø saûn phaåm coù ñoä tinh saïch cao (maëc duø ñieàu naøy coøn phuï thuoäc vaøo quaù trình tinh saïch saûn phaåm). Phöông phaùp toång hôïp peptide treân chaát mang raén (solid phase peptide synthesis - SPPS) naøy laàn ñaàu tieân ñöôïc noùi ñeán vaøo naêm 1963 bôûi Robert Bruce Merrifield. Ngaøy nay, phöông phaùp naøy ñöôïc nhaéc ñeán nhö laø phöông phaùp toång hôïp Merrifield. Nguyeân taéc: Phöông phaùp toång hôïp peptide pha raén ñöôïc dieãn ra nhö sau: Chuoãi peptide seõ ñöôïc gaén vôùi chaát mang polymer khoâng tan, ñaây laø polymer nhaân taïo coù chöùa caùc nhoùm hoaït ñoäng (X) (ví duï nhoùm -OH). Caùc nhoùm naøy phaûn öùng deã daøng vôùi nhoùm carboxyl cuûa amino acid ñaõ ñöôïc baûo veä ñaàu N, töø ñoù hình thaønh lieân keát giöõa phaân töû amino acid vaø polymer. Nhoùm (Y) baûo veä ñaàu N coù theå ñöôïc loaïi boû vaø moät phaân töû amino acid ñöôïc baûo veä ñaàu N thöù 2 coù theå ñöôïc keát hôïp tieáp tuïc. Quaù trình ñöôïc laëp ñi laëp laïi cho tôùi khi ñöôïc maïch peptide theo yeâu caàu. Cuoái quaù trình toång hôïp, moät taùc nhaân ñöôïc söû duïng ñeå phaân huûy lieân keát giöõa ñuoâi C cuûa peptide vaø chaát mang raén, töø ñoù peptide ñi vaøo dung dòch. Hình 3.1: Sô ñoà quaù trình toång hôïp peptide pha raén Caùc kyù hieäu: Y - nhoùm baûo veä taïm thôøi cho ñaàu N; R1, R2, Rn, Rn+1 – maïch cuûa amino acid. Chaát mang raén: Yeâu caàu: caàn phaûi trô veà maët hoùa hoïc, beàn cô hoïc, khoâng tan trong dung moâi ñöôïc söû duïng, vaø coù theå taùch ra deã daøng trong quaù trình loïc. Ngoaøi ra, noù coøn phaûi coù ñuû soá löôïng caùc vuøng hoaït hoùa ñeå coù theå gaén caùc amino acid ñaàu tieân cuûa chuoãi peptide vaøo. Moät soá vaät lieäu laøm chaát mang ñöôïc söû duïng: polyethylene, cellulose, silica, controlled pore glass (CPG) vaø chitin Moät soá hình daïng chaát mang: daïng maøng moûng, daïng haït, daïng sôïi Möùc ñoä amino acid ñaàu tieân gaén vaøo chaát mang coù giaù trò toái öu laø 0.2-0.5mmol/g chaát mang. Töø ñoù coù theå tính toaùn ra raèng peptide sau khi gaén 15 amino acid thì chieám 50% khoái löôïng. Toác ñoä taêng tæ leä khoái löôïng giöõa peptide/chaát mang thöôøng khoâng laøm giaûm hieäu quaû cuûa quaù trình toång hôïp maëc duø khi ñoù tính chaát phoàng leân trong dung moâi khoâng phaân cöïc cuûa chaát mang bò giaûm ñi roõ reät. Nhöõng vaät lieäu phaân cöïc hôn (ví duï polyamide) thöôøng duøng ñeå toång hôïp caùc peptide maïch daøi hôn. Nhoùm chöùc hoaït ñoäng treân chaát mang: coù theå xem nhö laø töông öùng vôùi nhoùm baûo veä ñaàu C cuûa peptide (töùc laø coù taùc duïng baûo veä ñaàu C cuûa peptide). Tuøy thuoäc vaøo ñaàu C cuûa peptide naøo maø ngöôøi ta caàn 1 carboxylate, 1 carboxamide, 1 hydrazide, 1 ester, 1 thioester , hoaëc 1 alcohol. Trong haàu heát caùc tröôøng hôïp, amino acid ñaàu tieân ñöôïc gaén vôùi chaát mang nhôø lieân keát ester. Vieäc löïa choïn phuø hôïp seõ giuùp quaù trình gaén vaø taùch peptide khoûi chaát mang thuaän lôïi, ñoàng thôøi traùnh ñöôïc hieän töôïng racemic hoùa (trong quaù trình gaén amino acid ñaàu tieân) vaø söï hình thaønh diketopiperazine (trong quaù trình taïo thaønh dipeptide). Chaát mang ñaàu tieân ñöôïc söû duïng trong SPPS laø 1 copolymer cuûa polystyrene vaø 1-2% divinyl benzene. Haït chaát mang khoâ coù ñöôøng kính khoaûng 20-80m vaø coù theå phoàng leân ñeán theå tích lôùn hôn theå tích ban ñaàu töø 5-6 laàn tuøy loaïi dung moâi (dung moâi duøng cho toång hôïp peptide). Do ñoù, chaát mang polymer (thöôøng lô löûng trong dung moâi) khoâng phaûi daïng maïng raén (solid matrix) maø ôû daïng gel ñöôïc solvate hoùa toát vaø chuoãi polymer khaù linh ñoäng. Ñieàu naøy giuùp cho caùc chaát phaûn öùng deã khueách taùn tôùi caùc vuøng phaûn öùng. Ngöôøi ta nhaän thaáy coù theå coù khoaûng 1012 chuoãi polypeptide giöõ treân haït chaát mang Polystyrene/divinylbenzene coù ñöôøng kính 50 m vaø coù theå chöùa 0.3mmol peptide/g chaát mang. Hình 3.2: Chaát mang Polystyrene/divinylbenzene Baûng 3.3: Ñoä phoàng leân cuûa chaát mang Polystyrene/divinylbenzene (so vôùi theå tích ban ñaàu) trong moät soá dung moâi Dung moâi Ñoä phoàng leân Tetrahydrofuran 5.5 N,N-Dimethylacetamide 3.4 Dichloromethane 5.1 Diethylether 2.5 Dioxan 4.6 Acetonitrile 2.0 Toluene 4.5 Ethanol 1.05 N,N-Dimethylformamide 3.5 Methanol 0.95 Öu ñieåm cuûa phöông phaùp SPPS so vôùi phöông phaùp toång hôïp trong dung dòch: Trong quaù trình toång hôïp ta khoâng phaûi thöïc hieän vieäc taùch vaø laøm saïch caùc saûn phaåm trung gian raát toán thôøi gian nhö khi laøm trong dung dòch. Trong phöông phaùp naøy, saûn phaåm cuûa phaûn öùng ñöôïc giöõ laïi treân chaát mang raén, coùn nhöõng chaát tham gia phaûn öùng coøn dö hoaëc saûn phaåm phuï seõ ñöôïc loaïi boû baèng caùch loïc. Chu kyø saûn xuaát ngaén hôn, naêng suaát cao hôn. Nhöôïc ñieåm cuûa phöông phaùp SPPS: Ñeå coù theå coù phaûn öùng xaûy ra hoaøn toaøn thì caàn coù moät löôïng lôùn caùc amino acid moãi loaïi Vaãn coù theå xaûy ra caùc phaûn öùng khoâng mong muoán (bôûi caùc nhoùm chöùc khaùc trong maïch cuûa amino acid) trong quaù trình hoaït hoùa, keát noái, thaùo caùc chaát baûo veä. Vieäc theo doõi tieán trình phaûn öùng vaø phaân tích xem phaûn öùng ñaõ hoaøn toaøn chöa thì raát khoù thöïc hieän Söï phoàng leân (swelling) cuûa polymer vaø söï khueách taùn cuûa caùc chaát phaûn öùng trong quaù trình toång hôïp laø ñieàu heát söùc quan troïng Hieän töôïng keát tuï cuûa chuoãi peptide laøm cho vieäc toång hôïp trôû neân phöùc taïp Ñieàu kieän phaûn öùng ñeå giaûi phoùng peptide khoûi polymer coù theå gaây phaù huûy saûn phaåm Coù theå xaûy ra hieän töôïng raùp maïch khoâng ñuùng: Ñieàu naøy xaûy ra khi coù söï acyl hoùa khoâng hoaøn toaøn, vieäc loaïi caùc nhoùm baûo veä khoâng hoaøn toaøn hoaëc coù moät vaøi amino acid thaønh phaàn khoâng ñöôïc raùp vaøo maïch, vieäc taùch caùc saûn phaåm khoâng mong muoán naøy toán nhieàu thôøi gian, coâng söùc, do ñoù caàn coù bieän phaùp phoøng traùnh nhöõng hieän töôïng naøy xaûy ra. Phöông phaùp toång hôïp peptide pha loûng Giôùi thieäu & nguyeân taéc: Phöông phaùp toång hôïp peptide pha loûng (liquid-phase peptide synthesis) laø phöông phaùp toång hôïp peptide döïa treân chaát mang polymer hoøa tan. Vieäc söû duïng polyethyleneglycol (PEG) laøm chaát mang vaø baûo veä ñuoâi C cuûa chuoåi peptit laø moät böôùc tieán quan troïng trong toång hôïp peptide pha loûng.Trong phöông phaùp naøy, caùc chaát phaûn öùng dö coù phaân töû löôïng nhoû seõ ñöôïc taùch bôûi quaù trình sieâu loïc. Sau naøy ñeå thöïc hieän quaù trình taùch ngöôøi ta coøn söû duïng phöông phaùp keát tuûa: khi theâm dung moâi höõu cô thích hôïp (ví duï diethylether) seõ laøm taêng khaû naêng keát tuûa caùc peptidyl-PEG bôûi söï hình thaønh caùc