Đề tài Tổng quan về enzym lipase từ cá

CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYM LIPASE Enzym thuỷ phân chất béo cĩ nhiệm vụ phá vỡ cấu trúc chất béo bên trong các tế bào của những cơ quan khác nhau cũng như tạo điều kiện cho sự di chuyển của lipit từ cơ quan này sang cơ quan khác. Một khía cạnh quan trọng của hệ enzym thuỷ phân chất béo là chúng chỉ xúc tác cho các phản ứng lý hố tại bề mặt tiếp xúc giữa hai pha béo-nước, nhờ cơ chế hấp phụ bề mặt (kiểu xúc tác sensu stricto). Hầu hết enzym Lipase là enzym hồ tan được trong nước hoạt động trên những cơ chất khơng tan trong nước. Đặc tính phức tạp của loại xúc tác này làm cho nĩ khĩ định lương đươc chính xác cả về tỷ suất bề mặt cũng như những tham số tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha (như lực căng bề mặt, tính nhớt bề mặt, điện thế bề mặt) và liên quan với chất lượng bề mặt của cơ chất mà quá trình phân ly chất béo phải phụ thuộc. Sự nhũ hố giữa nước và các chất khơng tan trong nước sẽ cần đến sự tồn tại của các chất hoạt động bề mặt như: các chất tẩy rửa, các chất béo khác nhau, protein… ngay tại bề mặt giao tiếp giữa hai pha, vì vậy cĩ thể ảnh hưởng một cách mạnh mẽ đến phương pháp đo hoạt tính của enzym Lipase mà sự kìm hãm khơng đặc hiệu của lipase do sự xuất hiện của Protein tại bề mặt tiếp xúc của hai pha dầu-nước là một ví dụ điển hình. Các enzym Lipase đã được định nghĩa bằng những thuật ngữ động học, được dựa trên hiện tượng “ hoạt động bề mặt giữa các pha “, nghĩa là sự gia tăng hoạt tính xuất hiện khi một phần cơ chất tan trong nước trở thành cơ chất khơng tan trong nước. Quá trình này chưa được quan sát trên các esterases ( nhĩm enzym xúc tác sự tổng hợp và thuỷ phân các ester ). Cấu trúc 3-D của lipase được xác định gần đây cho thấy các nếp gấp a/b của hydrolase và tâm ái nhân cĩ chứa gốc Serin. Một số lipase ( khơng phải là tất cả ) cịn cĩ vùng kieểm sốt trung tâm hoạt động và hiện tượng “ hoạt động bề mặt “chưa phải là tiêu chuẩn thích hợp để phân loại các esterases đặc biệt như lipase. Vì các enzym thường được đặt tên theo kiểu phản ứng mà chúng xúc tác, lipase cĩ thể được định nghĩa lại là các carboxy-esterases hoạt động trên chuỗi acylglycerols mạch dài: chúng là những enzym phân cắt lipit đơn giản. Ở những nước cơng nghiệp phát triển, các chất béo ăn được đã cĩ mặt trong bữa ăn của con người, mà thành phần chủ yếu là triacylglycerols (TAGs) từ 100-150g mỗi ngày, chiếm khoảng 30% năng lượng mà cơ thể đưa vào hàng ngày. Những phân tử TAG khơng thể tự đi qua màng ruột được. Một chuỗi các phản ứng thuỷ phân và hấp thụ cần xảy ra để giải phĩng hố năng cĩ mặt trong các mạch hydrocacbon của TAG sinh vật cĩ thể sử dụng được. Enzym lipase bên trong bộ máy tiêu hố đĩng vai trị đặc biệt quan trọng trong những chu trình cung cấp dinh dưỡng cho cơ thể con người và những động vật bậc cao. Lipase hiện nay được sử dụng rộng rãi như những chất xúc tác chọn lọc trong mơi trường cĩ nước ( hoặc ít nước ) và nhiều phân tử tổng hợp mà cĩ thể được sử dụng như những cơ chất của lipase. Trong quá trình này, chúng ta chỉ đề cập đến sự phân tích lipase kéo theo sự thuỷ phân ester carboxylic. Những phản ứng này thường được thực hiện dưới điều kiện hoạt độ của nước thấp. Hơn nữa, người đọc được tham chiếu tới những điều lệ phổ biến mà liên quan đến enzym Lipase trong phép phân tích lập thể chọn lọc. Trong enzym học, người ta khơng định lượng enzym một cách trực tiếp mà thường xác định gián tiếp thơng qua xác định mức độ hoạt động ( hoạt độ ) của enzym. Bởi vì, khi cĩ mặt enzym thì sự hoạt động của nĩ được biểu hiện ra ở chỗ nĩ làm thay đổi cac tính chất vật lý, hố lý cũng như tính chất hố học của hỗn hợp phản ứng. Theo dõi những biến đổi đĩ cĩ thể biết được chính xác mức độ hoạt động của enzym thơng qua xác định lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng. Về nguỵên tắc, cĩ thể chia ra 3 nhĩm phương pháp sau: Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lương sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzym xác định Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm ứng với một nồng độ enzym nhất định. Chọn nồng độ enzym cần thiết như thế nào để trong một thời