Đề tài Tổng quan về legionella gây bệnh trong nước

CHÖÔNG 1 : MÔÛ ÑAÀU Đặt vấn ñeà Trong nhöõng naêm qua thì ngoä ñoäc thöïc phaåm ñöôïc bieát ñeán khaù thöôøng xuyeân, trôû thaønh moái quan taâm cuûa toaøn xaõ hoäi. Coù nhieàu nguyeân nhaân khaùc nhau coù theå gaây ra ngoä ñoäc thöïc phaåm nhöng phaàn lôùn caùc tröôøng hôïp laø coù nguoàn goác töø vi sinh vaät, do söï hieän dieän cuûa vi sinh vaät gaây beänh hay söï hieän dieän cuûa ñoäc toá tieát ra bôûi caùc vi sinh vaät naøy trong nöôùc uoáng, thöïc phaåm. Ngaøy nay, an toaøn nhaát laø veà phöông dieän vi sinh vaät, trôû thaønh moät trong nhöõng yeâu caàu khoâng theå thieáu ñoái vôùi chaát löôïng thöïc phaåm. Vieät Nam laø moät nöôùc noâng nghieäp coù tieàm löïc lôùn veà saûn xuaát noâng saûn, thuûy haûi saûn, thöïc phaåm. Ngoaøi thò tröôøng tieâu thuï noäi ñòa cho gaàn 80 trieäu daân, thöïc phaåm vaø thuûy saûn cuûa nöôùc ta cuõng ñaõ xuaát khaåu ñöôïc ra thò tröôøng theá giôùi ñem laïi nguoàn ngoaïi teä lôùn cho ñaát nöôùc. Ñaëc bieät, thuûy haûi saûn cheá bieán cuûa Vieät Nam ñaõ coù ñöôïc thò phaàn quan troïng taïi Baéc Myõ, Chaâu Aâu, Nhaät Baûn, Hoa Kyø…laø moät trong nhöõng ngaønh kinh teá mang laïi ngoaïi teä quan troïng cho ñaát nöôùc, giaûi quyeát vieäc laøm cho moät soá löôïng lôùn ngöôøi lao ñoäng ôû caû noâng thoân vaø thaønh thò. Do nhaän thöùc ngaøy caøng ñöôïc naâng cao cuûa ngöôøi tieâu duøng trong nöôùc veà an toaøn veä sinh thöïc phaåm vaø söï taêng cöôøng quaûn lyù nhaø nöôùc, kieåm tra, giaùm saùt cuûa caùc cô quan chöùc naêng, vieäc phaân tích vi sinh vaät gaây beänh vaø thöïc hieän caùc bieän phaùp ñaûm baûo saûn xuaát, cheá bieán thöïc phaåm ñaït tieâu chuaån veà an toaøn veà vi sinh vaät ngaøy caøng ñöôïc caùc ñôn vò saûn xuaát, cheá bieán thöïc phaåm noäi ñòa quan taâm. Ñoái vôùi thuûy haûi saûn xuaát khaåu, ñeå ñaùp öùng tieâu chuaån nghieâm ngaët veà vi sinh cuûa caùc thò tröôøng treân theá giôùi vaø taêng cöôøng naêng löïc caïnh tranh, trong nhöõng naêm gaàn ñaây caùc ñôn vò saûn xuaát cheá bieán thuûy haûi saûn xuaát khaåu Vieät Nam ñaõ raát chuù troïng ñeán vieäc ñaàu tö ñoåi môùi coâng ngheä, thöïc thi caùc chöông trình quaûn lyù ñaûm baûo chaát löôïng nhö phaân tích vaø kieåm soaùt, trong ñoù vieäc xaây döïng phoøng phaân tích, kieåm ñònh vaø ñaøo taïo caùn boä phaân tích, kieåm ñònh vi sinh vaät ngaøy caøng ñöôïc quan taâm. Nhö vaäy, hieän nay ñang coù moät nhu caàu thöïc tieãn raát lôùn veà phía nhaø saûn xuaát cuõng nhö veà phía ngöôøi lao ñoäng veà ñaøo taïo caùn boä phaân tích vi sinh vaät gaây beänh trong thöïc phaåm. Nhaø saûn xuaát coù phoøng thí nghieäm phaân tích toát, coù ñoäi nguõ coù tay ngheà cao seõ deã thuyeát phuïc, taïo ñöôïc nieàm tin ôû ñoái taùc ñeå kyù keát caùc hôïp ñoàng saûn xuaát quan troïng. Caùn boä kyõ thuaät, kyõ thuaät vieân ñöôïc ñaøo taïo, naâng caùo kyõ naêng veà phaân tích vi sinh vaät seõ deã cuûng coá vai troø vaø söï caàn thieát cuûa mình ñoái vôùi ñôn vò. Vôùi yù nghóa thöïc tieãn ñoàng thôøi ñöôïc söï chaáp nhaän cuûa Khoa Moâi tröôøng vaø Coâng ngheä Sinh hoïc, chuùng toâi tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi “Toång quan veà Legionella gaây beänh trong nöôùc”. Muïc ñích Tìm hieåu veà Legionella gaây beänh trong nöôùc. Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của Legionella. Noäi dung nghieân cöùu - Tìm hieåu ñoäc toá vaø khaû naêng gaây beänh cuûa Salmonella trong thöïc phaåm. - Tìm hieåu ñoäc toá vaø khaû naêng gaây beänh cuûa Escherichia Coli trong thöïc phaåm. - Tìm hieåu ñoäc toá, cô cheá gaây beänh, ñaëc ñieåm caáu truùc cuûa Legionella gaây beänh trong nöôùc. - Tìm hieåu caùc nguoàn nhieãm cuûa Legionella vaø caùc phöông phaùp phaùt hieän Legionella. - Tìm hieåu bieän phaùp kieåm soaùt Salmonella, Escherichia Coli, Legionella gaây beänh trong thöïc phaåm. CHÖÔNG 2 : TOÅNG QUAN MOÄT SOÁ VI SINH VAÄT GAÂY BEÄNH TRONG THÖÏC PHAÅM 2.1. Salmonella 2.1.1. Lòch söû phaùt hieän Salmonella - Naêm 1880 Grafhy ñaõ moâ taû hình thaùi vi khuaån quan saùt ñöôïc treân tieâu baûn. - Naêm 1884 Grafhy laø ngöôøi ñaàu tieân phaân laäp Salomonella typhi. - Chi Samonella ñöôïc baét nguoàn töø teân cuoái cuøng cuûa Daniel Elmer Salmo. - Năm 1885 nhaø nghieân cöùu Theobald Smith trôï lyù cho Daniel Elmer Salmon (1850-1914) ñaõ phaùt hieän ra Salmonella choleraesuis. Keå töø ñoù soá löôïng Salmonella gaây ra Samonellosis ñaõ taêng leân 2.300 typhi. Nhöng sau ñoù Schweinittz vaø Dorset 1903 ñaõ chöùng minh beänh dòch taû laø do moät loaïi vi ruùt gaây neân vaø ñaõ xaùc ñònh S.choleraesuis laø vi khuaån gaây beänh phoù thöông haøn. - Naêm 1889 Klein phaân laäp ñöôïc S.gallinarum vaø Rettger cuõng ñaõ phaân laäp ñöôïc S.pullorum naêm 1909. Hình 2.1 : Vi khuaån Salomonella typhi vaø Salmonella choleraesuis. 2.1.2. Phaân loaïi Samonella Veà phaân loaïi khoa hoïc Salmonella ñöôïc xeáp vaøo : Giôùi : Bacteria Nghaønh : Proteobacteria Lôùp : Gamma Proteobacteria Boä : Enterobacteriales Hoï : Enterobacteriaceae Gioáng : Salmonella lignieres (1990) 2.1.3. Ñaëc ñieåm cuûa Salmonella 2.1.3.1. Ñaëc ñieåm hình thaùi Salmonella coù hình gaäy ngaén, hai ñaàu troøn. Ña soá caùc loaïi Salmonella ñeàu coù khaû naêng di ñoäng maïnh do coù töø 7-12 loâng xung quanh thaân. Vi khuaån seõ nhuoäm maøu vôùi caùc thuoác thoâng thöôøng, baét maøu Gram aâm. Khi nhuoäm vi khuaån baét maøu ñeàu toaøn thaân hoaëc hôi ñaäm ôû hai ñaàu. Salmonella laø tröïc khuaån Gram aâm, kích thöôùc trung bình töø 2-3 x 0,5-1µm. Di chuyeån baèng tieân mao (tröø Salmonella gallinarum vaø Salmonella pullorum gaây beänh cho gia caàm), khoâng taïo baøo töû, chuùng phaùt trieån toát ôû 6oC – 420C, thích hôïp nhaát ôû 350C – 370 C, pH töø 6 - 9 thích hôïp nhaát laø pH = 7,2. ÔÛ 180C – 400C vi khuaån coù soáng ñeán 15 ngaøy. Hình 2.2: Vi khuaån Salmonella enteritidis vaø Salmonella typhimurium. 2.1.3.2. Tính chaát nuoâi caáy Salmonella laø vi khuaån kî khí tuøy nghi, deã nuoâi caáy, nhieät ñoä thích hôïp 370C nhöng coù theå phaùt trieån ñöôïc ôû pH töø 6-9. Phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng nuoâi caáy thoâng thöôøng. Treân moâi tröôøng thích hôïp, vi khuaån seõ phaùt trieån sau 24 giôø. - Moâi tröôøng nöôùc thòt : Caáy vaøi giôø ñaõ ñuïc nheï, sau 18 giôø ñuïc ñeàu, nuoâi caáy laâu thì ôû ñaùy oáng nghieäm coù maët treân moâi tröôøng coù maøng moûng. - Moâi tröôøng thaïch thöôøng : Nuoâi caáy treân thaïch thöôøng vi khuaån moïc thaønh caùc khuaån laïc troøn, trong saùng hoaëc xaùm, nhaün boùng, hôi loài leân ôû giöõa, nhoû vaø traéng hôn khuaån laïc E.coli. - Moâi tröôøng Mac Conkey : ÔÛ 350C- 370C sau 18-24 giôø vi khuaån Salmonella moïc thaønh nhöõng khuaån laïc troøn, trong, khoâng maøu, nhaün boùng vaø hôi loài ôû giöõa. - Moâi tröôøng SS : Nuoâi caáy ôû 350C- 370C sau 18-24 giôø vi khuaån Salmonella moïc thaønh nhöõng khuaån laïc troøn, boùng, khoâng maøu. - Moâi tröôøng XLD : Nuoâi caáy ôû 350C- 370C sau 18-24 giôø vi khuaån Salmonella moïc thaønh nhöõng khuaån laïc troøn, loài coù taâm ñen ôû giöõa, moâi tröôøng chuyeån sang maøu hoàng. Hình 2.3: Salmonella spp sau khi taêng tröôûng 24 giôø treân thaïch XLD. 2.1.3.3. Ñaëc ñieåm sinh hoùa Moãi loaøi Salmonella coù khaû naêng leân men moät soá ñöôøng nhaát ñònh vaø khoâng ñoåi. Phaàn lôùn caùc loaøi Salmonella leân men ñöôøng glucose, sinh hôi, khoâng leân men lactose, sucrose, salicin vaø inositol. - Moät soá loaøi Salmonella cuõng leân men ñöôøng glucose nhöng khoâng sinh hôi nhö S.abortus equi, S. abortus bovis, S.typhisuis, S.typhi… - Tuy nhieân khoâng phaûi loaøi Salmonella naøo cuõng coù tính chaát treân, caùc ngoaïi leä ñaõ ñöôïc xaùc ñònh nhö Salmonella typhi leân men ñöôøng glucose khoâng sinh hôi, khoâng söû duïng citrate trong moâi tröôøng Simmon, haàu heát caùc chuûng S.paratyphi vaø S.cholerasuis khoâng sinh H2S. S.pullorum khoâng leân men mantose. - Taát caû caùc Salmonella khoâng leân men lactose vaø saccarose. - Ña soá Salmonella khoâng laøm tan chaûy gelatin, khoâng phaân giaûi ureâ, khoâng sinh Indol, moät soá söû duïng ñöôïc cacbon. - Treân moâi tröôøng KIA (Kiglen Iron Agar) : vi khuaån leân men glucose vaø khoâng leân men lactose neân phaàn thaïch ñöùng chuyeån sang maøu vaøng, phaàn thaïch nghieâng giöõ nguyeân maøu cuûa moâi tröôøng (maøu hoàng), vi khuaån coù hoaëc khoâng sinh - Phaûn öùng H2S döông tính (tröø S.paratyphi A, S.abortusequi, S.typhisuis). 2.1.3.4. Ñaëc ñieåm caáu truùc Salmonella Salmonella coù 3 loaïi khaùng nguyeân ñoù laø nhöõng chaát khi xuaát hieän trong cô theå thì kích thích ñaùp öùng mieãn dòch vaø keát hôïp ñaëc hieäu vôùi nhöõng saûn phaåm cuûa söï kích thích ñoù. Khaùng nguyeân ñoù bao goàm : + Khaùng nguyeân thaân O + Khaùng nguyeân loâng H + Khaùng nguyeân voû K + Vi khuaån thöông haøn (S.typhi) coù khaùng nguyeân V (Virulence) laø yeáu toá choáng thöïc baøo giuùp cho vi khuaån thöông haøn phaùt trieån beân trong teá baøo baïch caàu. a) Khaùng nguyeân thaân O Thaønh phaàn cô baûn laø vaùch teá baøo coù caáu truùc phöùc taïp goàm hai lôùp : Trong cuøng laø moät lôùp peptidoglycan, caùch moät lôùp khoâng gian chu chaát vaø tôùi lôùp maøng ngoaøi laø phöùc hôïp lipidpolysaccharide goàm lipoprotein vaø lipoplysaccharide. Bao beân ngoaøi lôùp peptidoglycan laø lôùp phospholipid A vaø B (quyeát ñònh ñoäc toá cuûa noäi ñoäc toá), sau ñoù laø hai lôùp polysaccharide khoâng mang tính ñaëc hieäu. Khaùng nguyeân cuûa noäi ñoäc toá coù baûn chaát hoùa hoïc laø lypopolysaccharide (LPS). Tính ñaëc hieäu cuûa khaùng nguyeân O vaø LPS laø moät, nhöng tính mieãn dòch thì khaùc nhau: Khaùng nguyeân O ngoaøi LPS coøn bao goàm caû lôùp peptidoglycan neân tính mieãn dòch cuûa noù maïnh hôn LPS. Maøng ngoaøi coù caáu truùc gaàn gioáng teá baøo chaát nhöng phospholipid haàu nhö chæ gaëp ôû lôùp trong, coøn ôû lôùp ngoaøi laø lipopolysaccharide daøy khoaûng 8 - 10 nm goàm 3 thaønh phaàn: Lipid A, polysaccharide, loõi. Maøng ngoaøi khaùng nguyeân O coøn coù theâm caùc protein: + Protein cô chaát: Porin ôû vi khuaån coøn goïi laø protein loã xuyeân maøng vôùi chöùc naêng cho pheùp moät soá loaïi phaân töû ñi qua chuùng nhö dipeptide, disaccharide, caùc ion voâ cô. + Protein maøng ngoaøi: chöùc naêng vaän chuyeån moät soá phaân töû rieâng bieät vaø ñöa qua maøng ngoaøi. + Lipoprotein: Ñoùng vai troø lieân keát lôùp peptidoglycan beân trong vôùi lôùp maøng ngoaøi. b) Khaùng nguyeân voû K - Khaùng nguyeân voû K coù baûn chaát hoùa hoïc cuûa voû vi khuaån laø polypeptid hoaëc polysaccharide.Voû cuûa vi khuaån gaây mieãn dòch khoâng maïnh nhöng khi gaén vôùi teá baøo vi khuaån voû vaãn gaây ñöôïc mieãn dòch. Khaùng nguyeân voû ñöôïc duøng ñeå phaân loaïi caùc chuûng Salmonella. c) Khaùng nguyeân loâng H - Ñöôïc toång hôïp töø caùc acid amin daïng D ( daïng ít gaëp trong töï nhieân). Do ñoù vieäc xöû lyù khaùng nguyeân cuûa caùc teá baøo mieãn dòch khoâng thuaän lôïi vaø ñaùp öùng khaùng theå khoâng maïnh. Khi caùc sôïi loâng bò keát hôïp bôûi caùc khaùng theå ñaëc hieäu, loâng seõ bò baát ñoäng, vi khuaån khoâng theå di chuyeån ñöôïc.Khaùng nguyeân loâng cuõng duøng ñeå phaân loaïi moät số chuûng Salmonella. - Khaùng nguyeân loâng H chia laøm 2 phase : + Phase 1 : Coù tính ñaëc hieäu goàm 28 loaïi khaùng nguyeân loâng ñöôïc bieåu thò baèng chöõ soá La Tinh thöôøng : a, b, c… + Phase 2 : Khoâng coù tính ñaëc hieäu, loaïi naøy coù theå ngöng keát vôùi caùc loaïi khaùc ñoâi khi thaønh phaàn coù theå gaëp ôû E.coli. Phase 2 goàm coù 6 loaïi ñöôïc bieåu thò baèng chöõ soá AÛ Raäp hay chöõ soá La Tinh . 2.1.4. Ñoäc toá cuûa Salmonella - Vi khuaån Salmonella coù theå tieát ra hai loaïi ñoäc toá : Ngoaïi ñoäc toá vaø noäi ñoäc toá.- Noäi ñoäc toá Salmonella raát maïnh goàm 2 loaïi : Gaây xung huyeát vaø muïn huyeát, ñoäc toá ôû ruoät gaây ñoäc thaàn kinh, hoân meâ, co giaät. - Ngoaïi ñoäc toá chæ phaùt hieän khi laáy vi khuaån coù ñoäc tính cao cho vaøo tuùi colodion roài ñaët vaøo oå buïng chuoät lang ñeå nuoâi, sau 4 ngaøy laáy ra roài caáy chuyeàn nhö vaäy töø 5 ñeán 10 laàn, sau cuøng ñem loïc, nöôùc loïc coù khaû naêng gaây beänh cho ñoäng vaät thí nghieäm. Ngoaïi ñoäc toá chæ hình thaønh trong ñieàu kieän invitro vaø nuoâi caáy kî khí. Ngoaïi ñoäc toá taùc ñoäng vaøo thaàn kinh vaø ruoät. 