caáu truùc xoaén. Coøn caùc phaân töû coù phaân töû löôïng thaáp ban ñaàu coøn dö vaø nhöõng chaát moài phaûn öùng thì khoâng bò keát tuûa vaø chuùng ñöôïc taùch ra deã daøng. Caàn coù thôøi gian thích hôïp ñoái vôùi töøng tröôøng hôïp maø phöông phaùp qui ñònh ñeå caùc chaát axyl hoùa dö vaø caùc hôïp chaát keát hôïp vôùi nhau ñaït ñöôïc söï chuyeån hoùa toái öu. Phaïm vi aùp duïng: Nhöõng peptide coù ít hôn 30 amino acid coù theå toång hôïp baèng phöông phaùp naøy Öu ñieåm: So vôùi phöông phaùp SPPS thì phöông phaùp naøy coù ñöôïc öu ñieåm cuûa phaûn öùng ñoàng theå so vôùi phaûn öùng dò theå ôû SPPS: toác ñoä phaûn öùng ñoàng theå nhanh hôn dò theå. Nhöôïc ñieåm: Nhöôïc ñieåm chính cuûa phöông phaùp naøy laø thôøi gian tieán haønh keùo daøi vaø khoù töï ñoäng hoùa. Phöông phaùp toång hôïp peptide duøng enzyme Trong phöông phaùp naøy, ngöôøi ta söû duïng enzyme protease laøm xuùc taùc cho vieäc keát hôïp caùc amino acid. Quaù trình hình thaønh lieân keát peptide nhôø xuùc taùc protease coù theå ñöôïc phaân thaønh 2 loaïi döïa treân thaønh phaàn nhoùm carboxy ñöôïc söû duïng: Toång hôïp ñieàu khieån caân baèng (equilibrium – controlled synthesis – ECS): nhoùm carboxy töï do (ôû traïng thaùi bình thöôøng) Toång hôïp ñieàu khieån ñoäng hoïc (kinetically – controlled synthesis – KCS): nhoùm carboxy ôû traïng thaùi ñöôïc hoaït hoùa, thoâng thöôøng ngöôøi ta söû duïng daïng alkyl ester. Veà cô baûn, 2 phöông phaùp naøy khaùc nhau veà naêng löôïng caàn thieát ñeå hình thaønh lieân keát peptide. Toång hôïp ñieàu khieån caân baèng Quaù trình toång hôïp naøy ngöôïc laïi vôùi quaù trình thuûy phaân lieân keát peptide, do ñoù, taát caû protease ñeàu coù theå ñöôïc söû duïng. Tuy nhieân noù coù nhöôïc ñieåm laø caàn löôïng lôùn enzyme vaø toác ñoä phaûn öùng chaäm. Trong quaù trình thao taùc thì caàn phaûi ñieàu chænh sao cho caân baèng dòch chuyeån theo höôùng taïo ra lieân keát peptide. Ta coù theå theâm dung moâi höõu cô (coù theå hoøa tan vaøo nöôùc), tuy nhieân ñieàu kieän naøy coù theå laøm giaûm hoaït tính cuûa enzyme. Khi haèng soá ñieän moâi cuûa moâi tröôøng giaûm thì noù laøm giaûm tính acid cuûa nhoùm carboxy vaø tính base cuûa nhoùm amino. ECS xaûy ra theo chieàu höôùng taêng daàn noàng ñoä saûn phaåm theo thôøi gian roài sau ñoù phaûn öùng ñaït traïng thaùi caân baèng (nhö hình minh hoïa beân döôùi). Hình 3.3: Quaù trình toång hôïp peptide ñieàu khieån caân baèng Toång hôïp ñieàu khieån ñoäng hoïc So vôùi ECS thì KCS caàn ít enzyme hôn, thôøi gian ñeå ñaït ñöôïc naêng suaát saûn phaåm toái ña ñöôïc ruùt ngaén hôn vaø naêng suaát saûn phaåm phuï thuoäc vaøo tính chaát cuûa enzyme ñöôïc söû duïng vaø tính ñaëc hieäu cuûa cô chaát. Trong khi ECS keát thuùc ôû traïng thaùi caân baèng thì ñoái vôùi KCS, noàng ñoä cuûa saûn phaåm ñaït ñeán cöïc ñaïi roài sau ñoù bò thuûy phaân daàn. Hình 3.4: Quaù trình toång hôïp peptide ñieàu khieån ñoäng hoïc. Trong ñoù, R1-CO-X: nhoùm carboxy ñöôïc hoaït hoùa Hình 3.5: Moâ hình cuûa quaù trình toång hôïp peptide ñieàu khieån ñoäng hoïc duøng xuùc taùc protease EH: enzyme töï do; Ac-X: chaát cho nhoùm acyl (nhoùm carboxy ñöôïc hoaït hoùa); HX: nhoùm bò loaïi ñi; Ac-E: phöùc hôïp acyl-enzyme; Ac-OH: saûn phaåm thuûy phaân; HN: chaát nhaän nhoùm acyl; Ac-N: saûn phaåm peptide Hoaït tính amidase cuûa haàu heát caùc protease thì thaáp hôn hoaït tính esterase. Enzyme coù taùc duïng nhö chaát vaän chuyeån nhoùm acyl tôùi nhoùm amino hình thaønh lieân keát peptide Ac-N, phaûn öùng naøy coù söï caïnh tranh cuûa nöôùc. Tyû leä giöõa toác ñoä phaûn öùng toång hôïp lieân keát peptide vaø thuûy phaân noù thì coù yù nghóa quan troïng tôùi söï thaønh coâng cuûa phöông phaùp naøy. Phöông phaùp naøy thöôøng söû duïng serine vaø cystein protease. Tuy nhieân, serine vaø cystein protease thì khoâng phaûi laø nhöõng acyltransferase hoaøn haûo, nhöõng phaûn öùng khoâng mong muoán coù theå xaûy ra do söï giôùi haïn cuûa tính ñaëc hieäu cuûa chuùng. Moät yeáu toá quan troïng laøm haïn cheá öùng duïng cuûa KCS laø söï thuûy phaân cuûa Ac-X ngay taïi thôøi ñieåm baét ñaàu phaûn öùng (nhö hình minh hoïa phía treân cho thaáy) vaø söï thuûy phaân cuûa peptide saûn phaåm. Nhöõng phaûn öùng khoâng mong muoán naøy coù theå ñöôïc haïn cheá nhôø vieäc thöïc hieän moät soá bieän phaùp nhö: thay ñoåi moâi tröôøng phaûn öùng (laøm giaûm haøm löôïng nöôùc trong moâi tröôøng baèng caùch söû duïng dung moâi höõu cô), enzyme, cô chaát…. Khaùc vôùi phöông phaùp toång hôïp hoùa hoïc, phöông phaùp toång hôïp söû duïng enzyme coù theå baét ñaàu töø ñaàu amino hoaëc ñaàu carboxy bôûi vì xuùc taùc enzyme traùnh ñöôïc hieän töôïng racemic hoùa. Ngoaøi ra, phöông phaùp naøy coøn coù moät soá öu ñieåm nhö: khoâng toán nhieàu thôøi gian; khoâng coù quaù trình baûo veä vaø khöû caùc nhoùm baûo veä; giaûm vieäc söû duïng caùc dung moâi vaø caùc chaát hoùa hoïc (gaây ñoäc); coù theå taùi söû duïng enzyme. Hieän nay, löôïng peptide taïo saûn xuaát ra nhôø phöông phaùp naøy vaãn coøn raát ít; haàu heát caùc peptide ñöôïc saûn xuaát nhôø phöông phaùp toång hôïp hoùa hoïc. Moät vaøi di- vaø tripeptide coù theå ñöôïc toång hôïp vôùi quy moâ lôùn baèng phöông phaùp toång hôïp duøng enzyme, thaäm chí laø quaù trình toång hôïp coù theå ñöôïc tieán haønh lieân tuïc. Caùc di- vaø tripeptide naøy ñöôïc söû duïng laøm chaát trung gian trong quaù trình saûn xuaát caùc loaïi döôïc phaåm. Öùng duïng trong coâng nghieäp cuûa phöông phaùp ECS laø vieäc toång hôïp Z-Asp-Phe-Ome laø tieàn chaát cuûa aspartame. Phöông phaùp taùi toå hôïp gen Khaùi nieäm veà DNA taùi toå hôïp DNA taùi toå hôïp (recombinant DNA) laø DNA ñöôïc taïo ra töø hai hay nhieàu nguoàn vaät lieäu di truyeàn khaùc nhau. Phaân töû DNA taùi toå hôïp ñöôïc taïo ra nhôø kyõ thuaät gheùp noái caùc ñoaïn DNA cuûa caùc caù theå khaùc nhau trong cuøng moät loaøi hoaëc cuûa caùc loaøi khaùc nhau. Kyõ thuaät taùi toå hôïp DNA ñöôïc thöïc hieän qua nhieàu coâng ñoaïn phöùc taïp, tinh vi, thöïc chaát laø moät coâng ngheä goàm caùc böôùc chuû yeáu sau: Böôùc 1: Nuoâi teá baøo cho plasmid ñeå taïo vector chuyeån gen vaø nuoâi teá baøo cho (ví duï: teá baøo cuûa ngöôøi) ñeå cung caáp DNA. Böôùc 2: Taùch chieát DNA plasmid vaø DNA teá baøo cho. Böôùc naøy coøn goïi laø phaân laäp gen. Böôùc 3: Caét caû hai loaïi DNA ( DNA plasmid vaø DNA teá baøo cho) baèng cuøng moät loaïi enzym giôùi haïn (restriction enzym – RE). Böôùc 4: Troän chung DNA plasmid ñaõ bò caét vôùi DNA teá baøo cho cuõng ñaõ bò caét bôûi moät loaïi enzym giôùi haïn nhö ñaõ neâu treân. Böôùc 5: Boå xung enzym noái ligase ñeå taïo ra DNA taùi toå hôïp hoaøn chænh. Böôùc 6: Bieán naïp DNA taùi toå hôïp vaøo teá baøo chuû (ví duï vi khuaån