gian nhất định thu được sự biến thiên nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Ba nhĩm phương pháp này được tĩm tắt trong bảng sau : Nhĩm Các thơng số cố định Các thơng số thay đổi 1 Thời gian Nồng độ enzym Biến thiên của S hay P 2 Lượng cơ chất mất đi (hay lượng sản phẩm tạo thành). Nồng độ [E] Thời gian 3 Thời gian Lượng S mất đi (hay P tạo thành) Nồng độ E Cĩ thể tìm thấy trên các bài báo, tạp chí khoa học nhiều phương pháp để đo hoạt tính thuỷ phân của enzym lipase. Những phương pháp này cĩ thể được phân loại như sau : Phương pháp chuẩn độ ( Titrimetry ) Phương pháp quang phổ ( Spectroscopy ( photometry,fluorimetry )) Phương pháp sắc ký ( Chromatography ) Phương pháp phĩng xạ ( Radioactivity ) Phương pháp sức căng bề mặt ( Interfacial tensionmetry ) Phương pháp đục kế ( Turbidimetry ) Phương pháp đo độ dẫn điện ( Conductimetry ) Phương pháp hố học miễn dịch ( Immuno-chemistry ) Phương pháp hiển vi ( microscopy ) …. Phản ứng thuỷ phân triacylglycerol được xúc tác bởi enzym Lipase cĩ thể được viết : TAG DAG MAG Glycerol FFA FFA FFA TAG = triacylglycerols DAG = diacylglycerols MAG = monoglycerols FFA = free fatty acids. I.Các phương pháp hố lý : I.1. Sự biến mất của cơ chất : I.1.1. Phương pháp đo độ đục : a) Trong mơi trường rắn : Phương pháp này sử dụng các chất chỉ thị màu trên đĩa thạch với các ester carboxylic được dùng làm cơ chất , bản chất là xác định đường kính của vùng khuyếch tán sản phẩm. Sự phân giải chất béo sẽ làm lan rộng vùng sáng màu trên đĩa thạch. Hiện tượng quang học này chỉ quan sát được khi các acid béo được giải phĩng ra hồ tan một phần vào nước. Quá trình sáng màu này là kết quả của sự giảm kích thước của các hạt nhũ bị thuỷ phân cĩ tác dụng làm giảm ánh sáng khuyếch tán. Kỹ thuật này cũng cĩ thể được áp dụng trong quá trình theo dõi sự thuỷ phân của Twees do các enzym lipase khác nhau xúc tác. b) Trong mơi trường lỏng: Phương pháp này theo dõi sự giảm độ hấp thụ của nhũ TAG theo thời gian. Kỹ thuật này rất nhạy với những hệ nhũ, nhưng đối với các hệ nhũ tự nhiên ví dụ như huyết tương chẳng hạn, thì sự cĩ mặt của nhiều yếu tố khác cĩ thể ảnh hưởng đến quá trình. Thêm vào đĩ, kết quả khơng hồn tồn tuyệt đối là những giá trị hoạt động của enzym Lipase và thu được dữ liệu đáng tin cậy. Vì vậy, enzym Lipase thuần khiết được sử dụng để xây dựng một đường chuẩn. Bước chuẩn hố này đã hạn chế sự khuyếch tán rộng của phương pháp nhạy cảm này. Pháp phân tích esterase bằng phương pháp đo độ đục đã được phát triển, sử dụng một dung dịch Tween 20 với sự hiện diện của CaCl2, và sử dụng esterase từ Lysobacter enzymogenes làm nguồn enzym. Phản ứng được theo dõi bằng việc đo sự gia tăng mật độ quang ở bước sĩng 500nm vì quá trình thuỹ phân giải phĩng ra các acid béo từ Tween 20 và sự kết tủa của chúng dưới dạng muối Canxi. Phương pháp phân tích đo độ đục này đã được sử dụng để xác định hoạt tính riêng của enzym lipase từ chủng Chromobacterium ( với liều lượng là 87 IU.mg-1) và chủng Candida cylindracea ( với liều lượng là 0.5 IU.mg-1). II. Phương pháp đĩa Wilhelmy: II.1. Cơ chất là những màng film đơn phân tử thuần khiết: Trong số các phương pháp xác định sức căng bề mặt thì kĩ thuật màng film đơn phân tử tại bề mặt tiếp xúc của khơng khí -nước đã được phát triển rộng và được nhĩm nghiên cứu của Fréderic Beisson, Claude Rivìere cũng như nhĩm của Brockman sử dụng. Kỹ thuật này về cơ bản gồm một lớp Teflon ( lớp chống dính ) phủ trên máng, mà trên đĩ là một dung dịch. Một bản mỏng Pt nhúng trong bề mặt của pha nước được gắn liền với một electromicrobalance để đo áp suất bề mặt mà nĩ trực tiêp` liên quan đến sức căng bề mặt. Một vài cơng ty đã cĩ sẵn thiết bị này và được thương mại hố: KSV ( Helsinki, Finland ), Kruss GmbH ( Hamburg, Germany ) và Kibron Inc (Helsinki, Finland). Một màng film đơn phân tử của chất béo cĩ thể được phân bố tại bề mặt của pha nước, sử dung dung mơi dễ bay hơi như chloroform để hồ tan chất béo. Dung dịch chất béo được áp dụng ở dạng những giọt nhỏ mà chúng cĩ khả năng bay hơi được. Vùng bị chiếm giữ bởi lớp chất béo cĩ thể là hàng rào được điều chỉnh bởi một lớp Teflon quét trên bề mặt của pha nước. Áp suất bề mặt cĩ thể