2.1.4.1. Noäi ñoäc toá Endotoxin Maøng ngoaøi teá baøo vi khuaån gram aâm noùi chung vaø vi khuaån Salmonella noùi rieâng ñöôïc caáu taïo bôûi thaønh phaàn cô baûn laø lipopolysaccharide (LPS). LPS coù caáu taïo phaân töû lôùn, goàm 3 vuøng rieâng bieät vôùi ñaëc tính vaø chöùc naêng rieâng bieät : Vuøng öa nöôùc, vuøng loõi vaø vuøng lipit A. - Vuøng öa nöôùc bao goàm moät chuoãi polysaccharide chöùa caùc ñôn vò khaùng nguyeân O. - Vuøng loõi coù baûn chaát laø acid heteroligosaccharide, ôû trung taâm noái khaùng nguyeân O vôùi vuøng lipit A. - Vuøng lipit A ñaûm nhaän chöùc naêng noäi ñoäc toá cuûa vi khuaån. Caáu truùc noäi ñoäc toá gaàn gioáng vôùi caáu truùc cuûa khaùng nguyeân O. Caáu truùc noäi ñoäc toá bieán ñoåi seõ daãn tôùi söï thay ñoåi ñoäc löïc cuûa Salmonella. Noäi ñoäc toá thöôøng laø lipopolysaccharide (LPS) ñöôïc phoùng ra töø vaùch teá baøo vi khuaån khi bò dung giaûi. Tröôùc khi theå hieän ñoäc tính cuûa mình, LPS caàn phaûi lieân keát vôùi caùc yeáu toá lieân keát teá baøo hoaëc caùc receptor beà maët caùc teá baøo nhö : Teá baøo ñaïi thöïc baøo, tieåu thöïc baøo, teá baøo gan, laùch. Raát nhieàu caùc cô quan trong cô theå chòu söï taùc ñoäng cuûa noäi ñoäc toá LPS nhö : Gan, thaän, cô, heä tim maïch, heä tieâu hoùa, heä thoáng mieãn dòch. Vôùi caùc bieåu hieän beänh lyù nhö : Taéc maïch maùu, giaûm tröông löïc cô thieáu oxy moâ baøo, roái loaïn tieâu hoùa, maát tính theøm aên… Noäi ñoäc toá taùc ñoäng tröïc tieáp leân heä thoáng mieãn dòch cuûa cô theå vaät chuû, kích thích hình thaønh khaùng theå. LPS taùc ñoäng leân caùc teá baøo tieåu caàu, gaây soát noäi ñoäc toá theo cô cheá : + Giaûi phoùng caùc chaát hoaït ñoäng maïnh nhö : Histamin. + Ngöng keát caùc tieåu caàu ñoäng maïch. + Ñoâng voùn, taéc maïch quaûn. LPS taùc ñoäng leân quaù trình trao ñoåi gluxit : LPS laøm taêng cöôøng hoaït löïc cuûa caùc men phaân giaûi glucose, caùc men phaân giaûi glycogen, laøm giaûm hoaït löïc caùc men tham gia quaù trình toång hôïp glycogen… 2.1.4.2. Ñoäc toá ñöôøng ruoät Enterotoxin - Cô cheá mieãn dòch vaø di truyeàn caùc Enterotoxin cuûa Salmonella coù quan heä gaàn guõi vôùi Choleratoxin neân ñöôïc goïi laø Choleratoxin like enterotoxin ( vieát taét laø CT). - Ñoäc toá ñöôøng ruoät cuûa vi khuaån Salmonella coù hai thaønh phaàn chính : Ñoäc toá thaåm xuaát nhanh ( Rapid permeability facto vieát taét laø RPF) vaø ñoäc toá thaåm xuaát chaäm laø (Delayed permeability facto vieát taét laø DPF). - Ñoäc toá thaåm xuaát nhanh giuùp Salmonella xaâm nhaäp vaøo teá baøo bieåu moâ cuûa ruoät, sau khi thöïc hieän khaû naêng thaåm xuaát 1-2 giôø vaø keùo daøi 48 giôø thì laøm tröông caùc teá baøo CHO (Chinese Hamster Ovary cell). - Ñoäc toá thaåm xuaát nhanh kích thích co boùp nhu ñoäng ruoät, laøm taêng thaåm thaáu thaønh maïch, phaù huûy toå chöùc teá baøo moâ ruoät, giuùp vi khuaån Salmonella xaâm nhaäp vaøo teá baøo vaø phaùt trieån nhanh veà soá löôïng. - Ñoäc toá thaåm xuaát chaäm cuûa Salmonella coù caáu truùc, thaønh phaàn gioáng ñoäc toá khoâng chòu nhieät cuûa vi khuaån E.coli, neân ñöôïc goïi laø ñoäc toá khoâng chòu nhieät cuûa Salmonella (Heat Lable Toxin vieát taét laø LT). LT thöïc hieän chöùc naêng phaûn öùng chaäm töø 18-24 giôø. LT bò phaù huûy ôû 37 oC trong voøng 30 phuùt vaø ôû 50oC trong voøng 4 giôø. - Ñoäc toá thaåm xuaát chaäm laøm thay ñoåi quaù trình trao ñoåi nöôùc vaø chaát ñieän giaûi daãn ñeán caûn trôû söï haáp thu, gaây thoaùi hoùa lôùp teá baøo thaønh ruoät gaây tieâu chaûy. 2.1.4.3. Ñoäc toá teá baøo - Khi cô theå ngöôøi vaø ñoäng vaät bò tieâu chaûy thì keøm theo hieän töôïng maát nöôùc vì vaäy haøng loaït caùc teá baøo bieåu moâ ruoät bò phaù huûy hoaëc bò toån thöông ôû caùc möùc ñoä khaùc nhau. Söï phaù huûy hay toån thöông ñoù laø do ñoäc toá teá baøo cuûa Salmnella gaây neân. - Coù 3 daïng ñoäc toá teá baøo : + Daïng thöù nhaát : Khoâng beàn vöõng vôùi nhieät vaø maãn caûm vôùi trypsin. Ñoäc toá daïng naøy taùc ñoäng theo cô cheá laø öùc cheá toång hôïp protein cuûa teá baøo Hela vaø laøm teo teá baøo. + Daïng thöù hai : Coù nguoàn goác töø protein maøng ngoaøi teá baøo vi khuaån coù caáu truùc vaø chöùc naêng gaàn gioáng vôùi caùc daïng ñoäc toá teá baøo do Shigella. Phoå bieán ôû haàu heát caùc Salmonella serovar gaây beänh. + Daïng thöù ba : Coù lieân heä vôùi ñoäc toá hemolysin. Hymolysin lieân heä vôùi caùc ñoäc toá teá baøo coù söï khaùc bieät vôùi Hemolysin khaùc veà troïng löôïng phaân töû vaø caùc phöông thöùc taùc ñoäng leân teá baøo theo cô cheá dung giaûi caùc khoâng baøo noäi baøo. 2.1.5. Khaû naêng gaây beänh cuûa Salmonella Taát caû caùc kieåu huyeát thanh Salmonella ñeàu mang cuïm gen inv (invasion) giuùp cho quaù trình xaâm nhieãm vaøo thaønh ruoät cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät môû ñaàu cho tieán trình gaây beänh. Cuïm gen naøy naèm trong heä thoáng gen SPI – 1 (Salmonella pathogenicity island) coù maët trong taát caû caùc Salmonella tö ønhoùm tieán hoùa thaáp nhaát laø S.bongori ñeán nhoùm tieán hoùa cao nhaát laø S.enterica I. InvA laø moät baûn gen luoân coù maët trong heä thoáng geninv. Söï xaâm nhieãm Salmonella vaøo cô theå vaät chuû vaø gaây beänh ñöôïc thöïc hieän chuû yeáu qua con ñöôøng tieâu hoùa vôùi bieåu hieän phoå bieán nhaát laø gaây tieâu chaûy, ñoâi khi laø thöông haøn vaø phoù thöông haøn. Salmonella chuû yeáu gaây beänh baèng noäi ñoäc toá. Noäi ñoäc toá chòu ñöôïc nhieät ñoä soâi vaø khoâng bò phaân huûy bôûi protease, tính khaùng nguyeân yeáu vaø khoâng saûn xuaát ñöôïc khaùng nguyeân.Traùi laïi vôùi ngoaïi ñoäc toá ñeå gaây beänh Salmonella xaâm nhaäp vaøo cô theå theo ñöôøng tieâu hoùa do thöùc aên, nöôùc uoáng bò nhieãm baån. Caùc chuûng Salmonella thöôøng saûn sinh ra moät entertoxin coù baûn chaát lipopolysaccharide voán coù khaû naêng taùc ñoäng ñeán nhieàu moâ khaùc nhau, ñeán caùc chöùc naêng moâ. Tuy nhieân trong tröôøng hôïp nhieãm ñoäc thöïc phaåm chaát ñoäc naøy chæ coù taùc duïng khi noù ñöôïc giaûi phoùng vaøo trong ruoät töø nhöõng vi khuaån soáng vaø ñang trong pha sinh saûn. Khi aên caùc baøo töû soáng thì coù theå sinh beänh song khi aên caùc vi khuaån ñaõ bò cheát do nhieät thì khoâng bò aûnh gì. Sau khi ñi vaøo oáng tieâu hoùa, vi khuaån baùm vaøo nieâm maïc ruoät non roài xaâm nhaäp qua nieâm maïc vaøo caùc haïch maïc treân ruoät. ÔÛ ñaây chuùng nhaân leân qua heä thoáng baïch huyeát vaø oáng ngöïc ñi vaøo maùu, luùc naøy daáu hieäu laâm saøng baét ñaàu xuaát hieän. Töø maùu, vi khuaån ñeán laù laùch vaø caùc cô quan khaùc. - Tôùi maøng Peyer vi khuaån tieáp tuïc nhaân leân. - Tôùi gan theo maät ñoå xuoáng ruoät roài ñöôïc ñaøo thaûi qua phaân. - Tôùi thaän moät soá vi khuaån ñöôïc ñaøo thaûi ra ngoaøi theo ñöôøng nöôùc tieåu. Salmonella gaây beänh baèng söï xaâm cuûa baûn thaân vi khuaån phaù huûy toå chöùc teá baøo baèng noäi ñoäc toá cuûa Salmonella khi bò cheát. Ngoä ñoäc do Salmonella caàn coù 2 ñieàu kieän: - Thöùc aên phaûi nhieãm moät löôïng lôùn vi khuaån soáng, vì tính chaát gaây ñoäc cuûa vi khuaån raát yeáu. - Vi khuaån vaøo cô theå tieát ra moät löôïng lôùn ñoäc toá. 2.1.6. Ñieàu trò khi nhiễm Salmonella Những khaùng sinh thöôøng ñöôïc duøng ñeå ñieàu trò Salmonella galiinarum laø choloramphenicol vaø ampicillin. Tröôùc ñaây chloramphenicol laø loaïi khaùng sinh coù hieäu löïc gaàn nhö tuyeät ñoái trong ñieàu trò caùc Salmonella noùi chung vaø caùc Salmonella gaây beänh thöông haøn noùi rieâng. Tuy nhieân chuùng ta caàn löu yù ñeán hai nguyeân taéc cô baûn : - Luùc ñaàu khoâng ñöôïc duøng lieàu thuoác quaù maïnh vì nhö theá coù theå tieâu dieät vi khuaån laøm chuùng nhaû ra nhieàu ñoäc toá coù theå nguy haïi ñeán tim, thaàn kinh laøm beänh nhaân coù theå cheát baát thaàn. - Neân duøng thuoác töø 1-2 tuaàn leã sau khi haï nhieät vì vi khuaån coøn aån troán trong haïch hay tuùi maïch deã coù nguy cô taùi phaùt sau naøy. Hieän nay, tyû leä Salmonella gallinarum khaùng thuoác ngaøy caøng taêng. ÔÛ nöôùc ta, nhöõng naêm gaàn ñaây ñaõ xuaát hieän nhöõng vuï dòch thöông haøn do vi khuaån khaùng thuoác gaây neân. Theo keát quaû cuûa Chöông trình Quoác gia giaùm saùt tính khaùng thuoác cuûa caùc loaïi vi khuaån gaây beänh coâng boá naêm 1999, ñaõ coù tôùi 40% S.typhi ( phaân laäp naêm 1998) khaùng laïi ampicllin vaø 62% khaùng laïi chloramphenicol. - ÔÛ nhöõng nôi beänh thöông haøn thöôøng xuyeân xaûy ra neân tieâm phoøng baèng vaccin, tuøy hieäu löïc cuûa töøng loaïi vaccin coù theå tieâm laïi sau 2-5 naêm. - Söû duïng Vaccin phoøng beänh thöông haøn do vi khuaån Salmonella gaây ra ñöôïc söû duïng khaùng nguyeân V cuûa S.typhi ñöa vaøo cô theå baèng ñöôøng tieâm vôùi 1 lieàu 25mg coù hieäu löïc baûo veä 70%. - Taïi Vieät Nam coù 2 loaïi Vaccin thöông haøn thöôøng söû duïng: + Vaccin thöông haøn tieâm ( injection) : teân thöông maïi TyphimVi- NSX Vieän Baøo Cheá Pasteur Merieux Connaught- Phaùp. + Vaccin thöông haøn uoáng Zerotyph Cap . Nhaø baøo cheá Boryung Biopharma. 2.1.7. Caùc thöïc phaåm lieân quan - Vi khuaån Salmonella coù maët ôû khaép moïi nôi vaø coù theå gaây nhieãm vaøo baát cöù loaïi thöùc aên naøo. - Caùc thöïc phaåm töôi soáng coù nguoàn goác töø ñoäng vaät vaø moät soá loaïi rau quaû coù theå chöùa vi khuaån Salmonella nhö: thòt gia suùc,thòt gia caàm, tröùng töôi, saûn phaåm töø tröùng töôi, nguû coác, nöôùc, haûi saûn vaø caùc loaïi rau quaû ñeàu coù vi khuaån Salmonella. Hình 2.4: Caùc thöïc phaåm coù khaû naêng nhieãm Salmonella. - Caùc saûn phaåm töø söõa nhö söõa khoâng thanh truøng, pho maùt töø söõa töôi vaø caùc saûn phaåm töø söõa noùi chung ñöôïc cheá bieán töø caùc noâng traïi, caùc thieát bò coù theå gaây nhieãm vaøo nguyeân lieäu, taïo moâi tröôøng thuaän lôïi cho Salmonella vaø töø ñoù gaây nhieãm ñoäc cho saûn phaåm söõa. 2.1.8. Caùc bieän phaùp ngaên ngöøa vaø kieåm soaùt - Luoân röûa tay baèng nöôùc aám vaø xaø phoøng thaät kyõ tröôùc khi aên, tröôùc vaø sau khi sô cheá, cheá bieán thöùc aên. - Thöùc aên phaûi ñöôïc röûa thaät kyõ döôùi voøi nöôùc chaûy. Khoâng neân röûa trong chaäu hoaëc boàn röûa. - Naáu kyõ thöïc phaåm coù nguoàn goác töø ñoäng vaät tröôùc khi aên ñaëc bieät laø thòt gia caàm, thòt lôïn, tröùng ( ít nhaát laø ñun tôùi 70 ∙C), khoâng duøng tröùng soáng hoaëc chöa naáu kyõ. Hình 2.5 : Caùc bieän phaùp ngaên ngöøa Salmonella. - Böùc xaï taàn soá cao vaø axit hoùa: chieáu tia böùc xaï vaøo thòt gia caàm laø phöông phaùp hieäu quaû nhaèm phaù huûy, tieâu dieät Salmonella. Hôn nöõa vi khuaån naøy khong sinh saûn ôû pH< 4. - Caùc duïng cuï nhaø beáp phaûi saïch seõ tröôùc khi ñöôïc söû duïng. Khoâng ñeå thöïc phaåm chín laãn loän vôùi thöïc phaåm soáng. - Laøm laïnh thöïc phaåm : vi khuaån naøy sinh saûn chaäm trong khoaûng nhieät ñoä 5- 120 ∙C vaø nhanh ôû nhieät ñoä thöôøng. Chính vì lí do ñoù maø khoâng neân ñeå thöïc phaåm laâu trong tuû laïnh nhaát laø ôû nhieät ñoä thöôøng.Thòt ñoâng laïnh phaûi ñöôïc laøm tan ôû phoøng laïnh chöù khoâng ñöôïc röûa baèng nhieät ñoä phoøng hay baèng nöôùc aám. Baûo quaûn thöùc aên ñaõ naáu chín trong caùc hoäp nhoû. Traùnh gaây taùi nhieãm vi khuaån trong beáp sau khi thöùc aên ñaõ ñöôïc naáu chín, ñeå thöïc phaåm töôi soáng rieâng vôùi thöïc phaåm naáu chín. - Thanh tra veä sinh vaø giaùm saùt caån thaän caùc loø moå, caùc nhaø maùy cheá bieán thöùc aên, caùc cöûa haøng thòt tröùng. - Thöïc hieän ñuùng quy cheá veä sinh trong caùc khaâu saûn xuaát, vaän chuyeån, baûo quaûn, döï tröõ. - Thöôøng xuyeân kieåm tra söùc khoûe ngöôøi cheá bieán hoaëc tieáp xuùc vôùi thöïc phaåm, xeùt nghieäm phaân ñeå sôùm phaùt hieän caùch ly vaø ñieàu trò. - Tuyeân truyeàn giaùo duïc veä sinh, aên chín uoáng soâi, röûa tay tröôùc khi aên vaø sau khi ñi veä sinh. - Trong vuøng coù nhieàu ngöôøi maéc beänh hoaëc vuøng luõ luït, oâ nhieãm moâi tröôøng naëng caàn ñöôïc saùt khuaån baèng dung dòch Cloramin B, voâi boät. 2.2. Escherichia Coli 2.2.1. Lòch söû phaùt hieän Escherichia Coli - Naêm 1885 baùc só khoa nhi teân Theodor Escherich raát quan taâm ñeán nhöõng phaùt hieän quan troïng cuûa Louis Pasteur vaø Robert Kock veà vi khuaån. Trong nghieân cöùu beänh tieâu chaûy Theodor Escherich ñaõ toû roõ moái löu yù tôùi moät soá vi sinh vaät ñöôøng ruoät ôû treû em qua nhieàu thí nghieäm laâm saøng. Vi khuaån do Theodor Escherich ñaõ ñöôïc phaùt hieän töø trong taû loùt cuûa treû em ñöôïc coâng boá vôùi teân goïi ñaàu tieân laø Bacterium coli commune. - Chæ boán naêm sau vi khuaån naøy ñöôïc giôùi chuyeân moân ñoåi teân thaønh Escherich nhaèm tri aân ngöôøi coù coâng khaùm phaù ra noù. - Ñeán naêm 1895 vi khuaån naøy ñöôïc goïi baèng teân Bacillus coli. - Naêm 1896 goïi thaønh Bacterium coli. - Naêm 1991 vi khuaån naøy ñöôïc ñònh danh thoáng nhaát toaøn caàu laø Escherichia coli. 2.2.2. Phaân loaïi Escherichia Coli - Giới (domain) :Bacteria - Ngaønh (Phylum) : Proteobacteria - Lớp (Class) : Gamma Proteobacteria - Bộ (Ordo) : Enterobacteriales - Họ (Familia) : Enterobacteriaceae - Chi (Genus) : Escherichia - Loaøi (Species) : E.coli 2.2.3. Ñaëc ñieåm cuûa Escherichia Coli - E.coli laø tröïc khuaån Gram aâm, kích thöôùc trung bình töø 2 - 3µm . Moät soá chuûng coù voû, nhöng haàu heát ñeàu coù loâng vaø coù khaû naêng di ñoäng. - E.coli coù khaû naêng leân men nhieàu loaïi ñöôøng vaø coù khaû naêng sinh hôi. E.coli coù khaû naêng sinh Indol, khoâng sinh H2S, khoâng söû duïng ñöôïc nguoàn carbon cuûa citrat trong moâi tröôøng Simmons, coù deoxycarboxylase neân coù khaû naêng phaân giaûi carborxyl cuûa lysin, arginin vaø acid glutamic. Thöû nghieäm VP (Voges –Proskauer) sau 24h aâm tính, sau 48h coù theå döông tính. - E. coli laø vi sinh vaät hieän dieän trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi vaø caùc loaøi ñoäng vaät maùu noùng, phaùt trieån deã daøng treân caùc moâi tröôøng nuoâi caáy thoâng thöôøng. - E.coli leân men nhieàu loaïi ñöôøng vaø coù sinh hôi, caùc E.coli ñeàu leân men lactose vaø sinh hôi tröø Enteroinvasive E.coli. - E.coli phaùt trieån ôû nhieät ñoä 44-45 ∙C treân moâi tröôøng toång hôïp. T uy nhieân moät soá chuûng coù theå phaùt trieån ôû 37 ∙C chöù khoâng phaùt trieån ôû 44-45 ∙C vaø moät soá khaùc cuõng khoâng sinh hôi. E.coli khoâng sinh oxidase hoaëc thuûy phaân ure. - So vôùi vi sinh vaät khaùc thì E.coli coù toác ñoä sinh tröôûng vaø sinh soâi naûy nôû cöïc kyø lôùn. Vi khuaån Escherichia coli trong caùc ñieàu kieän thích hôïp cöù 12-20 phuùt laïi phaân caét moät laàn. Hình 2.6: Vi khuaån Escherichia coli. 2.2.4. Ñoäc toá cuûa Escherichia Coli Ngöôøi ta chia E.coli thaønh nhieàu nhoùm, moãi nhoùm sinh ra caùc loaïi ñoäc toá khaùc nhau, hieän coù 5 nhoùm chính : STEC (Shiga toxin-producing E.coli), EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli), EPEC (Enteropathogenic E.coli) vaø ETEC (Enterotoxigenic E.coli), EAEC (Enteroaggregative E.coli), EIEC (Enteroinvasive E.coli). 