E.coli) vaø nhaân doøng. Böôùc 7: Choïn loïc vaø taïo doøng teá baøo chuû (vi khuaån) mang DNA taùi toå hôïp vaø theo doõi hoaït ñoäng, bieåu hieän cuûa gen thoâng qua saûn phaåm cuûa gen laáy röø teá baøo cho. Sô ñoà khaùi quaùt cuûa quaù trình taïo doøng DNA taùi toå hôïp Hình 3.6: Sô ñoà quaù trình taïo doøng DNA taùi toå hôïp Caùc enzym chuû yeáu duøng trong kyõ thuaät DNA taùi toå hôïp Caùc enzym giôùi haïn. Trong Coâng ngheä di truyeàn, muoán taïo ra DNA taùi toå hôïp ñeå ñöa vaøo teá baøo chuû caàn phaûi coù coâng cuï caét plasmid hình voøng vaø ñoaïn DNA cuûa teá baøo roài cho chuùng noái laïi vôùi nhau. Coâng cuï caét DNA laø caùc enzym giôùi haïn. Khaùi nieäm veà enzym giôùi haïn Thoâng thöôøng teá baøo vi khuaån bò nhieãm phagô (theå thöïc khuaån) thì vi khuaån ñoù bò phagô phaù huûy. Moät soá loaïi vi khuaån sau khi nhieãm phagô laïi khoâng bò phaù huûy do trong teá baøo vi khuaån naøy coù loaïi enzym coù khaû naêng caét DNA phagô thaønh nhöõng ñoaïn nhoû. Naêm 1970, Hamilton Smith laø ngöôøi ñaàu tieân taùch ñöôïc loaïi enzym naøy töø vi khuaån Haemophilus influenzae ñöôïc goïi teân laø HinII. Ngay sau ñoù, caùc nhaø khoa hoïc ñaõ thaáy raèng, phaàn lôùn caùc loaøi vi khuaån mang loaïi enzym coù khaû naêng caét DNA laï xaâm nhaäp ñeå baûo veä teá baøo khoûi bò xaâm nhaäp cuûa caùc DNA laï. Nhöõng enzym ñoù ñöôïc goïi laø enzym giôùi haïn. Enzym giôùi haïn laø enzym coù khaû naêng nhaän bieát nhöõng ñoaïn trình töï DNA nhaát ñònh vaø caét DNA ôû ngay ñieåm naøy hay ñieåm keá caän. Tuøy theo phöông thöùc caét vaø nguoàn goác cuûa enzym giôùi haïn maø ngöôøi ta phaân loaïi vaø ñaët teân cho caùc enzym giôùi haïn ñoù. Phaân loaïi enzym giôùi haïn. Caùc enzym giôùi haïn ñöôïc phaân thaønh 3 kieåu I, II vaø III. Caùc enzym giôùi haïn thöôøng duøng phoå bieán trong coâng ngheä DNA taùi toå hôïp, Coâng ngheä di truyeàn laø enzym giôùi haïn thuoäc kieåu II. Caùc enzym naøy caét beân trong maïch DNA (khoâng phaân huûy töø 2 ñaàu cuûa DNA) neân coøn ñöôïc goïi laø enzym endonuclease. Enzym giôùi haïn kieåu II thöïc chaát laø endonuclease giôùi haïn kieåu II. Caùc endonuclease giôùi haïn kieåu II: Caùch goïi teân caùc enzym giôùi haïn kieåu II cuõng nhö caùc enzym giôùi haïn khaùc döïa treân qui öôùc chung. Teân enzym giôùi haïn ñöôïc gheùp bôûi chöõ caùi ñaàu tieân laø teân chi vaø 2 chöõ caùi tieáp theo laø teân loaøi cuûa vi sinh vaät maø enzym ñöôïc taùch chieát, nhöõng chöõ vaø soá La maõ tieáp theo laø teân cuûa chuûng vaø doøng cuûa loaøi vi sinh vaät cuï theå ñaõ taùch chieát enzym . Ví duï: Teân enzym Chi Loaøi Chuûng Thöù töï doøng Escherichia coli Ry13 E.coRI E. co R I E.coRV E. co R Vi sinh vaät Bacillus amyloliquefaciens H BamHI B am H I Haemophilus aegyptius HaeIII H ae III Serratia martesens SmaI S ma I Giaù trò cuûa enzym giôùi haïn laø ôû tính chaát caét ñaëc hieäu cuûa chuùng. Moãi enzym cuï theå coù theå nhaän bieát moät ñoaïn trình töï ñaëc thuø caùc caëp bazô treân DNA. Ñoaïn nhaän bieát phoå bieán nhaát coù chieàu daøi 4, 5 hoaëc 6 nucleotit töông öùng vôùi khoaûng 44 = 256 caëp bazô, 45 = 1024 caëp bazô hoaëc 46 = 4096 caëp bazô coù khaû naêng laëp laïi moät laàn trong caáu truùc chung cuûa DNA. Nhö vaäy enzym giôùi haïn nhaän bieát ñoaïn trình töï 4 nucleotit seõ caét phaân töû DNA ngaén hôn caùc enzym giôùi haïn nhaän bieát ñoaïn trình töï 5 hoaëc 6 nucleotit Coù 2 kieåu caét cuûa enzym giôùi haïn laø: kieåu caét taïo ñaàu baèng (blunt ends) vaø ñaàu so le (ñaàu dính – cohesive ends). Enzym giôùi haïn caét ñaàu baèng khoâng töï noái caùc ñoaïn DNA laïi vôùi nhau. Ñeå noái caùc ñoaïn DNA sau khi caét, caàn söû duïng enzym noái ligase vaø caùc adaptor chuyeân duïng cho moãi loaïi enzym. Enzym giôùi haïn caét ñaàu so le taïo ñaàu dính. Sau khi caét chuùng coù theå töï noái laïi vôùi nhau theo nguyeân taéc boå sung. Chính ví vaäy trong coâng ngheä DNA taùi toå hôïp ngöôøi ta thöôøng duøng caùc enzym giôi haïn caét ñaàu so le. Moät soá enzym giôùi haïn thöôøng ñöôïc söû duïng cuøng vôùi ñoaïn trình töï nhaän bieát vaø vò trí caét cuûa chuùng . Baûng3.4: Moät soá enzym giôi haïn thöôøng duøng Enzym Vi khuaån coù enzym Ñoaïn nhaän bieát vaø caét treân DNA BamHI Bacilus amyloliquefaciens GGATCC CCTAG G EcoRI E.coli RY13 GAATTC CTTAA G HhaI Haemophilus haemolyticus G CGC C GCG HindIII Haemophilus influenzae A AGCTT TTCGA A PstI Providencia stuartii CTGCA G G ACGTC HaeIII Haemophilus aegyptipus GG CC CC GG SmaI Serratia martesens CCC GGG GGG CCC  Caùc enzym giôùi haïn caét ñaàu so le caét theo 2 kieåu hình daïng. Caùc ñoaïn coù theå sinh ra ñoù laø caùc ñoaïn coù ñaàu 3’ nhoâ ra vaø caùc ñoaïn coù ñaàu 5’ nhoâ ra HaeIII PstI EcoRI 5’ – GG CC – 3’ CC GG 5’ – C TGCA G – 3’ G ACGT C 5’ – G AATT C – 3’ C TTAA G Ñaàu baèng Ñaàu so le 3’ Ñaàu so le 5’ Hình 3.7 : Caùc daïng ñaàu muùt taïo bôûi caùc loaïi enzym giôùi haïn Hai loaïi enzym taïo ñaàu so le 3’ vaø ñaàu so le 5’ thöôøng ñöôïc duøng trong Coâng ngheä di truyeàn do khaû naêng töï noái laïi vôùi nhau, hoaëc vôùi caùc ñoaïn DNA khaùc coù ñaàu töông töï. Khi söû duïng töøng loaïi enzym giôùi haïn caàn coù caùc ñieàu kieän nhieät ñoä, ñoä pH, dung moâi thích hôïp. Nguyeân taét chung caét DNA baèng moät enzym giôùi haïn naøo ñoù laø uû DNA sôïi keùp vôùi moät löôïng enzym giôùi haïn thích hôïp trong moät cheá ñoä dung dòch ñeämtheo höôùng daãn cuûa nhaø saûn xuaát vaø ôû moät nhieät ñoä toái öu cho chính loaïi enzym naøy. Trong ñieàu kieän thích hôïp, phaûn öùng caét hoaøn toaøn 1 microgam DNA sôïi keùp keùo daøi 1-3 giôø vaø thöôøng ôû 370C. moät soá loaïi enzym coù hoaït tính yeáu, do vaäy khi caét coù theå keùo daøi theâm thôøi gian, hoaëc boå sung theâm enzym giôùi haïn sau 1-2 giôø roài laïi uû tieáp. Caùc enzym polymerase Caùc enzym polymerase xuùc taùc cho quaù trình sao cheùp caùc axit nucleotit (DNA hoaëc ARN) ñöôïc söû duïng nhieàu trong Coâng ngheä di truyeàn. Khi noùi veà moät enzym polymerase naøo ñoù, ngöôøi ta thöôøng duøng thuaät ngöõ “phuï thuoäc DNA” hoaëc “phuï thuoäc ARN” ñeå chæ axit nucleic maø enzym naøy xuùc taùccho vieäc sao cheùp. DNA polymerase phuï thuoäc DNA thì sao cheùp DNA sang DNA; DNA polymerase phuï thuoäc ARN thì sao cheùp ARN sang DNA, coøn enzym ARN polymerase phuï thuoäc DNA thì phieân maõ DNA sang ARN. Caùc enzym naøy toång hôïp axit nucleic baèng caùch noái caùc nucleotit vôùi nhau theo nguyeân taéc boå sung döïa theo maïch khuoân. Quaù trình toång hôïp maïch môùi boå sung dieãn ra theo chieàu töø 5’-3’ vaø söï khôûi ñaàu caàn coù ñaàu 3’-OH töï do. Caùc DNA polymerase Enzym DNA polymerase I (pol I) laø enzym DNA polymerase I xuùc taùc cho vieäc laáp ñaày choã troáng treân phaân töû DNA hoaëc maïch ñôn cuûa DNA ngaén. Enzym