được duy trì bề mặt cĩ thể được duy trì khơng đổi tự động bằng cách sử dụng sự thuyên chuyển của Teflon mà được kiểm sốt và điều chỉnh phụ thuộc vào đầu ra của electromicrobalance. Dung dịch chứa enzym lipase được tiêm vào bên dưới màng film chất béo, áp suất bề mặt sẽ giảm vì sự hồ tan của những sản phẩm phản ứng thuỷ phân chất béo. Khi lớp màng chắn này di chuyển cĩ tác dụng duy trì hằng số áp suất bề mặt, động học của phản ứng cĩ thể được theo dõi bằng cách ghi lại sự chuyểng động của lớp màng chắn này theo thời gian. Với kỹ thuật này, ta cĩ thể đo và điều khiển những tham số bề mặt quan trọng như áp suất bề mặt ( năng lượng tự do của bề mặt tiếp xúc giữa các pha) và vùng phân tử của cơ chất. Phương pháp màng film đơn phân tử thích hợp để nghiên cứu những phản ứng enzym trên chất béo mà được phân bố tại bề nặt tiếp xúc khơng khí-nước. Phương pháp này cĩ độ nhạy cao, và lương chất béo thấp đáp ứng yêu cầu để thực hiện những phép đo động học đáng tin cậy. II.2. Màng film đơn phân tử được trộn lẫn với cơ chất: Hầu hết những nghiên cứu động học về hoạt động của enzym thuỷ phân chất béo đã được thực hiện invitro, dùng những chất béo thuần khiết làm cơ chất. Thực tế, tất cả các mặt phân cách của sinh vật đều là sự pha trộn phức tạp của hỗn hợp gồm lipit và Protein. Kỹ thuật đơn lớp lý tưởng thích hợp cho việc nghiên cứu kiểu hoạt động của hệ enzym thuỷ phân chất béo tại mặt phân cách, sử dụng hỗn hợp chất béo đã được điều chỉnh. Cĩ 2 phương pháp từ hỗn hợp chất béo tạo màng đơn lớp tại bề mặt phân pha khí-nước, hoặc bằng cách phân bố hỗn hợp chất béo khơng tan trong nước vào một dung mơi hữu cơ dễ bay hơi, hoặc tiêm một dung dịch nhũ tương của chất tẩy rửa vào trong pha nước,được bao phủ bởi lớp đơn chất béo khơng tan. Một ứng dụng mới của máng “ Zero-order ” được đề xướng bởi Píeroni và Verger [70] cho việc nghiên cứu sự thuỷ phân của lớp đơn phân tử hỗn hợp ở mật độ bề mặt khơng thay đổi và thành phần chất béo cố định như sơ đồ biểu diễn trong hình Fig 1A. Màng chắn bằng teflon được đặt ngang qua kênh nhỏ của máng “ Zero-order “ để ngăn truyền thơng bề mặt giữa màng chứa ( reservoir ) và bộ phận phản ứng (reaction compartment). Áp suất bề mặt được xác định rõ đầu tiên bằng cách đặt bản Pt vào trong bộ phận phản ứng , nơi mà hỗn hợp film được phân bố ở áp suất yêu cầu. Áp suất bề mặt được đo sau khi chuyển bản Pt tới màng chứa, nơi mà film cơ chất thuần khiết được phân bố tiếp sau.Áp suất bề mặt của màng chứa bằng với áp suất bề mặt của bộ phận phản ứng bằng việc di chuyển lớp màng chắn di động. Màng chắn giữa 2 bộ phận được chuyển dịch cho phép những bề mặt tiếp xúc với nhau và enzym được tiêm vào trong bộ phận phản ứng và kết quả động học được ghi chép như mơ tả. II.3. Liên kết bề mặt và sự phục hồi lớp: Bằng cách sử dụng kỹ thuật lớp đơn phân tử, nhiều nhà nghiên cứu đã báo cáo rằng giá trị tối ưu xảy ra ở mối tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt. Giá trị chính xác của điểm tối ưu biến đổi tuỳ theo sự kết hợp giữa enzym và cơ chất được sử dụng. Một cách giải thích hợp lý đã được đưa ra để giải thích hiện tượng này là: Giả thuyết đầu tiên, được đề nghị bởi Hughes và những người làm việc thuộc thế hệ sau ơng: Sự định hướng phụ thuộc màng bao của cơ chất cĩ lẽ là một trong những nhân tố điều hồ mà quá trình phân giải chất béo phụ thuộc. Sử dụng những enzym đã được đánh dấu phĩng xạ, Verger và Pattus đã thiết lập rằng giá trị cực đại được quan sát của sự tương quan giữa vận tốc và áp suất bề mặt sẽ biến mất tương quan với sự gia tăng tính hoạt động bề mặt của enzym. Thật vậy, sự khác biệt chính giữa lớp đơn và khối lớn (bulk system) nằm ở khu vực bề mặt giao tiếp và tỉ lệ thể tích, chúng khác nhau bởi nhiều trật tự sắp xếp ở hệ thống đơn lớp, tỉ lệ này thường là 1 cm-1, phụ thuộc vào độ sâu của cái máng. Trong khi đĩ, ở khối lớn tỉ lệ này cĩ thể cao khoảng 10-5 cm-1, phụ thuộc vào lượng lipit sử dụng và trạng thái của sự phân giải lipit. Kết quả là ở trường hợp của khối lớn sự hấp phụ hầu hết các enzym xuất hiện tại bề mặt giao tiếp, trong khi ở lớp đơn chỉ cĩ 1 phân tử enzym trong hàng trăm các enzym cĩ thể xuất hiện tại bề mặt giao tiếp. Vì ở tình trạng