2.2.4.1. Nhoùm EHEC Cô cheá cuõng chöa hoaøn toaøn roõ, nhöng ngöôøi ta ñaõ xaùc ñònh ñöôïc moät loaïi ñoäc toá coù caáu truùc khaùng nguyeân vaø cô cheá taùc ñoäng gioáng vôùi ngoaïi ñoäc toá cuûa S.shiga. Trong quaù trình gaây beänh, EHEC laøm toån thöông xuaát huyeát ôû ruoät, laøm xuaát huyeát ñaïi traøng hoaëc tieâu chaûy maùu coù theå tieán trieån ñeán hoäi chöùng ureâ huyeát coù khaû naêng gaây gaây töû vong. EHEC ñöôïc ñaëc tröng bôûi vieäc saûn xuaát ñoäc toá verotoxin hoaëc Shiga. Trong soá naøy thì O157:H7 thöôøng xuyeân gaây beänh treân toaøn theá giôùi. Lieàu truyeàn nhieãm cho O157:H7 ñöôïc öôùc tính laø 1-10 teá baøo, nhöng khoâng coù thoâng tin cho caùc nhoùm EHEC gaây nhieãm truøng. EHEC coù maët ôû caùc thöïc phaåm nhö söõa töôi, baùnh mì laïnh, nöôùc, traùi caây, rau quaû chöa tieät truøng. 2.2.4.2. Nhoùm EPEC E.coli gaây beänh ñöôøng ruoät. Laø nguyeân nhaân haøng ñaàu gaây beänh tieâu chaûy ôû treû em ôû caùc nöôùc ñang phaùt trieån. Caùc yeáu toá ñoäc löïc chính bao goàm gen eae maõ hoùa protein itimin caàn thieát cho vieäc taïo ra toån thöông daïng A/E, plasmid 50 -70 Mda (EAF) : maõ hoùa BFP (bundle – forming pilus), PER (plasmid - encoded regulator ) vaø Ler ( LEE - encorded regulator). Caùc protein tieát : Tir, EspA, EspB, EspD, EspF, EspG vaø MAP (mitochondria – associated protein ), EAST – 1 coù khaû naêng phaù huûy teá baøo bieåu moâ vaø CDT (Cytolethan distending toxin). 2.2.4.3. Nhoùm ETEC - Nhoùm ETEC coù hai nhoùm quyeát ñònh ñoäc löïc chính laø ñoäc toá ruoät (enterotoxin) vaø yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF). Ñoäc toá ruoät (enterotoxin) Nhoùm ETEC goàm nhöõng E.coli taïo ra ít nhaát moät trong hai ñoäc toá ñöôøng ruoät laø ST vaø LT. ETEC gaây beänh baèng caùch vi khuaån baùm vaøo beà maët maøng nhaày ruoät non vaø tieát ra ñoäc toá ruoät, laøm gia taêng tình traïng tieát dòch. Nhoùm ETEC gaây tieâu chaûy thoâng qua söï tieát ñoäc toá ñöôøng ruoät LT vaø ST. E.coli nhoùm naøy coù theå chæ tieát ñoäc toá LT, hoaëc chæ tieát ST, hoaëc coù theå tieát caû LT vaø ST. Yeáu toá ñònh vò (colonization factor – CF) Cô cheá laø ETEC keát dính vaø cö truù treân lôùp maøng nhaày ruoät ñaõ ñöôïc nghieân cöùu kyõ. Ñeå gaây tieâu chaûy, ETEC phaûi keát dính ngay luùc ñaàu vaøo teá baøo ruoät non nhôø vaøo loâng treân beà maët cuûa vi khuaån, goïi laø yeáu toá ñònh vò (CF). CFA coù theå ñöôïc phaân loaïi döïa treân ñaëc tính hình thaùi. Coù 3 loaïi chính goàm loâng hình que cöùng, loâng hình que meàm coù daïng boù, loâng coù caáu truùc maûnh meàm. Gen cuûa CFA thöôøng ñöôïc maõ hoùa treân plasmid, cuõng laø nôi maõ hoùa cho ñoäc toá ST hoaëc LT. 2.2.4.4. Nhoùm EAEC Nhöõng ñoäc löïc chính cuûa EAEC bao goàm caùc baùm dính keát taäp AAF (aggregative adhesion fimbriae), yeáu toá ñieàu hoøa baùm dính keát taäp aggR, Protein Pet vaø doäc toá EAST -1 ( enteroaggregative heat - stabe toxin - 1). AFF ñöôïc xem laø yeáu toá quyeát ñònh ñoäc löïc. EIEC closely resemble Shigella in their pathogenic mechanisms and the kind of clinical illness they produce.Unlike typical EE.coli baùm dính ñöôøng ruoät, gaây beänh do baùm vaøo nieâm maïc vaø laøm toån thöông chöùc naêng ruoät.Coù lieân quan ñeán tieâu chaûy keùo daøi ôû treû nhoû. EAEC gioáng vôùi ETEC trong ñoù caùc vi khuaån baùm vaøo nieâm maïc ruoät gaây tieâu chaûy coù maùu vaø laøm vieâm ruoät. Ñieàu naøy cho thaáy moät soá caùc sinh vaät saûn xuaát moät loaïi enterotoxin. EAEC cuõng saûn xuaát ra hemolysin lieân quan ñaán E.coli gaây nhieãm truøng ñöôøng tieâu hoùa. EAEC coøn tieát ra moät loaïi protein laøm tan maùu vaø laøm maát thaêng baèng vaän chuyeån protein qua maøng. 2.2.4.5.Nhoùm EIEC EIEC (Enteroinvasive E.coli) : E.coli xaâm nhaäp ñöôøng ruoät, gaây beänh do khaû naêng xaâm nhaäp vaøo nieâm maïc ñaïi traøng, EIEC gaàn gioáng vôùi Shigella trong cô cheá gaây beänh. EIEC xaâm nhaäp vaø nhaân leân trong caùc teá baøo bieåu moâ cuûa ñaïi traøng phaù huûy teá baøo. Nhöõng hoäi chöùng laâm saøng gaây tieâu chaûy kieát lî vaø soát. EIEC khoâng theå cöû ñoäng deã daøng, khoâng coù decarboxylate lysine vaø khoâng leân men lactose. Caùc gen treân plasmid naøy maõ hoùa cho caùc khaùng nguyeân xaâm nhaäp (IpaA ñeán IpaD) vôùi Ipa : Invasion plasmid antigen). EIEC coøn coù khaû naêng saûn xuaát ñoäc toá ruoät gioáng moät soá Shigella. Gen maõ hoùa cho ñoäc toá naøy coù teân laø sen (Shigella enterotoxin), cô cheá gaây beänh gioáng vi khuaån lî. 2.2.5 Khaû naêng gaây beänh cuûa Escherichia Coli - E.coli gaây beänh baèng caùch saûn sinh ra ñoäc toá coù teân laø Shiga. Trong ñöôøng tieâu hoùa, E.coli chieám khoaûng 80% caùc vi khuaån hieáu khí. - E.coli coäng sinh vôùi cô theå, goùp phaàn tieâu hoùa thöùc aên, saûn xuaát moät soá vitamin vaø giöõ caân baèng sinh thaùi caùc vi khuaån. Nhöng E.coli cuõng laø vi khuaån gaây beänh quan troïng trong caùc vi khuaån gaây tieâu chaûy ôû treû em döôùi 2 tuoåi, vieâm ñöôøng tieát nieäu, vieâm ñöôøng maät. E.coli coøn laø nguyeân nhaân gaây nhieàu beänh khaùc nhö vieâm phoåi, vieâm maøng naõo, nhieãm khuaån veát thöông. - Trong ñoäc toá cuûa E.coli thì ñoäc toá Shiga laø nguy hieåm nhaát. Noù xaâm nhaäp vaøo teá baøo bieåu moâ ñaïi traøng, öùc cheá quaù trình toång hôïp protein laøm cheát teá baøo. Haäu quaû laø gaây vieâm ñaïi traøng xuaát huyeát, gaây tieâu chaûy phaân ñi ngoaøi coù maùu. Hoaïi töû naëng coù theå gaây thuûng ruoät. 2.2.6. Caùc thöïc phaåm lieân quan ñeán Escherichia Coli - Vi khuaån E.coli coù theå tìm thaáy trong rau xanh, caùc loaïi rau coù maøu xanh saãm nhö rau chaân vòt. Con ñöôøng truyeàn nhieãm cuûa nhöõng vi khuaån naøy chuû yeáu qua ñöôøng phaân. - Thòt boø, thòt lôïn, bô söõa töø gia suùc coù theå mang maàm beänh E.coli trong suoát quaù trình moå gia suùc, gia caàm. Nhaát laø nhöõng nôi moå khoâng ñaûm baûo veä sinh, ñeå thòt tieáp xuùc vôùi ñaát baån, nöôùc nhieãm khuaån… - Cô theå raát deã bò nhieãm khuaån E.coli neáu thòt khoâng ñöôïc naáu ôû nhieät ñoä cao hoaëc thôøi gian naáu khoâng ñuû laâu ñeå dieät heát vi khuaån. Khi aên thöùc aên chöa ñöôïc naáu chín vi khuaån naøy seõ thaâm nhaäp vaøo daï daøy vaø ruoät. - Uoáng nöôùc bò nhieãm khuaån, khoâng ñaûm baûo veä sinh. - Uoáng söõa chöa trieät truøng - Laøm vieäc hoaëc tieáp xuùc vôùi caùc gia suùc hay gia caàm. - Vi khuaån E.coli raát deã laây truyeàn khi moät ngöôøi nhieãm maàm beänh khoâng röûa tay thaät saïch baèng xaø phoøng sau khi ñi veä sinh maø laïi chaïm tay vaøo baát cöù thöù gì ñaëc bieät laø thöùc aên. Nhöõng ngöôøi ñaõ bò nhieãm vi khuaån E.coli raát deã bò laây nhieãm caùc beänh khaùc nöõa. Ñaëc bieät treû nhoû vaø ngöôøi giaø laø nhöõng ngöôøi coù söùc ñeà khaùng yeáu, vì vaäy khoâng neân ñöa hoï tôùi beänh vieän khi khoâng thöïc söï caàn thieát, phaûi haïn cheá tieáp xuùc vôùi caùc nhaø veä sinh coâng coäng. 2.2.7. Caùc bieän phaùp ngaên ngöøa vaø kieåm soaùt E.coli trong thöïc phaåm Nöôùc vaø thöïc phaåm bò nhieãm E.coli chaúng coù bieåu hieän gì ñaëc bieät, neân raát khoù maø bieát ñöôïc nöôùc uoáng vaø thöùc aên maø chuùng ta duøng haøng ngaøy coù bò nhieãm E.coli hay khoâng. Vì theá, caàn coù nhöõng bieän phaùp( hay thoùi quen) phoøng ngöøa nhieãm khuaån nhö sau: - Röûa tay thaät saïch baèng xaø phoøng tröôùc khi baét ñaàu naáu aên. - Naáu chín thòt cho ñeán khi khoâng nhìn thaáy maøu ñoû ôû thòt nöõa. - Ñöøng neám khi thòt coøn soáng trong luùc baïn ñang naáu. - Khoâng ñeå thòt chín vaøo ñóa hoaëc thôùt tröôùc ñoù ñöïng thòt soáng. - Naáu thòt ôû nhieät ñoä ít nhaát khoaûng 70 ∙C. - Ñeå thòt ñoâng laïnh tan ñaù töø tuû ñaù xuoáng tuû döôùi hoaëc ñeå ôû laø vi soáng tröôùc khi naáu, khoâng neân ñeå ngoaøi nhieät ñoä bình thöôøng. - Ñeå thòt lôïn hoaëc thòt gia caàm soáng xa caùc thöùc aên khaùc. Söû duïng nöôùc noùng hoaëc xaø phoøng ñeå röûa ñóa tröôùc ñoù ñöïng thòt soáng. - Khoâng uoáng nöôùc chöa ñöôïc ñun soâi. - Giöõ thöùc aên trong tuû laïnh hoaëc tuû ñaù. - Ñeå rieâng thöùc aên noùng vaø thöùc aên laïnh ra choã khaùc nhau. - Öôùp laïnh thöùc aên coøn thöøa chöa duøng ñeán ngay sau khi baïn khoâng caàn duøng nöõa hoaëc vöùt noù ñi. - Ñi aên ngoaøi baïn khoâng neân aên thòt taùi chín vaø yeâu caàu hoï naáu kyõ khoâng coøn maøu hoàng ñoû ôû thòt laø ñöôïc. - Ngöôøi maéc beänh tieâu chaûy neân röûa tay saïch seõ vaø thöôøng xuyeân, söû duïng nöôùc noùng vaø xaø phoøng röûa tay ít nhaát 30 giaây. Nhöõng ngöôøi laøm vieäc ôû trung taâm y teá hoaëc vieän döôõng laõo cuõng phaûi röûa tay thöôøng xuyeân. CHÖÔNG 3 : GIÔÙI THIEÄU VEÀ LEGIONELLA GAÂY BEÄNH TRONG NÖÔÙC 3.1. Lòch söû phaùt hieän Legionella Theo Trung Taâm kieåm soaùt dòch beänh (CDC) ôû Atlanta. Caùc beänh do Legionella ñöïôc goïi laø legionellosis. - Naêm 1957 beänh legionellosis ñöïôïc tìm thaáy trong moät nhaø maùy ñoùng goùi thòt ôû Minnesota. - Naêm 1965 beänh legionellosis baét nguoàn töø Legionella tìm thaáy taïi moät beänh vieän taâm thaàn ôû Washington. - Naêm 1974 moät oå dòch cuûa beänh vieâm phoåi cuûa nhöõng ngöôøi tham gia hoäi nghò Oddfellows taïi khaùch saïn ôû Philadelphia ñaõ ñöôïc tìm thaáy. - Naêm 1976 ñaõ coù moät oå dòch cuûa beänh vieâm phoåi cuûa nhöõng ngöôøi tham gia hoäi nghò Legion moät ngöôøi Myõ taïi Philadelphia. Coù toång coäng 182 ngöôøi ñaõ ngaõ beänh vaø 34 ngöôøi ñaõ qua ñôøi. Caùc nhaø ñieàu tra töø Trung Taâm kieåm soaùt dòch beänh (CDC) ñaõ coâ laäp moät loaïi vi khuaån töø caùc moâ phoåi laáy töø nhöõng ngöôøi ñaõ cheát, vi khuaån naøy ñöôïc ñaët teân laø Legionella pneumophila. Phaûi maát moät thôøi gian daøi ñeå tìm ra nguyeân nhaân gaây ra dòch. 3.2. Phaân loaïi Legionella Giôùi (domain) : Bacteria. Ngaønh (Phylum) : Proteobacteria. Lôùp (Class) : Gamma Proteobacteria. Boä (Ordo) : Legionellales Hoï (Familia ) : Legionellacaea. Chi (Genus) : Legionella. Loaøi (Species) : Legionella pneumophila. Ñaëc ñieåm cuûa Legionella 3.3.1. Ñaëc ñieåm hình thaùi - Legionella laø vi khuaån soáng phoå bieán trong moâi tröôøng nöùôc töï nhieân, coù ít nhaât laø 50 loaøi vaø 70 nhoùm xaùc ñònh. - Legionella pneumophila laø moät vi khuaån gram aâm, hieáu khí. Legionella pneumophila daøi khoaûng 2 µm vaø roäng 0.3 – 0.9 µm. - Legionella ñược tìm thaáy deã daøng trong moâi tröôøng thuyû saûn, moâi tröôøng nöôùc töï nhieân vaø moät soá loaøi ñöôïc tìm thaáy ôû trong moâi tröôøng ñaát. - Legionella toàn taïi trong moät ñieàu kieän nhaát ñònh vôùi nhieät ñoä töø 0 - 63 ∙C, pH 5.0-8.5 vaø noàng ñoä oxy hoaø tan töø 0.2 – 15 ppm trong nöôùc. Legionella phaùt trieån toát nhaát trong nöôùc aám, beå chöùa nöôùc noùng, heä thoáng oáng nöùôc lôùn hoaëc caùc boä phaän cuûa heä thoáng ñieàu hoaø khoâng khí cuûa caùc toaø nhaø lôùn. Nhieät ñoä laø moät yeáu toá quan troïng quyeát ñònh söï phaùt trieån cuûa Legionella. Ngoaøi ra söï hieän dieän cuûa cuûa caùc vi sinh vaät coù trong nöôùc laø caàn thieát cho söï phaùt trieån toái öu cho Legionella. Hình 3.1: Vi khuaån