DNA polymerase I xuùc taùc toång hôïp maïch ñôn môùi ñoàng thôøi coù vai troø trong vieäc söûa chöõa caùc sai soùt trong quaù trình sao cheùp DNA. Ngoaøi chöùc naêng toång hôïp, enzym DNA polymerase I coøn coù hoaït tính exonuclease, nghóa laø noù coù khaû naêng thuûy phaân lieân keát giöõa caùc nucleotit töø 2 ñaàu cuûa phaân töû DNA, caét rôøi töøng nucleotit theo caû 2 chieàu 5’-3’ vaø 3’-5’. Trong nhieàu tröôøng hôïp, enzym DNA polymerase I ñöôïc söû duïng trong kyõ thuaät xaùc ñònh trình töï DNA baèng phöông phaùp dideoxy, toång hôïp maãu doø coù ñaùnh daáu phoùng xaï hoaëc thieát keá caùc vector maïch ñôn. Trong thöïc teá enzym DNA polymerase I ít ñöôïc söû duïng maø ngöôøi ta thöôøng söû duïng moät saûn phaåm thuûy phaân cuûa noù ñöôïc goïi laø ñoaïn Klenow (Klenow fragment). Ñoaïn naøy vaãn giöõ ñöôïc hoaït tính cuûa polymerase vaø exonuclease 5’-3’. Ñoaïn Klenow ñöôïc söû duïng khi caàn sao cheùp moät phaân töû DNA maïch ñôn vì chöùc naêng exonuclease bò thieáu khaû naêng caét ñaàu 3’-5’ neân enzym naøy khoâng theå thuûy phaân maïch ñôn laøm khuoân trong quaù trình toång hôïp DNA môùi. Enzym T4 DNA polymerase coù nguoàn goác töø theå thöïc khuaån T4 (phageT4) xaâm nhieãm vi khuaån E.coli. Hoaït tính cuûa enzym T4 DNA polymerase töông töï ñoaïn Klenow. Do noù coù hoaït tính exonuclease 3’-5’ maïnh neân thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå toång hôïp maãu doø coù ñoä phoùng xaï cao. Enzym Tag polymerase ñöôïc chieát xuaát töø vi khuaån chòu nhieät Thermophilus aquaticus. Enzym Tag polymerase thöôøng ñöôïc söû duïng trong vieäc nhaân gen trong kyõ thuaät chuoãi truøng hôïp (kyõ thuaät PCR). Enzym Tag coù khaû naêng taêng cöôøng söï baét caëp taïo DNA boå trôï (cDNA-complementary DNA) nhöng khoâng hoaït ñoäng treân caùc phaân töû DNA. Hieän nay coøn coù nhieàu loaïi DNA polymerase khaùc löu haønh treân thò tröôøng nhö T7 DNA polymerase, Vent DNA polymerase … Caùc enzym DNA polymerase Coù 3 loaïi enzym DNA polymerase thöôøng ñöôïc duøng trong thöïc teá, ñoù laø SP6 DNA polymerase, T3 DNA polymerase vaø T7 DNA polymerase. Enzym SP6 DNA polymerase ñöôïc taùch chieát töø phage xaâm nhieãm vi khuaån Samonella typhimurium. Enzym T3 DNA polymerase vaø T7 DNA polymerase ñöôïc taùch chieát töø phage xaâm nhieãm E.coli. Caùc enzym naøy xuùc taùc quaù trình phieân maõ toång hôïp ARN töø maïch khuoân cuûa phaân töû DNA theo chieàu töø 5’-3’ (maïch khuoân coù chieàu 3’-5’). Treân thöïc teá DNA polymerase ñöôïc öùng duïng trong toång hôïp maãu doø ARN vaø trong vieäc nghieân cöùu quaù trình phieân maõ toång hôïp mARN. Enzym phieân maõ ngöôïc (Reverse transcriptase) Enzym phieân maõ ngöôïc coù khaû naêng toång hôïp DNA moät maïch goïi laø DNA boå trôï (cDNA) töø khuoân mARN hoaëc töø moät ñoaïn polynucleotit ñöôïc toång hôïp baèng con ñöôøng hoùa hoïc. Nhôø coù enzym phieân maõ ngöôïc naøy maø coù theå toång hôïp ñöôïc haàu heát caùc gen rieâng bieät naøo ñoù neáu nhö coù maët mARN cuûa gen ñoù. Caùc cDNA maïch ñôn coù theå bieán thaønh maïch keùp nhôø DNA polymerase vaø ñöôïc goïi laø cDNA maïch keùp (c-DNA duplex). Ñoaïn cDNA maïch keùp coù theå gaén vaøo plasmid roài bieán naïp vaøo vi khuaån, töø ñoù taïo doøng c-DNA. Neáu cDNA coù nguoàn goác töø 1 gen thì ta taïo ñöôïc doøng gen. Trong tröôøng hôïp mARN tröôûng thaønh khi ñaõ ôû ngoaøi nhaân thì ta seõ thu ñöôïc doøng gen chæ chöùa nhöõng ñoaïn maõ hoùa (exon), khoâng coù ñoaïn khoâng maõ hoùa (nitron). Caùc enzym noái (Ligase) Enzym ligase laø enzym noái quan troïng trong teá baøo. Caùc enzym naøy xuùc taùc hình thaønh caùc lieân keát phosphodiester ñeå noái caùc ñoaïn axit nucleic vôùi nhau. DNA ligase xuùc taùc noái 2 ñoaïn DNA vôùi nhau, ARN ligase xuùc taùc noái caùc ñoaïn ARN vôùi nhau. Trong coâng ngheä DNA taùi toå hôïp, DNA ligase laø enzym chuû yeáu ñöôïc söû duïng roäng raõi. Coù moät soá enzym noái khaùc nhau nhöng enzym T4 DNA ligase keát hôïp vôùi 2 loaïi enzym T4 polynucleotit kinase vaø alkaline phosphatase ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong caùc thí nghieäm veà Coâng ngheä di truyeàn. Coù 3 loaïi enzym noái thöôøng duøng trong Coâng ngheä di truyeàn. Enzym E.coli DNA ligase ñöôïc taùch chieát töø vi khuaån E.coli, xuùc taùc phaûn öùng noái 2 ñoaïn trình töï DNA coù ñaàu so le. Enzym T4 DNA ligase ñöôïc taùch chieát töø phage T4 xaâm nhieãm vaøo E.coli coù chöùc naêng gioáng nhö E.coli DNA ligase nhöng laïi coù khaû naêng noái 2 ñoaïn trình töï DNA coù ñaàu baèng vaø laø enzym noái ñöôïc öa chuoäng nhaát hieän nay. Enzym T4 DNA ligase taùch chieát töø phage T4 xaâm nhieãm E.coli coù khaû naêng noái 2 trình töï ARN baèng caùc lieân keát phosphodiester. Ngoaøi caùc loaïi enzym keå treân, hieän nay ngöôøi ta coøn söû duïng caùc ñoaïn noái (ñaàu dính-adaptor) cho caùc enzym caét ñaàu baèng. Adaptor xuùc taùc noái caùc ñoaïn DNA do caùc enzym giôùi haïn caét ñaàu baèng, töø ñoù taïo neân ñaàu so le. Moãi loaïi enzym caét ñaàu baèng ñeàu coù caùc loaïi adaptor ñaëc tröng rieâng. Caùc enzym nuclease Caùc enzym nuclease phaân huûy caùc axit nucleic baèng caùch laøm ñöùt caùc lieân keát phosphodiester laø lieân keát noái caùc nucleotit cuøng moät maïch vôùi nhau. Ngoaøi caùc enzym giôùi haïn ñaõ neâu ôû treân coøn coù caùc loaïi nuclease chuû yeáu sau: Enzym ADNase I (endonuclease) taùch chieát töø tuïy cuûa boø, xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân caùc lieân keát ngay sau 1 bazô nitô ôû caû maïch ñôn vaø maïch keùp hoaøn toaøn ngaãu nhieân. Enzym S1 nuclease (endonuclease) laø enzym taùch chieát töø naám moác Aspegillus oryzae. S1 nuclease phaân caét caùc DNA maïch ñôn vaø caû ARN Enzym nuclease BAL 3 (endonuclease) phaân caét caû 2 ñaàu 5’ vaø 3’ cuûa DNA vaø khoâng coù khaû naêng caét noäi lieân keát. Enzym exonuclease III laø moät 3’ exonuclease caét ñaàu 3’ cuûa maïch ñôn vaø taïo thaønh caùc ñoaïn DNA coù ñaàu 5’ nhoâ ra. Enzym ARNase A taùch chieát töø tuïy boø. Enzym naøy thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå loaïi boû ARN trong hoãn hôïp DNA vaø ARN. Enzym ARNase H duøng ñeå loaïi boû ARN trong caùc phaân töû lai DNA-ARN, nhaát laø sau phaûn öùng phieân maõ ngöôïc ñeå hình thaønh maïch thöù 2 cuûa cDNA, töø ñoù taïo neân phaân töû cDNA keùp. Caùc vector söû duïng trong coâng ngheä DNA taùi toå hôïp Muoán chuyeån ñöôïc gen mong muoán töø theå cho sang vaät chuû nhaän (theå nhaän), hoaëc taùch doøng gen, ñieàu cô baûn laø caàn phaûi coù vaät chuyeån gen (vector chuyeån gen). Vector chuyeån gen laø phaân töû DNA nhoû coù khaû naêng mang ñöôïc gen caàn thieát. a) Yeâu caàu cuûa vector chuyeån gen: Coù ñieåm khôûi ñaàu sao cheùp (origin of replication – ori) ñeå töï sao cheùp maø