này, một lượng nhỏ khơng xác định ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ thuỷ phân được hấp phụ trên lớp đơn. Để khắc phục sự giới hạn này thì nhiều phương pháp đã được đề ra để phục hồi và đo lượng enzym đã được hấp phụ tại bề mặt giao tiếp. Sau khi đo tốc độ, Momsen và Brockman [77] đã chuyển lớp đơn đến 1 mẩu giấy kỵ nước và những enzym được hấp phụ sau đĩ được phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Sau khi so sánh với tốc độ của mẫu trắng và pha mang ( subphase ), số lượng của những enzym được hấp phụ sẽ được tính tốn từ vận tốc của mạng lưới và hoạt động của những enzym đặc hiệu. Trong bảng phân tích những enzym hoạt động phĩng xạ, màng film được hút ra bằng cách lồng những đáy của ống mao quản thuỷ tinh cong vào trong chất lỏng và nổi lên trên đỉnh của một phần thành Teflon. Khi những phân tử enzym được đánh dấu phĩng xạ tan trong pha mang sẽ bị hút ra cùng với những thành phần đi kèm với màng film. Kết quả sẽ được kiểm tra dựa trên sự hoạt động phĩng xạ trong cùng một thể tích của pha mang được hút ra. Sự khác biệt giữa 2 giá trị thực sự đã phản ánh được hoạt động phĩng xạ vượt mức tồn tại ở bề mặt tiếp xúc, được quy cho phân tử enzym cĩ liên kết với màng film. Bởi vì cĩ thể sử dụng kỹ thuật lớp đơn để đo tốc độ phản ứng được thể hiện bằng đơn vị mol.cm-2.min-1 và sự vượt mức của enzym ở bề mặt bằng đơn vị mg.cm-2. Ta dễ dàng đạt được giá trị hoạt động đặc hiệu của enzym thường được đo bằng đơn vị là mol.min-1.mg-1( IU.mg-1). Bằng cách kết hợp đồng thời 2 kĩ thuật ELISA và kĩ thuật lớp đơn phân tử, ta cĩ thể đo được hoạt tính của enzym lipase trong đường ruột của người ( HGL-Human gastric lipase). Trên lớp màng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lớp dicaprin) và cũng cĩ thể xác định được sự vượt mức của enzym bề mặt tương ứng. Một lượng HGL luân chuyển sẽ gia tăng một cách ổn định với màng bao lipit. Những hoạt tính đặc hiệu được xác định trên lớp dicaprin tại 35mN.m-1 đã được tìm thấy ở cùng một mức độ giá trị khi được đo dưới điều kiện phân tích khối lớn tối ưu, sử dụng cơ chất là chất nhũ hố tributyrin (liều lượng là 1000IU cho 1mg enzym). Tại một nồng độ lipase cho trước trong pha mang nước, sự liên kết bề mặt của các HGL với lớp màng phosphatidylcholine ưa béo của lịng đỏ trứng đã được nhận ra rằng chậm hơn 10 lần so với trường hợp của lớp màng dicaprin. Tuy nhiên, chúng ta phải lưu ý rằng những phân tử enzym được liên kết bề mặt khơng chỉ bao gồm những enzym đĩ ( là những enzym liên quan trực tiếp đến sự xúc tác) mà cịn một lượng Protein khơng đốn được (được hấp phụ lên lớp đơn). Những enzym này khơng liên quan đến sự thuỷ phân enzym của lớp. II.4. Phương pháp hiển vi lực nguyên tử (Atomic force microscopy): Để theo dõi động học của sự thuỷ phân của màng phospholipids kép bằng phospholipase A2, Nielsen đã làm một thí nghiệm sử dụng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM) trong mơi trường chất lỏng. Theo những nghiên cứu này thì sự thuỷ phân enzym của màng acylglycerols/phospholipids kép bằng enzym Humicola lanuginosa lipase (HLL) cũng đã được nghiên cứu bằng phương pháp AFM. Màng lipit kép củng cố bởi Mica bị thuỷ phân bởi HLL và vì sản phẩm hồ tan trong dung dịch đệm, các khu vực bị khoét sâu của màng kép sẽ bị phát hiện ra bởi đỉnh AFM. Húng ta sẽ cĩ được những hình ảnh thời gian thực của sự thuỷ phân xuất hiện ở lớp màng kép và sẽ phân tích chúng bằng phần mềm đã được thiết lập sẵn. Những hình ảnh này sẽ chỉ ra được sự xuất hiện của vết lõm tại bề mặt ở mức xấp xỉ 10-9 một cách gia tăng dần. Thêm vào đĩ, sự gia tăng diện tích của lỗ hổng ở lớp màng kép lipit mà được ghi nhận như là chức năng thời gian và hoạt tính đặc hiệu của enzym sẽ được đánh giá với điều kiện một phân tử lipase sẽ hoạt động trong 1 lỗ. Kết quả được sử dụng để làm mẫu cho động học của phản ứng enzym tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha béo-nước. Dữ liệu này cung cấp hình ảnh đầu tiên ở tầm Nano của động học quá trình phân giải lipit. II.5. Quang phổ học hồng ngoại: Một phân tích liên tục để đo sự thủy phân của những TAG do lipase xúc tác micell đảo ngược sử dụng Fourier thay đổi quang phổ học hồng ngoại (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), được phát triển bởi Walde và Luisi [80]. Sự phân hủy chất béo cĩ thể được theo dõi bằng việc ghi lại phổ FTIR của tồn bộ hỗn hợp phản ứng. Số lượng những ester axit béo và FFAs ( mà cực đại đỉnh tương ứng tại 1751cm-1 và tại 1715 cm-1 ) cĩ thể dựa trên cơ sở của những hệ số tắt và định luật của Beer. Phương pháp này được ứng dụng để đo sự phân hủy chất béo của những cơ chất khác nhau ( như trioctanoyglycerol, các loại dầu thực vật ). III. Sự xuất hiện những sản phẩm của phản ứng thủy phân: III.1. Sự giải phĩng Proton như một phép phân tích gián tiếp: III.1.1. Những chất chỉ thị màu: Trong mơi trường rắn: Khi dung dịch lipase được đặt trên một đĩa agar chứa ester carboxylic như một cơ chất, cĩ thể theo dõi độ pH bằng việc quan sát sự thay đổi màu của những chất chỉ thị (do những axit béo được giải phĩng trong phản ứng thủy phân gây ra) mà trước đĩ đã được kết hợp cùng với những cơ chất trong gel agar.Ở đây tồn tại một mối quan hệ tuyến tính giữa đường kính của đốm ( vị trí ) khuyếch tán axit béo và logarit của vùng phân bố enzym. Kỹ thuật này rất tiện lợi trong việc sàng lọc nhanh chĩng những vi sinh vật phân hủy lipid phát triển trên những đĩa agar. Tuy nhiên một vài sai sĩt cĩ thể là kết quả từ quá trình axit hĩa của mơi trường, vì sự phát sinh của những chất chuyển hĩa axit khác với FFAs mà được giải phĩng bởi những vi khuẩn lipase. Trong mơi trường chất lỏng: mặc dù đây là một phương pháp định tính, kỹ thuật này cung cấp một phương tiện đơn giản để phát hiện hoạt tính của lipase trong những phần nhỏ cột ghi sắc kí tại những giai đoạn làm sạch lipase khác nhau bằng việc quan sát những thay đổi màu sắc của những chất chỉ thị màu được trộn đều với những cơ chất ester. Một phương pháp định tính đơn giản hơn mà dựa vào sự phát hiện những đặc trưng mạnh mẽ về mùi của axit butyric và axit caproic, chúng cĩ mùi của những giọt sữa đã bị thủy phân mà được dùng như một cơ chất lipase. III.1.2. Phép chuẩn độ: Phương pháp pH-stat nổi tiếng (Fig 2) nĩi chung đã được sử dụng như một phép phân tích enzym lipase khác [82,83]. Đây là một kỹ thuật tiện lợi để mơ tả đặc điểm và sự đặc biệt của lipase cũng như hiện tượng kích hoạt bề mặt tiếp xúc giữa các pha. Với phương pháp pH-stat, hoạt động của lipase được đo trên một máy khuấy trộn hệ nhũ tương của những TAGs tự nhiên hay chất tổng hợp bằng việc trung hịa FFAs được giải phĩng theo thời gian bởi sự thêm vào chất chuẩn độ NaOH để duy trì độ pH tại một giá trị điểm cuối khơng đổi. Thiết bị pH-stat cĩ sẵn đã được sản xuất thương mại như bức xạ kế (Copenhagen,Denmark ) hoặc Metrohm Ltd (Herisau, Switzerland ). Trong trường hợp đặc biệt của lipase/colipase tụy tạng phức tạp, sự phân tích thường chung nhất là được thực hiện trong một máy điều nhiệt (ở 37oC) bình phản ứng hiện chứa đựng 0.5ml tributyrin trong 5ml dung dịch đệm cĩ chứa nước ( cĩ pH = 8 ), trong đĩ khơng cĩ mặt của bất kỳ chất hoạt động bề mặt hay hệ nhũ tương nào khác. Thơng thường, tributyrin đơn giản được nhũ tương hĩa tại chỗ bởi sự kích thích khuấy trộn cơ học hiệu quả trong bình pH-stat. Hiệu quả của dịch đồng nhất tuần hồn của dầu oliu được nhũ tương hĩa với keo arabic đã được chỉ ra để cải thiện độ nhạy của phép phân tích. Phương pháp pH-stat được dùng để phát hiện ra hoạt tính của lipase trong dịch mơ đồng thể thực vật, cĩ mặt của deoxycholate,sử dụng triolein được nhũ hĩa với keo arabic như cơ chất. Kỹ thuật pH-stat đã được dùng để xác định những hoạt tính lipase trong huyết thanh, plasma và dịch tá tràng. Phương pháp pH-stat là một phương pháp định lượng cho kết quả khá chính xác (nhạy) trong giới hạn 1mol axit béo được giải phĩng trong 1 phút. Khi sử dụng NaOH 0.1M làm chất chuẩn độ thì phương pháp này khơng đáng tin cậy trong việc nhận biết được mức độ hoạt động nhỏ hơn 0.1 mol/phút. Ngồi tính nhạy thấp của nĩ, nhược diểm của phương pháp pH-stat là vùng phân bố hẹp của những giá trị pH mà cĩ thể được nghiên cứu tìm hiểu. Đặc biệt hơn, sự phát hiện những Proton được giải phĩng trong suốt thời gian phản ứng thủy phân mà được xúc tác bởi những enzym lipase thì cần cĩ quá trình ion hĩa một phần những axit béo