Legionella. Trong chi Legionella bao goàm loaøi Legionella pneumophila laø tröïc khuaån hieáu khí. Ngoaøi Legionella pneumophila coøn coù 41 loaøi khaùc vaø caùc loaøi naøy ñöôïc chia thaønh 64 nhoùm. Trong ñoù Legionella pneumophila serogroups 1 , 4 vaø 6 laø nguyeân nhaân gaây beänh legionellosis phoå bieán nhaát vaø ñöôïc goïi beänh Legionnaire trong hoï Legionellaceae. Legionella pneumophila 1 aûnh höôûng ñeán 70- 90 % tröôøng hôïp. 3.3.2. Caáu truùc cuûa Legionella 3.3.2.1. Caáu truùc teá baøo Legionella pneumophila laø moät tröïc khuaån hieáu khí, gram aâm. L.pneumophila daøi khoaûng 2 µm vaø roäng 0.3 – 0.9 µm, ñaëc bieät trong ñieàu kieän ngheøo dinh döôõng L.pneumophila coù theå trôû neân daøi vaø hình thaønh daïng sôïi. Maøng teá baøo cuûa L.pneumophila chöùa moät lipopolysaccharide phaûn öùng mieãn dòch vôùi vaät chuû. Caùc lipopolysaccharide (LPS) trong L.pneumophila coù moät söï töông taùc yeáu hôn so vôùi caùc protein thuï theå CD14 cuûa caùc teá baøo khaùc vaø so vôùi söï töông taùc cuûa lipopolysaccharides vôùi caùc vi khuaån khaùc, chaúng haïn nhö enterobacteria. Söï töông taùc yeáu naøy laøm giaûm taùc duïng cuûa endotoxic cuûa L.pneumophila . Caùc khaùng nguyeân naèm treân maøng teá baøo ñöôïc söû duïng ñeå xaùc ñònh caùc nhoùm khaùc nhau trong chi Legionella. L.pneumophila nhoùm 1 LPS cuõng coù moät khaùng nguyeân O laëp ñi laëp laïi. Noù laø moät homopolymer hieám ñöôïc goïi laø legionaminic acid. Khaùng nguyeân O laø yeáu toá quyeát ñònh caùc ñaëc tính caùc nhoùm trong chi. 3.3.2.2. Caáu truùc phaân töû Toång theå coù 41 loaøi khaùc nhau ñöôïc xaùc ñònh trong chi Legionella. Caùc loaøi naøy ñöôïc chia ra toång coäng 64 nhoùm. Ba trong soá nhoùm naøy thì Legionella pneumophila nhoùm 1, 4 vaø 6 ñaõ ñöïôc nghieân cöùu vaø gaây beänh phoå bieán nhaát. Caáu truùc di truyeàn cuûa boä gen Legionella ñöôïc nghieân cöùu qua thôøi gian daøi. Trong ba naêm ñaõ hoaøn thaønh ba boä gen khaùc nhau cuûa L.Pneumophila. Thaùng 10 naêm 2001 ñaõ hoaøn thaønh ba boä gen veà Legionella : Legionella pneumophila ssp, Legionella pneumophila str, Legionella pneumophia 1. Thaùng 10 naêm 2004 Paris ñaõ hoaøn thaønh Plasmid pLPP cuûa Legionella pneumophila str. Caùc boä gen cuûa Paris veà Legionella pneumophila str ñaõ ñöôïc tìm thaáy coù chöùa 3.503.610 caëp base vaø chöùa khoaûng 3.136 gen maõ hoaù protein. Heä gen laø moät nhieãm saéc theå troøn vôùi noäi dung GC trung bình laø 38 %. Naêm 2004, caùc nhaø nghieân cöùu ñaõ phaân tích boä gen hoaøn chænh cuûa Paris veà Legionella pneumophila vaø Legionella pneumophila cuûa Lens laø moät chuûng ñaëc höõu maø chuû yeáu taïi Phaùp. Caùc doøng Legionella pneumophila cuûa Lens coù khoaûng 3.345.687 caëp base vaø chöùa khoaûng 3001 gen maõ hoaù protein vaø gioáng nhö heä gen cuûa Paris laø moät nhieãm saéc theå troøn vôùi noäi dung GC trung bình 38 %. Baûng 3.1. Caáu truùc phaân töû cuûa Legionella Teân Gen Caùc caëp base Naêm Legionella pneumophila Paris 3.136 3.503.610 2004 Legionella pneumophila str Lens 3001 3.345.687 2004 Legionella pneumophila ssp, Legionella pneumophila str. Philadelphia 1. 3002 3.397.754 2001 Hai chuûng khaùc nhau ôû khoaûng 13% trình töï boä gen vaø coù 3 plasmid khaùc nhau. Chuûng Paris laø duy nhaát vì noù coù chöùa moät heä thoáng tieát loaïi V vaø moät chuoãi 36 Kb maõ hoùa multicopy plasmid hoaëc tích hôïp vaøo moät nhieãm saéc theå loaïi IV trong heä thoáng tieát. Khaû naêng naøy cho gen ñeå di chuyeån xung quanh laøm taêng tính linh hoaït trong L.pneumophila. Ñeå thay ñoåi chöùc naêng teá baøo vaät chuû thì L.pneumophila chöùa nhieàu gen maõ hoùa protein gioáng nhö eukaryotic. Ñoäc löïc vaø khaû naêng gaây beänh Nhieàu nghieân cöùu ñaõ chæ ra raèng nguyeân nhaân gaây ra beänh vieâm phoåi laø do Legionella. Rowbotham laø ngöôøi ñaàu tieân chöùng minh raèng L.pneumophila coù theå laây nhieãm amip vaø ñaëc tröng voøng ñôøi cuûa Legionella ôû amip. Coù nhöõng ñieåm töông ñoàng noåi baät trong quaù trình maø Legionella laây nhieãm ñoäng vaät nguyeân sinh vaø teá baøo thöïc baøo cuûa ñoäng vaät coù vuù, caùc teá baøo sinh vaät ñôn baøo coù lieân quan, söû duïng phoå bieán gen vaø caùc saûn phaåm gen. 3.4.1. Toång quan veà chu kyø soáng Caùc cô cheá veà ñoäc tính cuûa L.pneumophila raát phöùc taïp vaø chöa ñöôïc nghieân cöùu ñaày ñuû. Ñoäc tính laø moät yeáu toá quan troïng ñoái vôùi khaû naêng nhieãm vaø nhaân leân cuûa L.pneumophila beân trong a-mip. Tuy nhieân, moät soá chuûng khaùc coù ñoäc tính thaáp thì coù theå nhaân leân trong teá baøo chuû. Moät soá nghieân cöùu töông phaûn veà vai troø cuûa moät soá caùc yeáu toá ñoäc löïc khaùc coù theå giuùp cho vi khuaån xaâm nhaäp vaøo cô theå con ngöôøi maø khoâng caàn thoâng qua vaät chuû laø kyù sinh truøng. Söï töông taùc giöõa ñoäc löïc cuûa Legionella vôùi caùc teá baøo thöïc baøo coù theå chia thaønh caùc böôùc: Gaén caùc vi sinh vaät leân thuï theå treân beà maët teá baøo eukaryote Xaâm nhaäp cuûa vi sinh vaät vaøo teá baøo thöïc baøo Thoaùt khoûi söï taán coâng dieät khuaån Hình thaønh moät khoâng baøo sao cheùp (moät ngaên beân trong teá baøo cho quaù trình sao cheùp cuûa vi khuaån). Nhaân noäi baøo vaø gieát cheát caùc teá baøo chuû. Chu kyø soáng cuûa Legionella töông töï nhau trong ñoäng vaät nguyeân sinh vaø trong ñaïi thöïc baøo cuûa con ngöôøi. Tuy nhieân, coù moät soá söï khaùc bieät trong cô cheá nhaäp baøo vaø xuaát baøo ñoái vôùi töøng loaïi teá baøo chuû. Khoâng phaûi taát caû caùc loaøi Legionella ñeàu coù khaû naêng laây nhieãm vaøo caùc ñaïi thöïc baøo. Tuy nhieân, L.pneumophila coù caùc yeáu toá ñoäc löïc lieân quan coù theå laây nhieãm vaø nhaân roäng beân trong caùc ñoäng vaät nguyeân sinh hieän dieän trong ñaát vaø trong nöôùc vaø taùi taïo baèng caùch naøy thì trôû neân ñoäc haïi hôn. Moät khi Legionella ñi vaøo phoåi cuûa ngöôøi beänh, thì caû hai chuûng ñoäc vaø khoâng ñoäc bò ñaïi thöïc baøo ôû tuùi phoåi thöïc hieän quaù trình thöïc baøo vaø naèm nguyeân veïn beân trong teá baøo thöïc baøo. Tuy nhieân, chæ chuûng ñoäc haïi coù theå nhaân leân beân trong teá baøo thöïc baøo vaø öùc cheá söï hôïp nhaát cuûa phagosome vôùi lysosome. Ñieàu naøy laøm cheát caùc ñaïi thöïc baøo vaø phoùng thích soá löôïng lôùn vi khuaån töø teá baøo. Vi khuaån coù theå sau ñoù laây nhieãm tôùi caùc ñaïi thöïc baøo khaùc, vaø theo caùch ñoù noàng ñoä vi khuaån taêng leân raát ñaùng keå trong phoåi. Quaù trình phaùt sinh beänh cuûa L.pneumophila ñaõ hieåu roõ raøng hôn baèng caùch xaùc ñònh caùc gen cho pheùp caùc sinh vaät boû qua caùc con ñöôøng xaâm nhieãm ôû caû sinh vaät ñôn baøo vaø caùc teá baøo cuûa con ngöôøi. Maëc duø khoâng phaûi taát caû caùc loaøi ñieàu tra ñeàu coù khaû naêng naøy. Trong quaù trình thöïc baøo, Legionella baét ñaàu caùc hoaït ñoäng sau bao goàm: Söï öùc cheá cuûa cuïm oxy hoùa Giaûm axit hoùa phagosome Chaën söï tröôûng thaønh cuûa phagosome Do ñoù, Legionella ngaên chaën caùc hoaït ñoäng dieät khuaån cuûa thöïc baøo vaø bieán ñoåi caùc phagosome thaønh choã thích hôïp cho quaù trình nhaân leân cuûa chuùng. Vi khuaån naøy coù theå thoaùt khoûi teá baøo chuû baèng caùch ly giaûi thoâng qua söï hình thaønh caùc loã treân maøng hoaëc vaãn naèm beân trong amip. L. pneumophila beân trong teá baøo goàm coù hai phase taêng tröôûng : daïng sinh saûn khoâng di ñoäng vaø daïng di ñoäng khoâng sinh saûn. Söï saûn xuaát caùc protein trong caùc teá baøo chuû môùi aûnh höôûng bôûi caùc yeáu toáá nhö ñoä nhaïy vôùi natri, tính ñoäc teá baøo, söï di ñoäng vaø traùnh söï dung hôïp cuûa phagosome vaø lysosome. Khaû naêng laây nhieãm vaøo teá baøo chuû cuõng bò aûnh höôûng bôûi söï bieåu hieän cuûa flagellin maëc duø baûn thaân caùc protein roi khoâng phaûi laø yeáu toá ñoäc tính. 3.4.2.Caáu truùc beà maët lieân quan ñeán khaû naêng gaây beänh Caáu truùc beà maët ñoùng moät vai troø quan troïng trong quaù trình sinh beänh cuûa Legionella. Söï gaén keát ñeå vi khuaån xaâm nhaäp vaøo teá baøo chuû laø böôùc chæ yeáu trong chu kyø xaâm nhieãm. Cuøng vôùi loâng vaø roi, moät soá protein beà maët tham gia vaøo quaù trình gaén keát vaø xaâm nhieãm cuûa Legionella vaøo ñaïi thöïc baøo tuùi phoåi vaø ñoäng vaät nguyeân sinh. Caùc protein naøy bao goàm: Caùc protein beân ngoaøi maøng teá baøo (MOMP). Caùc protein soác nhieät (Hsp60). Caùc protein coù khaû naêng lan truyeàn lôùn. MOMP lieân keát vôùi caùc thaønh phaàn C3 cuûa boå theå vaø laøm trung gian cho söï gaén cuûa L. pneumophila thoâng qua thuï theå cuûa ñaïi thöïc baøo leân thaønh phaàn CR1 vaø CR3 cuûa boå theå. Söï thöïc baøo cuûa L.pneumophila cuõng xaûy ra bôûi moät soá cô cheá khoâng caàn boå theå. 3.4.3. Caùc yeáu toá gaây ñoäc Baûn thaân caùc yeáu toá sinh hoïc vaø mieãn dòch lieân quan ñeán ñoäc löïc chöa ñöôïc xaùc ñònh roõ raøng. Tuy nhieân, söï phaân tích quaù trình laây nhieãm ôû ñoäng vaät nguyeân sinh vaø caùc teá baøo chuû ôû con ngöôøi thì coù theå xaùc ñònh moät soá yeáu toá chung maø coù theå aûnh höôûng ñeán ñoäc tính nhö: Bieåu hieän cuûa söï nhaân protein trong nhieãm cuûa caùc ñaïi thöïc baøo. Bieåu hieän cuûa moät soá protease Plasmid trong L.pneumophila coù theå aûnh höôûng ñeán söï soáng soùt trong noäi baøo. Moät saûn phaåm cuûa Legionella lieân quan ñeán ñoäc tính laø protein coù khaû naêng nhieãm vaøo ñaïi thöïc baøo (Mip) coù troïng löôïng phaân töû 24 kDa, ñöôïc maõ hoùa bôûi gene mip. Mip protein caàn cho quaù trình xaâm nhieãm vaøo teá baøo ñoäng vaät laãn ñoäng vaät nguyeân sinh nhöng cô cheá hoaït ñoäng cuûa noù khoâng roõ. Heä thoáng tieát type IV : laø moät heä thoáng tieáp hôïp cuûa vi khuaån ñöôïc söû duïng trong vieäc vaän chuyeån vaø bôm DNA hay ñoäc toá vaøo trong teá baøo ñích, ñoùng vai troø chuû yeáu trong quaù trình lan truyeàn cuûa maàm beänh. Beân trong vuøng maõ hoùa cho heä thoáng tieát type IV naøy laø 24 gene caàn thieát cho quaù trình xaâm nhieãm vaøo teá baøo chuû vaø lieân quan ñeán vieäc taäp hôïp vaø hoaït hoùa DNA plasmid. L. pneumophila söû duïng nhöõng operon naøy ñeå taïo neân caùc yeáu toá ñoäc löïc vaø taïo neân moät protein ñaùnh laïc höôùng cuûa phagosome. Caùc gene nhö pilE (maõ hoùa cho protein sôïi) vaø pilD ñoùng vai troø quan troïng trong söï taêng tröôûng noäi baøo. Moät vuøng khaùc lieân quan ñeán söï nhaân leân cuûa vi khuaån trong teá baøo laø mak (gieát cheát ñaïi thöïc baøo), mil (vuøng nhieãm chuyeân bieät treân ñaïi thöïc baøo) vaø pmi (nhieãm treân ñaïi thöïc baøo vaø ñoäng vaät nguyeân sinh). Protease phaù huûy moâ : Ñaây laø moät yeáu toá quan troïng khaùc giuùp cho Legionella xaâm nhieãm. Caùc yeáu toá khaùc coù theå laøm taêng ñoäc tính bao goàm caùc cytotoxin, protein shock nhieät vaø caùc hôïp chaát lieân quan ñeán söï haáp thu saét. Söï ñaùp öùng cuûa phase oån ñònh vaø chöùc naêng haáp thu saét cuûa L. pneumophila cuõng ñoùng vai troø quan troïng trong quaù trình phaùt sinh beänh, goàm caùc gene pts vaø enh. 3.4.4. Söï khaùng cuûa vaät chuû Söï baûo veä vaät chuû choáng laïi Legionella chuû yeáu döïa vaøo cô cheá mieãn dòch teá baøo. Ít nhaát hai loaïi protein ñöôïc saûn xuaát bôûi L.pneumophila coù theå kích hoaït söï mieãn dòch teá baøo hoaït ñoäng maø khoâng coù yeáu toá ñoäc haïi - caùc protein phaân tieát lôùn (MSP, 39 kDa) vaø caùc protein ngoaøi maøng (ompS, 28kDa). Khaùng theå tuaàn hoaøn cuõng ñöôïc saûn xuaát khi L.pneumophila nhieãm ôû ngöôøi nhöng döôøng nhö khoâng coù chöùc naêng baûo veä. 3.4.5. Söï lan truyeàn Moät nguoàn laây nhieãm (ví duï nhö moät ñaøi phun nöôùc) coù theå phaùt taùn daïng söông hoaëc gioït nöôùc chöùa Legionella goïi chung laø huyeàn phuø. Khi ñieàu naøy xaûy ra, haàu heát hoaëc taát caû caùc gioït nöôùc nhoû hay caùc gioït hôi nöôùc bay hôi nhanh choùng, phaùt taùn vaøo khoâng khí vôùi soá löôïng ñuû nhoû ñeå xaâm nhieãm qua ñöôøng hoâ haáp. Caùc haït coù ñöôøng kính nhoû hôn 5 µm coù theå ñöôïc hít saâu vaø xaâm nhaäp vaøo ñöôøng hoâ haáp vì vaäy gaây ra beänh legionellosis. Khoâng coù baèng chöùng veà söï laây nhieãm giöõa ngöôøi vaø ngöôøi trong beänh Legionnaires vaø soát Pontiac. 