ñoäc laäp trong teá baøo. Coù caùc ñoaïn trình töï nhaän bieát cho enzym giôùi haïn caét roài ñeå hôû taïo nôi laép raùp cho caùc ñoaïn gen laï/ Coù ñoaïn trình töï khôûi ñieåm (proâmter). Coù daáu chuaån choïn loïc cho pheùp deã daøng phaùt hieän nhaän bieát chuùng trong teá baøo chuû nhaän. Thoâng thöôøng daáu chuaån choïn loïc laø caùc gen khaùng chaát khaùng sinh, hoaëc gen toång hôïp chaát maøu. Ñeå ñaûm baûo ñöôïc tính beàn vöõng cuûa DNA taùi toå hôïp, ngoaøi caùc ñaëc ñieåm treân vector chuyeån gen caàn nhöõng ñaëc tính khaùc ñeå cho vieäc taïo, taùch doøng deã thöïc hieän nhö: Chöùa caùc gen voâ hieäu hoùa caùc ñoaïn DNA khoâng mong muoán bò gaén nhaàm vaøo. Coù khaû naêng taïo nhieàu baûn sao ñeå khi taùch khoûi teá baøo ñöôïc soá löôïng lôùn, ñaûm baûo söï khueách ñaïi cuûa gen laï mong muoán ñöôïc gaén vaøo. Giaù trò cuûa caùc vector chuyeån gen ôû choã noù ñöôïc caáu taïo thuaän tieän cho muïc ñích söû duïng. Hieän taïi chöa coù loaïi vector chuyeån gen toaøn naêng, maø caàn phaûi löïa choïn vector chuyeån gen cho töøng ñoái töôïng vaø tuøy thuoäc vaøo kích thöôùc cuûa ñoaïn gen caàn ñöôïc chuyeån. b) ÖÙng duïng chuû yeáu cuûa vector chuyeån gen : Taïo doøng, nhaân doøngcaùc ñoaïn trình töï hoaëc gen ñeå taïo nhieàu baûn sao gioáng nhau. Nghieân cöùu söï bieåu hieän cuûa moät ñoaïn trình töï DNA hoaëc moät gen Chuyeån gen vaøo teá baøo cuûa vi sinh vaät khaùc (vaät chuû nhaän). Saûn xuaát caùc ARN. Saûn xuaát caùc protein ñöôïc toång hôïp töø gen ñaõ ñöôïc taïo doøng. Do tính chaát quan troïng vaø nhieàu öùng duïng neân caùc vector chuyeån gen ngaøy caøng ñöôïc khaùm phaù, hoaøn thieän khoâng ngöøng. Töø nhöõng vector chuyeån gen saün coù trong töï nhieân nhö plasmid ôû vi khuaån, ngaøy nay ngöôøi ta ñaõ taïo ra nhieàu loaïi vector phöùc taïp öùng duïng vaøo nhieàu muïc ñích khaùc nhau thaäm chí taïo ra caû nhieãm saéc theå nhaân taïo. Các vector chuyển gen: Plasmid Plasmid là những phân tử của DNA cực nhỏ nằm ở bào tương của Procaryote. Plasmid có một số đặc điểm cơ bản sau: + Có kích thước nhỏ hơn kích thước của DNA ở nhân tế bào. + Hoàn toàn giống mã di truyền của DNA trong nhân. + Có khả năng tái tạo độc lập. + Có khả năng truyền lại một số tính chất đặc biệt cho thế hệ sau, thí dụ như tính kháng nguyên tố nặng, tính kháng sinh, tạo nhân tố CoIE1 (tức Plasmid có E1). Các vector chuyển gen thường được sử dụng là các plasmid của vi khuẩn và các Bacteriophage. Plasmid được coi như vector chuyển gen và được nghiên cứu rất sớm, ngày càng hoàn thiện. Thế hệ thứ nhất: là các plasmid tự nhiên. Hiện nay người ta không sử dụng loại plasmid này nữa. Thế hệ thứ hai: là các plasmid có cấu tạo phức tạp hơn. Một trong những plasmid loại này được sử dụng nhiều nhất là pBR322. Ðây là plasmid được cấu tạo từ nhiều đoạn nhỏ của các plasmid khác nhau, để vừa có được các gen kháng thuốc, vừa có các điểm nhận biết cho các gen hạn chế và chúng có chiều dài khoảng 5000 cặp base. Plasmid này có khả năng sao chép độc lập với tế bào E.coli, và tồn tại với số lượng trung bình 20-30 bản sao cho mõi tế bào.  Trong những điều kiện nuôi cấy đặc biệt ta có thể khuyếch đại có chọn lọc làm tăng số lượng plasmid đến hơn 1000 bản sao cho 1 tế bào. Thế hệ thứ ba: Là những plasmid đa năng và chuyên dùng. Có rất nhiều trình tự nhận biết các loại plasmid này, được xếp nối tiếp nhau tạo thành đoạn dài gọi là polylinkers. Các vector chuyển gen là phage lamđa (l) Nhiều thí nghiệm cho thấy là phage (l) có khả năng tải nạp. Chúng mang gen từ tế bào vi khuẩn sang tế bào cho.  Ưu điểm nổi bật của vector phage (l) là: Chúng có hệ thống tự động xâm nhập và khả năng sinh sản trong tế bào chủ với hiệu quả cao hơn rất nhiều so với việc đưa plasmid theo con đường biến nạp.DNA của phage có thể ở dạng thẳng. Khi bị cắt ở giữa rời ra thành hai phần phải và trái. Ðoạn gen lạ được ráp vào giữa sao cho DNA tái tổ hợp không lớn hơn 105% hay nhỏ hơn 78% của bộ gen bình thường của phage lamđa. Chúng có khả năng mang đoạn DNA lạ dài hơn của plasmid. DNA có thể gói gọn vào đầu phage. Các vector chuyển gen khác: Cosmid: là vector được cấu tạo từ plasmid có gắn thêm gen cos của phage .Gen cos s4 giúp cho DNA của phage ( từ dạng thẳng nối đấu lại thành vòng tròn). Cosmid có thể chứa một gen lạ có kích thước lên đến 45Kb. Phage M13: là loại vector thể sợi có DNA mạch đơn. Người ta thường sử dụng chúng để xác định trình tự các nucleotid của gen, sản xuất các mẫu thăm dò DNA , thực hiện một đột biến định hướng. Phagemi: là vector được cấu tạo từ plasmid có gắn thêm một đoạn DNA của phage M13. Plasmid Ti: loại này được sử dụng rộng rãi để chuyển gen vi khuẩn đất Agrobađerium tumefaciens sang cho thực vật. Nhân tố gây u cho thực vật là Plasmid Ti. (Tumor – Puducing) có DNA vòng tròn và kích thước khoảng 200Kb, T – DNA là phần rất quan trọng của plasmid. Khi được chuyển, nó gắn xen kẻ một cách ngẫu nhiên vào bộ gen của tế bào thực vật. Nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men: Người ta tìm thấy ở nấm men Saccharomyces cerevisiae một loại plasmid vòng tròn 2 (có độ dài vào khoảng 6.300 cặp nucleotid). Đây là trường hợp duy nhất được tìm thấy ở Eucaryote. Từ loại plasmid này người ta đã tạo ra được một loại plasmid nhân tạo giống y như thế và đã đặt tên cho nó là YAC (Yeast Artificial Chromosome). Loại plasmid này có một số nucleotid rất quan trọng. ARS (Autonomously Replicating Sequence) trình tự sao chép của chúng tương tự ori ở plasmid. CEN (Centromere – tâm động). Trình tự CEN đảm bảo cho sự phân đôi và đi về hai cực tế bào như tâm động. 2 TEL (Telemere) là 2 trình tự duy trì hai đầu mút thẳng mà không bị cắt, vãn sao chép và tiến hành phân chia nhiễm sắc thể. Các điểm nhận biết cho endonuclease Sma I, Bam HI, Xho I và Sfi I, Not I. Taïo plasmid taùi toå hôïp 1) Taïo nguoàn gen Böôùc ñaàu cuûa vieäc taïo plasmid taùi toå hôïp laø caàn phaûi thu ñöôïc nguoàn gen. Coù 3 phöông phaùp khaùc nhau ñeå thu nhaän gen: Thu nhaän DNA töø heä gen (thö vieän DNA): Ñaây laø phöông phaùp thöôøng duøng ngay töø giai ñoaïn ñaàu tieân phaùt trieån coâng ngheä DNA taùi toå hôïp. Toaøn boä phaân töû DNA cuûa moät loaøi sinh vaät ñöôïc taùch thaønh caùc ñoaïn nhoû baèng caùch laéc cô hoïc hoaëc duøng enzym giôùi haïn. Coâng ñoaïn sau ñoù laø gaén caùc ñoaïn naøy vaøo plasmid. Phöông phaùp naøy ñöôïc duøng ñeå laäp ngaân haøng DNA cuûa caû heä gen. Toång hôïp gen baèng phöông phaùp hoùa hoïc: Muoán toång hôïp hoùa hoïc ñoaïn DNA hay moät gen caàn phaûi bieát trình töï caùc ñoaïn DNA hay gen ñoù. Söû duïng caùc maùy toång hôïp DNA töï ñoäng (DNA synthesizer). Laäp ngaân haøng DNA boå trôï (cDNA): Ñaây laø phöông phaùp taïo gen töø mARN nhôø enzym phieân maõ ngöôïc (reverse