được giải phĩng. Bởi vậy, những giá trị pH của điểm cuối của mơi trường phản ứng phải gần bằng nhau, hoặc cao hơn, thích hợp hơn giá trị pKa hiển thị của axit béo được giải phĩng. Điều này đã được tường trình bởi Benzonana và Desnuelle mà giá trị pKa hiển thị của axit oleic cĩ thể cao đúng 7.5 trong những điều kiện phân tích của lipase [93]. Hơn nữa, nên chú ý rằng: khả năng ion hĩa cũng như sự cĩ mặt của những ion Canxi sẽ làm giảm đáng kể sự chính xác của những giá trị pKa hiển thị. Sự cĩ mặt của những ion Ca2+ cĩ ảnh hưởng tích cực đến hiệu quả ion hố của những axit béo mạch dài. Hiện tượng kết tủa vi mơ này điều khiển cân bằng hĩa học bằng định luật hoạt động khối lượng. Nếu tại giá trị pH được chọn, FFAs khơng hồn tịan bị ion hĩa, sự chuẩn độ liên tục của họ cũng khơng chính xác hoặc khơng thể thực hiện được, thậm chí sau khi đã cĩ một hệ số hiệu chỉnh. Sự chuẩn độ ngược (a back-titration ) phải được thực hiện, như trong trường hợp của HGL, hoạt động trong những điều kiện pH axit. Bởi vậy, hoạt động HGL được đo bằng việc ủ ấm dung dịch enzym với hệ nhũ tương TAG trong vài phút ở pH = 3. Sự giải phĩng FFAs khơng được ion hĩa thì được chuẩn độ ngược ở cuối phản ứng bằng việc chuyển dịch nhanh độ pH từ 3 đến 9. III.2.Phương pháp Fluorimatric ( đo sự phát hùynh quang ) dựa vào những ester Umbelliferyl: Một phương pháp mới Fluorimatric để đo hoạt tính lipase đã được mơ tả. Hỗn hợp hùynh quang umbelliferone (UMB) được ester hĩa với những axit báo no và khơng no cĩ chiều dài mạch carbon khác nhau, và sử dụng cơ chất là những ester khơng hùynh quang để đo hoạt tính của 2 loại enzym lipase được làm sạch từ 2 chủng Rhizopus delemar và Candida cylindracea. Cường độ huỳnh quang của UMB do các chất được giải phĩng bởi sự thủy phân cơ chất đã cho một dấu hiệu về hoạt động của lipase với những ester tương ứng. UMB được tìm thấy cĩ phần nhạy và ổn định hơn so với 4-methylumbelliferone (4-MU) đã được sử dụng trước đây. Phương pháp cĩ độ nhạy cao ( nmoles UMB/ml/hr) được mơ tả ở đây đã được kiểm tra trên 5 ester khác nhau. Phương pháp có ưu điểm là không cần sự trích rúùt của những sản phẩm thuỷ phân chất béo, nó cũng có thể được thực hiện nhanh chóng trong 2 đến 3 phút và như vậy hình thành một lớp màng chắn cho chính lipase được sinh ra bởi vi sinh vật. Những enzym lipase cĩ thể được chia cắt vào trong hai lớp với cơ chất đặc biệt của chúng. Những enzym lipase của nhĩm đầu tiên thì đặc biệt với axit béo tự nhiên, trong khi nhĩm thứ hai thì đặc biệt tới vị trí của liên kết ester trên glycerol của xương sống. Ví dụ, Lipase từ chủng Penicillium cyclopium thuỷ phân những triglyceride mạch ngắn, trong khi những enzym lipase từ chủng Aspergillus niger và Rhizopus delemar chỉ thuỷ phân liên kết ester tại vị trí 1 của triglycerides. Nhiều phương pháp đã được mơ tả để đo hoạt tính của lipase. Những phương pháp thường sử dụng nhất được dựa vào sự chuẩn độ những axit béo tự do được giải phĩng trong suốt thời gian thuỷ phân. Tuy nhiên, những phương pháp này yêu cầu cĩ sự chuẩn bị của những hệ nhũ tương bền của những cơ chất và sự điều khiển pH trong thời gian thuỷ phân. Phương pháp đồng vị phĩng xạ cĩ độ nhạy lớn hơn, nhưng yêu cầu các cơ chất phải được đánh dấu. Phương pháp so màu (colorimetric) dựa trên sự thuỷ phân những ester của p-nitrophenol hoặc thioesters cĩ sẵn. Các cơ chất huỳnh quang đã được sử dụng để phân tích Protease, phosphatase, glycosidase, sulfatase và những hoạt tính của enzym lipase. Chẳng hạn như, rhodamine 6G thì hữu ích để đo hoạt tính của những enzym lipase và những ester của C6NBD{ [(7-nitro-2,1,3-benzoxandiazol-4-yl)amino]-caproyl } thì thích hợp để đo hoạt tính của những enzym phospholipase.Một dẫn xuất coumarin (C9H8O2 : anhydrit của axit o-cumarin,lacton kết tinh màu trắng, độc tìm thấy ở nhiều loại cây và chế tạo tổng hợp, được dùng trong sản xuất nước hoa và xà phịng, cịn gọi là 1,2-benzopyrone) cũng đã được sử dụng để phân tích hoạt tính lipase. Ở bài viết này, chúng ta mơ tả về : Phương pháp Fluorimetric cĩ độ nhạy để đo hoạt tính lipase sử dụng nhiều ester khác nhau của umbelliferone ( 7-hydroxycoumarin) và 2 enzym lipase cĩ sẵn trong những sản phẩm thương