3.5. Maøng sinh hoïc (Biofilms) 3.5.1. Thaønh phaàn maøng sinh hoïc Vi sinh vaät bao goàm caû L.pneumophila vôùi maøng sinh hoïc nhö laø moät hình thöùc ñeå chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän baát lôïi chaúng haïn nhö caùc chaát dinh döôõng, nhieät ñoä. Caùc beà maët thöôøng coù polysaccharide ngoaïi baøo do teá baøo tieát ra. Chaát naøy bao goàm (caùc glycocalyx hoaëc chaát nhôøn) laø moät polysaccharide ñöôïc saûn xuaát bôûi polymerase gaén lieàn vôùi caùc thaønh phaàn lipopolysaccharide cuûa thaønh teá baøo . Maøng sinh hoïc cuûa vi khuaån cöïc kyø phöùc taïp khoâng ñoàng nhaát caùc heä sinh thaùi vi khuaån vaø coù theå bao goàm caû vi khuaån, taûo vaø ñoäng vaät nguyeân sinh. Vaø khi tieán haønh nuoâi caáy, vi sinh vaät thöôøng khoâng hình thaønh maøng sinh hoïc naøy 3.5.2. Söï hình thaønh maøng sinh hoïc Trong quaù trình hình thaønh maøng sinh hoïc, beà maët coù maøng gaén leân laø ñieàu kieän ñaàu tieân, quaù trình naøy ñöôïc thöïc hieän tieáp theo bôûi söï nhaân leân cuûa vi sinh vaät ñaàu tieân ñeå hình thaønh vi khuaån laïc. Caùc vi khuaån laïc seõ ñöôïc baûo veä bôûi moät lôùp glycocalyx nhöng moät soá phaàn coù theå bò caét bôùt vaø taùi thieát laäp nhöõng phaàn khaùc cuûa heä thoáng gioáng nhö treân. Doøng chaûy xung quanh vi khuaån laïc mang chaát dinh döôõng vaø beà maët bò ñoäng vaät nguyeân sinh söôït qua (neáu coù) nhaèm giaûi phoùng caùc chaát dinh döôõng vaø laøm saïch beà maët vaø giuùp cho söï taêng tröôûng. Maøng sinh hoïc coù theå bao goàm legionellae vaø ñoäng vaät nguyeân sinh coù theå hình thaønh treân beà maët cuûa caùc toøa nhaø quaûn lyù keùm hoaëc khaên laïnh. Maøng sinh hoïc taïo ñieàu kieän thuaän lôïi veà dinh döôõng, trao ñoåi khí, baûo veä vi sinh vaät khoâng chæ töø caùc chaát dieät khuaån maø coøn töø söï gia taêng nhieät ñoä vaø söï loaïi boû caùc taùc nhaân vaät lyù. Maøng sinh hoïc coù khaû naêng hình thaønh ôû maët phaân caùch, thoâng thöôøng giöõa nöôùc vaø beà maët raén nhöng cuõng coù theå tìm thaáy ôû maët phaân caùch daàu – nöôùc. Maøng sinh hoïc coù theå hình thaønh ôû nôi coù löu löôïng nöôùc thaáp hay nöôùc ñöôïc ñoïng laïi. Trong moät maøng sinh hoïc, vi sinh vaät ñöôïc bao boïc trong moät lôùp ngoaïi baøo coù khaû naêng hình thaønh caùc caáu truùc, tính oån ñònh, chaát dinh döôõng vaø baûo veä töø caùc aûnh höôûng ñoäc haïi coù theå coù treân beà maët khi maøng sinh hoïc phaùt trieån. Gradient cuûa chaát dinh döôõng, ñoä pH vaø oxy trong lôùp ñoù hoã trôï caùc nhu caàu khaùc nhau cuûa vi sinh vaät khaùc nhau trong quaàn theå khoâng ñoàng nhaát. Legionella taêng tröôûng trong maøng sinh hoïc coù khaû naêng ñeà khaùng cao hôn so vôùi loaøi vi khuaån töông töï trong nöôùc cuûa heä thoáng. 3.5.3. Aûnh höôûng cuûa maøng sinh hoïc ñeán söï taêng tröôûng cuûa vi khuaån Vi khuaån hieän dieän treân beà maët ñeà khaùng cao hôn ñoái vôùi caùc chaát dieät khuaån, laøm caùc chaát dieät khuaån maát taùc duïng vaø cho pheùp söï sinh soâi naûy nôû cuûa maàm beänh. Do ñoù, söï hieän dieän cuûa maøng sinh hoïc laø moät yeáu toá quan troïng cho söï soáng coøn vaø taêng tröôûng Legionella trong caùc heä thoáng nöôùc. Soá löôïng nhoû Legionella ñöôïc tìm thaáy trong nguoàn nöôùc uoáng, heä thoáng nöôùc trong caùc toøa nhaø vaø thaùp laøm maùt. Ñieàu naøy giaûi thích raèng söï hieän dieän vaø taêng tröôûng cuûa Legionellae ñaõ toàn taïi trong caùc moâi tröôøng nöôùc nhaân taïo. Caùc chaát dinh döôõng saün coù trong maøng sinh hoïc ñaõ khieán moät soá nhaø nghieân cöùu ñeà xuaát raèng maøng sinh hoïc hoã trôï söï soáng coøn vaø sinh soâi cuûa Legionella beân ngoaøi teá baøo vaät chuû. Söï taêng tröôûng beân trong maøng sinh hoïc bao goàm caùc vi sinh vaät töï nhieân coù trong nöôùc maø khoâng coù ñoäng vaät nguyeân sinh. Moät nghieân cöùu khaùc ñaõ chöùng minh raèng söï sinh soâi cuûa Legionella trong maøng sinh hoïc chæ coù ôû amip. 3.5.4. Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh maøng sinh hoïc Ngaên caûn söï hình thaønh maøng sinh hoïc laø moät bieän phaùp quan troïng choáng laïi söï gia taêng cuûa Legionella. Ngaên chaën söï phaùt trieån cuûa maøng sinh hoïc laø quan troïng bôûi khi moät khi maøng sinh hoïc ñöôïc hình thaønh thì seõ gaây khoù khaên ñeå loaïi boû töø heä thoáng phöùc taïp cuûa ñöôøng oáng. Nhieàu yeáu toá laøm taêng khaû naêng hình thaønh maøng sinh hoïc: Söï hieän dieän cuûa caùc chaát dinh döôõng trong hai tröôøng hôïp laø trong nguoàn nöôùc vaø trong vaät lieäu cuûa heä thoáng. Quy moâ vaø aên moøn. Nhieät ñoä nöôùc aám. Löu löôïng nöôùc cuûa ñöôøng oáng vaø heä thoáng phaân phoái. Söï hieän dieän cuûa quy moâ vaø söï aên moøn trong moät heä thoáng seõ laøm taêng dieän tích beà maët coù saün vaø cho pheùp söï hình thaønh cuûa microniches ñöôïc baûo veä khoûi söï khöû truøng. Quy moâ vaø söï aên moøn cuõng laøm taêng noàng ñoä caùc chaát dinh döôõng vaø caùc yeáu toá taêng tröôûng, nhö saét trong heä thoáng nöôùc. Maøng sinh hoïc khoâng ñöôïc kieåm soaùt daãn ñeán söï gia taêng Legionella. Hôn nöõa, söï hieän dieän cuûa caû maøng sinh hoïc vaø ñoäng vaät nguyeân sinh coù hieäu quaû baûo veä vi khuaån gaáp ñoâi trong heä thoáng bôûi vì noù laøm taêng chaát höõu cô vaø baát hoaït caùc thuoác khöû truøng. Theâm vaøo ñoù, maøng sinh hoïc vaø vi khuaån (caû Legionella spp) ñöôïc taêng tröôûng trong ñoäng vaät nguyeân sinh coù theå chòu ñöôïc noàng ñoä chlorine vaø caùc chaát dieät khuaån ôû noàng ñoä cao hôn noàng ñoä thöôøng söû duïng trong caùc heä thoáng nöôùc. Caùc vaät lieäu cuûa heä thoáng cuõng aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa maøng sinh hoïc. Moät soá vaät lieäu nhö oáng nöôùc cuõng hoã trôï hoaëc taêng cöôøng söï gia taêng vi sinh vaät bao goàm Legionella spp. Caùc chaát töï nhieân nhö mieáng ñeäm cao su cuõng cung caáp cô chaát neàn giaøu dinh döôõng vaø ñöôïc vi sinh vaät söû duïng ñeå taêng tröôûng. Thaäm chí, vi sinh vaät seõ phaùt trieån treân beà maët cuûa heä thoáng baèng ñoàng maø baûn thaân heä thoáng naøy coù theå khaùng laïi söï hình thaønh taäp ñoaøn, moät khi beà maët ñöôïc ñieàu hoøa. 3.6. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï taêng tröôûng cuûa Legionella 3.6.1. Aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä Legionella ñaõ ñöôïc phaân laäp töø heä thoáng nöôùc noùng leân tôùi 660C. Tuy nhieân, ôû nhieät ñoä treân 700C thì Legionella gaàn nhö bò phaù huûy ngay laäp töùc. Kusnetsov vaø ctv (1996) thaáy raèng söï taêng tröôûng cuûa taát caû caùc chuûng thí nghieäm giaûm khi nhieät ñoä 44 - 450C, vôùi nhieät ñoä giôùi haïn cho söï taêng tröôûng cuûa vi sinh vaät töø 48,40C ñeán 50,00C. Caùc chuûng Legionella saûn xuaát dioxide carbon leân tôùi 51,60C, cho thaáy raèng moät soá enzyme vaãn toàn taïi ôû nhieät ñoä naøy. Heä thoáng nöôùc phöùc taïp chaúng haïn nhö nöôùc aám, heä thoáng oáng nöôùc, ñieàu hoøa nhieät ñoä vaø boàn taém nöôùc noùng (coøn goïi laø beå spa) laø ñieàu kieän thuaän lôïi giuùp cho Legionella taêng tröôûng. Vì vaäy, ñeå ngaên ngöøa nhieãm Legionella thì phaûi giöõ nhieät ñoä trong nöôùc laø 250C vaø nhieät ñoä lyù töôûng nhaát laø 200C. Legionella seõ toàn taïi trong thôøi gian daøi ôû nhieät ñoä thaáp vaø sau ñoù sinh soâi naûy nôû khi nhieät ñoä taêng leân neáu caùc ñieàu kieän khaùc thích hôïp. L.pneumophila laø vi khuaån chòu nhieät vaø khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä töø 500C trong vaøi giôø. Nhieät ñoä nöôùc laø moät yeáu toá quan troïng trong söï phaùt trieån cuûa Legionella. Duy trì nhieät ñoä cuûa heä thoáng nöôùc noùng vaø nöôùc laïnh trong caùc toøa nhaø ñeå ngaên ngöøa hoaëc giaûm söï taêng tröôûng cuûa Legionellae laø moät bieän phaùp kieåm soaùt quan troïng ñeå ngaên chaën nguy cô nhieãm truøng Legionella. 3.6.2. AÛnh höôûng cuûa caùc vi sinh vaät khaùc 3.6.2.1.Yeâu caàu dinh döôõng Nguoàn nöôùc laø thaønh phaàn khoâng theå thieáu nhöng khoâng ñuû ñeå L.pneumophila sinh soâi naûy nôû, ví duï trong nghieân cöùu, baèng caùch söû duïng nöôùc caát voâ truøng vaø nöôùc maùy voâ truøng thì L.pneumophila soáng soùt trong thôøi gian daøi nhöng khoâng taêng tröôûng veà maët soá löôïng. Vaø Legionella caàn caùc vi sinh vaät khaùc ñeå taêng tröôûng. Ñeå khueách ñaïi Legionella, ví duï trong töï nhieân L.pneumophila coù theå soáng soùt nhôø caùc sinh vaät khaùc vaø nhaân leân trong nöôùc maùy khoâng voâ truøng. Keát quaû naøy cho thaáy taêng tröôûng cuûa Legionella ñoøi hoûi caùc chaát dinh döôõng ñaõ coù saün trong nöôùc maùy. Caùc chaát dinh döôõng coù theå ñöôïc cung caáp tröïc tieáp hoaëc giaùn tieáp hoaëc baèng caùc loaøi vi khuaån hoaëc caùc chuûng vi sinh vaät coù lieân quan ñeå taïo neân caùc chaát höõu cô hoøa tan. Caùc keát quaû naøy phuø hôïp vôùi nghieân cöùu cho thaáy axit amin laø nguoàn dinh döôõng chính caàn cho söï taêng tröôûng L.pneumophila. Söï keát hôïp cuûa L.pneumophila vôùi nhieàu sinh vaät khaùc nhau töø nguoàn lôïi thuûy saûn ñaõ ñöôïc chöùng minh, bao goàm ñoäng vaät nguyeân sinh, Fischerella spp vaø caùc vi khuaån khaùc. 3.6.2.2.Ñoäng vaät nguyeân sinh Drozanski (1963) moâ taû kyù sinh truøng vi khuaån cuûa amip ñaõ ñöôïc phaân laäp töø ñaát nhöng khoâng phaùt trieån treân caùc moâi tröôøng nhaân taïo. Ñieàu naøy chöùng toû caùc kyù sinh truøng vi khuaån naøy laø Legionella. Rowbotham (1980) laø ngöôøi ñaàu tieân phaùt hieän moái quan heä giöõa amip vaø L.pneumophila, ñieàu ñoù coù theå chöùng minh raèng Legionella laø kyù sinh truøng noäi baøo tuøy yù. Legionella coù theå sinh tröôûng trong 14 loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh bao goàm: Acanthamoeba, Naegleria vaø Hartmanella spp Caùc Tetrahymena pyriformis, Tetrahymena vorax, Cyclidium coù loâng rung. Moät loaøi naám moác chaát nhôøn Hôn nöõa moät nghieân cöùu cuûa Vandenesch (1990) chöùng minh raèng L.pneumophila coù theå laây nhieãm vaø taùi saûn xuaát trong amip Acanthmoeba ngay caû khi tyû leä teá baøo Legionella thaáp. Gaàn ñaây Legionella ñaõ ñöôïc phaùt hieän laø coù theå phaùt trieån trong caùc teá baøo sinh vaät ñôn baøo. Ñoäng vaät nguyeân sinh laø yeáu toá quan troïng ñoái vôùi söï soáng coøn vaø phaùt trieån cuûa Legionella trong töï nhieân vaø moâi tröôøng nhaân taïo vaø ñaõ ñöôïc phaùt hieän trong caùc moâi tröôøng lieân quan ñeán beänh Legionellosis. Trong moâi tröôøng töï nhieân L.pneumophila phaùt trieân ôû ñoäng vaät nguyeân sinh beân trong phagosome, coù theå saûn xuaát proteases gaây ñoäc teá baøo vaø laø nguyeân nhaân gaây phaù huûy moâ. Moät khi noù haáp thuï bôûi amip, söï soáng coøn cuûa L. pneumophila phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä moâi tröôøng nöôùc. ÔÛ 220C, caùc vi khuaån naøy bò tieâu huûy bôûi amip trong khi ôû 350C chuùng coù theå sinh soâi naûy nôû trong caùc amip. Nhieät ñoä cuõng taùc ñoäng ñeán söï bieåu hieän cuûa tieân mao. Tieân mao coù moät vai troø quan troïng trong quaù trình sinh beänh cuûa nhieàu vi sinh vaät, bao goàm Salmonella vaø Pseudomonas aeruginosa. Ñieàu ñoù chöùng toû raèng Legionella khoâng coù tieân mao ít coù khaû naêng laây nhieãm treân ñoäng vaät nguyeân sinh vaø caùc ñaïi thöïc baøo hôn caùc chuûng hoang daïi coù tieân mao. Ñoäng vaät nguyeân sinh giuùp baûo veä Legionella töø nhöõng aûnh höôûng cuûa chaát dieät khuaån vaø nhieät khöû truøng. Legionella coù theå toàn taïi trong teá baøo amip vaø ñoù coù theå laø moät cô cheá maø Legionella pneumophila coù theå toàn taïi trong caùc ñieàu kieän baát lôïi veà moâi tröôøng vaø toàn taïi trong caùc haït khoâng khí . 3.6.3. Caùc yeáu toá moâi tröôøng vaø ñoäc tính Caùc yeáu toá ñoäc tính cuûa Legionella cuõng bò aûnh höôûng bôûi caùc yeáu toá moâi tröôøng chaúng haïn nhö nhieät ñoä, dinh döôõng vaø noàng ñoä Na. 3.7. Caùc nguoàn nhieãm Legionella. 3.7.1. Dòch beänh laây lan qua bình xòt vaø hít Vai troø cuûa aerosol töø heä thoáng phaân phoái nöôùc uoáng bò oâ nhieãm daãn ñeán legionellosis laø cuõng ñöôïc thaønh laäp. Caùc chöông trình thaûo luaän veà aerosol taïo heä thoáng ñaõ ñöôïc lieân keát vôùi truyeàn daãn chaúng haïn nhö thaùp laøm maùt, xaây döïng heä thoáng laøm maùt, xaây döïng heä thoáng nöôùc, thieát bò trò lieäu vaø boàn taém noùng. Möa raøo laø nguoàn duy nhaát cuûa bình xòt lieân keát vôùi nosocomial legionellosis. Tuy nhieân, caùc cöûa haøng nöôùc, thieát bò hoâ haáp vaø nebulizers ñaõ ñöôïc laáp ñaày hoaëc röûa saïch baèng nöôùc maùy cuõng coù theå laây lan Legionella vaø coù baùo caùo nhö moät nguoàn laây nhieãm trong moät vaøi tröôøng hôïp. Caùc dòch lôùn nhaát cuûa beänh cho ñeán nay coù taát caû ñöôïc keát hôïp vôùi söï truyeàn cuûa aerosol töø caùc loaïi thieát bò. Thaùp giaûi nhieät laø moät vaán ñeà cuï theå, vôùi moät baùo caùo cho raèng thaùp laøm maùt laø 28% cuûa taát caû caùc tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis. Caùc heä thoáng khaùc lieân quan ñeán söï laây lan cuûa legionellosis qua aerosol trong nöôùc bao goàm heä thoáng oáng nöôùc, phun söông caùc thieát bò lieân quan, nhöõng thöïc phaåm hieån thò trong nhöõng suoái nöôùc noùng vaø nhöõng suoái khoaùng töï nhieân. 