transcriptase). Ñaàu tieân, töø mARN toång hôïp ñöôïc cDNA maïch ñôn. Nhôø enzym phieân maõ ngöôïc neân baát cöù gen naøo coù mARN hoaëc moät ñoaïn polyribonucleotit toång hôïp baèng con ñöôøng hoùa hoïc ñeàu coù theå toång hôïp ñöôïc cDNA. Töø caùc cDNA maïch ñôn coù theå taïo thaønh cDNA maïch keùp nhôø coù enzym DNA polymerase. Caùc cDNA maïch keùp ñöôïc gaén vaøo plasmid ñeå taïo ra plasmid taùi toå hôïp. Ngaân haøng DNA boå trôï coù nhieàu öu theá vì caùc doøng cDNA chöùa ñoaïn trình töï nucleotit chæ goàm caùc ñoaïn maõ hoùa cuûa moät gen. Maët khaùc coù theå taïo ra nhöõng teá baøo vi khuaån chuyeân hoùa chæ taïo ra moät loaïi protein töông öùng vôùi moät mARN cuï theå, töø ñoù saûn phaåm taïo ra deã ñöôïc tinh saïch vaø ñöôïc saûn phaåm nhö mong muoán. Taïo plasmid taùi toå hôïp Khi coù caùc ñoaïn DNA hay cDNA mong muoán. Böôùc tieáp theo laø gaén chuùng vaøo vector chuyeån gen ñeå taïo ra plasmid taùi toå hôïp. Coù nhieàu phöông phaùp gaén caùc ñoaïn DNA hoaëc cDNA vaøo plasmid hoaëc caùc vector chuyeån gen khaùc. Phöông phaùp duøng ñaàu dính: Theo phöông phaùp naøy, ñaàu tieân caàn xöû lyù DNA chöùa ñoaïn gen mong muoán vaø vector chuyeån gen (nhö plasmid) baèng caùc loaïi enzym giôùi haïn caét taïo ñaàu dính (ví duï: E.coli). Troän laãn DNA vaø vector chuyeån gen ñaõ bò caét baèng cuøng moät loaïi enzym giôùi haïn nhö ñaõ neâu treân. Böôùc tieáp theo laø duøng enzym noái ligase ñeå gaén caùc ñoaïn caàn noái vôùi nhau. Phöông phaùp naøy ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong vieäc taïo plasmid taùi toå hôïp. Phöông phaùp duøng ñoaïn noái (linkers): Caùc ñoaïn DNA hay ARN ngaén khoaûng 10-20 nucleotit ñöôïc toång hôïp baèng con ñöôøng hoùa hoïc, goïi laø oligonucleotit. Ñoaïn oligonucleotit toång hôïp naøy caàn coù ñoaïn trình töï nhaän bieát töông öùng vôùi moät loaïi enzym giôùi haïn (ví duï: E.coRI) duøng laøm ñoaïn noái (linker). Caùc ñoaïn noái ñöôïc gaén vaøo 2 ñaàu cuûa ñoaïn DNA (gen) laï taïo thaønh ñoaïn DNA coù 2 ñoaïn trình töï töông öùng vôùi ñieåm caét cuûa enzym giôùi haïn. Böôùc tieáp theo laø xöû lyù caùc ñoaïn DNA laï coù gaén ñoaïn noái vaø xöû lyù vector chuyeån gen baèng cuøng moät loaïi enzym giôùi haïn (E.coRI). Troän chung vector vaø DNA ñaõ xöû lyù baèng enzym giôùi haïn (E.coRI) vaø gaén chuùng vôùi nhau nhôø enzym noái ligase. Phöông phaùp duøng enzym terminal transferase: Ñaây laø phöông phaùp gaén ñuoâi oligo, moät loaïi nucleotit, ví duï CCCCC (ñuoâi dC) vaøo ñaàu 3’-OH cuûa moät maïch DNA (ñuoâi homopolymer), do ñoù taïo ra ñöôïc maïch ñôn thöù 2 cuûa cDNA coù ñuoâi boå sung laø GGGGG. Khaû naêng taïo ñuoâi homopolymer laø do enzym terminal transferase xuùc taùc. Ta coù theå hình dung phöông phaùp naøy nhö sau: Töø moät phaân töû mARN taïo ra maïch cDNA maïch ñôn roài taïo ra cDNA maïch keùp nhôø enzym phieân maõ ngöôïc vaø DNA polymerase. Xöû lyù cDNA maïch keùp ñeå taïo doøng cDNA ñaàu baèng nhôø vieäc söû duïng enzym S1 nuclease. Xöû lyù caùc doøng cDNA ñaàu baèng baèng enzym terminal transferase cuøng vôùi oligo (dC) ñeå taïo ñaàu muùt 3’CCCCC. Xöû lyù plasmid coù ñoaïn trình töï nhaän bieát cuûa enzym giôùi haïn REPstI baèng enzym giôùi haïn PstI, sau ñoù uû vôùi enzym terminal transferase cuøng vôùi oligo (dC) ñeå taïo ñuoâi 3’GGGGG. Troän laãn caùc doøng cDNA vaø plasmid sau khi xöû lyù vôùi nhau. Caùc ñaàu muùt cuûa 2 loaïi ñuoâi boå trôï seõ baét caëp boå sung cho nhau. Do vaäy, ñoaïn DNA laï (töø cDNA) baét caëp vôùi plasmid. Nhôø coù enzym DNA polymerase I vaø ligase chuùng seõ noái vôùi nhau taïo ra plasmid taùi toå hôïp. Kyõ thuaät taïo DNA boå sung (cDNA) – Ngaân haøng gen 1) Khaùi nieäm veà cDNA. Heä gen cuûa sinh vaät nhaân chuaån coù kích thöôùc raát lôùn goàm nhieàu gen, caùc gen coù caáu truùc phöùc taïp. Quaù trình taïo doøng gen (cloning gene) thöïc chaát laø taïo moät phaàn heát söùc nhoû beù trong toång soá DNA cuûa teá baøo. Khi taïo doøng gen, khoâng phaûi taát caû caùc ñoaïn cuûa gen caàn taïo doøng gen maø chæ caàn caùc ñoaïn maõ hoùa cuûa moät gen. Nhaân cuûa teá baøo nhaân chuaån baäc cao chöùa nhöõng ñoaïn maõ hoùa (exon) xen keõ vôùi caùc ñoaïn khoâng maõ hoùa (intron). Do vaäy chuùng ta caàn baûn sao cuûa gen chæ chöùa phaàn maõ hoùa cho protein. Baûn sao naøy baát nguoàn töø phaân töû mARN tröôûng thaønh sau khi ñaõ caét boû caùc ñoaïn töông öùng vôùi caùc intron. Nhôø enzym sao maõ ngöôïc maø töø mARN tröôûng thaønh naøy seõ toång hôïp neân DNA. Caùc DNA taïo neân baèng caùch naøy ñöôïc goïi laø DNA boå sung (cDNA: complementary DNA). Nhö vaäy cDNA laø caùc phaân töû DNA ñöôïc toång hôïp töø khuoân mARN nhôø quaù trìng phieân maõ ngöôïc. cDNA thu ñöôïc töø 1 teá baøo, ôû caùc giai ñoaïn khaùc nhau löu giöõ taïo thaønh ngaân haøng cDNA. Kyõ thuaät taïo cDNA vaø ngaân haøng cDNA Muoán taïo ra cDNA vaø taäp hôïp thaønh ngaân haøng cDNA caàn coù caùc böôùc sau: Taùch caùc mARN ra khoûi caùc ARN khaùc. Quaù trình naøy ñöôïc thöïc hieän ôû caùc giai ñoaïn phaùt trieån khaùc nhau cuûa loaøi. Muoán taùch chieát mARN ra khoûi caùc loaïi ARN khaùc (rARN, tARN) caàn cho hoãn hôïp ARN chaûy qua pheãu coù gaén cellulose-oligoT. mARN ñöôïc gaén laïi trong pheãu. Coâng ñoaïn tieáp theo laø giaûi phoùng mARN ra khoûi pheãu nhôø ñeäm Tris-EDTA. Söû duïng mARN laøm khuoân cuøng vôùi enzym sao maõ ngöôïc vaø caùc nguyeân lieäu dNTP ñeå taïo cDNA. Taïo doøng cDNA, thu thaäp caùc doøng cDNA ôû caùc giai ñoaïn phaùt trieån khaùc nhau cuûa teá baøo, löu giöõ ñeå laäp ngaân haøng cDNA . Tìm caùc cDNA caàn thieát baèng lai DNA hoaëc nhôø caùc phaûn öùng mieãn dòch. Öu, nhöôïc ñieåm cuûa kyõ thuaät taïo cDNA Kyõ thuaät taïo cDNA ñeå taïo doøng gen khoâng chöùa phaàn nitron, töø ñoù coù theå xaùc ñònh trình töï cuûa caùc nucleotit cuûa gen, treân cô sôû ñoù chuû ñoäng taïo ra saûn phaåm protein ñaëc hieâäu caàn thieát. Khi taïo ra ñöôïc caùc doøng cDNA, coù theå deã daøng bieán naïp vaøo caùc vaät chuû laø vi khuaån. Trong teá baøo vi khuaån, gen ñöôïc nhaân baûn vaø ñöôïc bieåu hieän. Bieán naïp cDNA khaéc phuïc ñöôïc hieän töôïng teá baøo vi khuaån khoâng dung naïp gen coù caáu truùc mang phaàn khoâng maõ hoùa (intron). Tuy nhieân, kyõ thuaät cDNA cho ta nhieàu gen khaùc nhau. Maët khaùc moãi giai ñoaïn phaùt trieån khaùc nhau cuûa cô theå thì söï phieân maõ cuûa heä gen laø khaùc nhau, vì vaäy vieäc thieát laäp ngaân haøng cDNA vaø choïn loïc gen mong muoán ñoøi hoûi coâng phu, tyû myû vaø toán nhieàu thôøi gian. Caùc loaïi teá baøo chuû Nhieàu loaïi teá baøo chuû khaùc nhau ñöôïc duøng phuï thuoäc vaøo muïc ñích söû duïng nhö: Nuoâi soá löôïng lôùn ñeå taùch plasmid cho thí nghieäm taïo doøng. Heä thoáng teá baøo chuû naøy caàn ñôn giaûn, deã söû duïng. Duøng