mại được sản xuất bởi Rhizopus delemar và Candida cylindracea. Nguồn nguyên liệu và phương pháp: Sử dụng những enzym lipase từ chủng Rhzopus delemar ( Fluka, Buchs, Switzerland, 60 đơn vị Protein–mg, 1 đơn vị thì bằng hoạt động mà sản sinh ra 1mol axit oleic trong 1 phút tại pH = 8 ) và những enzym lipase từ chủng Candida cylindracea (Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, type VII, 500 đơn vị Protein-mg ). Hố chất :Umbelliferone, axit béo chlorides và Trito X-100 được thu nhận từ Sigma. Tetrahydrofuran (THF), pyridine, diethyl ether và ethylene glycol monomethyl ether và những dung mơi khác của thứ bậc ghi sắc ký. Sự chuẩn bị của những ester umbelliferone: axit chloride oleic (10mmol) được hồ tan trong 4ml pyridine khan và được pha lỗng với 14ml THF khan. Dung dịch này được thêm vào UMB (10mmol) trong THF (40ml). Hỗn hợp được hồi lưu trong một bình được trang bị sẵn với một người khuấy trộn tính cho 6hr ở 80oC, xúc tác bởi argon và được thực hiện trong tối. Sau sự bay hơi của THF dưới điều kiện chân khộng, phần cịn lại cho vào trong 100ml diethyl ether được thực hiện trong tối dưới xúc tác argon. Dung dịch được rửa 3 lần với nước (15ml), 2 lần với 10% HCl (10ml), 2 lần với 1M NaOH (10ml), và 3 lần rửa khác với nước (10ml). Pha ether được sấy khơ thành magiê-sunfat khan. Sau sự bay hơi của ether dưới điều kiện chân khơng thì năng lượng cịn lại ( khoảng 70% hiệu suất ) được giữ trong tối dưới xúc tác argon. Những ester axit béo khác được thu nhận và sử dụng cùng chung 1 cách làm. Vùng tập trung tương đối của UMB và axit chlorides, cũng như thời gian phản ứng, được tối ưu hố để cho những năng suất cao nhất. Những ester được kết tinh lại trong ethenol lỏng, và độ thuần khiết của chúng được kiểm tra bởi phép ghi sắc ký lớp mỏng. Quang phổ HNMR (nuclear magnetic resonance) và quang phổ IR của những ester phù hợp với những cấu trúc tương ứng. Phân tích enzym: Hỗn hợp phản ứng chứa 10ml dung dịch ethylene glycol monomethyl ether của ester đặc biệt tại vùng phân bố hẹp từ 0.1-250mM trong tồn bộ thể tích của 3ml dung dịch đệm Tris-maleate (0.05M, pH=7) phản ứng được thực hiện ở 30oC. Ở thời điểm t = 0, 10ml dung dịch lipase cĩ chứa nước được thêm vào hỗn hợp này, và sự phát huỳnh quang (ở bước sĩng 470nm) được ghi lại sau 2-3 phút (SFM 25 spectrofluorimeter, Kontron Instruments, Hermle, Switzerland) ở bước sĩng kích thước (320nm) tương ứng với đỉnh hấp thụ của UMB. Những bước sĩng được chọn cung cấp kết quả tốt nhất trong những điều kiện pH và nhiệt độ thử nghiệm của chúng ta. Kết quả : Cường độ phát huỳnh quang của Umbelliferone tự do (UMB) được tìm thấy để cân đối vùng tập trung qua phạm vi được kiểm tra từ 0-20 mM. Các ester umbelliferyl, được hồ tan trong ethylene glycol monomethyl ether cho thấy những mức phát huỳnh quang cĩ độ đồng nhất thấp trong suốt vùng pH bên trong phạm vi tập trung từ 9-20 mM. Sự phát huỳnh quang căn bản này khơng thay đổi trong suốt thời gian 15 phút ủ ấm ở 30oC. (Fig 1) Trong những điều kiện phân tích của chúng ta, sự thuỷ phân của những ester dẫn tới sự tăng tuyến tính trong sự phát huỳnh quang. Những kết quả của UMB và 4-methyl umbelliferone (4-MU) được so sánh trong những điều kiện được mơ tả bởi Jacks và Kircher.Cả hai huỳnh quang ban đầu cùng cho thấy thực chất chúng là những hỗn hợp cơ bản, tuy nhiên chỉ cịn lại sự ổn định theo thời gian trong trường hợp của UMB (Fig 2). Chúng ta thu được kết quả đáp lại tốt nhất với UMB ở pH = 7.4 (100%) (Fig 3). Ở đĩ cĩ 95% kết quả là ở pH = 7 và ở pH=6 thì kết quả đáp lại khoảng 60%. Dữ liệu được xác nhận cho vài vùng phân bố của UMB, với phạm vi từ 1.5-20 mM (Fig 3). Tốc độ thuỷ phân ban đầu của umbelliferyl oleate (20 mM) được xác định cho snhững vùng phân bố enzym từ 0.1-100 mg/ml. Tốc độ thuỷ phân của cơ chất được tìm thấy cân đối với vùng tập trung của enzym. Những kết quả đồng nhất thu được với những ester axit béo khác nhau, bao gồm 12:0; 16:0; 18:0 và 18 : 2. Sự phụ thuộc của hoạt tính lipase vào vùng phân bố cơ chất được thiết lập như hình 4 (Fig 4). Ví dụ, Umbelliferyl oleate, hoạt tính cực đại ( Vmax ) đạt được ở vùng phân bố cơ chất tại 20 mM và ở những mức cao hơn nữa. (Fig 4). Tốc