3.7.2. Dòch beänh laây lan qua ñaát Caùc taøi lieäu veà tieâu chuaån Legionella 1985 baùo caùo raèng Legionella ñaõ ñöôïc phaân laäp töø buøn vaø caùt, ñaát aåm beân bôø suoái coù chöùa vi khuaån. Vaên baûn 1985 söï thieáu ñaát cuõng tham gia vaøo vieäc Legionella laây sang ngöôøi maëc duø coù söï roái loaïn vôùi moät soá dòch beänh Legionella veà ñaát. Taïi thôøi ñieåm ñoù, Legionella chæ ñöôïc phaân laäp töø buøn vaø ñaát aåm (EPA 1985). Trong moät soá tröôøng hôïp taøi lieäu veà beänh legionellosis do Legionella gaây ra thì nguyeân nhaân vaø khaû naêng maéc beänh ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong caùc chaäu ñaát. Haàu heát caùc baùo caùo veà nguoàn goác gaây beänh ñöôïc bieát ñeán töø naêm 1990. Gaàn ñaây, moät trong nhöõng loaøi ñaõ ñöôïc tìm thaáy thì L.longbeachae sinh soáng vaø phaùt trieån maïnh trong chaäu ñaát. Sau moät oå dòch legionellosis do L.longbeachae taïi Nam UÙc vaøo naêm 1988 vaø 1989 thì Steele et al.,1990 ñaõ phaân tích moät soá maãu nöôùc vaø caùc maãu ñaát ñeå tìm nguoàn goác L.longbeachae. Keát quaû laø L.longbeachae khoâng ñöôïc coâ laäp töø baát kyø maãu nöôùc naøo nhöng L.longbeachae laïi ñöôïc tìm thaáy töø ba maãu hoãn hôïp vaø töø ñaát troàng caây trong chaäu surroundingtwo. Qua ñoù, thì ngöôøi ta cuõng keát luaän raèng L.longbeachae coù thôøi gian soáng soùt keùo daøi baûy thaùng trong hai chaäu hoãn hôïp ñöôïc löu tröõ ôû nhieät ñoä phoøng. Trong moät soá taøi lieäu cuûa Legionellosis. Trong nhöõng tröôøng hôïp, caùc khaû naêng gaây beänh ñaõ ñöôïc phaùt hieän töø trong chaäu ñaát. Haàu heát caùc baùo caùo nhieãm beänh coù nguoàn goác töø ñaát ñöôïc xaùc ñònh töø naêm 1990 do L.longbeachae laø taùc nhaân truyeàn nhieãm. Phöông thöùc truyeàn nhieãm vaãn chöa bieát. Caùc dòch coù theå laø do söï phaân taùn cuûa buïi trong quaù trình hoaït ñoäng earthmoving, töø ñoù thaùp giaûi nhieät boå sung theâm chaát dinh döôõng vaø caùc beà maët cho vi khuaån phaùt trieån vaø cuõng gaây trôû ngaïi cho biocide. Ngoaøi ra caùc oå dòch coù theå laø do söï can thieät trong vieäc cung caáp nöôùc, oâ nhieãm do vi khuaån bao goàm caû legionella. 3.7.3. Legionella trong nöôùc maët töï nhieân Vi khuaån Legionella ñöôïc tìm thaáy trong moâi tröôøng nöôùc töï nhieân, vi khuaån naøy phaùt trieån toát nhaát trong moâi tröôøng nöôùc aám, ví duï nhö ñöôïc tìm thaáy trong boàn nöôùc noùng, beå chöùa nöôùc noùng, thaùp laøm maùt, caùc boä phaän cuûa heä thoáng ñieàu hoøa khoâng khí. Ngoaøi ra Legionella coøn coù trong nöôùc ngaàm, nöôùc uoáng, maët nöôùc bieån. Nhöõng vi khuaån naøy ñöôïc tìm thaáy trong caùc heä thoáng phaân phoái nöôùc cuûa beänh vieän, khaùch saïn, taøu, coâng trình, nhaø cöûa, nguoàn nöôùc khaùc trong ñoù Legionella ñöôïc tìm thaáy trong thaùp laøm maùt. Nhöõng vi khuaån naøy ñöôïc vaän chuyeån töø nöôùc saïch cho khoâng khí baèng voøi nöôùc, voøi sen, thaùp laøm maùt. Legionella coù theå taêng leân gaáp nhieàu laàn trong caùc thaùp laøm maùt, thaùp ngöng bay hôi, maùy giaët, khoâng khí, ñoä aåm, maùy ñun nöôùc noùng, ôû spa, ñaøi phun nöôùc vaø trong caùc oáng nöôùc. Trong thôøi haïn moät thaùng, Legionella coù theå nhaân leân töø 10/ml ñeán hôn 1.000/ml trong nöôùc aám cuûa caùc heä thoáng. Soá löôïng cao nhaát cuûa Legionella ñaõ tìm thaáy trong maãu nöôùc laø 150.000/ml nöôùc. Legionella laây nhieãm sang ngöôøi khi hoï hít caùc haït nhoû trong khoâng khí maø maét thöôøng khoâng thaáy ñöôïc. Legionella phaân taùn trong moâi tröôøng coù theå môû roäng treân moät khoaûng caùch ít nhaát laø 6km ( Theo taïp chí Beänh truyeàn nhieãm 193:102-11,2006). Legionella ñöôïc coi laø phoå bieán trong moâi tröôøng nöôùc, vaøi nghieân cöùu kieåm tra nonepidemic beà maët töï nhieân vuøng bieån cho söï hieän dieän cuûa hoï. Naêm 1985, tieâu chuaån trích daãn moät vaøi taøi lieäu nghieân cöùu chöùng minh roõ raøng söï xuaát hieän roäng raõi cuûa Legionella töø beà maët nöôùc ngoït töï nhieân ( ví duï nhö soâng, suoái) taïi Hoa Kyø. Theâm caùc nghieân cöùu gaàn ñaây chæ ra raèng Legionella laø khaù phoå bieán ôû vuøng bieån vaøo naêm 1993. 3.8. Tình hình nhieãm Legionella treân theá giôùi vaø Vieät Nam hieän nay. 3.8.1.. Tình hình nhieãm Legionella treân theá giôùi Naêm 1996 coù 201 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis . Caùc tröôøng hôïp lieân keát vôùi nguoàn laây nhieãm laø : 101 tröôøng hôïp chieám 50% do ñi laïi hoaëc ôû nöôùc ngoaøi hoaëc ôû Anh vaø 98 tröôøng hôïp 49% do mua laïi coäng ñoàng. Soá löôïng caùc tröôøng hôïp lieân quan ñeán dòch hoaëc cuïm ñaõ ñöôïc 55 chieám 27% vaø 146 tröôøng hôïp coøn laïi laø 73% ñaõ ñöôïc baùo caùo laø tröôøng hôïp duy nhaát. Toång coäng coù 3005 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis trong cö daân Anh vaø xöù Wales ñaõ ñöôïc baùo caùo trong giai ñoaïn 1980 – 1996 vaøo naêm 1997. Nhìn chung, du lòch vaø communitycases töøng chieám 46%. Töø naêm 1993 soá ngöôøi maéc beänh do legionella ngaøy caøng taêng vaø coù moät gia taêng maïnh soá löôïng caùc tröôøng hôïp nhieãm legionella trong naêm 1996 (201 tröôøng hôïp) so vôùi 160 tröôøng hôïp naêm 1995. Naêm 1993, 24 nöôùc chaâu Aâu ñaõ göûi ñöôïc thoâng tin veà tröôøng hôïp beänh legionellosis ôû chaâu Aâu thoâng qua caùc hình thöùc hoaøn thaønh baùo caùo haøng naêm taïi London. Keát quaû haøng naêm cho naêm 1996 ñaõ ñöôïc baùo caùo trong dòch teã hoïc haøng tuaàn. Legionella have been detected recently that are able to grow intracellularly in protozoan cells evenNaêm 1996 coù 1566 tröôøng hôïp veà beänh legionellosis ñaõ ñöôïc baùo caùo taïi 24 nöôùc Chaâu Aâu bao goàm Anh, Wales vaø Scotland. Boán quoác gia baùo caùo coù hôn 100 tröôøng hôïp moãi naêm : Taây Ban Nha 430, Phaùp 294, Anh vaø xöù Wales 200 vaø Ñöùc (Baéc vaø Ñoâng Nam) 181. Naêm 1996 ñaõ coù hôn 300 tröôøng hôïp hôn so vôùi naêm 1995 vaø hôn 400 tröôøng hôïp so vôùi naêm 1994. Söï gia taêng naøy chuû yeáu laø do moät oå dòch lôùn trong coäng ñoàng Taây Ban Nha 1996. Ngoaøi ra tyû leä trung bình ôû caùc nöôùc Chaâu Aâu coù tyû leä 4,45 tröôøng hôïp treân moät trieäu daân vaøo naêm 1996. Ña soá caùc tröôøng hôïp ôû caùc nöôùc chaâu AÂu baùo caùo vaøo naêm 1996 veà beänh legionellosis gaây ra bôûi L.pneumophilaserogroup 1 chieám 75 %, chöa xaùc ñònh nhoùm naøo chieám 18% vaø coøn laïi 7% laø khoâng roõ loaøi Legionella. Caùc tröôøng hôïp legionellosis taïi Australia vaø New Zealand thì phaûi khai baùo cho caùc nhaø chöùc traùch bieát veà heä thoáng giaùm saùt beänh. Naêm 1991 thì ñaõ coù 1.041 thoâng baùo cuûa legionellosis taïi UÙc. Naêm 1995 caùc tröôøng hôïp gaây ra do L.pneumophila chieám 41%, L.longbeachae chieám 22%, coù 2% tröôøng hôïp thuoäc caùc loaøi khaùc vaø 35% tröôøng hôïp khoâng coù speciated. Baùo caùo naøy cho raèng nhöõng soá lieäu naøy coù moät söï khaùc bieät vi sinh vaät trong tyû leä maéc legionellosis taïi UÙc vì L.pneumophila ñaõ ñöôïc baùo caùo laø chòu traùch nhieäm ít nhaát 90% trong nhieãm truøng legionellosis cuûa caùc quoác gia khaùc. Theo Trung Taâm kieåm soaùt dòch beänh (CDC) giöõa 8.000 vaø 18.000 tröôøng hôïp nhaäp vieän vôùi legionellosis taïi Hoa Kyø moãi naêm vôùi tyû leä töû vong cuûa noù trong moät oå dòch chieám töø 5- 30% ôû nhöõng ngöôøi maéc beänh. Trong soá 2.400.000 tröôøng hôïp vieâm phoåi xaûy ra moãi naêm ôû Hoa Kyø, öôùc tính khoaûng 10.000 ñeán 25.000 tröôøng hôïp cuûa beänh legionellosis chieám 5%-15% bò töû vong. Caùc tröôøng hôïp legionellosis do Legionella gaây ra ñaõ ñöôïc baùo caùo ôû Baéc vaø Nam Myõ, Chaâu AÙ, Australia, New Zealand, Chaâu Aâu vaø Nam Phi. 3.8.2. Tình hình nhieãm Legionella ôû Vieät Nam hieän nay Beân caïnh vi khuaån gaây beänh cho ñöôøng hoâ haáp aån truù thöôøng xuyeân trong maùy laïnh, môùi ñaây caùc nhaø khoa hoïc tieáp tuïc phaùt hieän theâm hai loaïi virus nguy hieåm khaùc cuõng ñang choïn maùy laïnh laøm “ nhaø”. Theo ñaùnh giaù cuûa beänh vieän ñaïi hoïc Y döôïc TP.HCM vaø beänh vieän Phaïm Ngoïc Thaïch, soá beänh nhaân bò hen suyeãn, caùc beänh veà ñöôøng hoâ haáp do aûnh höôûng cuûa moâi tröôøng laøm vieäc ñang ngaøy caøng taêng. Trung bình moät tuaàn, beänh vieän ñaïi hoïc Y döôïc TP.HCM tieáp nhaän haøng chuïc ca ñeán khaùm trong ñoù raát nhieàu ca bò vieâm phoåi keøm theo ñau khôùp, nhöùc ñaàu ,tieâu chaûy do vi khuaån Legionella pneumophila gaây ra. Phaàn ñoâng ngöôøi lao ñoäng ñang laøm vieäc taïi caùc cao oác, nhaø cao taàng. Trong ñoù cuõng coù moät soá tröôøng hôïp laø treû em vaø hoïc sinh, sinh vieân. Taïi beänh vieän Phaïm Ngoïc Thaïch, hoà sô beänh aùn cuõng ñaõ ghi nhaän töøng coù ca söng phoåi töû vong lieân quan ñeán Legionella pneumophila. Haàu heát caùc tröôøng hôïp phaùt beänh ñeàu ngoä nhaän do aûnh höôûng cuûa caùc taùc nhaân beân ngoaøi ( oâ nhieãm khoùi buïi ngoaøi ñöôøng, huùt thuoác laù, uoáng röôïu bia) maø khoâng maáy ai nghi ngôø maàm beänh ñang truù aån ngay trong phoøng laøm vieäc cuûa mình : caùc chaát voâ cô, höõu cô, naám moác xng quanh vaø trong maùy laïnh. Theá giôùi ñaõ caûnh baùo taùc haïi cuûa vi khuaån legionella pneumophila töø nhieàu thaäp kyû tröôùc do chuùng raát nguy hieåm vaø thöôøng gaëp. Choã truù aån ngon laønh nhaát cuûa vi khuaån naøy khoâng ñaâu khaùc laø ñöôøng oáng nöôùc cuûa maùy laïnh. Lgionella pneumophila coù theå laøm cho beänh nhaân khôûi phaùt raát nhanh beänh söng phoåi vaø töû vong chæ trong vaøi ngaøy neáu keát quaû ñieàu trò khoâng nhaän dieän ra chuùng sôùm. CHÖÔNG 4 : CAÙC PHÖÔNG PHAÙP PHAÙT HIEÄN LEGIONELLA Caùc trieäu chöùng laâm saøng khi nhieãm Legionella vaø caùc trieäu chöùng cuûa beänh vieâm phoåi laø khoâng theå phaân bieät ñöôïc. Do ñoù phöông phaùp chaån ñoaùn chính xaùc laø caàn thieát ñeå xaùc ñònh Legionella vaø ñeå ñieàu trò kòp thôøi, phuø hôïp. Ñeå caûi thieän cho vieäc chaån ñoaùn thì chuyeân ngaønh phoøng thí nghieäm phaûi ñöôïc kieåm tra vaø tieán haønh ngay. Caùc xeùt nghieäm cho beänh lyù phaûi ñöôïc thöïc hieän treân taát caû caùc beänh nhaân coù nguy cô bò vieâm phoåi cao, keå caû nhöõng ngöôøi bò oám naëng (coù hoaëc khoâng coù tính naêng laâm saøng cuûa beänh legionellosis). Ñaëc bieät, caùc xeùt nghieäm cho beänh neân ñöôïc tìm ra treân beänh nhaân ñaõ bò beänh tröôùc ñoù, öùc cheá mieãn dòch hoaëc khoâng ñaùp öùng vôùi khaùng sinh beta – lactam hoaëc nhöõng ngöôøi coù theå tieáp xuùc vôùi Legionella trong moät oå dòch . Maëc duø söï saün coù cuûa phaân töû mieãn dòch vaø phöông phaùp di truyeàn thì chaån ñoaùn beänh Legionellosis noùi chung thì nguyeân nhaân chuû yeáu laø L.pneumophila serogroup1. Töø naêm 1995 thì caùc xeùt nghieäm chaån ñoaùn cho legionellosis ñaõ thay ñoåi ñaùng keå. Caùc phoøng thí nghieäm ñang söû duïng moät soá phöông phaùp ñeå chaån ñoaùn nhieãm truøng Legionella : - Söï coâ laäp cuûa vi khuaån treân phöông tieän truyeàn thoâng vaên hoùa. - Xaùc ñònh caùc vi khuaån baèng caùch söû duïng serology. - Phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. - Phaùt hieän caùc vi khuaån trong moâ hoaëc chaát dòch trong cô theå baèng kính hieån vi immunofluorescent ( Ví duï : Khaûo nghieäm tröïc tieáp immunofluorescent Dfa). - Phaùt hieän DNA cuûa vi khuaån baèng caùch söû duïng phaûn öùng daây chuyeàn polymerase (PCR). 4.1. Phöông phaùp truyeàn thoáng 4.1.1. Maãu Maãu nöôùc ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích laø maãu nöôùc töø caùc maùy laïnh trong caùc nhaø cao taàng. 4.1.2. Phöông phaùp Kyõ thuaät xöû lyù nhieät ñöôïc söû duïng ñeå phaân laäp Legionella caùc maãu töø moâi tröôøng. Quy trình naøy thöïc hieän ñôn giaûn, khoân ñaét tieàn, khoâng yeâu caàu trang thieát bò phöùc taïp. Moâi tröôøng söû duïng bao goàm moâi tröôøng MWY agar, moâi tröôøng alpha – BCYE vaø blood agar. Caû moâi tröôøng MWY agar vaø alpha – BCYE agar chöùa L – cystein vaø ferric pyrophosphate. Cystein laø moät acid amin caàn cho quaù trình taêng tröôûng Legionella pneumophila. Moâi tröôøng MWY agar laø moät moâi tröôøng coù chöùa glycine ñeå naâng cao söï taêng tröôûng cuûa Legionella trong moâi tröôøng. Noù cuõng chöùa khaùng sinh öùc cheá söï phaùt trieån cuûa caùc vi khuaån khaùc trong moâi tröôøng. Maãu nöôùc ñöôïc ly taâm ôû 4000 voøng/phuùt trong 30 phuùt. Phaàn noåi treân maët loaïi boû vaø thu 10ml phaàn caën. Ñeå loaïi boû phaàn caën neân thöïc hieän caån thaän ñeå traùnh laøm loaïn phaàn caën. Laáy 1ml caën ñem gia nhieät ôû 500C trong 30 phuùt. Coøn 9ml ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä 200C ñeå sau naøy söû duïng. Laáy 50µl maãu nöôùc ñöôïc gia nhieät caáy traûi treân moâi tröôøng MWY agar uû nhieät ñoä 350C trong khoâng khí aåm trong 3 – 4 ngaøy. Ñeám taát caû nhöõng khuaån laïc nghi ngôø treân moâi tröôøng MWY agar, sau ñoù caáy chuyeån sang moâi tröôøng alpha – BCYE vaø blood agar vaø uû trong 35 – 370C töø 3 – 4 ngaøy. Söï hieän dieän cuûa söï taêng tröôûng vi sinh vaät treân moâi tröôøng alpha – BCYE agar vaø söï khoâng taêng tröôûng treân moâi tröôøng Blood agar chöùng toû coù söï hieän dieän cuûa Legionella. Nhöõng vi khuaån giaû ñònh coù kích côõ töø 1 – 4 mm vaø xuaát hieän aùnh saùng laáp laùnh, loài vaø coù nhöõng ñoám nhoû. Tieán haønh caùc thöû nghieäm sinh hoùa : oxidase, catalase, gelatin, β – lactamase vaø thuûy phaân hippurate. Caùc chuûng Legionella giaû ñònh bò nhuõ hoùa trong 0.05ml khaùng huyeát thanh. Baát cöù söï ngöng keát naøo xaûy ra trong 1 phuùt ñöôïc xem laø Legionella döông tính. Quy trình phaân tích : Nöôùc maãu (400ml) 3500- 4000 voøng/trong 30 phuùt Traàm tích (10ml) ` Nhieät khí 1ml maãu ôû 500C/30 phuùt Caáy 50 µl maãu leân MWY agar UÛ 350C – 370C trong 3 – 4 ngaøy Nhaän vaø caáy vaøo caùc thuoäc ñòa Legionella Thaïch BCYE Blood agar trung bình Legionella spp Khoâng coù Legionella spp BCYE khoâng coù L-cysteine Khoâng phaûi kieåm tra huyeát thanh loïc Legionella 4.2. Caùc phöông phaùp hieän ñaïi 4.2.1. Phaùt hieän Legionella pneumophila trong heä thoáng nöôùc laïnh baèng phöông phaùp PCR. Legionella pneumophila tham gia vaøo hôn 95% tröôøng hôïp vieâm phoåi chuû yeáu laø nhieãm truøng do hít phaûi caùc bình xòt thoâng qua caùc heä thoáng nöôùc laøm maùt. Trong ñoù ta coù theå phaùt hieän moät soá chuûng Legionella baèng phöông phaùp Taq polymerase, khueách ñaïi DNA vaø PCR ñeå phaùt hieän Legionella cuï theå treân trình töï 16S-rDNA. Trong soá 77 maãu nöôùc ñaõ ñöôïc thöû nghieäm bôûi PCR thì coù 30 maãu chieám 39% coù lieân quan ñeán Legionella. Tuy nhieân, L.pneumophila ñaõ ñöôïc phaùt hieän vaø chieám 18,2% töø caùc maãu nöôùc laøm maùt baèng phöông phaùp PCR. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp PCR - Phöông phaùp PCR cung caáp keát quaû trong 24 giôø so vôùi quay voøng 10 ngaøy cuûa phöông phaùp vaên hoùa. - Keát quaû cuûa Legionella ñöôïc xaùc ñònh baét ñaàu taïi thôøi ñieåm laáy maãu. - Phöông phaùp PCR coù thôøi gian phaùt hieän nhanh hôn nhieàu so vôùi phöông phaùp truyeàn thoáng do söï nhaïy caûm cao hôn trong quaù trình PCR. - Quùa trình phaùt hieän ôû caáp ñoä DNA gaây cho Legionella bò maéc keït trong LMS biofi vaø trong caùc sinh vaät khaùc nhö amip. - Söï hieän dieän cuûa caùc sinh vaät khoâng phaûi laø muïc tieâu loaïi boû trong quaù trình xaùc ñònh Legionella baèng phöông phaùp PCR. - Xaùc ñònh cation ôû möùc ñoä DNA thì PCR laø phöông phaùp khoâng chính xaùc do caùc phaûn öùng cheùo, vôùi boä duïng cuï chính xaùc hôn laø huyeát thanh loïc coù theå khoâng nhaém muïc tieâu vôùi sinh vaät. 4.2.2. Caùc phaùt hieän Legionella trong maãu moâi tröôøng vaø sinh hoïc Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän Legionella trong nöôùc, ñôøm, maùu. Kohler (1986) baùo caùo raèng caùc khaùng nguyeân coù theå ñöôïc phaùt hieän trong nöôùc tieåu cuûa beänh nhaân bò vieâm phoåi chieám 80% vaø ñaëc tröng cuûa caùc khaûo nghieäm chieám 99%. Haàu heát caùc xeùt nghieäm treân ñöôøng hoâ haáp, cuï theå laø moâ pheá quaûn vaø khí quaûn, ñôøm. Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñöôïc thöïc hieän treân vi khuaån laø tröïc tieáp vaø giaùn tieáp baèng phöông phaùp huyønh quang ñöôïc aùp duïng ñoái vôùi caû hai moâi tröôøng. Huyønh quang laø nhöõng hôïp chaát höõu cô thuoäc caùc phaân töû khaùng theå ñöôïc gaén vaøo moät teá baøo hoaëc khaùng nguyeân treân beà maët teá baøo. Khaûo nghieäm immunofluorescence bao goàm khaûo nghieäm tröïc tieáp (Dfa) vaø giaùn tieáp (IFA).Caùc xeùt nghieäm huyeát thanh khaùc nhau chuû yeáu ôû ñoä nhaïy, ñaëc tính cuûa Legionella. Khaûo nghieäm tröïc tieáp immunofluorescence (Dfa) Tröïc tieáp khaûo nghieäm immunofluorescence(DFAs) caàn 2-3 giôø ñeå nhuoäm khi söû duïng khaùng theå keát hôïp vôùi moät fluorochrome. DFAs cuûa ñôøm cho keát quaû döông tính sau 2-4 ngaøy sau khi baét ñaàu ñieàu trò baèng khaùng sinh vaø thöôøng cho khoaûng thôøi gian trong tröôøng hôïp cuûa beänh vieâm phoåi. DFA ñaõ ñöôïc söû duïng thaøng coâng vôùi ñôøm vaø dòch maøng phoåi. Dòch chaát loûng ñöôïc kieåm tra trong beänh nhaân vieâm phoåi baèng Dfa hieám khi mang laïi keát quaû tích cöïc. Giöõa beänh nhaân legionellosis ñaõ ñöôïc chöùng minh vôùi Dfa cho L.pneumophila tôùi 25%-70% vaø ñaëc tröng cuûa thöû nghieäm laø cao hôn 99,9%. Phaûi caån troïng ñeå ngaên ngöøa keát quaû döông tính giaû cuûa Dfa. Khaûo nghieäm giaùn tieáp immunofluorescence (IFA) Vi khuaån Legionella vaø khaùng theå trong huyeát thanh beänh nhaân bò vieâm phoåi ñöôïc phaùt hieän qua IFA. Nhieät coá ñònh khaùng nguyeân thöôøng ñöôïc söû duïng taïi Hoa Kyø nhöng khaùng nguyeân formolized ñöôïc söû duïng chuû yeáu ôû Chaâu Aâu. Bôûi vì chuyeån ñoåi huyeát thanh chæ xaûy ra sau moät thôøi gian daøi ôû ngöôøi, caùc thöû nghieäm IFA thöôøng ñöôïc söû duïng cuøng vôùi caùc xeùt nghieäm khaùc vaø moät loaït caùc xeùt nghieäm huyeát thanh hoïc ñöôïc tieán haønh ñeå kieåm tra khaùng theå vaø thöôøng keát hôïp vôùi IFA. Hieän nay tröôøng hôïp veà legionellosis ñöôïc xaùc ñònh thoâng qua phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu. Nhö moät heä quaû cuûa söï chuyeån ñoåi thì phaùt hieän L.pneumophila serogroup 1 gaây legionellosis ñang gia taêng vaø taát caû caùc serogroup khaùc coù leõ underdiagnosed. Theo baùo caùo cuûa caùc nöôùc chaâu Aâu vaøo naêm 1999 thì beänh legionellosis xaûy ra raát cao. Phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø phöông phaùp phoå bieán nhaát trong ñieàu trò beänh legionellosis. Caùc xeùt nghieäm phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø nhaïy caûm ñaùng keå hôn cho communityacquired vaø chaêm soùc söùc khoûe nhieãm truøng mua laïi. Khaùng nguyeân tieát nieäu Enzyme immunoassays. Vieäc söû duïng Enzyme immunoassays (EIAs) ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân L.pneumophila trong nöôùc tieåu cho pheùp chaån ñoaùn beänh legionellosis sôùm trong quaù trình laây nhieãm. Söû duïng EIAs giuùp thöû nghieäm nhanh choùng caùc ñaëc tröng vaø söï nhaïy caûm ñoái vôùi L.pneumophila 1. Caùc khaùng nguyeân ñöôïc phaùt hieän trong haàu heát caùc beänh nhaân töø moät ñeán ba ngaøy sau khi baét ñaàu xuaát hieän caùc trieäu chöùng vaø coù theå keùo daøi vaøi tuaàn hay vaøi thaùng ngay khi caùc xeùt nghieäm khaùc khoâng phaùt hieän khaùng nguyeân. Caùc xeùt nghieäm nöôùc tieåu söû duïng EIAs thì coù maët khaùng nguyeân tôùi 80 -85%. Do ñoù söû duïng EIA ñeå phaùt hieän L.pneumophila 1 khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Ngoaøi ra söû duïng Enzyme immunoassays ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân tieát nieäu laø phöông phaùp ñöôïc löïa choïn cho L.pneumophila 1. So vôùi caùc phöông phaùp chaån ñoaùn khaùc thì lôïi theá cuûa khaùng nguyeân tieát nieäu ñaït hieäu quaû cao hôn. Vì maãu vaät thu ñöôïc deã daøng, khaùng nguyeân ñöôïc phaùt hieän töø raát sôùm trong quaù trình nhieãm, thöû nghieäm nhanh choùng...Caùc khaùng nguyeân cuõng ñöôïc phaùt hieän trong beänh vieâm phoåi maø khoâng coù khaùng sinh ñieàu trò . Khaûo nghieäm Immunochromatographic Khaûo nghieäm Immunochromatographic giuùp phaùt hieän nhanh choùng L.pneumophila 1 khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Khaûo nghieäm naøy giuùp phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu trong thôøi gian raát ngaén vaø khoâng yeâu caàu trang thieát bò phoøng thí nghieäm . Moâ khaùng nguyeân Söû duïng kính hieån vi immunofluorescence ñeå phaùt hieän Legionella trong caùc maãu thuoäc ñöôøng hoâ haáp nhö phoåi vaø dòch maøng phoåi. Söû duïng caùc kyõ thuaät giaùn tieáp immunofluorescence (IEAT) ñöôïc söû duïng haàu heát trong caùc phoøng thí nghieäm ñeå phaùt hieän caùc khaùng theå huyeát thanh. Ñaõ chöùng minh ñöôïc L.pneumophila 1 gaây beänh legionellosis xuaát hieän caùc trieäu chöùng trong voøng 1-9 tuaàn sau. Trung bình beänh nhaân phaùt trieån caùc khaùng theå (seroconvert) trong voøng 2 tuaàn. Tuy nhieân, coù khi leân ñeán 25% cuûa seroconversions laø khoâng bò phaùt hieän bôûi vì huyeát thanh thu ñöôïc hôn 8 tuaàn sau khi beänh khôûi phaùt. Maëc duø phaùt hieän chaån ñoaùn baèng khaùng theå töø moâ vaãn coøn höõu ích cho caùc nghieân cöùu dòch teã hoïc taïi oå dòch, thöôøng bò thay theá baèng caùc xeùt nghieäm khaùng nguyeân tieát nieäu. Söû duïng giaùn tieáp IFAT ñeå chaån ñoaùn beänh legionellosis . Ñoä nhaïy vaø ñaëc tính cuûa IFAT chæ ñöôïc ñaùnh giaù baèng caùch söû duïng khaùng nguyeân cho L.pneumophila 1, ñoä nhaïy vaø ñaëc tính cho caùc nhoùm vaø loaøi khaùc thì khoâng ñöôïc bieát ñeán. Khaûo nghieäm Enzyme Linked Immunoabsorbent (ELISA) Khaûo nghieäm Enzyme Linked Immunoabsorbent (ELISA) cuøng vôùi radioimmunoassay (RIA) duøng ñeå phaùt hieän khaùng theå Legionella. Nhöõng phöông phaùp naøy söû duïng caùc enzyme vaø ñoàng vò phoùng xaï ñeå phaùt hieän caùc phaân töû khaùng theå. Caùc phöông phaùp ELISA ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän khaùng theå Legionella trong huyeát thanh beänh nhaân, nhöng noù cuõng ñöôïc duøng ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu. Vôùi phöông phaùp ELISA thì phaûi saáy sô boä maãu laø caàn thieát ñeå traùnh döông tính giaû. Phöông phaùp RIA cuõng ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän caùc Legionella khaùng nguyeân trong nöôùc tieåu nhöng khoâng coøn thöông maïi vaø phoå bieán. Khaùng theå ñôn doøng Khaùng theå ñôn doøng ñöôïc kieåm tra, thöû nghieäm vôùi caùc khaùng theå hình thaønh töø baûn sao duy nhaát cuûa caùc teá baøo, ñöôïc tìm thaáy chính xaùc hôn xeùt nghieäm polyclonal do söï ñaøn aùp cuûa neàn huyønh quang. Ngoaøi ra, keát quaû sai töø caùc phaûn öùng cheùo vôùi caùc sinh vaät khoâng coù Legionella ñöôïc loaïi boû. Khaùng theå ñôn doøng coù theå ñöôïc saûn xuaát ñeå phaûn öùng vôùi moät loaøi cuï theå. Theo Kohler (1986) ôû phoøng thí nghieäm khaúng ñònh raèng coù nhieàu khaùng theå cho L.pneumophila ñaõ ñöôïc phaùt trieån ôû caùc loaøi cuï theå vaø thaäm chí laø cuï theå ôû caùc nhoùm. 4.2.3. Phöông phaùp Enzyme – linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ñöôïc söû duïng ñeå phaùt hieän ñoäc toá hoaït tính sinh hoïc vaø söï doø tìm ñoäc toá khoâng tích cöïc. Nhöõng tieán boä kyõ thuaät trong vaøi thaäp nieân vöøa qua thuùc ñaåy söï phaùt trieån cuûa nhieàu kyõ thuaät chuaån ñoaùn huyeát thanh hoïc nhanh nhaïy, chính xaùc caùc beänh truyeàn nhieãm. Maët khaùc, söï phaùt trieån cuûa nhöõng kyõ thuaät töï ñoäng hoùa cho pheùp ñôn giaûn hoùa thao taùc thöïc hieän. Nguyeân taéc cuûa phöông phaùp mieãn dòch laø phaûn öùng keát hôïp giöõa moät teá baøo (khaùng nguyeân) vôùi moät khaùng khaùng theå ñaëc hieäu. Tính hieäu cuûa phaûn öùng mieãn dòch laø coù theå nhaän bieát thoâng qua söï ngöng tuûa hay keát dính cuûa khaùng nguyeân – khaùng theå. Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät ELISA laø söû duïng khaùng theå ñôn doøng phuû beân ngoaøi ñóa gieáng. Neáu coù söï hieän dieän cuûa khaùng nguyeân muïc tieâu trong maãu, khaùng nguyeân naøy seõ giöõ laïi treân beà maët gieáng. Caùc khaùng nguyeân naøy seõ ñöôïc phaùt hieän baèng caùch söû duïng khaùng theå thöù caáp coù gaén vôùi enzyme nhö alkaline phosphate. Khi boå sung moät cô chaát ñaëc hieäu cuûa enzyme vaøo gieáng, enzyme xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân cô chaát ñeå taïo ra caùc saûn phaåm coù maøu hay phaùt saùng. Baèng caùch theo doõi söï ñoåi maøu coù theå phaùt hieän söï hieän dieän vaø ñònh löôïng khaùng nguyeân. ELISA ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi döôùi daïng caùc boä kit thöông maïi vaø coù theå ñöôïc caûi tieán ñeå töï ñoäng hoùa. ELISA coù theå ñöôïc söû duïng phaùt hieän vaø ñònh löôïng vi sinh vaät trong thöïc phaåm trong thôøi gian vaøi giôø sau khi taêng sinh. 4.2.4. Phöông phaùp PCR Phöông phaùp PCR (Polymerase chain reaction) laø phöông phaùp invitro ñeå toång hôïp DNA döïa treân khuoân laø moät trình töï DNA ban ñaàu, khueách ñaïi, nhaân soá löôïng baûn sao thaønh haøng trieäu baûn sao nhôø hoaït ñoäng cuûa enzyme polymerase vaø moät caëp moài ñaëc hieäu cho ñoaïn DNA naøy. Hieän nay, kyõ thuaät naøy ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå phaùt hieän taïo ra caùc ñoät bieán gen, chaån ñoaùn beänh, phaùt hieän caùc maàm beänh vi sinh vaät coù trong thöïc phaåm… Taát caû caùc DNA polymerase ñeàu caàn nhöõng moài chuyeân nghieäp ñeå toång hôïp moät maïch DNA môùi töø maïch khuoân. Maïch khuoân thöôøng laø moät trình töï DNA cuûa gen ñaëc tröng cho loaøi vi sinh vaät muïc tieâu hoaëc laø gen quy ñònh vieäc toång hôïp moät loaïi ñoäc toá chuyeân bieät cuûa vi sinh vaät naøy. Moài laø nhöõng ñoaïn DNA ngaén, coù khaû naêng baét caëp boå sung vôùi moät ñaàu cuûa ñoaïn maïch khuoân vaø nhôø hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase ñöôïc noái daøi ñeå hình thaønh maïch môùi. Phöông phaùp PCR ñöôïc hình thaønh döïa treân ñaëc tính cuûa DNA polymerase. Khi coù söï hieän dieän cuûa hai moài chuyeân nghieäp baét caëp boå sung vôùi hai ñaàu cuûa moät trình töï DNA trong phaûn öùng PCR, ôû ñieàu kieän ñaûm baûo hoaït ñoäng cuûa DNA polymerase, ñoaïn DNA naèm giöõa hai moài seõ ñöôïc khueách ñaïi thaønh soá löôïng lôùn baûn sao ñeán möùc coù theå thaáy sau khi nhuoäm baèng ethidium bromide vaø coù theå thu nhaän ñöôïc ñoaïn DNA naøy cho caùc muïc ñích thao taùc treân gen. Nhö vaäy, khueách ñaïi moät trình töï DNA xaùc ñònh caàn phaûi coù nhöõng thoâng tin toái thieåu veà trình töï cuûa DNA, ñaëc bieät laø trình töï caùc base ôû hai ñaàu ñoaïn ñuû ñeå taïo caùc moài boå sung chuyeân bieät. Phaûn öùng PCR goàm nhieàu chu kyø laëp laïi noái tieáp nhau. Moãi chu kyø goàm 3 böôùc : a) Böôùc 1 : Trong moät dung dòch phaûn öùng bao goàm caùc thaønh phaàn caàn thieát cho söï sao cheùp, phaân töû DNA bieán tính ôû nhieät ñoä cao, thöôøng laø 94 – 950C trong 30 – 60 giaây. Maïch ñoâi DNA taùch ra thaønh daïng maïch ñôn. b) Böôùc 2 : Nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp hôn Tm cuûa caùc moài cho pheùp caùc moài baét caëp vôùi maïch khuoân, nhieät ñoä naøy khoaûng 40 – 700C, trong khoaûng 30 – 60 giaây. c) Böôùc 3 : Toång hôïp. Nhieät ñoä ñöôïc taêng leân ñeán 720C giuùp cho DNA polymerase hoaït ñoäng toát nhaát. Thôøi gian cuûa böôùc naøy tuøy thuoäc vaøo ñoä daøi trình töï DNA caàn khueách ñaïi, thöôøng 30 giaây ñeán nhieàu phuùt. Quy trình chung cho vieäc phaùt hieän vi khuaån gaây beänh trong maãu nhö sau : Böôùc 1 : Taêng sinh treân moâi tröôøng khoâng hoaëc ít choïn loïc trong thôøi gian töø 10 – 20 giôø. Böôùc 2 : Thu dòch nuoâi caáy, ly taâm boû maûnh vuïn, ly taâm goäp sinh khoái teá baø vi khuaån, huyeàn phuø teá baøo TE (10Mm Tris – HCl, pH =8,0, 1Mm EDTA) vôùi theå tích baèng 1/10 teå tích dòch nuoâi caáy ban ñaàu, xöû lyù nhieät ôû 1000C trong 10 phuùt, ly taâm loaïi boû taïp chaát khoâng tan öùc cheá phaûn öùng PCR. Böôùc 3 : Thöïc hieän phaûn öùng PCR Böôùc 4 : Ñieän di gel agarose 1,5% xem keát quaû treân ñeøn UV. 4.3. Caùc bieän phaùp kieåm soaùt Legionella trong thöïc phaåm Coù nhieàu phöông phaùp khöû truøng lieân quan ñeán vaät lyù (ví duï nhö maøng loïc), nhieät (ví duï nhö nhieät khöû truøng) vaø hoùa hoïc (ví duï nhö chlor hoùa). Ñoái vôùi vieäc khöû truøng nöôùc thì phöông phaùp ñöôïc söû duïng laø thuoác khöû truøng (chlor laø phoå bieán nhaát) ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát. Thuoác khöû truøng ñöôïc söû duïng cho nöôùc uoáng phaûi ñöôïc an toaøn cho con ngöôøi tieâu thuï veà maët hoùa hoïc laãn tính chaát. Taát caû nhöõng phöông phaùp vaø thuoác khöû truøng phaûi ñöôïc aùp duïng ñeå cung caáp cho caùc heä thoáng taïi caùc cô sôû coâng nghieäp. Ñoái vôùi heä thoáng nöôùc khoâng saïch thì caàn boå sung chaát khöû truøng vaø khoâng cho con ngöôøi söû duïng. Nhieät khöû truøng ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi ñaëc bieätø cho caùc heä thoáng nöôùc vì Legionella ñaõ ñöôïc tìm thaáy gaàn nhö ngay laäp töùc ñöôïc baát hoaït ôû 700C. Trong xem xeùt naøy thì thoâng tin veà phöông phaùp hoùa hoïc vaø phöông phaùp nhieät ñöôïc tìm thaáy. Vì vaäy coù nhieàu loaïi thuoác khöû truøng coù saün, xem xeùt laïi ñaõ ñöôïc duøng daønh cho caùc phöông phaùp hoùa hoïc. 4.3.1. Hieäu löïc cuûa maøng sinh hoïc vaø caùc yeáu toá khöû truøng khaùc Caùc khaùng cuûa vi khuaån ñeå khöû truøng Legionella phuï thuoäc vaøo caùc ñieàu kieän vaên hoùa. Ngoaøi ra soá nöôùc phaùt trieån neàn vaên hoùa, nhöõng lieân keát vôùi maøng sinh hoïc (vi khuaån khoâng cuoáng) ñaõ ñöôïc > 100 laàn khaùng iodine hôn nhöõng sinh vaät phuø du. Ñieàu naøy laøm taêng söùc ñeà khaùng cuûa Legionella do nhu caàu thuoác khöû truøng ñeå thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc ñeå tieáp caïnh vôùi vi khuaån. Green cho thaáy 1mg/l Chlor ñaõ töï do gieát cheát caùc sinh vaät phuø du, trong khi ñoù thì L.bozemanii taêng leân 4 laàn laø ñieàu caàn thieát ñeå thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc vaø Legionella gieát cheát vi khuaån khoâng cuoáng trong 24h. Cho moät noàng ñoä thuoác khöû truøng thì moät thôøi gian lieân laïc laâu hôn nöõa laø yeâu caàu voâ hieäu hoùa vi khuaån khoâng cuoáng hôn so vôùi sinh vaät phuø du. Theo Yabuuchi thì coù theå voâ hieäu hoùa sinh vaät phuø du trong voøng 15 phuùt ôû 0,4 mg/L Chlor. Tuy nhieân, khi noàng ñoä chlor >3mg/L laø caàn thieát ñeå voâ hieäu hoùa vaø ngaên chaën caùc vi khuaån coù lieân quan ñeán maøng sinh hoïc. Vi khuaån Legionella ñaõ ñöôïc bieát ñeán khi phaù hoaïi moät soá ñoäng vaät nguyeân sinh bao goàm caû amip. Ñaây laø khoù khaên trong vieäc tieâu dieät Legionella khi coù lieân quan vôùi amip vaø thaäm chí khoù khaên hôn khi chuùng coù lieân quan vôùi u nang amip. Ví duï, Hartmannellavermiformis moät amip phoå bieán trong nöôùc uoáng ñaõ khoâng laøm taêng tröôûng L.pneumophila taïi > 4mg/L chlor trong khi ñoù L.pneumophila coù theå chòu ñöôïc ít nhaát laø 50mg/L chlor töï do trong caùc u nang Acanthamoebapolyphage. Srikanth vaø Berk thaáy raèng caùc loaøi amip ñöôïc phaân laäp töø moät thaùp laøm maùt cuûa moät heä thoáng ñieàu hoøa khoâng khí vaø tieáp xuùc ñeå khöû truøng khoâng oxi hoùa. Sutherland vaø Berk cuõng ñaõ coâ laäp boán loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh ñoù laø : - Hai loaøi ciliate : Tetrahymena sp vaø Colpoda sp - Hai loaøi amip : Vannella miroides vaø Acanthamoebahatchetti. Srikanth vaø Berk ñaõ tìm thaáy raèng söï tieáp xuùc cuûa moät loaøi ñoäng vaät nguyeân sinh vôùi moät chaát khöû truøng daãn ñeán söùc ñeà khaùng cuûa mình cho chaát khöû truøng khaùc. Ñieàu naøy coù theå laøm cho söï kieåm soaùt cuûa vi khuaån Legionella khoù khaên hôn. Tuy nhieân, traùi vôùi nhöõng phaùt trieån veà moái quan heä giöõa vi khuaån Legionella vaø amip thì McCallet baùo caùo raèng söï hieän dieän cuûa caùc amip khoâng lieân quan ñeán thuoäc ñaïi Legionella sau khi khöû truøng vì amoebae ñaõ ñöôïc phuïc hoài maø khoâng caàn söï taùi phaùt trieån nhanh choùng cuûa Legionella. 4.3.2. Söï khöû truøng baèng hoùa hoïc 4.3.2.1. Söï böùc xaï UV Böùc xaï UV coù böôùc soùng ngaén ñeå tieâu dieät sinh vaät, vôùi khaû naêng gieát maïnh nhaát ôûù böôùc soùng 254 nm vaø hoaït ñoäng bôûi söï saûn xuaát ra caùc dimer thymine trong phaân töû DNA ngaên caûn quaù trình taùi baûn DNA. Chieáu xaï tia cöïc tím chöa ñöôïc söû duïng roäng raõi trong khöû truøng nöôùc uoáng vì khoâng theå gieát cheát caùc maàm beänh vaøo cuoái quaù trình xöû lyù. Chieáu xaï tia cöïc tím ñöôïc söû duïng roäng raõi trong khöû truøng nöôùc thaûi bôûi vì mong muoán laø khoâng coøn soùt laïi nhöõng vi khuaån gaây oâ nhieãm, khoâng gaây baát lôïi hay taùc ñoäng ñeán ñôøi soáng thuûy saûn. Ñoái vôùi caùc öùng duïng cuûa tia cöïc tím chieáu xaï Legionella caàn nghieân cöùu laïi thoâng qua caùc nghieân cöùu khaùc nhau. Ví duï, tia cöïc tím chieáu xaï ñaõ ñöôïc aùp duïng ñeå xöû lyù caùc nguoàn nöôùc laïnh vaø nguoàn cung caáp nöôùc noùng taïi caùc beänh vieän nhö moät phaàn cuûa chöông trình ñeå kieåm soaùt vi khuaån Legionella. Ñeøn UV thöôøng ñöôïc caøi ñaët gaàn caùc cöûa haøng thieát bò ngoaïi vi. Keát quaû cuûa nhöõng nghieân cöùu naøy ñaõ chæ ra raèng chieáu xaï tia cöïc tím moät mình laø khoâng hieäu quaû ñeå kieåm soaùt Legionella vaø caùc bieän phaùp khaùc ñöôïc aùp duïng chaúng haïn nhö söû duïng chlorine hoaït tính maïnh ñònh kyø vaø nhieät ñoä khöû truøng seõ phaûi ñöôïc söû duïng chung vôùi chieáu xaï tia cöïc tím ñeå cho vieäc kieåm soaùt Legionella coù hieäu quaû hôn. Chieáu xaï tia cöïc tím coù theå gaây baát lôïi cho vieäc cung caáp nöôùc uoáng coâng coäng vaø caùc nguoàn nöôùc laïnh, noùng taïi caùc beänh vieän. Chæ söû duïng phöông phaùp chieáu xaï tia cöïc tím cuõng seõ khoâng hieäu quaû trong vieäc kieåm soaùt vi khuaån Legionella trong nöôùc vaø caùc chaát loûng khaùc. 4.3.2.2. Caùc ion kim loaïi Nhieàu nghieân cöùu ñaõ ñöôïc tieán haønh veà vieäc söû duïng keát hôïp ñoàng vaø caùc ion baïc ñeå khöû truøng caùc heä thoáng nöôùc noùng vaø nöôùc laïnh taïi caùc beänh vieän ñeå choáng laïi vi khuaån Legionella, vôùi caùc öùng duïng môùi nhaát treân heä thoáng nöôùc noùng tuaàn hoaøn. Nhöõng ion ngaên caûn cho caùc enzyme lieân quan ñeán hoâ haáp teá baøo vaø gaén leân phaân töû DNA ôû nhöõng vò trí chuyeân bieät, vì vaäy lieàu löôïng hieäu quaû cuûa caùc ion kim loaïi ñaõ ñöôïc laø moät phaàn traêm mg/L ñoái vôùi ñoàng vaø moät vaøi chuïc mg/L ñoái vôùi baïc. Caùc ion naøy coù theå ñöôïc theâm vaøo trong nöôùc hoaëc laø ñieän phaân caùc muoái kim loaïi. Haàu heát caùc nghieân cöùu ñeàu söû duïng keát hôïp cuûa hai loaïi ion kim loaïi. Tuy nhieân, Lin ñaõ tieán haønh nghieân cöùu trong phoøng thí nghieäm veà vieäc söû duïng keát hôïp hai ion kim loaïi ñoàng vaø ion kim loaïi baïc ñeå choáng laïi L.pneumophila. Hoï ñaõ baát hoaït hoaøn toaøn caùc sinh vaät trong 2,5 h vôùi caùc ion ñoàng ôû 0,1mg/L. Ion baïc cuõng coù hieäu quaû vaø söï keát hôïp cuûa hai ion cuõng ñaõ ñöôïc chöùng minh. Ñònh kyø giaùm saùt noàng ñoä ion kim loaïi cho nöôùc saïch ñeå ñaûm baûo noàng ñoä döôùi ngöôõng cuûa EPA (möùc ñoä gaây oâ nhieãm (MCLG) cuûa 1,3 mg/L cho ñoàng vaø 0,1mg/L cho baïc). Döïa teân nhöõng phaùt hieän khaû naêng khöû truøng cuûa caùc ion kim loaïi (ñoàng, baïc hay söï keát hôïp cuûa caû hai ion) laø moät söï löïa choïn khaû thi ñeå aùp duïng cho caùc heä thoáng tuaàn hoaøn nöôùc noùng. Khoâng coù coâng boá baùo caùo veà vieäc aùp duïng caùc ion kim loaïi ñeå laøm maùt heä thoáng nöôùc. Neáu phöông thöùc khöû truøng ñöôïc tìm thaáy coù hieäu quaû cho nöôùc laøm maùt, söû duïng caùc ion ñoàng coù theå thöïc hieän kieåm soaùt caû Legionella vaø taûo. Noàng ñoä cuûa caùc ion vaø caùc taùc ñoäng baát lôïi cuûa chuùng veà khaû naêng xöû lyù nöôùc thaûi ôû haï nguoàn phaûi ñöôïc kieåm tra, theo doõi thöôøng xuyeân. 4.3.2.3. Nhöõng chaát oxi hoùa Nhieàu taùc nhaân oxy hoùa ñöôïc söû duïng roäng raõi vaø thaønh coâng ñeå khöû truøng nöôùc uoáng. Nhöõng chaát ñoù laø nhöõng halogen (chlor, brom, iode), chlodrine dioxide, nhöõng chloramine, ozone, hydroxy peroxide vaø thuoác tím kali. Taát caû nhöõng taùc nhaân naøy cuõng ñaõ ñöôïc söû duïng trong nhöõng heä thoáng caáp nöôùc khaùc nhö nguoàn nöôùc laïnh vaø nhöõng hoà taém. Moät chaát höõu cô khaùc nhö 1-Brom-3-chlor-5,5-dimethylhydantoin (BCDMH) coù chöùa brom vaø chlor cuõng ñöôïc söû duïng ñeå kieåm soaùt Legionella trong nöôùc laïnh. Trong soá caùc taùc nhaân oxy hoùa, chlor ñöôïc söû duïng roäng raõi nhaát trong thuoác khöû truøng ôû Myõ. Do lo ngaïi taùc haïi cuûa chaát khöû truøng lieân quan ñeán chlor (ví duï nhö trihalomethanes, chlorform ), thuoác khöû truøng khaùc (ví duï nhö ozone, caùc hôïp chaát khöû trung chlor khaùc vôùi saûn phaåm phuï ít ñoäc haïi hôn) vaø lieàu löôïng chlor thaáp ñöôïc söû duïng cho vieäc khöû truøng nöôùc uoáng. Chlor cuõng ñaõ ñöôïc söû duïng trong hoà bôi vaø nöôùc laïnh. Ñeå kieåm soaùt L.pneumophila thì noàng ñoä cuûa chlor ñöôïc söû duïng laø 2-6mg/L. McCall baùo caùo laø ôû noàng ñoä 2 mg/L chlor thì löôïng vi khuaån Legionella trong töï nhieân giaûm (caû sinh vaät phuø du vaø maøng sinh hoïc) trong voøng 1 h. Chlor coù hieäu quaû choáng laïi L.pneumophila ôû nhieät ñoä cao laø 250C so vôùi 430C. Coù ba vaán ñeà chính lieân quan ñeán quaù trình chlor hoùa : aûnh höôûng trong thôøi gian daøi, khaû naêng phaân huûy, vaø caùc saûn phaåm phuï trong quaù trình chlor hoùa vaø tính ñoäc cuûa chlorine. Tröôùc tieân chlor hoùa coù theå ngaên chaën Legionella nhöng hieám khi loaïi boû Legionella. Ñieàu naøy coù theå giaûi thích bôûi söï hieän dieän cuûa Legionella trong amip, coù theå chòu ñöôïc chlorine hay chlor khoâng thaâm nhaäp vaøo maøng sinh hoïc. Thöù hai, söùc aên moøn cuûa chlor phaûi ñöôïc xem xeùt ñoái vôùi nhöõng caùi oáng vaø nguyeân lieäu xaây döïng ñöôïc duøng trong nhöõng heä thoáng caáp nöôùc coù chlor neân ñöôïc baûo veä baèng caùch phuû natri silicat. Cuoái cuøng, keå töø khi phaùt hieän caùc saûn phaåm cuûa chlor hoùa (ví duï nhö chlor höõu cô) trong nöôùc uoáng naêm 1970, moái quan taâm lôùn laø taùc ñoäng xaáu ñaán söùc khoûe, ñaëc bieät laø gaây ung thö. Nöôùc chlor thaûi ra coù theå gaây ñoäc haïi ñoái vôùi caùc vi sinh vaät trong xöû lyù sinh hoïc nöôùc thaûi cuûa heä thoáng. Ngoaøi ra, brom ñaõ ñöôïc söû duïng trong hoà bôi vaø nöôùc laøm maùt, nhöng khoâng ñöôïc ñeà nghò trong vieäc xöû lyù nöôùc saïch. Töông töï nhö chlor, brom toàn taïi nhö acid hypobromous trong nöôùc trong hai hình thöùc laø HOBr vaø OBr- tuøy thuoäc vaøo pH. Thomas chæ ra raèng brom laø ít hieäu quaû hôn c