ñeå bieåu hieän gen, ñaëc bieät ôû sinh vaät nhaân chuaån baäc cao nhö ñoäng vaät, thöïc vaät. Heä thoáng teá baøo chuû naøy caàn mang tính ñaëc thuø. Duøng ñeå saûn xuaát protein taùi toå hôïp. Tuøy theo muïc ñích söû duïng maø choïn moät loaïi teá baøo chuû thích hôïp. Caùc teá baøo chuû coù theå chia laøm 2 heä thoáng chính, ñoù laø teá baøo chuû nhaân sô vaø teá baøo chuû nhaân chuaån. Teá baøo chuû nhaân sô Moät loaïi teá baøo chuû lyù töôûng laø teá baøo caàn phaûi deã nuoâi caáy, deã giöõ vaø nhaân gioáng, laïi chaáp nhaän ñöôïc nhieàu loaïi vector. Vi khuaån E.coli ñaùp öùng caùc yeâu caàu cuûa teá baøo chuû lyù töôûng vaø ñöôïc söû duïng nhieàu trong kyõ thuaät taïo vaø taùch doøng gen. Do tính chaát ñaëc bieät cuûa teá baøo chuû lyù töôûng neân E.coli ñöôïc nghieân cöùu tyû myû veà cô cheá di truyeàn, phaân laäp vaø taïo neân nhieàu chuûng khaùc nhau. E.coli laø vi khuaån gram aâm, hình que (daøi khoaûng 1mm), khoâng gaây beänh, thöôøng gaëp trong ruoät ngöôøi. E.coli coù 1 nhieãm saéc theå (phaân töû DNA) daïng voøng naèm trong vuøng nhaân. Kích thöôùc cuûa caùc phaân töûd naøy khoaûng 4x106 caëp bazô. Caùc quaù trình bieåu hieän cuûa gen nhö phieân maõ, dòch maõ ñöôïc xaûy ra ñoàng thôøi. Sau khi mARN ñöôïc toång hôïp seõ ñöôïc söû duïng ngayñeå dòch maõ maø khoâng qua caùc böôùc söûa ñoåi sau phieân maõ vì gen cuûa chuùng khoâng coù caùc nitron (ñoaïn khoâng maõ hoùa). Do vaäy, E.coli ñöôïc coi laø teá baøo chuû ñôn giaûn nhaát. Raát nhieàu thí nghieäm taùch doøng gen ôû caùc phoøng thí nghieäm ñang söû duïng E.coli laøm teá baøo chuû. Ngoaøi E.coli, moät soá vi khuaån khaùc cuõng ñöôïc duøng laøm teá baøo chuû cho caùc thí nghieäm taùch doøng gen nhö: Bacillus, Pseudomonas vaø Streptomyces… tuy nhieân nhöõng teá baøo chuû naøy caàn phaûi coù vector thích hôïp, neân vieäc ñöa caùc DNA taùi toå hôïp vaøo chuùng gaëp nhieàu khoù khaên. Teá baøo chuû nhaân chuaån Moät trong nhöõng nhöôïc ñieåm cô baûn khi duøng E.coli laøm teá baøo chuû ñeå taùch doøng gen laø khoâng coù maøng nhaân bao boïc NST ví noù laø vi sinh vaät nhaân sô. Do vaäy caùc gen ôû sinh vaät nhaân chuaån khoâng theå bieåu hieän ñöôïc trong E.coli vì moâi tröôøng khaùc vôùi moâi tröôøng bình thöôøng cuûa gen sinh vaät nhaân chuaån. Nhö vaäy, neáu chuùng ta muoán saûn xuaát moät loaïi protein nhaân chuaån trong moät thí nghieäm taùch doøng thì khoù coù theå tin raèng E.coli mang DNA taùi toå hôïp coù theå saûn sinh ra protein coù chöùc naêng ñaày ñuû nhö protein nhaân chuaån mong muoán. Caùc teá baøo chuû nhaân chuaån coù phoå toàn taïi raát roäng töø caùc vi sinh vaät nhaân chuaån baäc thaáp nhö naám men, naám moác, taûo cho ñeán caùc teá baøo sinh vaät ña baèophöùc taïp nhö ñoäng vaät, thöïc vaät. Teá baøo naám men (Saccharomyces cerevisiae) Naám men S.cerevisiae ñöôïc söû duïng laøm teá baøo chuû moät caùch roäng raõi trong Coâng ngheä di truyeàn vì nhieàu lí do: S.cerevisiae laø vi sinh vaät nhaân chuaån ñôn baøo (kích thöôùc khoaûng 5 mm) ñaõ ñöôïc nghieân cöùu tyû myû veà ñaëc ñieåm di truyeàn, sinh lyù. Naám men S.cerevisiae deã nuoâi caáy vôùi qui moâ lôùn ñeå thu sinh khoái teá baøo. Moät soá S.cerevisiae coù khôûi ñieåm (promotor) maïnh vaø coù plasmid duøng laøm vector YAC bieåu hieän gen. S.cerevisiae coù khaû naêng thöïc hieän caùc bieán ñoåi sau dòch maõ nhö ñöôøng hoùa, phosphoril hoùa… ñeå protein coù ñaày ñuû caùc hoaït tính sinh hoïc. S.cerevisiae bình thöôøng toång hôïp ít loaïi protein cuûa baûn thaân noù, neáu ñöa gen laï toång hôïp protein môùi thì saûn phaåm deã laøm tinh saïch. S.cerevisiae laø loaøi naám men ñöôïc söû duïng roäng raõi trong leân men baùnh mì, leân men röôïu, bia. Do ñoù noù ñöôïc coâng nhaän laø vi sinh vaät an toaøn, haàu nhö khoâng taïo ra ñoäc toá. Heä gen (genome) cuûa S.cerevisiae coù khoaûng 1,35x107 caëp bazô ñaõ ñöôïc giaûi trình töï vaøo naêm 1996 vaø coù kích thöôùc daøi hôn E.coli khoaûng 3,5 laàn. Caùc vi naám khaùc cuõng ñöôïc söû duïng laøm teá baøo chuû trong caùc thí nghieäm taïo doøng gen nhö naám moác Aspergillus nidulans, Neurospora crassa hoaëc Pechia pastoris. Vector bieåu hieän gen ôû teá baøo S.cerevisiae cuõng nhö ôû sinh vaät nhaân chuaån khaùc chuùng bao goàm khôûi ñieåm (P- promotor), ñieåm keát thuùc (T- terminator), khôûi ñaàu sao cheùp cuûa E.coli (ori E); khôûi ñaàu sao cheùp ôû teá baøo Eukaryota (orieuk); caùc gen ñaùnh daáu choïn loïc (ESM); caùc vò trí nhaän bieát cuûa enzym giôùi haïn (MCS- multicloning site: ñieåm ña taùch doøng). Caùc teá baøo chuû thöïc vaät Moät soá loaïi teá baøo chuû thöïc vaät ñöôïc söû duïng laøm teá baøo chuû trong caùc thí nghieäm thao taùc gen. Taûo ñôn baøo, ví duï nhö loaøi Chramydomonas rainhardii coù taát caû nhöõng ñaëc tính öu vieät cuûa vi sinh vaät coäng vôùi caáu truùc vaø chöùc naêng cuûa teá baøo thöïc vaät. Do vaäy taûo ñôn baøo ñöôïc söû duïng ngaøy caøng nhieàu. Tuy nhieân, ngöôøi ta cuõng coøn duøng caùc teá baøo thöïc vaät nuoâi caáy trong nhöõng moâi tröôøng thích hôïp coù theå duøng laøm teá baøo chuû. Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät nuoâi raát phöùc taïp, nhöng trong nhöõng ñieàu kieän caàn thieát cho söï bieåu hieän ra caùc protein coù hoaït tính sinh hoïc, ngöôøi ta vaãn söû duïng teá baøo chuû ñoäng vaät. Caùc teá baøo chuû ñoäng vaät bao goàm: Teá baøo thaän cuûa khæ xanh Chaâu Phi (African green monkey kidney). Teá baøo thaän chuoät ñoàng nhoû (Baby hamster kidney). Teá baøo thaän phoâi ngöôøi (Human embryonic kidney). Teá baøo töû cung chuoät baïch (Chinese hamster ovary). Teá baøo coân truøng ñeå nuoâi Baculovirus bieåu hieän protein ngöôøi. Teá baøo tuyeán truøng Caenorhabditis elegans. Phöông phaùp leân men Nguyeân taéc: Peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù theå ñöôïc giaûi phoùng khoûi protein ban ñaàu nhôø quaù trình leân men cuûa vi sinh vaät. Vi sinh vaät coù theå söû duïng caùc enzyme ngoaïi baøo ñeå thuûy phaân protein hoaëc khi caùc vi sinh vaät naøy bò phaân huûy thì caùc enzyme noäi baøo cuûa noù thoaùt ra ngoaøi, caùc enzyme naøy coù theå tieáp tuïc thuûy phaân protein. Leân men söõa: Ñeå laøm taêng löôïng peptide coù hoaït tính sinh hoïc trong caùc saûn phaåm söõa leân men thì ngöôøi ta cho leân men hoaëc ñoàng leân men vôùi chuûng vi khuaån lactic thuûy phaân protein maïnh. Vieäc löïa choïn chuûng vi khuaån coù aûnh höôûng tôùi vieäc giaûi phoùng peptide coù hoaït tính sinh hoïc. Chuûng vi khuaån khoâng neân thuûy phaân protein quaù maïnh (noù coù theå phaù huûy saûn phaåm) vaø caàn coù tính ñaëc hieäu phuø hôïp ñeå coù theå giaûi phoùng peptide coù hoaït tính sinh hoïc mong muoán. Caùc protease ôû thaønh teá baøo vi khuaån lactic coù tính ñaëc hieäu roäng, noù thuûy phaân protein söõa, laøm giaûi phoùng nhieàu loaïi oligopeptide. Vi khuaån lactic coù theå vaän chuyeån caùc peptide coù töø 18 amino acid trôû xuoáng ñi vaøo teá baøo ñeå söû duïng laøm nguoàn nitô. Caùc peptide coù maïch daøi hôn thì khoâng ñöôïc vaän chuyeån vaøo teá baøo. Sau khi teá baøo vi khuaån bò phaân huûy thì nhöõng peptide naøy seõ ñöôïc thuûy phaân tieáp bôûi caùc peptidase noäi baøo cuûa vi khuaån lactic. Nhieàu vi sinh vaät coù heä enzyme thuûy phaân protein maïnh, ví duï 1 soá loaøi ñaõ ñöôïc nghieân cöùu nhö: Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus, Lb plantarum, Lb rhamnosus, Lb acidophilus, Streptococcus thermophilus vaø Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus…. Heä enzyme naøy bao goàm caùc enzyme ôû thaønh teá baøo vaø caùc enzyme beân trong teá baøo ví duï: endopeptidase, aminopeptidase, tripeptidase vaø dipeptidase (Christensen, Dudley, Pederson, & Steele, 1999). Hieän ñaõ coù nhieàu nghieân cöùu baùo caùo veà söï giaûi phoùng cuûa caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc töø protein cuûa söõa nhôø vi sinh vaät thuûy phaân (Gobbetti et al., 2004; Gobbetti, Stepaniak, De Angelis, Corsetti, & Di Cagno, 2002; Korhonen & Pihlanto-Leppa la, 2001, 2004; Matar et al., 2003), tuy nhieân haàu heát nhöõng baùo caùo naøy ñeàu taäp trung vaøo vieäc thu nhaän caùc peptide coù taùc duïng laøm giaûm chöùng cao huyeát aùp, ñieàu hoøa heä mieãn dòch, choáng oxi hoùa. Hai trong soá nhöõng peptide öùc cheá ACE ñöôïc bieát ñeán nhieàu nhaát laø VPP vaø IPP, 2 peptide naøy ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong söõa leân men bôûi Lb.helveticus (Nakamura, Yamamoto, Sakai, Okubo et al., 1995; Sipola, Finckenberg, Korpela, Vapaatalo, & Nurminen, 2002). So vôùi caùc vi khuaån lacitc khaùc thì khi leân men söõa vôùi Lb.helveticus thì saûn phaåm cho thaáy hoaït tính öùc cheá ACE cao vaø taùc ñoäng laøm giaûm huyeát aùp roõ reät. Gobbetti, Ferranti, Smacchi, Goffredi, and Addeo (2000) ñaõ chöùng minh coù söï taïo thaønh peptide öùc cheá ACE khi söû duïng 2 loaøi Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus vaø Lc. lactis ssp.cremoris sau khi leân men söõa trong 72 giôø. Hai peptide öùc cheá ACE ñöôïc tìm thaáy Ser-Lys-Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly Pro-Ile vaø Ser-Lys-Val-Tyr-Pro cho thaáy khaû naêng beàn vöõng trong moâi tröôøng taùc ñoäng bôûi acid, kieàm, enzyme thuûy phaân cuûa heä tieâu hoùa hoaëc trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû 5-10oC trong 4 ngaøy. Nhieàu nghieân cöùu ñaõ chöùng minh söï thuûy phaân nhôø vi sinh vaät coù theå laøm sinh ra caùc peptide coù khaû naêng ñieàu hoøa heä mieãn dòch (Gill, Doull, Rutherfurd, & Cross, 2000). Khi söû duïng enzyme ñöôïc taùch ra töø Lactobacillus GG var. casei ñeå thuûy phaân casein, sau ñoù tieáp tuïc cho thuûy phaân baèng pepsin vaø trypsin, saûn phaåm thu ñöôïc coù tính chaát ñieàu hoøa heä mieãn dòch, khaû naêng naøy theå hieän maïnh nhaát khi söû duïng -casein. Matar (2001) ñaõ cho Lb.helveticus vaøo söõa, sau ñoù laáy söõa naøy cho chuoät aên trong 3 ngaøy thì phaùt hieän löôïng IgA taêng raát cao trong chaát nhaày ôû ruoät. Baûng 3.5: Moät vaøi ví duï veà caùc peptide coù hoaït tính sinh hoïc coù nguoàn goác töø protein cuûa söõa ñöôïc giaûi phoùng ra nhôø vi sinh vaät Leân men ñaäu naønh: Gaàn ñaây ngöôøi ta cuõng quan taâm ñeán caùc saûn phaåm töø ñaäu naønh leân men nhö: natto, tempeh, nöôùc töông, soy paste. Ngöôøi ta nhaän thaáy quaù trình leân men (nhôø Bacillus vaø Rhizopus) ñaäu naønh chæ coù theå thuûy phaân protein ñaäu naønh thaønh nhöõng peptide lôùn. Ngoaøi ra, Gibbs vaø coäng söï (2004) ñaõ phaùt hieän moät ñieàu thuù vò laø trong quaù trình leân men coù xuaát hieän peptide ELLVYLL, peptide naøy khoâng coù trong protein ñaäu naønh, do ñoù hoï cho raèng trong quaù trình leân men cuõng coù theå xaûy ra hieän töôïng toång hôïp caùc peptide. Peptide öùc cheá ACE (His-His-Leu) ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong soy paste (Shin vaø coäng söï, 2001), nöôùc töông (Okamoto 1995), natto vaø tempeh (Gibbs 2004). Phöông phaùp duøng enzyme thuûy phaân Nguyeân taéc: Duøng protease coù tính ñaëc hieäu phuø hôïp ñeå thuûy phaân protein, töø ñoù thu ñöôïc hoãn hôïp caùc peptide. Hoãn hôïp peptide sau ñoù seõ ñöôïc taùch vaø tinh saïch ñeå thu ñöôïc peptide mong muoán. Theo Haileselassie vaø coäng söï (1999) thì trong phaân töû peptide neáu coù chöùa caøng nhieàu goác proline thì peptide naøy seõ caøng coù nhieàu khaû naêng khaùng laïi söï taán coâng cuûa caùc enzyme thuûy phaân. Ngöôøi ta coù theå keát hôïp quaù trình thuûy phaân vaø taùch trong cuøng moät thieát bò: tieán haønh thuûy phaân trong thieát bò phaûn öùng membrane. Trong thieát bò naøy, söï thuûy phaân protein ñi keøm vôùi vieäc tinh saïch caùc peptide töø hoãn hôïp caùc saûn phaåm nhôø quaù trình loïc (hoaëc keát tuûa). Ngoaøi ra, do enzyme ñöôïc giöõ laïi trong heä thoáng neân laøm cho heä thoáng coù theå deã daøng vaän haønh lieân tuïc. Vieäc söû duïng maøng sieâu loïc (1-100nm hoaëc MWCO 500-100000 Da) phuø hôïp cho vieäc giöõ laïi haàu heát enzyme (Prazeres vaø Cabral, 1994). Vieäc taùch 1 peptide cuï theå naøo ñoù töø hoãn hôïp sau phaûn öùng thì buoäc ta phaûi söû duïng enzyme coù tính ñaëc hieäu cao, giaûi phoùng caùc peptide mong muoán 1 caùch nhanh choùng, ñoàng thôøi caùc peptide coù phaân töû löôïng khaùc nhau seõ ñöôïc taùch rôøi choïn loïc nhôø maøng sieâu loïc. Öu ñieåm chính cuûa thieát bò phaûn öùng membrane: Naêng suaát cao do hoaït ñoäng lieân tuïc Khoáng cheá söï chuyeån hoùa cuûa saûn phaåm Ñieàu chænh phaân töû löôïng cuûa saûn phaåm thuûy phaân Nhöôïc ñieåm chính cuûa phöông phaùp naøy: söï giaûm naêng suaát theo thôøi gian do söï taêng noàng ñoä cuûa caùc chaát tích ñieän, söï voâ hoaït cuûa enzyme (Perea vaø Ugalde, 1996). Söï thuûy phaân casein glycomacropeptide bôûi trypsin ñaõ ñöôïc thí nghieäm trong thieát bò naøy. Moät maøng sieâu loïc vôùi MWCO 3000Da taùch nhöõng peptide nhoû töø thieát bò, ñoàng thôøi, cô chaát môùi ñöôïc cho vaøo thieát bò vôùi toác ñoä phuø hôïp. So saùnh vôùi thieát bò phaûn öùng theo meû thì thieát bò naøy cho naêng suaát cao hôn 3 laàn sau 3.5 giôø tieán haønh thuûy phaân. Tuy nhieân löôïng CMP ñöôïc thuûy phaân thì chæ khoaûng 50%, do ñoù caàn phaûi toái öu hoùa noàng ñoä cô chaát vaø löu löôïng cho vaøo thieát bò (Bouhallab et al., 1992). Moät nghieân cöùu töông töï, immunomodulatory peptide -casein (193-209) ñöôïc phaân taùch töø vieäc thuûy phaân -casein bôûi chymosin. Khi thieát bò söû duïng maøng loïc membrane laøm töø cellulose thì vieäc vaän chuyeån cuûa peptide qua maøng seõ deã daøng hôn (Bouhallab et