độ cực đại của sự thuỷ phân cũng được quan sát cho những cơ chất fluorogenic khác thì cao hơn những mức 20 mM. Tất cả các phép đo huỳnh quang kế tiếp được thực hiện ở tại vùng tập trung cơ chất là 20 mM.. sDựa vào biểu đồ trên, ta thấy đối với axit béo no ( 12 : 0;16 : 0; 18 : 0 ), hoạt tính của lipase từ 2 chủng Rhzopus delemar và Candida cylindracea thì tăng khi chiều dài của mạch giảm. Trong chuỗi C18, sự cĩ mặt của liên kết đơi dường như làm gia tăng hoạt tính của lipase ( 6mmol UMB/min/mg lipase cho axit oleic và axit linoleic ). Giá trị này thì cao hơn gấp 10 lần so với ester axit stearic mà đã được quan sát. Goodwin và Kavanagh (20) quan sát rằng sự phát huỳnh quang UMB và 4-MU xuất hiện ở bước sĩng tương ứng là 380 và 634nm.Chúng ta khơng phát hiện ra bất kì sự khác nhau quan trọng nào trong sự phát huỳnh quang giữa UMB và 4-MU ở tại thời điểm t = 0. Tuy nhiên, sự phát huỳnh quang 4-MU được chứng minh là khơng ổn định và gia tăng theo thời gian, trong khi sự phát huỳnh quang UMB cịn lại khơng thay đổi. (Fig 2). Như vậy UMB cho sự phân tích những mục đích thì đáng tin cậy hơn 4-MU. Ngồi ra, kết quả đáp lại cao nhất cho UMB thì thu được trong 1 phạm vi pH thấp hơn so với báo cáo. Hơn nữa, kết quả cĩ vẻ ít phụ thuộc vào pH, mặc dù giá trị cực đại (100%) xảy ra tại pH = 7.4, hoạt động cịn lại là 95% ở tại pH = 7.0 Sử dụng 4-MU butyrate, Roberts cĩ thể phát hiện ra hoạt động phân huỷ lipit thấp nhất mà chúng ta cĩ thể phát hiện ra là 0.3 nmoles/ml/hr. Độ nhạy cao này sẽ là 1 điều quan tâm đặc biệt khi cần phải đo hạot động phân huỷ lipit ở những mức rất thấp. Phương pháp Fluorimetric cĩ độ nhạy cao hơn khoảng 4000 lần so với phương pháp Colorimetric dựa vào thioestres và cao hơn gấp 10000 lần so với phương pháp chuẩn độ dựa vào sự sử dụng kỹ thuật pH-stat. Dưới những điều kiện tối ưu cho cả 2 cơ chất, tốc độ thuỷ phân ở vùng phân bố enzym là 0.3 mmol/min/mg enzymvới 4-MU oleate, và 2.5 mmol/min/mg enzym với UMB oleate. Sự cĩ mặt của nhĩm methyl cĩ thể làm giảm sút tốc độ thuỷ phân của những enzym lipase. Ngồi lợi ích là cĩ độ nhạy cao, phép phân tích Fluorimetric cĩ thể được thực hiện chỉ trong 2 đến 3 phút. Trái ngược với phương pháp đồng vị phĩng xạ, các sản phẩm của sự phân huỷ lipit cũng khơng cần phải được trích rút và tách riêng ra. Hơn nữa, những ester UMB rất ổn định và khơng bị sự tự thuỷ phân như 4-MU palmitate mà đã được báo cáo. Trong khi hệ nhũ tương 4-MU palmitate cĩ thể khơng ổn định thì hệ nhũ tương UMB cịn lại rất ổn định. Những ion canxi sẽ làm tăng thêm hoat tính của enzym lipase bởi sự tác động trực tiếp lên enzym. Chúng cũng cĩ thể giảm bớt tính hồ tan được của những axit béo sinh ra trong thời gian thuỷ phân, mà đây cĩ thể là một vấn đề quan trọng khi sử dụng phương pháp chuẩn độ. Phương pháp huỳnh quang (Fluorimetric) thì tránh được vấn đề này. Trong những điều kiện thử nghiệm như đã nêu, 30mM calcium chloride được kích hoạt cho enzym lipase từ chủng Rhizopus delemar; 8mM của Triton X-100 sẽ kìm hãm hoạt tính lipase về phía trglycerides, dẫn tới sự kìm hãm 100% hoạt động về phía những cơ chất fluorigenic. Một số ester 4-MU thương phẩm thì thích hợp cho việc sử dụng. Nhưng nếu hoạt tính lipase được phân tích là yếu thì những ester UMB cĩ thể là một sự thay thế tốt hơn. …. Khi xác định hoạt độ enzym cần chú ý một số điểm sau: Nồng độ cơ chất trong phản ứng phải ở trong một giới hạn thích hợp đủ thừa để bão hồ enzym nhưng khơng quá cao để đến mức kìm hãm enzim Với những enzim cần cĩ chất hoạt hố hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzim trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định. Nhưng cần phải chú ý là pH thích hợp cĩ thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào cơ chất và thành phần dung dịch đệm, lực iơn của dung dịch đệm ( thường trong phạm vi từ 0,01 – 0,1 ) Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzim để đề phịng tác dụng kìm hãm enzim do nhiệt độ cao Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút. Trong một số trường hợp cĩ thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ của enzim quá thấp. Trong trường hợp đĩ cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật.